JP2008503473A - Ｃ−ｋｉｔ活性を調節する化合物 - Google Patents
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Abstract
レセプタータンパク質チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔに対して活性な，７−アザインドールコア構造を有する化合物，ｃ−ｋｉｔに媒介される疾病または状態の治療に有用な組成物，およびその使用方法が提供される。さらに，ｃ−ｋｉｔリガンドを同定および設計する方法が提供される。
Description
発明の分野
本発明は，ｃ−ｋｉｔのリガンドの開発およびそのようなリガンドの利用に関する。
本発明は，ｃ−ｋｉｔのリガンドの開発およびそのようなリガンドの利用に関する。
発明の背景
以下に提供される情報は，読者の理解を助けることのみを意図するものである。提供される情報および引用される文献のいずれも，本発明に対する先行技術であると認めるものではない。引用されるそれぞれの文献は，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。
以下に提供される情報は，読者の理解を助けることのみを意図するものである。提供される情報および引用される文献のいずれも，本発明に対する先行技術であると認めるものではない。引用されるそれぞれの文献は，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。
レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）は，細胞成長および増殖を調節する鍵となるシグナル伝達カスケードを制御する。幹細胞因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）レセプターであるｃ−ｋｉｔは，５つの細胞外イムノグロブリン（ＩＧ）ドメイン，１つの貫膜ドメイン，およびキナーゼ挿入セグメントにより分断された細胞質キナーゼドメインを含む，タイプＩＩＩ貫膜ＲＰＴＫである。Ｃ−ｋｉｔは，メラノサイト，肥満細胞，生殖細胞，および造血細胞の発生において重要な役割を果たす。
幹細胞因子（ＳＣＦ）は，Ｓ１座によりコードされるタンパク質であり，これを同定したときに用いられた生物学的性質に基づいて，ｋｉｔリガンド（ＫＬ）および肥満細胞成長因子（ＭＧＦ）とも称されている（総説として，Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ １９９６，４６：９３３−９３８；Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９７，１５３：３３７−３４４；Ｖｌｉａｇｏｆｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ １９９７，１００：４３５−４４０；Ｂｒｏｕｄｙ，Ｂｌｏｏｄ １９９７，９０：１３４５−１３６４；Ｐｉｇｎｏｎ，Ｈｅｒｍａｔｏｌ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ １９９７，３９：１１４−１１６；およびＬｙｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９８，９１：１１０１−１１３４）。本明細書においては，ｃ−Ｋｉｔ ＲＴＫのリガンドを表すためにＳＣＦとの略語を用いる。
ＳＣＦは，エクソン６をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングにより２２０または２４８ダルトンの分子量を有する貫膜タンパク質として合成される。大きい方のタンパク質は，タンパク質加水分解的に切断されて可溶性の，グリコシル化されたタンパク質を形成することができ，これは非共有的に二量体化する。可溶性型および膜結合型のＳＣＦの両方とも，ｃ−Ｋｉｔに結合しこれを活性化することができる。例えば，皮膚においては，ＳＣＦは主として線維芽細胞，ケラチノサイトおよび内皮細胞により発現され，ｃ−Ｋｉｔを発現するメラノサイトおよび肥満細胞の活性を調節する。骨においては，骨髄間質細胞がＳＣＦを発現し，ｃ−Ｋｉｔ発現幹細胞の造血を制御する。胃腸管においては，腸上皮細胞がＳＣＦを発現し，カハルの腸細胞および上皮内リンパ球に影響を与える。精巣においては，セルトーリ細胞および顆粒膜細胞がＳＣＦを発現しており，これは生殖細胞上でｃ−Ｋｉｔと相互作用することにより精子形成を制御する。
別のＲＰＴＫタンパク質，例えばＲｅｔおよびＮＴＲＫ１が記載されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８７，７：１３７８−８５；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｃｅｌｌ．１９９１，６５：９１５−８）。ＲｅｔおよびＮＴＲＫ１は，神経系の特定の成分の発生および成熟において役割を果たす。ＲｅｔおよびＮＴＲＫ１の変化は，いくつかのヒト疾病，例えば，ある型の癌および発生以上と関連づけられている。
遺伝的変化と種々の疾病の出現との相関は，１つの遺伝子が２以上の疾病の原因であり得るという概念に寄与してきた。さらに，ＲｅｔおよびＮＴＲＫ１の両方の遺伝的変化は，"機能獲得"または"機能喪失"タイプの変異のいずれかに属することが観察されている。実際，レセプターの再配列または点突然変異はＲｅｔおよびＮＴＲＫ１を支配的に作用する形質転換遺伝子に変換し，これは甲状腺腫瘍につながるが，一方，ヒルシュスプリング病病（ＨＳＣＲ）および無発汗症を伴う先天性の痛みに対する不感症（ＣＩＰＡ）に関連する不活性化変異は，それぞれＲｅｔおよびＮＴＲＫ１の機能を弱める。
Ｍｏｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：３１４６１−４）により，ｃ−ｋｉｔキナーゼドメインと化合物ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ，Ｉｍａｔｉｎｉｂ）との共結晶構造が報告されている。自己阻害ｃ−ｋｉｔの構造は，ＳＴＩ−５７１との複合体中のｃ−ｋｉｔの構造とともに，Ｍｏｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９：３１６５５−６３）に記載されている。クローニング，結晶化条件および構造決定も記載されている。
インドリノン化合物を用いるｃ−Ｋｉｔの調節は，Ｌｉｐｓｏｎら，米国特許２００４０００２５３４（米国特許出願１０／６００，８６８，２００３年６月２３日出願）に記載されている。
ｃ−Ｋｉｔの異常な発現および／または活性化は，種々の病的状態における関与が示唆されている。例えば，ｃ−Ｋｉｔが新生物の病因に寄与するという証拠としては，白血病および肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，および胃腸管および中枢神経系のある種の癌との関連性が挙げられる。さらに，ｃ−Ｋｉｔは，神経外胚葉起源の女性生殖系肉腫の発癌，および神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成において役割を果たすことが示唆されている。肥満細胞が腫瘍微小環境を変化させ，腫瘍成長を促進することに関与することが見いだされている（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，１１２：１８５１−１８６１；Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，１１２：１７９１−１７９３）。したがって，当該技術分野においては，ｃ−ｋｉｔ活性の調節剤が求められている。
発明の概要
本発明は，ｃ−Ｋｉｔに対する活性を有する化合物，およびそのような化合物を設計する方法に関する。特に，本発明は，以下に示される式Ｉの化合物を提供する。すなわち，本発明は，ｃ−Ｋｉｔの調節を伴う治療および／または予防法に用いることができる化合物を提供する。
本発明は，ｃ−Ｋｉｔに対する活性を有する化合物，およびそのような化合物を設計する方法に関する。特に，本発明は，以下に示される式Ｉの化合物を提供する。すなわち，本発明は，ｃ−Ｋｉｔの調節を伴う治療および／または予防法に用いることができる化合物を提供する。
式Ｉの化合物は以下の構造を有する：
式Ｉ
［式中，
Ｒ1およびＲ5は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，または−ＮＲ22Ｒ23であり；
Ｒ3およびＲ4は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，または−Ｓ（Ｏ）nＲ21であり；
Ｒ2は，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，−Ｓ（Ｏ）nＲ21，または−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり，
ここで，
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−，−Ｃ（Ｓ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（Ｓ）ＣＨ2−，−Ｏ−，−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ2）−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，
Ｒaは，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
からなる群より選択され，
ここで，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
からなる群より選択され，ここで，
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内であり；
Ｒ16およびＲ17は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；または
Ｒ16およびＲ17は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｒ20は，ヒドロキシル，置換されているオキシ，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；
Ｒ21は，水素（ただしｎ＝０），任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；
Ｒ22およびＲ23は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，および−Ｓ（Ｏ）2Ｒ21であり；または
Ｒ22およびＲ23は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｘは，ＯまたはＳであり；および
ｎは，０，１，または２である］。
［式中，
Ｒ1およびＲ5は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，または−ＮＲ22Ｒ23であり；
Ｒ3およびＲ4は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，または−Ｓ（Ｏ）nＲ21であり；
Ｒ2は，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，−Ｓ（Ｏ）nＲ21，または−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり，
ここで，
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−，−Ｃ（Ｓ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（Ｓ）ＣＨ2−，−Ｏ−，−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ2）−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，
Ｒaは，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
ここで，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内であり；
Ｒ16およびＲ17は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；または
Ｒ16およびＲ17は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｒ20は，ヒドロキシル，置換されているオキシ，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；
Ｒ21は，水素（ただしｎ＝０），任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルであり；
Ｒ22およびＲ23は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，および−Ｓ（Ｏ）2Ｒ21であり；または
Ｒ22およびＲ23は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｘは，ＯまたはＳであり；および
ｎは，０，１，または２である］。
本明細書に記載される化合物について，以下の定義が適用される。
"ハロ"および"ハロゲン"とは，すべてのハロゲンを表し，クロロ（Ｃｌ），フルオロ（Ｆ），ブロモ（Ｂｒ），またはヨード（Ｉ）が含まれる。
"ヒドロキシル"および"ヒドロキシ"とは，基−ＯＨを表す。
"置換オキシ"とは，基−ＯＲfを表し，ここで，Ｒfは，アルキル，置換アルキル，アシル，置換アシル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，アラルキル，置換アラルキル，ヘテロシクリルアルキル，置換ヘテロシクリルアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，ヘテロシクリル，または置換ヘテロシクリルである。
"チオール"および"メルカプト"とは，基−ＳＨを表す。
"置換チオール"とは，基−ＳＲを表し，ここで，Ｒは，アルキル，置換アルキル，アシル，置換アシル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，アラルキル，置換アラルキル，ヘテロシクリルアルキル，置換ヘテロシクリルアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，ヘテロシクリル，または置換ヘテロシクリルである。
"アルキル"とは，１−２０個，好ましくは１−１５個の炭素原子を含む，アルカンから誘導されたラジカルを表す。アルキルには，直鎖アルキル，分枝鎖アルキルおよびシクロアルキルが含まれる。直鎖または分枝鎖のアルキル基は，１−１５個，好ましくは１−８個，より好ましくは１−６個，さらにより好ましくは１−４個，最も好ましくは１−２個の炭素原子を含み，例えば，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，ｔ−ブチル等である。アルキルはまた，１またはそれ以上のシクロアルキル部分を含むか，これによって中断された直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。例としては，限定されないが，４−（イソプロピル）−シクロヘキシルエチルまたは２−メチル−シクロプロピルペンチルが挙げられる。アルキル基は，任意の利用可能な位置で結合して安定な化合物を生成する。
"置換アルキル"とは，例えば，ハロ，ヒドロキシ，任意に置換されていてもよいアルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアリールオキシ，任意に置換されていてもよいヘテロアリールオキシ，任意に置換されていてもよいアミノ，任意に置換されていてもよいアミド，アミジノ，任意にアルキル，アリール，ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で置換されていてもよいウレア，任意にアルキル，アリールまたはヘテロアリール基でＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−置換されていてもよいアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，複素環，置換複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，窒素，シアノ，チオール，スルホニルアミノ等の，任意の利用可能な点に結合した１またはそれ以上の，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルキル基である。
"低級アルキル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルキル基を表す。
"置換低級アルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルキルである。
"シクロアルキル"とは，１つの環あたり３−８個，より好ましくは３−６個の環メンバーを有する，飽和または不飽和の非芳香族性の，一環，二環または三環の炭素環系を表し，例えば，シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，アダマンチルなどがある。
"置換シクロアルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているシクロアルキルである。
"アルキレン"とは，１−２０個，好ましくは１−１５個の炭素原子を含み，同じ炭素原子から，または異なる炭素原子から２つの水素原子が除かれている，直鎖または分枝鎖の２価のアルカン誘導ラジカルを表す。アルキレンの例としては，限定されないが，メチレン−ＣＨ2−，エチレン−ＣＨ2ＣＨ2−などが挙げられる。
"置換アルキレン"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルキレンである。
"低級アルキレン"とは，１−６個の炭素原子を含むアルキレンである。
"置換低級アルキレン"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成している低級アルキレンである。
"アルケニル"とは，２−２０個，好ましくは２−１７個，より好ましくは２−１０個，さらに好ましくは２−８個，最も好ましくは２−４個の炭素原子を含み，少なくとも１つ，好ましくは１−３個，より好ましくは１−２個，最も好ましくは１個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖，分枝鎖または環状の炭化水素を表す。シクロアルキル基の場合，２個以上の炭素−炭素二重結合の共役は環に芳香族性を付与しないようなものである。炭素−炭素二重結合は，シクロアルキル部分中に含まれていてもよく（ただしシクロプロピルを除く），または直鎖または分枝鎖部分中に含まれていてもよい。アルケニル基の例としては，限定されないが，エテニル，プロペニル，イソプロペニル，ブテニル，シクロヘキセニル，シクロヘキセニルアルキル等が挙げられる。
"置換アルケニル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルケニルである。
"低級アルケニル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルケニル基を表す。
"置換低級アルケニル"は，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルケニルである。
"アルキニル"とは，２−２０個，好ましくは２−１７個，より好ましくは２−１０個，さらに好ましくは２−８個，最も好ましくは２−４個の炭素原子を含み，少なくとも１つ，好ましくは１つの炭素−炭素三重結合を含む，直鎖または分枝鎖の炭化水素を表す。アルキニル基の例としては，限定されないが，エチニル，プロピニル，ブチニル等が挙げられる。
"置換アルキニル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルキニルである。
"低級アルキニル"とは，１−６個の炭素原子を有するアルキニル基を表す。
"置換低級アルキニル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成している低級アルキニルである。
"アルコキシ"とは，基−ＯＲfを表し，ここでＲfは低級アルキルである。
"置換アルコキシ"とは，基−ＯＲf'を表し，ここでＲf'は置換低級アルキルである。
"アルキルチオ"または"チオアルコキシ"とは，基−Ｓ−Ｒを表し，ここでＲは低級アルキルである。
"置換アルキルチオ"または"置換チオアルコキシ"とは，基−Ｓ−Ｒを表し，ここでＲは置換低級アルキルである。
"スルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）−を表す。
"置換スルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）−Ｒを表し，ここで，Ｒは低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである。
"スルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）2−を表す。
"置換スルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）2−Ｒを表し，ここで，Ｒは，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである。
"スルホニルアミノ"とは，基−ＮＲＳ（Ｏ）2−を表し，ここで，Ｒは水素または低級アルキルである。
"置換スルホニルアミノ"とは，基−ＮＲaＳ（Ｏ）2−Ｒbを表し，ここで，Ｒaは，水素または低級アルキルであり，Ｒbは，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，ヘテロシクリル，置換ヘテロシクリル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ヘテロアラルキル，置換ヘテロアラルキル，アラルキルまたは置換アラルキルである。
"アシル"とは，基−Ｃ（Ｏ）Ｒhを表し，ここでＲhは，水素，低級アルキル，アリール，ヘテロアリール等である。
"置換アシル"とは，基−Ｃ（Ｏ）Ｒh'を表し，ここでＲh'は，置換低級アルキル，置換アリール，置換ヘテロアリール等である。
"アシルオキシ"とは，基−ＯＣ（Ｏ）Ｒhを表し，ここで，Ｒhは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール等である。
"アリールオキシ"とは，基−ＯＡｒを表し，ここで，Ａｒは，アリールまたは置換アリール基である。
"ヘテロアリールオキシ"とは，基−ＯＨｅｔを表し，ここで，Ｈｅｔは，任意に置換されていてもよいヘテロアリール基である。
"アミノ"または"アミン"とは，基−ＮＨ2を表す。
"置換アミノ"または"置換アミン"とは，基−ＮＲiＲjを表し，ここで，ＲiおよびＲjは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，アシル，置換アシル，スルホニルまたは置換スルホニルであるが，ただし，ＲiおよびＲjの少なくとも１つは水素ではない。ＲiＲjは，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい複素環またはヘテロアリール環を形成してもよい。
"アミド"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2を表す。
"置換アミド"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＮＲkＲlを表し，ここで，ＲkおよびＲlは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，または置換ヘテロアリールであるが，ただし，ＲkおよびＲlの少なくとも１つは水素ではない。ＲkＲlは，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい複素環またはヘテロアリール環を形成委してもよい。
"アミジノ"とは，基−Ｃ（＝ＮＲm）ＮＲnＲoを表し，ここで，Ｒm，Ｒn，およびＲoは，独立して，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
"アルキルスルフィニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）Ｒpを表し，ここでＲpは任意に置換されていてもよいアルキルである。
"アルキルスルホニル"とは，基−Ｓ（Ｏ）2Ｒpを表し，ここでＲpは任意に置換されていてもよいアルキルである。
"アルキルスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒpを表し，ここでＲpは任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"アリールスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒsを表し，ここでＲsは任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"ヘテロアリールスルホニルアミノ"とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒtを表し，ここでＲtは任意に置換されていてもよいヘテロアリールであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"カルボニルアミノ"とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｈを表し，ここでＲqは水素または低級アルキルである。
"置換カルボニルアミノ"とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒpを表し，ここでＲqは水素または低級アルキルであり，Ｒpは，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアリールである。
"アルキルカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒpを表し，ここでＲpは任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"アリールカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒsを表し，ここでＲsは任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"ヘテロアリールカルボニルアミノ"とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒtを表し，ここでＲtは任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは水素または低級アルキルである。
"カルボキシル"とは，基−Ｃ（Ｏ）ＯＲrを表し，ここで，Ｒrは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘテロアリールである。
"アリール"とは，フェニルまたはナフチルを意味し，好ましくは５−７員環，より好ましくは５−６員環のシクロアルキルと縮合していてもよい。
"アリーレン"とは，二価のアリールを意味する。
"置換アリール"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているアリール基である。
"複素環"または"ヘテロシクリル"とは，単環または縮合多環を有する飽和または不飽和の非芳香族性炭素環基を意味し，例えば，５−１０個の原子を有し，環中の１−３個の炭素原子がＯ，Ｓ，Ｎ等の複素原子で置き換えられており，任意に５−６員環のベンゾまたはヘテロアリールと縮合していてもよいか，および／または任意に置換されていてもよいシクロアルキル基である。ヘテロシクリルは，酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮオキシドを含むことが意図される。結合点は，炭素または窒素原子である。複素環またはヘテロシクリル基の例としては，モルホリノ，テトラヒドロフラニル，ジヒドロピリジニル，ピペリジニル，ピロリジニル，ピペラジニル，ジヒドロベンゾフリル，ジヒドロインドリル等が挙げられる。
"置換複素環"または"置換ヘテロシクリル"とは，，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルまたはオキソ基で置換されて安定な化合物を生成している複素環である。
"オキソ"とは，結合した炭素に二重結合している酸素置換基を表す。
"ヘテロアリール"とは，Ｏ，Ｓ，およびＮからなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，好ましくは１−４個，より好ましくは１−３個，さらに好ましくは１−２個の複素原子を含み，５または６個の環原子を含む単環芳香族性環構造または８−１０個の原子を有する二環芳香族基を表す。ヘテロアリールはまた，酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮオキシドを含むことが意図される。炭素または窒素原子は，安定な芳香族環が保持されるような，ヘテロアリール環構造の結合点に存在する。ヘテロアリール基の例としては，ナフトピリジル，ピリジニル，ピリダジニル，ピラジニル，キノキサリル，インドリジニル，ベンゾ［ｂ］チエニル，キナゾリニル，プリニル，インドリル，キノリニル，ピリミジニル，ピロリル，オキサゾリル，チアゾリル，チエニル，イソオキサゾリル，オキサチアジアゾリル，イソチアゾリル，テトラゾリル，イミダゾリル，トリアジニル，フラニル，ベンゾフラニル，インドリル等が挙げられる。
"ヘテロアリーレン"とは，二価のヘテロアリールを意味する。
"置換ヘテロアリール"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているヘテロアリールを表す。
"アラルキル"とは，基−Ｒ−Ａｒを表し，ここで，Ａｒはアリール基であり，Ｒは低級アルキレンである。
"置換アラルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているアラルキル基を表す。
"ヘテロシクリルアルキル"とは，基−Ｒ−Ｈｅｔを表し，ここで，Ｈｅｔは複素環基であり，Ｒは低級アルキレン基である。
"置換ヘテロシクリルアルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，またはオキソ基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているヘテロシクリルアルキル基を表す。
"シクロアルキルアルキル"とは，基−Ｒ−Ｃｙｃを表し，ここで，Ｃｙｃはシクロアルキル基であり，Ｒは低級アルキレン基である。
"置換シクロアルキルアルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているシクロアルキルアルキル基を表す。
"ヘテロアリールアルキル"および"ヘテロアラルキル"とは，基−Ｒ−ＨｅｔＡｒを表し，ここで，ＨｅｔＡｒは，ヘテロアリール基であり，Ｒは低級アルキレンである。
"置換ヘテロアリールアルキル"および"置換ヘテロアラルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているヘテロアリールアルキル基を表す。
式Ｉを参照して，上述の置換基を有しないコア構造は，"アザインドールコア"と称される。このアザインドールコアについて，環原子または環の位置に関しては，以下の構造：
に示されるとおりである。
式Ｉの化合物に関連する特定の態様においては，Ｒ1およびＲ5は水素である。特定の態様においては，式Ｉの化合物は，Ｒ2が水素以外であるか，Ｒ3が水素以外であるか，Ｒ4が水素以外であるか，Ｒ2およびＲ3が水素以外であるか；およびＲ2およびＲ4が水素以外である。ある態様においては，挙げられる置換が唯一の置換である；挙げられる置換は，Ｒ1およびＲ5がＨであるものと組み合わせられる；挙げられる置換は，式Ｉに示される置換位置の別の１つにおける置換と組み合わせられる。
１つの態様においては，本発明は，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法を提供し，この方法は，被験者に有効量の上述の式Ｉの化合物を投与することを含む。
さらに別の態様においては，治療の対象であるｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連するものである。
ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態の治療に関連する本発明のさらに別の態様においては，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達は，肥満細胞におけるものである。
ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態の治療に関連する本発明のさらに別の態様においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，肥満細胞症，喘息，慢性関節リウマチまたは慢性鼻炎である。
ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態の治療に関連する本発明のさらに別の態様においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，細胞増殖性疾患，線維性疾患，または代謝性疾患である。
さらに別の態様においては，細胞増殖性疾患は癌である。
さらに別の態様においては，癌は，白血病，肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，胃腸管の癌，中枢神経系の癌，女性生殖系の癌，神経外胚葉起源の肉腫，または神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成である。
ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態の治療に関連する本発明のさらに別の態様においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は多発性硬化症である。
特定の態様においては，式Ｉの化合物は，以下のサブジェネリック構造である式Ｉａ：
式Ｉａ
（式中，Ｒ2は式Ｉについて定義したとおりである）にしたがう構造を有する。式Ｉａの別の態様においては，Ｒ2は−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり，ここで，Ｘ1，Ｘ2，Ｘ3およびＸ4は，式Ｉにおいて定義したとおりである。
（式中，Ｒ2は式Ｉについて定義したとおりである）にしたがう構造を有する。式Ｉａの別の態様においては，Ｒ2は−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり，ここで，Ｘ1，Ｘ2，Ｘ3およびＸ4は，式Ｉにおいて定義したとおりである。
本発明の別の態様においては，式Ｉａを参照して，−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4が
であるとき，Ｒdは，Ｆ，Ｃｌ，ＣＨ3またはＣＦ3ではない。
さらに別の態様においては，Ｘ1は，メチレンおよび置換メチレンからなる群より選択される。
さらに別の態様においては，Ｘ1はジフルオロメチレンまたは−Ｃ（Ｏ）−であり，Ｘ2はフェニレンである。
さらに別の態様においては，Ｘ2は１または２個の窒素原子を含む。
さらに別の態様においては，Ｘ2は，ピリジンジイル，ピリミジンジイル，ピラジンジイル，またはピリダジンジイルである。
さらに別の態様においては，Ｘ2は
である。
さらに別の態様においては，Ｘ4は
である。
さらに別の態様においては，Ｘ3は
であり，ここで，
Ｒbは水素または低級アルキルであり；そして
Ｒcはメチレンまたは置換メチレンである。
Ｒbは水素または低級アルキルであり；そして
Ｒcはメチレンまたは置換メチレンである。
さらに別の態様においては，Ｘ3は−ＮＨＣＨ2−，または−ＮＨＣ（Ｏ）−であり，さらに，Ｘ2はヘテロアリールである。
さらに別の態様においては，Ｘ3は，
であり，Ｒbは水素または低級アルキルである。
さらに別の態様においては，Ｘ4は，
であり，ここで，
Ｒdは，それぞれの場合について，独立して，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，またはスルホニルアミノであり；そして
ｍは０−２の範囲である。
Ｒdは，それぞれの場合について，独立して，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，またはスルホニルアミノであり；そして
ｍは０−２の範囲である。
さらに別の態様においては，Ｘ4は，
であり，Ｃ2は，チエニル，置換チエニル，ピリジニル，ピリミジニル，ピラジニル，ピリダジニル，ピロリル，イミダゾリル，またはフラニルである。
さらに別の態様においては，Ｘ4は，アルキルまたは置換アルキルである。
さらに別の態様においては，本発明は，薬学的に許容しうる担体および式Ｉａの構造：
式Ｉａ
［式中，
Ｒ2はＸ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4；
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｏ−，−Ｓ−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，Ｒaは，水素，低級アルキル，および，フルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
からなる群より選択され，ここで，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
からなる群より選択され，ここで，
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内であり；
ただし，化合物は
ではなく，化合物は，
ではない］
を有する１またはそれ以上の化合物，またはその薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，または異性体を含む組成物を提供する。
［式中，
Ｒ2はＸ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4；
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｏ−，−Ｓ−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，Ｒaは，水素，低級アルキル，および，フルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内であり；
ただし，化合物は
を有する１またはそれ以上の化合物，またはその薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，または異性体を含む組成物を提供する。
さらに別の態様においては，本発明は上述の組成物を提供するが，ただし，Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4が
であるとき，Ｒdは，Ｆ，Ｃｌ，ＣＨ3，およびＣＦ3からなる群より選択されない。
さらに別の態様においては，本発明は，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法を提供し，この方法は，被験者に有効量の式Ｉの組成物を投与することを含む。
上述の組成物のさらに別の観点においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連する。
上述の組成物のさらに別の観点においては，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達は肥満細胞のものである。
上述の組成物のさらに別の観点においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，肥満細胞症，喘息，または慢性鼻炎である。
上述の組成物のさらに別の観点においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，細胞増殖性疾患，線維性疾患，または代謝性疾患である。
上述の組成物のさらに別の観点においては，細胞増殖性疾患は癌である。
上述の組成物のさらに別の観点においては，癌は，白血病，肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，胃腸管の癌，中枢神経系の癌，女性生殖系の癌，神経外胚葉起源の肉腫，または神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成である。
上述の組成物のさらに別の観点においては，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は多発性硬化症である。
上述の態様のいずれかに加えて，Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4およびＲ5が水素である場合，Ｒ2は
または
ではない。
本明細書に記載されるｃ−ｋｉｔ調節剤化合物に関して，化合物または化合物の群の特定は，明確にそうではないと示さないかぎり，そのような化合物の薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，およびすべての異性体を含む。
すなわち，１つの観点においては，本発明は，動物の被験者，例えば，ヒトなどの哺乳動物において，ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態，例えば，異常なｃ−Ｋｉｔ活性（例えばキナーゼ活性）により特徴づけられる疾病または状態を治療する方法を提供し，この方法は，被験者に式Ｉの化合物を投与することを含む。
本明細書において用いる場合，ｃ−ｋｉｔ媒介性疾病または状態との用語は，ｃ−Ｋｉｔの生物学的機能が疾病または状態の発達および／または経過に影響を与えるか，および／またはｃ−Ｋｉｔの調節がその発達，経過，および／または症状を変化させる疾病または状態を表す。
治療または予防することができる特定の疾病または疾患としては，本明細書の発明の詳細な説明および本明細書に引用される参考文献に記載されるものが含まれる。例示的疾病および状態としては，限定されないが，癌，喘息，関節炎，慢性鼻炎，多発性硬化症，ＧＩＳＴ，および肥満細胞症疾患が挙げられる。
関連する観点においては，式Ｉの化合物はｃ−Ｋｉｔ媒介性疾病または状態，例えば，癌，喘息，関節炎，慢性鼻炎，多発性硬化症，または本明細書に示される他の疾病の治療用の医薬品の製造において用いることができる。
別の観点においては，本発明は，本明細書に記載される式Ｉの化合物（例えば，有利なレベルの活性および／またはｃ−Ｋｉｔに対する選択性を有する化合物）を提供する。ある態様においては，化合物は，コア二環構造（アザインドールコア）の３位で，第１のアリールまたはヘテロアリール基に結合した第１のリンカー（これは第２のアリールまたはヘテロアリール基に結合している１−３原子のリンカーに結合している）を含む置換基で，この順番で置換されている。直前に説明した３位の置換基を含むある態様においては，第１のリンカーは，メチレン，エチレン，−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−，−Ｃ（Ｓ）−，−ＣＨ2−Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（Ｓ）ＣＨ2−，−Ｏ−，−Ｓ−，または−Ｓ（Ｏ2）−であり；第１のアリールまたはヘテロアリール基は，ピリジニル，ピリミジニル，ピラジニル，ピリダジニル，ピロリル，イミダゾリル，トリアゾリル，チアゾリル，フラニル，またはオキサゾリルであり；第２のリンカーは，メチルアミノ−（ＮＨ−ＣＨ2）−，エチルアミノ−（ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2）−，アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−），スルホンアミド（−ＮＨ−（ＳＯ2）−）ウレア（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−），チオウレア（−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−），またはスルホニルウレア（−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＨ−）であり；第２のアリールまたはヘテロアリール基は，フェニル，ピリジニル，ピリミジニル，ピラジニル，ピリダジニル，ピロリル，イミダゾリル，トリアゾリル，チアゾリル，フラニル，またはオキサゾリルであり；第２のアリールまたはヘテロアリール基は，低級アルキル基，メチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基，低級アルコキシ基，メトキシ基，エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基，ハロ置換低級アルキル，−ＣＨ2Ｆ，−ＣＨＦ2，−ＣＦ3，ハロ，Ｆ，Ｃｌで置換されている。別の特定の態様においては，３位の置換基は，第１のリンカー，第１のアリールまたはヘテロアリール基，第２のリンカー，第２のアリールまたはヘテロアリール基のそれぞれの特定の組み合わせであり，ここで，第２のアリールまたはヘテロアリール基は特定の置換基のそれぞれを有する。特定の態様においては，第２のアリールまたはヘテロアリール基は６員環であり；６員環は，パラ位で置換されており；６員環はメタ位で置換されており；６員環はオルト位で置換されており；６員環はメタ位およびパラ位で置換されている。特定の態様においては，第２のアリールまたはヘテロアリール基は５員環であり；５員環は第２のリンカーに結合した原子に隣接する位置で置換されており；５員環は第２のリンカーに結合した原子に隣接しない位置で置換されている。特定の態様においては，３位の置換基がアザインドールコア上の唯一の非水素置換基である。
特定の態様においては，化合物は，一般に受容されているキナーゼ活性アッセイにおいて判定して，１００ｎＭ未満，５０ｎＭ未満，２０ｎＭ未満，１０ｎＭ未満，５ｎＭ未満のＩＣ50を有する。ある態様においては，化合物の選択性は，化合物がｃ−Ｋｉｔに対してＲｅｔに対する活性より少なくとも２倍，５倍，１０倍，または１００倍活性が高い程度のものである。ある態様においては，化合物は，この段落において特定されるような，活性（例えばＩＣ50）と選択性とのそれぞれの組み合わせを有する。
本発明の別の観点は，治療上有効量の式Ｉの化合物（または一般式のいずれかの範囲に含まれる化合物のサブグループに属する化合物）および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体，賦形剤，および／または希釈剤を含む組成物に関する。この組成物は，複数の異なる薬学的に活性な化合物を含むことができ，これには式Ｉの複数の化合物が含まれる。
本明細書において用いる場合，"医薬組成物"との用語は少なくとも１つの活性な化合物および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む，意図される動物被験者に治療目的で投与するのに適した処方物を表す。
"薬学的に許容しうる"との用語は，示される物質が，合理的な慎重さを有する医療従事者が，治療すべき疾病または状態およびそれぞれの投与経路を考慮して，その物質を患者に投与することを避ける原因となる特性を有しないことを示す。例えば，そのような物質は，例えば注射用には本質的に無菌であることが一般に必要である。
本明細書の文脈においては，"治療上有効"および"有効量"との用語は，その物質および物質の量が，疾病または病的状態の１またはそれ以上の症状を予防，軽減または改善するのに有効であるか，および／または治療を受けている被験者の生存を長くするのに有効であることを示す。
関連する観点においては，本発明は，本明細書に記載される医薬組成物を含むキットを提供する。特定の態様においては，医薬組成物はバイアル，瓶，フラスコ等の容器に入っていてもよく，これはさらに，箱，封筒またはバッグ中に包装されていてもよい；医薬組成物は，米国食品医薬品局または同様の監督官庁により哺乳動物，例えばヒトへの投与について認可されたものである；医薬組成物はｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態用に哺乳動物，例えばヒトへの投与について認可されたものである；キットは，使用の説明書および／または組成物がｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態用に哺乳動物，例えばヒトへの投与に適しているかまたは認可されたものであることを示す他の指示書を含む；医薬組成物は単位投与量または１回投与の形態，例えば，１回投与量の丸薬，カプセルなどに包装されている。
疾病または状態の治療または予防に関連する本発明の観点においては，疾病または状態は，癌，喘息，関節炎，慢性鼻炎，多発性硬化症，肥満細胞症疾患，または他の疾病である。
ｃ−ｋｉｔに対する活性を有する式Ｉの化合物の同定はまた，ｃ−ｋｉｔに対する活性を有する式Ｉの複数の試験化合物のいずれかが，ｃ−ｋｉｔに対する活性を有する参照化合物と比較して１またはそれ以上の所望の薬理学的特性の改良を与えるか否かを判定し，もし存在すれば所望の薬理学的特性が改良されている化合物が存在すればこれを選択し，このことにより改良された調節剤を与えることにより，ｃ−ｋｉｔに対して活性な追加の化合物，例えば改良された調節剤を同定または開発する方法を提供する。
調節剤開発という特定の態様においては，所望の薬理学的特性は，２時間より長いか４時間より長いか８時間より長い血清半減期，水溶性，１０％より高い経口生物学的利用能，２０％より高い経口生物学的利用能である。
また，調節剤開発という特定の態様では，このプロセスは複数回，すなわち，複数ラウンドの誘導体の調製および／またはさらなる関連化合物の選択およびこのような関連化合物のさらなる誘導体の評価を，例えば，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０回またはそれよい多くのラウンドで反復してもよい。
別の観点においては，ｃ−Ｋｉｔに関する構造情報を，例えば，式Ｉの化合物または式Ｉの分子スキャフォールドまたはスキャフォールドコアと組み合わせて利用する。
本発明はまた，ｃ−Ｋｉｔに結合するリガンドを開発する方法を提供し，本方法は分子スキャフォールドとして，キナーゼの結合部位と結合する１種以上の式Ｉの化合物を同定すること，キナーゼとの共結晶中での少なくとも１種のそのような分子スキャフォールドの配向を決定すること，修飾されている場合には，分子スキャフォールドとキナーゼ間の結合親和性または結合特異性またはその双方を変更する，１種以上の分子スキャフォールドの化学構造を同定すること，および分子スキャフォールドの１種以上の化学構造が，変更された結合親和性または結合特異性またはその双方でキナーゼと結合するリガンドを提供するよう修飾されているリガンドを合成することを含む。
ヒトｃ−Ｋｉｔポリペプチド残基における特定のアミノ酸残基の番号を参照する場合，ＧｅｎＢａｎｋＮＰ＿０００２１３（配列番号１）のＫｉｔ配列に対応する番号付けにより規定される。ｃ−Ｋｉｔのすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列における特定のヌクレオチドの位置を参照する場合，ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿０００２２２（配列番号２）に与えられる配列に対応する番号付けにより規定される。
"Ｋｉｔ"，"ｃ−Ｋｉｔ"，および"ｃ−ｋｉｔ"との用語は，同じ長さのセグメントにわたって最大のアライメントをしたときに全長ｃ−Ｋｉｔ（例えば，ヒトｃ−Ｋｉｔ，例えば配列ＮＰ＿０００２１３）のＡＴＰ結合部位を含むアミノ酸残基と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含むか，または天然のｃ−Ｋｉｔの少なくとも２００個の連続するアミノ酸と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含み，かつキナーゼ活性を保持している，酵素的に活性なキナーゼを意味する。好ましくは，配列の同一性は少なくとも９５，９７，９８，９９，または１００％である。好ましくは，配列同一性の特定のレベルは，少なくとも３００個の連続するアミノ酸残基の長さの配列にわたるものである。特に示さない限り，この用語は，参照野生型ｃ−Ｋｉｔ，アレル変異体，および変異型（例えば，活性化変異を有するもの）を含む。
"ｃ−Ｋｉｔキナーゼドメイン"との用語は，ｃ−Ｋｉｔのキナーゼ触媒領域を含む，短い長さのｃ−Ｋｉｔ（すなわち，全長ｃ−Ｋｉｔより少なくとも５０，少なくとも１００，少なくとも１５０，または少なくとも２００アミノ酸少ない）を表す。本発明において用いるのに特に好ましくは，キナーゼドメインは，キナーゼ活性，好ましくは天然のｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性の少なくとも６０，７０，８０，９０，または１００％を保持している。
本明細書において用いる場合，"リガンド"および"調節剤"との用語は，同等に用いられて，標的生体分子，例えば，キナーゼ等の酵素の活性を変化（すなわち増加または減少）させる化合物を表す。一般に，リガンドまたは調節剤は小分子であろう。ここで，"小分子"とは，分子量１５００ダルトン以下，好ましくは１０００ダルトン以下，８００ダルトン以下，または６００ダルトン以下の化合物を表す。すなわち，"改良されたリガンド"とは，参照化合物より良好な薬理学的および／または薬物動態学的特性を有するものであり，ここで"良好な"とは，特定の生物系または治療的用途に関して定義することができる。スキャフォールドからのリガンドの開発という点では，リガンドはスキャフォールドの誘導体である。
結合化合物，分子スキャフォールドおよびリガンドの関連では，用語「誘導体」または「誘導化合物」とは，親または参照化合物と共通のコア化学構造を含むが，少なくとも１つの構造上の相違を有することによって，例えば１個以上の置換基が付加されている，かつ／または除去されている，かつ／または置換されていることで，ならびに／あるいは１個以上の原子が異なる原子で置換されていることで異なる化学構造を有する化合物を指す。明確に別に指示しない限りは，用語「誘導体」は，親化合物を出発物質として，または中間体として用いて合成された誘導体を意味しないが，誘導体が親から合成され得る場合もある。
したがって，用語「親化合物」とは，誘導化合物において維持されている構造上の特徴を有する，別の化合物にとっての参照化合物を指す。必ずしもそうではないが，親化合物が誘導体よりも単純な化学構造を有することが多い。
「化学構造」または「化学基礎構造」とは，分子の一部を構成する，いずれかの定義可能な原子または原子の群を意味する。通常，スキャフォールドまたはリガンドの化学基礎構造は，スキャフォールドまたはリガンドの標的分子との結合において役割を有し得るか，スキャフォールドまたはリガンドの三次元形状，帯電および／または配座特性に影響を及ぼし得る。
標的と，潜在的結合化合物間の相互作用に関連して，用語「結合する」とは，潜在的結合化合物が，標的と，一般的なタンパク質との会合（すなわち，非特異的結合）と比較して統計学的に有意な程度に会合することを示す。したがって，用語「結合化合物」とは，標的分子と統計学的に有意な会合を有する化合物を指す。結合化合物は特定の標的と１ｍＭ以下の解離定数（ｋd）で相互作用することが好ましい。結合化合物は，本明細書に記載されるような「低い親和性」，「極めて低い親和性」，「極端に低い親和性」，「中程度の親和性」，「中程度に高い親和性」または「高い親和性」で結合し得る。
標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い親和性」とは，化合物が参照化合物よりも，または参照条件における，すなわち，より低い解離定数での同一化合物よりも強固に結合することを示す。特定の実施形態では，より高い親和性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００，１０００または１０，０００倍高い親和性である。
また，生体分子標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い特異性」とは，化合物が，適切な結合条件下で存在し得る別の生体分子または複数の生体分子とよりも特定の標的とより高い程度で結合することを示し，ここでこのような他の生体分子との結合によって特定の標的との結合とは異なる生物活性が生じることを示す。通常，特異性はその他の生体分子の限定されたセット，例えば，ｃ−Ｋｉｔの場合には，その他のチロシンキナーゼまたはさらにその他の種類の酵素に対するものである。特定の実施形態では，より高い特異性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００または１０００倍高い特異性である。
化合物の標的との結合に関連して，用語「相互作用する」とは，結合している化合物から特定のアミノ酸残基までの距離が５．０オングストローム以下となることを示す。特定の実施形態では，化合物から特定のアミノ酸残基までの距離は４．５オングストローム以下，４．０オングストローム以下，または３．５オングストローム以下である。このような距離は，例えば，共結晶学を用いて求めることができ，または活性部位における化合物のコンピュータフィッティングを用いて推定することができる。
関連する観点においては，本発明は，ｃ−Ｋｉｔに特異的なリガンドを開発する方法を提供し，この方法は，複数のキナーゼに結合する式Ｉの化合物の誘導体が，この特定のキナーゼに対して，親化合物が他のキナーゼに対して有するより高い特異性を有するか否かを判定することを含む。
本明細書において，結合化合物またはリガンドに関連して使用されるとき，用語「ｃ−Ｋｉｔキナーゼに特異的」，「ｃ−Ｋｉｔに特異的」および同様の意味の用語は，特定の化合物がｃ−Ｋｉｔと，特定の生物中に存在し得るその他のキナーゼとよりも統計学的により高い程度に結合することを意味する。また，結合以外の生物活性が示される場合には，用語「ｃ−Ｋｉｔに特異的」とは，特定の化合物が他のチロシンキナーゼ，とよりもｃ−Ｋｉｔと結合することと関連して，高い生物学的効果，例えばキナーゼ活性阻害を有することを示す。特異性はまた，生物中に存在し得るその他の生体分子（キナーゼに限定されない）に関しても同様であることが好ましい。
もう１つの態様では，本発明は，ｃ−Ｋｉｔと結合する，改良リガンドを得る方法を提供する。この方法はその特定のキナーゼと結合する化合物を同定すること，その化合物が１個以上の保存された活性部位残基と相互作用するかどうかを調べること，およびその化合物の誘導体がそのキナーゼと，親の結合化合物よりも高い親和性でまたはより高い特異性でまたはその双方で結合するかどうかを調べることを含む。親化合物よりも高い親和性または高い特異性または双方での結合は，誘導体が改良リガンドであることを示す。また，このプロセスを，選択および誘導体化という連続ラウンドで，かつ／または複数の親化合物を用いて実施し，リガンド特性の改良された化合物または複数の化合物を提供することができる。同様に，誘導化合物を調べ，そのキナーゼに対して高選択性を示すよう，または標的の特定のセットに対して，例えばｃ−Ｋｉｔを含むキナーゼのサブセットに対して交差反応性を示すよう選択することができる。特定の実施形態では，既知のｃ−Ｋｉｔ阻害剤を使用でき，より高い親和性および／またはより高い特異性を有する誘導体を開発することができ，ｃ−Ｋｉｔ構造情報を用いて，他のチロシンキナーゼと比べ，ｃ−Ｋｉｔに対してより高い特異性が開発されることが好ましい。
「分子スキャフォールド」または「スキャフォールド」とは，共通構造要素を含む複数の分子を形成するよう，１以上のさらなる化学部分を共有結合，修飾，排除させることができる，簡単な標的結合分子を意味する。このような部分としては，それだけには限らないが，ハロゲン原子，ヒドロキシル基，メチル基，ニトロ基，カルボキシル基，またはそれだけには限らないが，本願に列挙されたものを含むいずれかのその他の種類の分子基が挙げられる。分子スキャフォールドは少なくとも１種の標的分子と，好ましくはタンパク質ファミリー中の複数の分子と結合し，標的分子は酵素，受容体またはその他のタンパク質であることが好ましい。スキャフォールドの好ましい特性としては，スキャフォールド上の１以上の置換基が標的分子結合部位中の結合ポケット中に位置するような標的分子結合部位での結合；特に合成反応によって化学修飾でき，その結果コンビナトリアルライブラリーを容易に構築できる，化学的に扱いやすい構造を有すること；スキャフォールドとタンパク質結合部位との結合を妨害しない部分を結合でき，その結果スキャフォールドまたはライブラリーメンバーを，リガンドを形成し，さらなる所望の特性を達成するよう修飾できる，例えばリガンドが細胞および／または指定の器官に活性に輸送されるようにできる，またはさらなる分析のためにリガンドがクロマトグラフィーカラムに結合されるようにできる，化学位置を有することを挙げることができる。したがって，分子スキャフォールドは，結合親和性および／または特異性，またはその他の薬理学的特性を改良するための修飾に先立って同定された標的結合分子である。
用語「スキャフォールドコア」とは，種々の置換基を結合できる，分子スキャフォールドのコア構造を指す。したがって，特定の化学的分類のいくつかのスキャフォールド分子については，スキャフォールドコアはすべてのスキャフォールド分子に共通している。多くの場合，スキャフォールドコアは１以上の環構造から構成されるかまたはこれを含むであろう。
「結合部位」とは，リガンドが非共有結合できる，標的分子の領域を意味する。結合部位は特定の形を具現しており，結合部位内に存在する複数の結合ポケットを含むことが多い。特定の形は分子の分類，例えば分子ファミリー内で保存されていることが多い。ある分類内の結合部位はまた，保存された構造，例えば，化学部分，結合ポケットの存在および／または結合部位または結合部位のある部分での帯電などを含む場合があり，そのすべてが結合部位の形に影響を及ぼし得る。
「結合ポケット」とは，結合部位内の具体的な容積を意味する。結合ポケットは，しばしば結合部位中の特定の形，窪み，または空洞であり得る。結合ポケットは，別の分子の非共有結合において重要である，特定の化学基または構造，例えば分子間のイオン性，水素結合またはファンデルワールス相互作用に寄与する基などを含み得る。
標的分子に結合している結合化合物に関連して「配向」とは，結合ポケットおよび／または少なくとも部分的に結合ポケットを決定づける標的分子の原子に対する，結合化合物（少なくともその構成原子のいくつかを参照して定義できる）の空間的関係を意味する。
本発明における標的分子の関連では，用語「結晶」とは，Ｘ線結晶学にとって適した種類の標的分子の規則正しい集合を指す。すなわち，Ｘ線のビームで照射されると，集合からＸ線回析パターンが生じる。したがって，結晶は，回析パターンを生じない標的分子の集塊またはその他の複合体とは区別される。
「共結晶」とは，標的分子と非共有結合しており，Ｘ線またはタンパク質結晶学による解析にとって適当な結晶形で存在している，化合物，分子スキャフォールドまたはリガンドの複合体を意味する。好ましい実施形態では，標的分子−リガンド複合体はタンパク質−リガンド複合体であり得る。
語句「結合親和性または結合特異性を変更する」とはそれぞれ，第１の化合物のもう１つのものに対する結合定数を変化させること，または第１の化合物の第２の化合物に対する結合レベルを，第１の化合物の第３の化合物に対する結合レベルと比較して変化させることを指す。例えば，特定のタンパク質に対する化合物の結合特異性は，その特定のタンパク質との結合の相対レベルが，化合物の無関係のタンパク質との結合と比較して増加する場合に増加する。
本明細書において試験化合物，結合化合物および調節剤（リガンド）に関連して，用語「合成すること」および同様の用語は，１種以上の前駆体物質からの化学合成を意味する。
語句「分子スキャフォールドの化学構造が修飾される」とは，誘導分子が，分子スキャフォールドのものとは異なるが依然として共通コア化学構造上の特徴を含む化学構造を有することを意味する。この語句は，誘導体の合成の前駆体として分子スキャフォールドが用いられることを必ずしも意味するわけではない。
「アッセイすること」とは，実験条件の作製および実験条件の特定の結果に関するデータの収集を意味する。例えば，酵素は，検出可能な基質に対して作用するその能力に基づいてアッセイできる。化合物またはリガンドは，特定の標的分子または複数の分子と結合するその能力に基づいてアッセイできる。
化合物の「セット」とは，化合物を集めたもの意味する。化合物は構造上関連があるものでも，ないものでもあり得る。
本明細書において用いる場合，"アザインドールスキャフォールド"またはアザインドールスキャフォールド構造"との用語は，式Ｉに示される構造を表す。同様に，"アザインドールコア"との用語は，上記に式Ｉとして示される構造であってＲ基を除く構造を表す。
本発明はさらに，ｃ−Ｋｉｔと式Ｉのｃ−Ｋｉｔ結合化合物の共結晶に関し，ｃ−Ｋｉｔは，短い長さのポリペプチド，例えばキナーゼドメインでありうる。このような共結晶は少なくとも３オングストローム，２．５オングストローム，２．０オングストローム，１．８オングストローム，１．７オングストローム，１．５オングストローム，１．４オングストローム，１．３オングストロームまたは１．２オングストロームのｃ−Ｋｉｔの構造決定を可能にするほど十分な大きさおよび質であることが有利である。共結晶は，例えばＸ線結晶学のためにマウントされた結晶学プレート中，および／またはＸ線ビーム中にあり得る。このような共結晶は，例えばｃ−Ｋｉｔと結合化合物間の相互作用に関する構造情報を得るために有益である。
結晶化条件はまず，スクリーニングキット，例えばハンプトン・リサーチ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（カリフォルニア州，リバーサイド）スクリーニングキット１を用いて同定できる。結晶をもたらす条件を選択し，結晶化条件を，実証された結晶化条件に基づいて最適化できる。その後の結晶学を補助するために，タンパク質をセレノ−メチオニン標識できる。また，前記で示したように，タンパク質は種々の型のいずれであってもよく，例えば触媒ドメインを提供する末端切断型であってよく，これは種々の長さであるよう選択できる。
別の観点においては，ｃ−ｋｉｔに対する活性を有する式Ｉの化合物（例えば本明細書に記載される方法を用いて開発される化合物）を提供することはまた，ｃ−Ｋｉｔを，式Ｉの化合物と接触させることによりｃ−Ｋｉｔ活性を調節する方法を提供する。化合物は，好ましくは，ｃ−Ｋｉｔの活性を少なくとも１０％，より好ましくは少なくとも２０％，３０％，４０％または５０％調節するのに十分なレベルで提供される。多くの態様においては，化合物は約１μＭ，１００μＭ，または１ｍＭ，または１−１００ｎＭ，１００−５００ｎＭ，５００−１０００ｎＭ，１−１００μＭ，１００−５００μＭ，または５００−１０００μＭの範囲内の濃度であろう。特定の態様においては，接触はインビトロで行う。
本明細書において用いる場合，用語「調節すること」または「調節する」とは，生物学的活性，特にｃ−Ｋｉｔ等の特定の生物分子に関連する生物学的活性を変更させる効果を表す。例えば，特定の生物分子のアゴニストまたはアンタゴニストは，その生物分子，例えば酵素の活性を調節する。
"ｃ−Ｋｉｔ活性"との用語は，ｃ−Ｋｉｔの生物学的活性を表し，特にキナーゼ活性を含む。
調節剤であるかまたは調節剤であり得る化合物の使用，試験またはスクリーニングの文脈においては，用語「接触させること」とは，化合物が特定の分子，複合体，細胞，組織，生物，または化合物とその他の特定の物質との間に結合相互作用および／または化学反応が生じる可能性があるように，その他の指定の物質に対して十分に近接させることを意味する。
ｃ−Ｋｉｔの共結晶が開発され分析されているため，別の観点は，ｃ−Ｋｉｔ（これは短い長さのｃ−Ｋｉｔであってもよく，通常はキナーゼドメインである）の電子表示に関し，例えば，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に１ＰＤＧとして，またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）に２３９３８として記載されるｃ−Ｋｉｔの座標に対応するｃ−Ｋｉｔの原子座標表示を含む電子表示を，ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ）を式Ｉの化合物で置き換えることにより改変したもの，または概略図，例えば，二次構造および／または鎖フォールディングを示し，保存された活性部位の残基をも示すことができるものに関する。
電子表示はまた，特定の残基の電子表示をその他の残基の電子表示と置き換えることによって修飾できる。したがって，例えば，上述したデータベースに示されるｃ−Ｋｉｔの座標に対応する原子座標表示を含む電子表示は，結合部位中の特定の保存された残基の座標を異なるアミノ酸と置き換えることによって修飾できる。修飾または複数の修飾の後，修飾または複数の修飾によって影響を受ける既知の相互作用を可能にするよう構造全体の表示を調節できる。ほとんどの場合，２以上の残基が関する修飾は反復法で実施される。
結合部位または触媒ドメインは，種々の方法で，例えば結合部位周辺の残基の原子座標の表示としておよび／または結合部位表面のでこぼことして表示でき，結合部位での特定の残基，例えば保存された残基の結合特性の表示を含み得る。
もう１つの態様では，ｃ−Ｋｉｔ構造情報により，ｃ−Ｋｉｔ構造を解析し，生物学的因子を形成する少なくとも１つの基礎構造を同定することによって，ｃ−Ｋｉｔに基づいて有用な生物学的因子を開発する方法を提供する。このような基礎構造としては，抗体形成のためのエピトープが挙げられ，方法としては，例えば，エピトープ提示組成物を哺乳類，例えば，ウサギ，モルモット，ギニアブタ，ブタ，ヤギまたはウマに注入することによるエピトープに対する抗体の開発が挙げられる。基礎構造としてはまた，ｃ−Ｋｉｔの活性を変更する突然変異が予想されるか，知られている突然変異部位が挙げられ，方法としては，その部位に突然変異を作製することが挙げられる。さらに，基礎構造としては，分離部分，例えばペプチド，ポリペプチド，固相物質（例えば，ビーズ，ゲル，クロマトグラフィー媒体，スライド，チップ，プレートおよびウェル表面），リンカーおよび標識（例えば，フルオロフォアなどの直接標識またはビオチンなどの間接標識またはその他の特異的結合対のメンバー）を付着するための付着点が挙げられる。方法としては，分離部分の付着が挙げられる。
もう１つの態様では，本発明は，化合物の少なくとも１つの電子表示を，ｃ−Ｋｉｔ結合部位の電子表示にフィッティングすることによる，潜在的ｃ−Ｋｉｔ結合化合物を同定する方法を提供する。結合部位の表示は，大きな部分の電子表示の一部またはｃ−Ｋｉｔ分子のすべてであってもよく，触媒ドメインのみの表示もしくは結合部位もしくは活性部位の表示であってもよい。電子表示は前記の通りであってもよく，別に本明細書に記載される通りであってもよい。
特定の実施形態では，本方法はコンピュータデータベースから得た化合物のコンピュータ表示を，キナーゼの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングすることを含み，キナーゼ分子と複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を除くこと，および潜在的結合化合物として好都合な幾何学的適合性およびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて活性部位と最良にフィッティングする化合物を同定することを含む。特定の実施形態では，化合物は既知のｃ−Ｋｉｔ阻害剤，例えば本明細書に引用された参照文献に記載されるものまたはその誘導体である。
その他の実施形態では，本方法は，１個以上の化学基の欠失または付加またはその双方によって，キナーゼ分子と複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を修飾すること，コンピュータデータベースから得た化合物のコンピュータ表示を，キナーゼ分子の活性部位のコンピュータ表示とフィッティングすること，および潜在的結合化合物として好都合な幾何学的適合性およびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて活性部位と最良にフィッティングする化合物を同定することを含む。
さらにその他の実施形態では，本方法は，キナーゼと複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を除くことおよび化合物検索コンピュータプログラムを用いてデータベースを複合化合物と構造類似性を有する化合物について検索すること，または化合物構造コンピュータプログラムを用いて複合体を形成している化合物の部分を同様の化学構造で置き換えることを含む。
化合物をフィッティングすることは，化合物がキナーゼの１個以上の保存された活性部位残基と相互作用するかどうかを調べることを含み得る。フィッティングのために選択された化合物またはキナーゼと複合体を形成している化合物は，例えば，既知のｃ−Ｋｉｔ阻害剤化合物，またはこのような化合物のコア構造を含む化合物であり得る。
もう１つの態様では，本発明は，ｃ−Ｋｉｔ結合化合物を付着成分と付着する方法ならびにｃ−Ｋｉｔ結合化合物上の付着部位を同定する方法を提供する。本方法は，ｃ−Ｋｉｔの結合部位に結合している結合化合物の付着成分の付着についてエネルギー的に許容される部位を同定すること，およびエネルギー的に許容される部位で化合物またはその誘導体を付着成分と付着させることを含む。
付着成分としては，例えば，固相または別の分子またはその他の部分との付着のためのリンカー（トレースレスリンカーを含む）が挙げられる。このような付着は，例えば，複数の化合物におけるコンビナトリアル合成において固相媒体に付着しているリンカー上に化合物または誘導体を合成することによって形成できる。同様に，固相媒体との付着によってアフィニティー媒体（例えば，アフィニティークロマトグラフィー用の）が提供され得る。
付着成分としてはまた，フルオロフォアなどの直接検出可能な標識，または特異的結合対のメンバー，例えばビオチンなどの間接的に検出可能なものであり得る標識が挙げられる。
関連態様では，ｃ−Ｋｉｔ結合化合物上のエネルギー的に許容される部位を同定する能力はまた，好ましくは，修飾された化合物とｃ−Ｋｉｔとの結合についてエネルギー的に許容される部位でリンカーが付着されている修飾された結合化合物を提供する。リンカーは前記の付着成分と付着できる。
本発明の別の観点は，修飾されたｃ−Ｋｉｔを別のチロシンキナーゼに対して天然ｃ−Ｋｉｔよりも類似性にする修飾を含む，またその他の突然変異またはその他の修飾も含み得る，修飾されたｃ−Ｋｉｔポリペプチドに関する。種々の実施形態では，ポリペプチドは全長ｃ−Ｋｉｔポリペプチドを含み，修飾されたｃ−Ｋｉｔ結合部位を含み，保存された部位を含む，ｃ−Ｋｉｔに由来する少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０または８０個の連続するアミノ酸残基を含む。
本発明はまた，ｃ−Ｋｉｔと結合し，および／またはその活性を調節する（例えば，阻害する）化合物，例えば，本明細書に記載される方法によって同定される化合物を提供する。したがって，ｃ−Ｋｉｔ結合化合物，分子スキャフォールドおよびリガンドまたは調節剤に関する態様および実施形態では，化合物は弱い結合化合物，中程度の結合化合物，強い結合化合物であり，化合物はキナーゼ中の１以上の保存された活性部位残基と相互作用し，化合物は小分子であり，化合物は複数の異なるキナーゼ（例えば，少なくとも２，３，４，５，７，１０またはそれより多くの異なるキナーゼ）と結合する。特に，本発明は，本明細書に記載される方法を用いて同定または選択される化合物または式Ｉの化合物に関する。
ｃ−Ｋｉｔ結合部位と結合化合物との組み合わせの原子座標が関連する上述の種々の観点においては，挙げられるデータベースにおいて提供される座標を用いることができる。次に，これらの座標を慣用のモデリング法を用いて，本明細書において同定される化合物とは異なる構造を有する化合物をフィットさせるよう調節することができ，したがって，これを現在記述されているｃ−Ｋｉｔ調節剤とは異なるｃ−Ｋｉｔ調節剤の開発に用いることができる。
本明細書においてアミノ酸または核酸配列に関連して用いる場合，"単離する"との用語は，配列が，これが通常付随しているアミノ酸および／または核酸配列の少なくとも一部から分離されていることを示す。
アミノ酸または核酸配列に関して，"精製した"との用語は，特定の分子が，組成物中の生体分子において，元の組成物，例えば細胞培養物におけるより有意に高い比率を占めることを示す。より高い比率は，２倍，５倍，１０倍またはそれ以上でありうる。
さらに別の観点および態様は，以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．一般
本発明は，ｃ−Ｋｉｔの阻害剤である式Ｉの化合物，およびｃ−Ｋｉｔの結合部位のモデル，構造情報，および関連する組成物を，ｃ−Ｋｉｔ活性を調節する構造を有する改良された化合物の開発に用いることを提供する。
Ｉ．一般
本発明は，ｃ−Ｋｉｔの阻害剤である式Ｉの化合物，およびｃ−Ｋｉｔの結合部位のモデル，構造情報，および関連する組成物を，ｃ−Ｋｉｔ活性を調節する構造を有する改良された化合物の開発に用いることを提供する。
表１は，ｃ−ｋｉｔに対して活性を有する式Ｉの一群の例示的化合物の構造および名称を示す。
表２は，式Ｉの追加の例示的化合物の説明を示す。
ｃ−ｋｉｔに対して活性な式Ｉの化合物の例は表１に示される。
式Ｉの別の例示的化合物は，表２において，式Ｉの以下のサブジェネリック構造中に存在する成分を記述することにより記載される。このサブジェネリック構造においては，Ｌ1はＣ1を二環コアにつなげる１−３個の連結原子を有する非環状リンカーであり（側鎖基または原子は数えない）；Ｃ1は環状基，好ましくはアリールまたはヘテロアリール基であり，Ｌ2は，Ｃ1とＣ2をつなげる１−４個の連結原子を有する非環状リンカーであり（側鎖基または原子は数えない）；ＺpはＣ2上のｐ個の非水素置換基であり，ここで，ｐは０−４であり，各Ｚは同じであっても異なっていてもよい。
表２において，Ｃ2が５員環の場合，Ｚ置換基の特定の次の括弧内の数字は，置換基の環位置を示し，ここで，Ｌ2に結合している原子は番号１であり，置換基の複素原子に対する結合が化学的に合理的でない位置における置換を除き，原子は環の周りに連続的に番号づけられている。
表２において，Ｃ2が６員環の場合，置換基の位置は，Ｌ2への結合に関して，フェニル基におけるものと類似の方式で，パラ，メタ，およびオルトの用語を用いて示されている。ただし，複素原子への置換基の結合が化学的に合理的でない場合の位置における置換を除く。
また，さらに別の態様は，化合物を参照して表２に記載される。表２に示されるＬ1，Ｃ1，Ｌ2，およびＣ2のそれぞれの組み合わせはまた，Ｃ2上の種々の置換基および／または成分Ｌ1，Ｃ1，およびＬ2の１またはそれ以上における置換基を含むことができる化合物群の狭い一般的記述を特定する。好ましくは，そのような置換基はそれぞれ，７個以下の非水素原子を含む。
同様に，Ｌ1，Ｃ1，Ｌ2，およびＣ2のそれぞれの組み合わせについて，二環コアも式Ｉについて特定されるように４位，５位，または４位と５位の両方で置換基で置換されている，狭い一般的化合物の記述の別の態様が提供される。さらに別の態様においては，４位および／または５位における置換は，先の段落に記載される置換基と組み合わせられる。
ｃ−Ｋｉｔに関連する疾病の例
本明細書に記載される化合物は，ｃ−Ｋｉｔに関連する疾患，例えば，特に細胞増殖性疾患，線維性疾患および代謝性疾患等の，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連する疾患の治療に有用である。以下におよびＬｉｐｓｏｎら，米国特許２００４０００２５３４（米国特許出願１０／６００，８６８，２００３年６月２３日出願，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により詳細に説明されるように，本発明により治療することができる細胞増殖性疾患としては，癌および肥満細胞増殖性疾患が挙げられる。
本明細書に記載される化合物は，ｃ−Ｋｉｔに関連する疾患，例えば，特に細胞増殖性疾患，線維性疾患および代謝性疾患等の，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連する疾患の治療に有用である。以下におよびＬｉｐｓｏｎら，米国特許２００４０００２５３４（米国特許出願１０／６００，８６８，２００３年６月２３日出願，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により詳細に説明されるように，本発明により治療することができる細胞増殖性疾患としては，癌および肥満細胞増殖性疾患が挙げられる。
以下に説明するように，ｃ−ｋｉｔの存在は，多数の異なるタイプの癌と関連づけられている。さらに，ｃ−ｋｉｔの異常と疾病との関連性は癌に限られない。例えば，これも以下により詳細に説明するが，ｃ−ｋｉｔは，肥満細胞症，喘息，多発性硬化症，炎症性腸症候群およびアレルギー性鼻炎等の炎症性疾病と関連づけられている。
ｃ−Ｋｉｔに関連する悪性疾病の例
ｃ−Ｋｉｔの異常な発現および／または活性化は，種々の癌における関与が示唆されている。新生物の病因においてｃ−Ｋｉｔが寄与するという証拠としては，白血病および肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，および胃腸管および中枢神経系のある種の癌における関与が含まれる。さらに，ｃ−Ｋｉｔは，女性生殖系の発癌（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３０４９−３０５３），神経外胚葉起源の肉腫（Ｒｉｃｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：２３９７−２４０５），および神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成（Ｒｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．３７：４１５−４３２）において役割を果たすことが示唆されている。肥満細胞は，腫瘍微小環境の調節および腫瘍成長の促進に関与することが見いだされている（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１８５１−１８６１；Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１７９１−１７９３）。すなわち，ｃ−Ｋｉｔは，神経線維腫症ならびに悪性腫瘍の治療における有用な標的である。
ｃ−Ｋｉｔの異常な発現および／または活性化は，種々の癌における関与が示唆されている。新生物の病因においてｃ−Ｋｉｔが寄与するという証拠としては，白血病および肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，および胃腸管および中枢神経系のある種の癌における関与が含まれる。さらに，ｃ−Ｋｉｔは，女性生殖系の発癌（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３０４９−３０５３），神経外胚葉起源の肉腫（Ｒｉｃｏｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：２３９７−２４０５），および神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成（Ｒｙａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．３７：４１５−４３２）において役割を果たすことが示唆されている。肥満細胞は，腫瘍微小環境の調節および腫瘍成長の促進に関与することが見いだされている（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１８５１−１８６１；Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：１７９１−１７９３）。すなわち，ｃ−Ｋｉｔは，神経線維腫症ならびに悪性腫瘍の治療における有用な標的である。
小細胞肺癌：ｃ−Ｋｉｔキナーゼレセプターは，小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞の多くの症例で異常に発現されていることが見いだされている（Ｈｉｂｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：２２９１−２２９６）。したがって，一例として，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，ＳＣＬＣの治療において，例えば，ＳＣＬＣを有する患者の長期生存を改善するのに，有用でありうる。
白血病：ＳＣＦのｃ−Ｋｉｔへの結合は，造血幹細胞および前駆細胞をアポトーシスから保護し（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２１１−３２１９），このことによりコロニー形成および造血に寄与する。ｃ−Ｋｉｔの発現は，急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）およびある種の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）においてしばしば観察される（総説としては，Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈａｅｍａｔ ８２：６１７−６２１；Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈ．３０：４５９−４６６を参照）。ｃ−Ｋｉｔは大部分のＡＭＬ細胞において発現されているが，その発現は疾病の進行の予後兆候ではないようである（Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｈａｅｍａｔ８２：６１７−６２１）。しかし，ＳＣＦは化学療法剤により誘導されるアポトーシスからＡＭＬ細胞を保護する（Ｈａｓｓａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｃｔａ．Ｈｅｍ．９５：２５７−２６２）。本発明によるｃ−Ｋｉｔの阻害は，これらの薬剤の有効性を高めて，ＡＭＬ細胞のアポトーシスを誘導しうるであろう。
脊髄形成異常症候群（Ｓａｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８：３１９−３２７）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｓａｗａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍ．１９９６，２：１１６−１２２）を有する患者からの細胞のクローン成長は，ＳＣＦと他のサイトカインとの組み合わせによって有意に増強されることが見いだされた。ＣＭＬは，骨髄のフィラデルフィア染色体陽性細胞の拡大により特徴づけられ（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．１９９８，１２：１３６−１３８），これは主としてアポトーシス死の阻害の結果であるようである（Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃ．１９９７，９：３−７）。フィラデルフィア染色体の産物であるｐ２１０BCR-ABLは，アポトーシスの阻害を媒介することが報告されている（Ｂｅｄｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９５，８６：１１４８−１１５８）。ｐ２１０BCR-ABLおよびｃ−ＫｉｔＲＴＫは両方ともアポトーシスを阻害し，ｐ６２dokが基質として示唆されているため（Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９７，８８：１９７−２０４），これらのキナーゼにより媒介されるクローン増殖は共通のシグナリング経路を通って生ずるのかもしれない。しかし，ｃ−Ｋｉｔはまた，ｐ２１０BCR-ABLと直接相互作用することが報告されており（Ｈａｌｌｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ Ｈａｅｍ．１９９６，９４：５−１６），このことは，ｃ−ＫｉｔがＣＭＬの病因における原因としてより大きな役割を有することを示唆する。したがって，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，上述の疾患の治療において有用であろう。
胃腸癌：正常な結腸直腸粘膜はｃ−Ｋｉｔを発現しない（Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。しかし，ｃ−Ｋｉｔは，結腸直腸癌でしばしば発現されており（Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１），ＳＣＦとｃ−Ｋｉｔとのオートクリンループがいくつかの結腸癌細胞株で認められている（Ｔｏｙｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＴｕｒｎＢｉｏｌ１４：２９５−３０２；Ｌａｈｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ ６：１１１１−１１１８；Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。さらに，中和抗体を用いるオートクリンループの破壊（Ｌａｈｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ．６：１１１１−１１１８），およびｃ−Ｋｉｔおよび／またはＳＣＦのダウンレギュレーションは，細胞増殖を有意に阻害する（Ｌａｈｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ ６：１１１１−１１１８；Ｂｅｌｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７２：１−１１）。
ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔオートクリンループは胃癌細胞株において認められており（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｌｏｏｄ ８０：３７４−３８１；Ｈａｓｓａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｄｉｇｅｓｔ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ４３：８−１４），構成的ｃ−Ｋｉｔ活性化はまた，胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）にとっても重要であるようである。ＧＩＳＴは消化系の最も一般的な間葉腫瘍である。ＧＩＳＴの９０％以上がｃ−Ｋｉｔを発現しており，このことは，これらの腫瘍細胞の起源がカハルの腸細胞（ＩＣＣ）であると推定されていることと一致する（Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：５７７−５８０）。ＩＣＣは，胃腸管の収縮を制御すると考えられており，ＩＣＣ中にｃ−Ｋｉｔを欠失した患者は，筋障害性型の慢性特発性腸偽閉塞を示す（Ｉｓｏｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｇａｓｔ．９：３３２−３３４）。異なる何名かの患者からのＧＩＳＴにおいて発現されているｃ−Ｋｉｔは，細胞内膜近傍ドメインに変異を有し，このＲＴＫの構成的活性化につながることが観察されている（Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：５７７−５８０）。したがって，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの癌の治療の有効な手段でありうる。
精巣癌：雄生殖細胞腫瘍は，組織学的にセミノーマ（生殖細胞特性を保持している），および非セミノーマ（胚性分化の特定を示すことができる）に分類されている。セミノーマおよび非セミノーマの両方とも，上皮内癌（ＣＩＳ）と称される前侵襲段階から始まると考えられている（Ｍｕｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｅｍ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１３３−１４４）。ｃ−ＫｉｔおよびＳＣＦの両方とも，胚形成の間の正常な性腺発生に必須であることが報告されている（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５３：３３７−３４４）。レセプターまたはリガンドのいずれの欠失も，生殖細胞を欠失した動物を生ずる。出生後試験においては，ｃ−Ｋｉｔはライディヒ細胞および精原細胞で発現されており，一方ＳＣＦはセルトーリ細胞で発現されていることが見いだされている（Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５３：３３７−３４４）。ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）Ｅ６およびＥ７オンコジンを発現するトランスジェニックマウスにおいて，ライディヒ細胞から高い頻度で精巣腫瘍が発生する（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３３３５−３３３９；Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：２１５１−２１５４）。これらの腫瘍は，ｃ−ＫｉｔおよびＳＣＦの両方を発現しており，Ｅ６およびＥ７と関連した，機能性ｐ５３および網膜芽細胞腫遺伝子産物の細胞の喪失を伴うオートクリンループが腫瘍発生に寄与しているかもしれない（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：３４１−３４７）（Ｄｙｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：９３４−９３７；Ｗｅｒｎｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：７６−７９；Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ ６３：１１２９−１１３６）。ＳＣＦ（Ｋｏｎｄｏｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：３４１−３４７）またはｃ−Ｋｉｔ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６：４３４３−４３４６）の欠陥シグナリング変異体は，ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７を発現するマウスにおいて精巣腫瘍の形成を阻害した。これらの動物においては，ｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性化は腫瘍形成において極めて重要であり，したがって，本発明によるｃ−Ｋｉｔキナーゼ経路の調節により，そのような疾患は予防または治療されるであろう。
生殖細胞腫瘍におけるｃ−Ｋｉｔの発現は，レセプターは，癌腫の大部分でインシトゥーおよびセミノーマで発現されているが，ｃ−Ｋｉｔは非セミノーマのわずかのものでのみ発現されていることを示す（Ｓｔｒｏｈｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５１：１８１１−１８１６；Ｒａｊｐｅｒｔ−ｄｅＭｅｙｔｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１７：８５−９２；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：２５３−２５８；Ｓｔｒｏｈｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５３：５１１−５１５；Ｂｏｋｅｎｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２：３０１−３０６；Ｓａｎｄｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１７：４０３−４０８）。したがって，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの疾患を治療する手段を提供する。
ＣＮＳ癌：ＳＣＦおよびｃ−Ｋｉｔは，発生中の齧歯類のＣＮＳに広く発現しており，発現のパターンは神経外胚葉細胞の成長，移動および分化における役割を示す。レセプターとリガンドとの両方の発現はまた，成人脳でも報告されている（Ｈａｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃ．３５：３２７−３３３）。ｃ−Ｋｉｔの発現はまた，正常ヒト脳組織においても認められている（Ｔａｄａ，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ８０：１０６３−１０７３）。頭蓋内腫瘍の大部分を占める神経膠芽細胞腫および星状細胞腫は，星状細胞の新生物性形質転換から生ずる（Ｌｅｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：２０２２−２０８２）。ｃ−Ｋｉｔの発現は，神経膠芽細胞腫の細胞株および組織においても認められている（Ｂｅｒｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５２：３４９８−３５０２；Ｔａｄａ，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ８０：１０６３−１０７３；Ｓｔａｎｕｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｃｔ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ ８９：１５８−１６５）。
Ｃｏｈｅｎら（１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８４：３４６５−３４７２）は，試験した１４種類の神経芽細胞腫細胞株すべてがｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦオートクリンループを含み，調べた腫瘍サンプルの４５％でレセプターとリガンドとの両方の発現が認められたことを報告している。２つの細胞株では，抗−ｃ−Ｋｉｔ抗体は細胞増殖を阻害し，このことは，ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔオートクリンループが成長に寄与していることを示唆する（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８４：３４６５−３４７２）。したがって，ｃ−Ｋｉｔキナーゼ阻害剤は，これらの癌の治療に用いることができる。
ｃ−Ｋｉｔが関与する肥満細胞疾病の例
ｃ−Ｋｉｔの過度の活性化は，過剰量の肥満細胞から生ずる疾病とも関連づけられている。肥満細胞症とは，過剰な肥満細胞増殖により特徴づけられる異なる疾患群を記述する用語である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，１９９１，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ ９３：２Ｓ−４Ｓ；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１３７９−１３８５）。急速進行性肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞においてｃ−Ｋｉｔ発現の上昇が報告されている（Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：１７５−１８１）。
ｃ−Ｋｉｔの過度の活性化は，過剰量の肥満細胞から生ずる疾病とも関連づけられている。肥満細胞症とは，過剰な肥満細胞増殖により特徴づけられる異なる疾患群を記述する用語である（Ｍｅｔｃａｌｆｅ，１９９１，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ ９３：２Ｓ−４Ｓ；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１３７９−１３８５）。急速進行性肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞においてｃ−Ｋｉｔ発現の上昇が報告されている（Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：１７５−１８１）。
さらに，肥満細胞および好酸球は，アレルギー，炎症および喘息に関与する鍵となる細胞である（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２７：５９３−５９７；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ７７：１０３３−１０７９；Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ ２７８：１８４２−１８４８；Ｃｏｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ ２７８：１８１５−１８２２）。ＳＣＦ，したがってｃ−Ｋｉｔは，直接または間接的に肥満細胞および好酸球の両方の活性化を制御し，このことにより，複数のメカニズムによってアレルギーおよび喘息に関与する主要な細胞に影響を与えている。この肥満細胞と好酸球の機能の相互制御のため，およびＳＣＦがこの制御において果たしうる役割のため，ｃ−Ｋｉｔの阻害は，アレルギーに関連する慢性鼻炎，炎症および喘息の治療に用いることができる。
肥満細胞症：ＳＣＦ（肥満細胞成長因子としても知られる）によるｃ−Ｋｉｔの刺激は，肥満細胞の成長および発生に必須であることが報告されている（Ｈａｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃ．３５：３２７−３３３；Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：５４−５６）。そのシグナリング活性を弱めるｃ−Ｋｉｔの変異を有するマウスは，その皮膚において有意に少ない肥満細胞を示した（Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，１９９６，Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ４６：９３３−９３８）。ｃ−Ｋｉｔの過剰な活性化は，過剰に多い肥満細胞に起因する疾病と関連する可能性がある。
肥満細胞症は，大部分の患者では皮膚に限定されているが，１５−２０％の患者では他の臓器も関与しうる（Ｖａｌｅｎｔ，１９９６，Ｗｅｉｎ／Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １０８：３８５−３９７；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１３７９−１３８５）。全身肥満細胞症を有する患者の間でも，この疾病は，比較的良性の予後を有するものから，急速進行性肥満細胞症および肥満細胞白血病まで，様々でありうる（Ｖａｌｅｎｔ，１９９６，Ｗｅｉｎ／Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １０８：３８５−３９７；Ｇｏｌｋａｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｎｃｅｔ ３４９：１３７９−１３８５）。ｃ−Ｋｉｔは，イヌ肥満細胞腫瘍からの悪性肥満細胞（Ｌｏｎｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｏｍｐａｒ．Ｐａｔｈｏｌ．１１５：３９９−４１４），ならびに急速進行性全身肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞（Ｃａｓｔｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｌｌｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：８３１−８４０）で観察されている。
ＳＣＦは，間質細胞上で膜結合タンパク質として発現されることが示されており，その発現は，線維形成性成長因子，例えば，ＰＤＧＦにより誘導することができる。これはまた，正常な皮膚においてケラチノサイト上で膜結合タンパク質として発現されることが示されている。しかし，肥満細胞症を有する患者の皮膚においては，増加した量の可溶性ＳＣＦが認められている（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１３０２−１３０７）。
肥満細胞キマーゼは，膜結合ＳＣＦを切断して可溶性の生物学的に活性な型にすることが報告されている。この肥満細胞媒介性プロセスは，肥満細胞の増殖および機能を増強するフィードバックループを生成することができ（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９０１７−９０２１），肥満細胞症の病因にとって重要であるかもしれない。ケラチノサイトからタンパク質分解的に放出されることができないある型のＳＣＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは，肥満細胞症を発症しないが，一方，ケラチノサイトにおいて正常ＳＣＦを発現する同様の動物はヒト皮膚肥満細胞症に似た表現型を示す（Ｋｕｎｉｓａｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１５６５−１５７３）。ある患者においては，大量の可溶性ＳＣＦの形成が肥満細胞症に伴う病因に寄与する可能性があり，本発明は，ＳＣＦとｃ−Ｋｉｔキナーゼとの間の相互作用を調節することにより，そのような疾患を治療または予防することができる。構成的キナーゼ活性をもたらすｃ−ＫｉｔＲＴＫのいくつかの異なる変異がヒトおよび齧歯類肥満細胞腫瘍細胞株で見いだされている（Ｆｕｒｉｔｓｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１７３６−１７４４；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ９：２６１９−２６２６；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１０６：３７７−３８５；Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，１９９６，Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ４６：９３３−９３８）。さらに，ｃ−Ｋｉｔ遺伝子の活性化変異は，肥満細胞症およびこれに伴う血液疾患を有する患者から単離された末梢単核細胞（Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｌｅｕｋ１２：１７５−１８１），および色素性じんま疹および急速進行性肥満細胞症を有する患者からの肥満細胞（Ｌｏｎｇｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．１２：３１２−３１４）においても観察されている。したがって，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，これらの疾患の治療において優れた治療上の役割を有すると考えられる。
ある患者においては，ｃ−ＫｉｔＲＴＫの活性化変異は，疾病の発病の原因であるかもしれず，ＳＣＦとｃ−Ｋｉｔキナーゼとの相互作用の調節により，これらの患者を治療することができるか，またはこのような疾病を予防することができる。ｃ−ＫｉｔのＳＣＦ活性化は肥満細胞アポトーシスを防止することが示されており，これは皮膚肥満細胞ホメオスタシスの維持に重要でありうる（Ｉｅｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４４：３２１−３２８；Ｙｅｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１７７７−１７８７；Ｍｅｋｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：２１９４−２２０３；Ｍｅｋｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１３７−１３８）。肥満細胞アポトーシスの阻害は，肥満細胞症に伴う肥満細胞の蓄積につながりうる。すなわち，レセプターの過剰発現，可溶型ＳＣＦの過剰な形成，またはそのキナーゼを構成的に活性化するｃ−Ｋｉｔ遺伝子の変異によりｃ−Ｋｉｔ活性化が生ずるという観察は，ｃ−Ｋｉｔのキナーゼ活性の阻害が肥満細胞の数を減少させ，肥満細胞症を有する患者に利益を与えるであろうという理論的根拠を提供する。
活性化ｃ−Ｋｉｔ変異を有する細胞については，ｃ−Ｋｉｔの阻害剤が細胞を阻害し，殺しさえすること（Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：３９２−３９４），特に調節領域における変異（Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ ９９：１７４１−１７４４）が見いだされている。Ｍａら（２００２）はまた，触媒領域における変異に関して，別のタイプのｃ−Ｋｉｔ阻害剤が有用であるが，阻害剤ＳＴＩ５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ）およびＳＵ９５２９は細胞を阻害しないことを示した。すなわち，ｃ−Ｋｉｔ阻害剤は，野生型ｃ−Ｋｉｔならびに変異，例えば，制御領域および／または触媒領域における活性化変異を有するｃ−Ｋｉｔの両方に対して用いることができる。
喘息およびアレルギー：肥満細胞および好酸球は，寄生虫感染，アレルギー，炎症，および喘息において鍵となる細胞である（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２７：５９３−５９７；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ７７：１０３３−１０７９；Ｈｏｌｇａｔｅ，１９９７，ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．；Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔ ａｌ，１９９７，ＪＡＭＡ ２７８：１８４２−１８４８；Ｃｏｓｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ ７７８：１８１５−１８２２）。ＳＣＦは，肥満細胞の発生，生存および成長に必須であることが示されている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：５４−５６；Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ７７：１０３３−１０７９）。さらに，ＳＣＦは，好酸球特異的レギュレータであるＩＬ−５と協調して，好酸球前駆細胞の発生を増加させる（Ｍｅｔｃａｌｆ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９５：６４０８−６４１２）。また，ＳＣＦは，肥満細胞を誘導して，好酸球の生存を刺激する（Ｋａｙ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１９６−１９９）因子を分泌されることが報告されている（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５）。これは，慢性の好酸球媒介性炎症に寄与するかもしれない（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５）。この点に関して，ＳＣＦは，肥満細胞および好酸球の両方の活性化を直接にまたは間接的に制御する。
ＳＣＦは，肥満細胞からのメディエータの放出を誘導し，ならびに，これらの細胞をＩｇＥ誘導性脱顆粒に向けてプライミングし（Ｃｏｌｕｍｂｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：５９９−６０２），好酸球由来顆粒球主要塩基性タンパク質に対するこれらの反応性を増感させる（Ｆｕｒｕｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：１０５５−１０６１）。活性化肥満細胞により放出される因子としては，ＩＬ−５，ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αが挙げられ，これらは好酸球タンパク質分泌に影響を及ぼす（Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：７５−７７；Ｏｋａｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：７０８−７１５）。肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導すること（Ｌｕｃｋａｃｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３９４５−３９５１；Ｈｏｇａｂｏａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１６６−６１７１）に加えて，ＳＣＦは，肥満細胞による好酸球走化性因子であるエオタキシンの産生（Ｈｏｇａｂｏａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１６６−６１７１），および好酸球浸潤（Ｌｕｃｋａｃｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３９４５−３９５１）を刺激する。
ＳＣＦはまた，肥満細胞（Ｄａｓｔｙｃｈ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２１３−２１９；Ｋｉｎａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１０３３−１０３８），および好酸球（Ｙｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：３１３−３２３）の両方の接着に直接影響を及ぼし，これは次に，組織浸潤を制御する。すなわち，ＳＣＦは，複数のメカニズムによりアレルギーおよび喘息に関与する主要な細胞に影響を及ぼすことができる。現在，コルチコステロイドがアレルギーに伴う慢性鼻炎および炎症の最も有効な治療法である（Ｎａｃｌｅｒｉｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＡＭＡ ２７８：１８４２−１８４８；Ｍｅｌｔｚｅｒ，１９９７，Ａｌｌｅｒ．５２：３３−４０）。これらの薬剤は，循環および浸潤肥満細胞および好酸球の減少，およびサイトカイン産生の阻害に伴う好酸球の生存の減少などの複数のメカニズムにより作用する（Ｍｅｌｔｚｅｒ，１９９７，Ａｌｌｅｒ．５２：３３−４０）。ステロイドは，線維芽細胞および内在結合組織細胞によるＳＣＦの発現を阻害し，これが肥満細胞生存の減少につながると報告されている（Ｆｉｎｏｔｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７２１−１７２８）。肥満細胞および好酸球の機能の相互制御，およびＳＣＦがこの制御に対して果たしうる役割のため，ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害は，アレルギーに関連する慢性鼻炎，炎症および喘息を治療する手段を提供する。
炎症性関節炎（例えば，慢性関節リウマチ）：肥満細胞の関節炎プロセスとの関連性のため（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１６８９−１６９２），ｃ−Ｋｉｔは，炎症性関節炎，例えば慢性関節リウマチの予防，遅延，および／または治療の有用な標的を提供する。
多発性硬化症：肥満細胞は，多発性硬化症（ＭＳ）のマウスモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において示されるように，自己免疫疾病において広範囲の役割を果たすことが示されている。肥満細胞は，疾病の完全な明示に必要であることが示されている（Ｓｅｃｏｒ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１：８１３−８２１）。したがって，ｃ−Ｋｉｔはまた，多発性硬化症の予防，遅延，および／または治療の有用な標的を提供する。
したがって，ｃ−Ｋｉｔ機能の調節剤は，上述したような疾病に対して使用することができる。
ＩＩ． ｃ−Ｋｉｔの構造
ｃ−Ｋｉｔと結合化合物ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ）との結晶構造が報告されており，この構造の原子座標は，ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に１ＰＫＧとして，およびｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに２３９３８として寄託されている。ＳＴＩ−５７１を別の化合物で置き換えることにより，そのような構造を種々の化合物の結合のモデリングに用いることができる。例えば，慣用の分子モデリングソフトウエアを用いて，ＳＴＩ−５７１の座標を除き，別の化合物の座標で置き換えることができる。置換化合物の結合を反映するよう構造を調節する。
ｃ−Ｋｉｔと結合化合物ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ）との結晶構造が報告されており，この構造の原子座標は，ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に１ＰＫＧとして，およびｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに２３９３８として寄託されている。ＳＴＩ−５７１を別の化合物で置き換えることにより，そのような構造を種々の化合物の結合のモデリングに用いることができる。例えば，慣用の分子モデリングソフトウエアを用いて，ＳＴＩ−５７１の座標を除き，別の化合物の座標で置き換えることができる。置換化合物の結合を反映するよう構造を調節する。
報告されている構造と同様に，ｃ−Ｋｉｔと式Ｉの化合物との共結晶を形成し，分析して共結晶構造を得ることができる。
本発明の結晶性キナーゼおよびキナーゼドメインは天然に存在するかまたは天然のキナーゼに限定されるものではないということは理解されなくてはならない。実際，本発明の結晶は，天然キナーゼの突然変異体の結晶を含む。天然キナーゼの突然変異体は，天然キナーゼ中の少なくとも１個のアミノ酸残基を，異なるアミノ酸残基で置き換えることによって，または天然ポリペプチド内のもしくは天然ポリペプチドのＮもしくはＣ末端でアミノ酸残基を付加もしくは欠失することによって得られ，突然変異体が由来する天然キナーゼと実質的に同じ三次元構造を有する。
実質的に同じ三次元構造を有することとは，天然キナーゼドメインの少なくとも約５０％〜１００％のＣα原子がスーパーポジション中に含まれる場合に，突然変異体が由来する天然キナーゼの原子構造座標とともにスーパーインポーズすると，二乗平均平方根偏差が約２Å以下である原子構造座標のセットを有することを意味する。
キナーゼの三次元構造を大きく妨害しないアミノ酸置換，欠失および付加は，幾分かは，置換，付加または欠失が生じるキナーゼの領域に応じて変わる。分子の高度に可変性の領域では，分子の三次元構造を大きく破壊することなく非保存的置換ならびに保存的置換が許容され得る。高度に保存された領域または重大な二次構造を含む領域では，保存的アミノ酸置換が好ましい。このような保存された領域および可変領域は，ｃ−Ｋｉｔと，その他のキナーゼとの配列アラインメントによって同定できる。
保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られており，関連するアミノ酸残基の極性，電荷，可溶性，疎水性，親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われる置換が挙げられる。例えば，負に帯電したアミノ酸としては，アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられ，正に帯電したアミノ酸としては，リシンとアルギニンが挙げられ，同様の親水性値を有する帯電していない極性頭部を含むアミノ酸としては，以下のものが挙げられる：ロイシン，イソロイシン，バリン；グリシン，アラニン；アスパラギン，グルタミン；セリン，トレオニン；フェニルアラニン，チロシン。その他の保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られている。
化学合成によって全体としてまたは一部分として得られるｃ−Ｋｉｔについては，置換または付加に利用できるアミノ酸の選択は，遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。実際，本明細書に記載される突然変異体は，遺伝的にコードされないアミノ酸を含んでいてもよい。一般的に知られている遺伝的にコードされないアミノ酸の多数の保存的アミノ酸置換は，当技術分野ではよく知られている。その他のアミノ酸の保存的置換は，遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比較した，それらの物理的特性に基づいて決定できる。
いくつかの例では，ｃＤＮＡをコードするポリペプチド中に好都合なクローニング部位を提供するために，ポリペプチドの精製を補助するために，およびポリペプチドの結晶化のために，天然キナーゼのアミノ酸残基を置換，欠失および／または付加することが特に有利または好都合であり得る。天然キナーゼドメインの三次元構造を実質的に変更しないこのような置換，欠失および／または付加は，当業者には明らかであろう。
本明細書において考慮される突然変異体はすべてキナーゼ活性を示す必要はないことに注目すべきである。実際，キナーゼ活性を妨害するが，ドメインの三次元構造を大きくは変更しないアミノ酸置換，付加または欠失が本発明によって特に考慮される。このような結晶ポリペプチドまたはそれから得られる原子構造座標を，天然ドメインと結合する化合物を同定するために使用できる。これらの化合物は，天然ドメインの活性に影響を及ぼし得る。
本発明の誘導体結晶は，１個以上の重金属原子と共有結合している結晶キナーゼポリペプチドを含み得る。このポリペプチドは天然または突然変異キナーゼに相当し得る。誘導体結晶を提供するのに有用な重金属原子としては，それだけには限らないが例として，金，水銀，セレンなどが挙げられる。
本発明の共結晶は通常，1種以上の化合物と結合している結晶キナーゼを含む。結合は共有結合であってもよく，非共有結合であってもよい。このような化合物としては，それだけには限らないが，補因子，基質，基質類似体，阻害剤，アロステリックエフェクターなどが挙げられる。
ＩＩＩ．Ｘ線結晶学を用いる三次元構造決定
Ｘ線結晶学は，分子の三次元構造を解き明かす方法である。分子の構造は，回析格子として結晶を用いてＸ線回析パターンから算出する。タンパク質分子の三次元構造は，そのタンパク質の濃縮した水溶液から成長した結晶から生じる。Ｘ線結晶学のプロセスは以下のステップを含み得る：
（ａ）ポリペプチドを合成および単離すること（あるいは得ること），
（ｂ）調節剤を伴ってか伴わずに，ポリペプチドを含む水溶液から結晶を成長させること，
（ｃ）結晶からＸ線回析パターンを集めること，単位セル寸法および対称性を決定すること，電子密度を決定すること，ポリペプチドのアミノ酸配列を電子密度に対してフィッティングすること，および構造を精密化すること。
Ｘ線結晶学は，分子の三次元構造を解き明かす方法である。分子の構造は，回析格子として結晶を用いてＸ線回析パターンから算出する。タンパク質分子の三次元構造は，そのタンパク質の濃縮した水溶液から成長した結晶から生じる。Ｘ線結晶学のプロセスは以下のステップを含み得る：
（ａ）ポリペプチドを合成および単離すること（あるいは得ること），
（ｂ）調節剤を伴ってか伴わずに，ポリペプチドを含む水溶液から結晶を成長させること，
（ｃ）結晶からＸ線回析パターンを集めること，単位セル寸法および対称性を決定すること，電子密度を決定すること，ポリペプチドのアミノ酸配列を電子密度に対してフィッティングすること，および構造を精密化すること。
ポリペプチドの製造
本明細書に記載される天然および突然変異型キナーゼポリペプチドは，当技術分野で周知の技術を用いて，全体または一部を化学合成できる（例えば，クレートン(Creighton)（１９８３）バイオポリマーズ(Biopolymers)２２（１）：４９〜５８頁参照）。
本明細書に記載される天然および突然変異型キナーゼポリペプチドは，当技術分野で周知の技術を用いて，全体または一部を化学合成できる（例えば，クレートン(Creighton)（１９８３）バイオポリマーズ(Biopolymers)２２（１）：４９〜５８頁参照）。
あるいは，当業者に周知の方法を使用して，天然または突然変異型キナーゼポリペプチドコード配列と適当な転写／翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては，インビトロ組換えＤＮＡ技術，合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば，マニアティス(Maniatis)，Ｔ（１９８９）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular cloning : A laboratory Manual.)。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)，ニューヨーク。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；およびオーズベル(Ausubel)，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology.)，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)，ニュージャージー州，セコーカス(Secaucus)に記載される技術を参照。
種々の宿主発現ベクター系を利用してキナーゼコード配列を発現できる。これらとしては，それだけには限らないが，キナーゼドメインコード配列を含む，組換えバクテリオファージＤＮＡ，プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；キナーゼドメインコード配列を含む，組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；キナーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系，キナーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ，タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染したか，組換えプラスミド発現ベクター（例えば，Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などの微生物が挙げられる。これらの系の発現エレメントはその強度および特異性の点で様々である。
用いる宿主／ベクター系に応じて，構築プロモーターおよび誘導プロモーターをはじめとするいくつかの適した転写および翻訳エレメントのいずれをも発現ベクターに使用できる。例えば，細菌系におけるクローニングの際には，誘導プロモーター，例えばバクテリオファージλのｐＬ，ｐｌａｃ，ｐｔｒｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などを使用でき，昆虫細胞系におけるクローニングの際には，バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用でき，植物細胞系におけるクローニングの際には，植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，熱ショックプロモーター，ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター），クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば，ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター，ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用でき，哺乳類細胞系におけるクローニングの際には，哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば，アデノウイルス後期プロモーター，ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用でき，キナーゼドメインＤＮＡの多重コピーを含む細胞株の作製の際には，ＳＶ４０，ＢＰＶおよびＥＢＶベースのベクターを適当な選択マーカーとともに使用できる。
用いるＤＮＡ操作，ベクター，種々の種類の細胞についての方法，ベクターを細胞に組み込む方法，発現技術，タンパク質精製および単離法，およびタンパク質濃縮法を説明する例示的方法は，ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８７３８に詳細に開示されている。この公開は参照により，図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。当業者には，このような記載を本発明に適用でき，それに容易に適応させることができることは当然であろう。
結晶成長
結晶は，種々の技術によって精製および濃縮されたポリペプチドを含有する水溶液から成長させる。これらの技術としては，バッチ，液体，ブリッジ，透析，蒸気拡散および水滴法が挙げられる。参照により，すべての図，表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる，マクファーソン(McPherson)（１９８２）ジョン・ウィレー，ニューヨーク，マクファーソン（１９９０）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１８９：１〜２３頁，ウェバー(Webber)（１９９１）アドバンセズ・イン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein Chemistry)４１：１〜３６頁。
結晶は，種々の技術によって精製および濃縮されたポリペプチドを含有する水溶液から成長させる。これらの技術としては，バッチ，液体，ブリッジ，透析，蒸気拡散および水滴法が挙げられる。参照により，すべての図，表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる，マクファーソン(McPherson)（１９８２）ジョン・ウィレー，ニューヨーク，マクファーソン（１９９０）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１８９：１〜２３頁，ウェバー(Webber)（１９９１）アドバンセズ・イン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein Chemistry)４１：１〜３６頁。
本発明の天然結晶は，概して，沈殿物をポリペプチドの濃縮溶液に添加することによって成長させる。沈殿物はタンパク質を沈殿させるのに必要な濃度のすぐ下の濃度で添加する。制御蒸発によって水を除去し，沈殿条件を生じさせ，これを結晶成長が終わるまで維持する。
本発明の結晶のための，例示的結晶化条件を実施例に記載する。当業者ならば，例示的結晶化条件を変更できることは認識するであろう。このような変化量は，単独または組合せて使用できる。さらに，その他の結晶化条件は，例えば，このようなその他の条件を同定するための結晶化スクリーニングプレートを用いることによって見出すことができる。次いで，それらの代替条件を，必要に応じて最適化し，より大きなまたはより良質な結晶を提供することができる。
本発明の誘導体結晶は，天然結晶を，重金属原子の塩を含有する母液に浸すことによって得ることができる。天然結晶を，約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのチメロサル，４−クロロメルリ安息香酸(chloromeruribenzoic acid)またはＫＡｕ（ＣＮ）2を含有する溶液に約２時間〜約７２時間浸すことによって，Ｘ線結晶構造の決定における同形置換として使用するのに適した誘導体結晶が得られることがわかっている。
本発明の共結晶は，天然結晶を，キナーゼと結合する化合物を含有する母液に浸すことによって得ることができ，または結合化合物の存在下でキナーゼポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。
一般に，キナーゼと結合化合物の共結晶化は，対応するキナーゼを結合化合物を含まずに結晶化するために同定した条件を用いて達成できる。キナーゼに対して複数の異なる結晶化条件が同定されている場合には，どの条件が最良の共結晶をもたらすかを決定するためにこれらを試験することができることが有利である。共結晶化のための条件を最適化することも有益であり得る。あるいは，例えば，結晶化についてスクリーニングし，次いでそれらの条件を最適化することによって，共結晶を得るための新規結晶化条件を決定することができる。例示的共結晶化条件を実施例に示す。
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の単位セル寸法および三次元構造の決定
結晶が成長すると，ガラスキャピラリーチューブまたはその他の封入装置に入れ，Ｘ線発生器およびＸ線検出装置と連結している保持装置上にマウントすることができる。Ｘ線回析パターンの収集は，当業者によって十分に立証されている。例えば，デュクルー(Ducruix)およびゲイジ(Geige)，（１９９２），ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献参照。Ｘ線のビームは結晶に入り，次いで結晶から回析する。Ｘ線検出装置を利用して結晶から広がる回析パターンを記録できる。こういった機器の古いモデルのＸ線検出装置は，１つのフィルムであるが，最新機器はＸ線回析散乱をデジタル記録する。Ｘ線供給源は種々の型のものであり得るが，高輝度供給源，例えばシンクロトロンビーム供給源を用いることが有利である。
結晶が成長すると，ガラスキャピラリーチューブまたはその他の封入装置に入れ，Ｘ線発生器およびＸ線検出装置と連結している保持装置上にマウントすることができる。Ｘ線回析パターンの収集は，当業者によって十分に立証されている。例えば，デュクルー(Ducruix)およびゲイジ(Geige)，（１９９２），ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献参照。Ｘ線のビームは結晶に入り，次いで結晶から回析する。Ｘ線検出装置を利用して結晶から広がる回析パターンを記録できる。こういった機器の古いモデルのＸ線検出装置は，１つのフィルムであるが，最新機器はＸ線回析散乱をデジタル記録する。Ｘ線供給源は種々の型のものであり得るが，高輝度供給源，例えばシンクロトロンビーム供給源を用いることが有利である。
ペプチド分子または分子複合体の結晶型の三次元構造を得る方法は，当技術分野では周知である。例えば，デュクルーおよびゲイジ（１９９２）ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献を参照。以下は，Ｘ線回析データから分子または複合体の三次元構造を決定するプロセス中のステップである。
結晶からＸ線回析パターンを収集した後，結晶中の単位セル寸法および配向を決定できる。それらは回析放射ならびにこういった放射から作られるパターン間の間隔から決定できる。単位セル寸法はオングストローム（１Å＝１０-10メートル）単位で三次元で，および各頂点の角度によって特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性もこの段階で特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性によって，反復パターンを同定することによって収集したデータの複雑性が単純化される。単位セルの対称性および寸法の適用を以下に説明する。
各回析パターン放射は，ベクトルとして特徴づけられ，方法のこの段階で収集したデータにより各ベクトルの振幅が決まる。ベクトルの位相は複数の技術を用いて決定できる。一方法では，同形置換と呼ばれる方法であるが，重原子を結晶にソークすることができ，これらの重原子をＸ線回析における参照点として用いることによってベクトルの位相を調べることができる（オトウィノウスキ(Otwinowski)，（１９９１），英国，ダーズベリー，８０〜８６）。同形置換法は通常２種以上の重原子誘導体を利用する。
もう１つの方法では，すでに構造の決定されている結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅および位相を，構造未知の結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅に適用し，続いてこれらのベクトルの位相を決定することができる。この第２の方法は分子置換として知られており，参照として用いられるタンパク質構造は，注目するタンパク質と密接に関連した構造を有していなくてはならない。（ナラザ(Naraza)（１９９４）プロテインズ(Proteins)１１：２８１〜２９６頁）。したがって，構造既知のキナーゼからのベクトル情報，例えば本明細書に報告されているものは，構造未知の別のキナーゼの分子置換解析にとって有用である。
結晶の単位セルを表すベクトルの位相を決定すると，ベクトル振幅および位相，単位セル寸法および単位セル対称性をフーリエ変換関数中の項として使用できる。フーリエ変換関数によって，これらの測定値から単位セル中の電子密度を算出する。単位セル中の分子の１つまたは分子複合体の１つを表す電子密度は，電子密度マップと呼ぶことができる。次いで，種々のコンピュータプログラムを用いて，配列のアミノ酸構造または結晶性ポリペプチドと複合体を形成している化合物の分子構造を，電子密度とフィッティングすることができる。プロセスのこのステップはモデルビルディングとも称され，Ｔｕｒｂｏ／ＦＲＯＤＯまたは「Ｏ」などのコンピュータプログラムを用いることによって達成できる。（ジョーンズ(Jones)（１９８５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)１１５：１５７〜１７１頁）。
次いで，実験的に求めた電子密度にフィッティングしたアミノ酸構造から理論上の電子密度マップを算出できる。理論上の電子密度マップおよび実験的電子密度マップを互いに比較することができ，これら２つのマップ間の一致はＲ因子と呼ばれるパラメーターによって表すことができる。低い値のＲ因子は，理論上の電子密度マップと実験的電子密度マップの間の高度にオーバーラップする電子密度を表す。
次いで，理論上の電子密度マップを精密化するコンピュータプログラムを用いてＲ因子を最小化する。当業者によって，Ｘ−ＰＬＯＲなどのコンピュータプログラムをモデル精密化のために使用できる。（ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー(Nature)３５５，４７２〜４７５頁）。精密化は反復プロセスで達成できる。第1のステップは，電子密度マップにおいて規定される原子の構造の変化を引き起こし得る。原子の構造は温度の上昇をシミュレートすることによって変更でき，これにより結合の振動周波数が増加し，構造中の原子の位置が改変される。原子撹乱プロセスにおける特定の点では，通常，原子間の相互作用を許容結合角および結合の長さ，ファンデルワールス相互作用，水素結合，イオン性相互作用および疎水性相互作用という点で規定する力場を，原子の系に適用できる。好都合な相互作用は自由エネルギーという言葉で表すことができ，原子は，自由エネルギー最小が達成されるまで多数の反復の間を動かされ得る。精密化プロセスは，Ｒ因子が最小値に達するまで反復され得る。
分子または分子複合体の三次元構造は，最小Ｒ値を特徴とする理論上の電子密度にフィッティングする原子によって表される。次いで，各原子を座標によって三次元に規定する三次元構造のファイルを作製することができる。
ＩＶ．ｃ−Ｋｉｔ結合部位の構造
ｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインと結合化合物との結晶の高解像度３次元構造および原子構造座標が決定されている。
ｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインと結合化合物との結晶の高解像度３次元構造および原子構造座標が決定されている。
当業者は，Ｘ線結晶学によって決定される原子構造座標には誤差が含まれうることを認識するであろう。したがって，一般に，骨格原子（Ｎ，Ｃα，ＣおよびＯ）を用いて本明細書に記載される座標の表に挙げられる構造座標と重ね合わせたときに約１．５Å以下の標準偏差（"ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．"）を有する，キナーゼの結晶について得られる構造座標の任意の組は，天然の結晶であっても，キナーゼドメイン結晶であっても，誘導体結晶または共結晶であっても，結晶化タンパク質の骨格原子の少なくとも約５０％−１００％が重ね合わせ中に含まれる場合には，この表に挙げられる構造座標と同一であると考えられる。
Ｖ．結晶および原子構造座標の使用
本発明の結晶，特にそれから得られた原子構造座標は多種多様な用途を有する。例えば，本明細書に記載される結晶は，当技術分野で公知のまたは後に開発されるキナーゼの使用法のいずれかにおいて出発点として使用できる。このような使用法としては，例えば，キナーゼの天然または突然変異型触媒ドメインと結合する分子を同定することが挙げられる。結晶および構造座標は，新規治療薬を開発することに向けたアプローチとして，キナーゼ活性を調節するリガンドを同定するためには特に有用である。詳しくは，結晶および構造情報は，分子スキャフォールドを利用してリガンドを開発する方法において有用である。
本発明の結晶，特にそれから得られた原子構造座標は多種多様な用途を有する。例えば，本明細書に記載される結晶は，当技術分野で公知のまたは後に開発されるキナーゼの使用法のいずれかにおいて出発点として使用できる。このような使用法としては，例えば，キナーゼの天然または突然変異型触媒ドメインと結合する分子を同定することが挙げられる。結晶および構造座標は，新規治療薬を開発することに向けたアプローチとして，キナーゼ活性を調節するリガンドを同定するためには特に有用である。詳しくは，結晶および構造情報は，分子スキャフォールドを利用してリガンドを開発する方法において有用である。
本明細書に記載される構造座標は，さらなるキナーゼの結晶構造，ならびに阻害剤，アゴニスト，アンタゴニストおよびその他の分子などのリガンドとこのようなキナーゼとの共結晶との構造を決定するための位相合わせモデルとして使用できる。構造座標，ならびにそれから得られた三次元構造のモデルもまた，天然または突然変異型キナーゼの溶液ベースの構造，例えばＮＭＲによって得られたものの解明を補助するために使用できる。
ＶＩ．ｃ−Ｋｉｔ構造の電子表示
キナーゼまたはキナーゼの一部（例えば，キナーゼ活性部位）の構造情報は，多数の異なる方法で表すことができる。特に有用なものは電子表示であり，これは表示により迅速かつ好都合なデータ操作および構造修飾が可能となるためである。電子表示は多数の種々のストレージ媒体または記憶媒体，しばしばコンピュータにより読み取り可能な媒体に埋め込むことができる。それだけには限らないが例としては，コンピュータランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ），フローピーディスク，磁気ハードドライブ，磁気テープ（アナログまたはデジタル），コンパクトディスク（ＣＤ），光学ディスク，ＣＤ−ＲＯＭ，メモリーカード，デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）などが挙げられる。ストレージ媒体は分離できるか，コンピュータシステムの一部であり得る。このようなコンピュータシステムは，専用の，特殊用途の，または内蔵されたシステム，例えばＸ線結晶学システムの一部を形成するコンピュータシステムであってもよく，汎用コンピュータであってもよい（Ｘ線結晶学システム中のセンサー装置などのその他の設備とデータ接続を有することができる）。多くの場合，このような電子表示によって示される情報はまた，例えば，紙に，画像表示として（例えば，２次元としてまたは疑似三次元画像としてコンピュータモニター上に）または三次元物理的モデルとして，物理的にまたは視覚的に二次元または三次元で表すことができる。このような物理的表示はまた，単独または電子表示と関連して使用できる。例示的な有用な表示としては，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
キナーゼまたはキナーゼの一部（例えば，キナーゼ活性部位）の構造情報は，多数の異なる方法で表すことができる。特に有用なものは電子表示であり，これは表示により迅速かつ好都合なデータ操作および構造修飾が可能となるためである。電子表示は多数の種々のストレージ媒体または記憶媒体，しばしばコンピュータにより読み取り可能な媒体に埋め込むことができる。それだけには限らないが例としては，コンピュータランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ），フローピーディスク，磁気ハードドライブ，磁気テープ（アナログまたはデジタル），コンパクトディスク（ＣＤ），光学ディスク，ＣＤ−ＲＯＭ，メモリーカード，デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）などが挙げられる。ストレージ媒体は分離できるか，コンピュータシステムの一部であり得る。このようなコンピュータシステムは，専用の，特殊用途の，または内蔵されたシステム，例えばＸ線結晶学システムの一部を形成するコンピュータシステムであってもよく，汎用コンピュータであってもよい（Ｘ線結晶学システム中のセンサー装置などのその他の設備とデータ接続を有することができる）。多くの場合，このような電子表示によって示される情報はまた，例えば，紙に，画像表示として（例えば，２次元としてまたは疑似三次元画像としてコンピュータモニター上に）または三次元物理的モデルとして，物理的にまたは視覚的に二次元または三次元で表すことができる。このような物理的表示はまた，単独または電子表示と関連して使用できる。例示的な有用な表示としては，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
原子座標表示
表示の１つの型として，分子構造，構造の一部または複合体（例えば，共結晶）中の特定の原子の位置を表す原子座標の羅列または表がある。このような表示はまた，さらなる情報，例えば特定の座標の占有率に関する情報を含み得る。
表示の１つの型として，分子構造，構造の一部または複合体（例えば，共結晶）中の特定の原子の位置を表す原子座標の羅列または表がある。このような表示はまた，さらなる情報，例えば特定の座標の占有率に関する情報を含み得る。
エネルギー表面または相互作用表面表示
別の表示としては，例えば，活性部位またはその他の結合部位のエネルギー表面表示があり，これは電子および立体相互作用のエネルギー表面を表す。このような表示もまたその他の特徴を含み得る。例としては，特定のアミノ酸残基または特定のアミノ酸残基上の基，例えば，Ｈ結合もしくはイオン性相互作用に参加し得る残基または基の表示を含むことができる。このようなエネルギー表面表示は種々の利用可能なコンピュータプログラムのいずれかを用いて原子座標表示から容易に作製することができる。
別の表示としては，例えば，活性部位またはその他の結合部位のエネルギー表面表示があり，これは電子および立体相互作用のエネルギー表面を表す。このような表示もまたその他の特徴を含み得る。例としては，特定のアミノ酸残基または特定のアミノ酸残基上の基，例えば，Ｈ結合もしくはイオン性相互作用に参加し得る残基または基の表示を含むことができる。このようなエネルギー表面表示は種々の利用可能なコンピュータプログラムのいずれかを用いて原子座標表示から容易に作製することができる。
構造表示
さらにもう１つの表示として構造表示，すなわち，物理的表示またはこのような物理的表示の電子表示がある。このような構造表示としては，分子または複合体の特定の特徴の関連位置の表示が挙げられるが，これは構造的特徴間の結合に関することが多い。例えば，中でも，すべての原子が結合している；水素以外の原子が結合している；重大な電子相互作用に参加し得る側鎖原子の表示は含むか含まない，主鎖原子が結合している構造を表すことができる。しかし，すべての特徴が結合している必要はない。例えば，分子または複合体の一部の構造表示については，特徴を表すことができるために構造的特徴（例えば，結合部位でリガンドとの有意な結合相互作用を有し得るアミノ酸残基の原子）は重大である。そのようなアミノ酸残基は互いに結合していない場合もある。
さらにもう１つの表示として構造表示，すなわち，物理的表示またはこのような物理的表示の電子表示がある。このような構造表示としては，分子または複合体の特定の特徴の関連位置の表示が挙げられるが，これは構造的特徴間の結合に関することが多い。例えば，中でも，すべての原子が結合している；水素以外の原子が結合している；重大な電子相互作用に参加し得る側鎖原子の表示は含むか含まない，主鎖原子が結合している構造を表すことができる。しかし，すべての特徴が結合している必要はない。例えば，分子または複合体の一部の構造表示については，特徴を表すことができるために構造的特徴（例えば，結合部位でリガンドとの有意な結合相互作用を有し得るアミノ酸残基の原子）は重大である。そのようなアミノ酸残基は互いに結合していない場合もある。
構造表示はまた，図式表示でもあり得る。例えば，図式表示は図式的に二次および／または三次構造を表すことができる。このようなポリペプチドの図式表示内に，特定のアミノ酸残基もしくは残基上の基，例えば，結合部位中の保存された残基，および／または結合化合物と相互作用し得る残基もしくは基を含めることができる。電子構造表示は，例えば，その機能のために設計されたコンピュータプログラムを用いて原子座標情報から，および／または別の形の構造情報の解釈に基づいて手動入力で電子表示を構築することによって作製できる。物理的表示は，例えば，コンピュータ生成画像の画像を印刷することによって，または３Ｄモデルを構築することによって作製できる。そのような印刷された表示の一例は，図２に示されるリボンダイアグラムである。
ＶＩＩ．構造座標を用いる，構造未知のキナーゼの構造決定
構造座標，例えばｃ−Ｋｉｔについて入手可能な構造座標を用いて，構造未知のキナーゼの三次元構造を決定することができる。以下に記載した方法は，構造既知のポリペプチドの構造座標を，別のデータセット，例えばアミノ酸配列，Ｘ線結晶学回析データまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）データに適用することができる。本発明の好ましい実施形態は，修飾されたキナーゼ，その他の天然キナーゼおよび関連ポリペプチドの三次元構造を決定することに関する。
構造座標，例えばｃ−Ｋｉｔについて入手可能な構造座標を用いて，構造未知のキナーゼの三次元構造を決定することができる。以下に記載した方法は，構造既知のポリペプチドの構造座標を，別のデータセット，例えばアミノ酸配列，Ｘ線結晶学回析データまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）データに適用することができる。本発明の好ましい実施形態は，修飾されたキナーゼ，その他の天然キナーゼおよび関連ポリペプチドの三次元構造を決定することに関する。
アミノ酸相同性を用いる構造
ホモロジーモデリングは，構造既知のポリペプチドの構造座標を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法は，ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造のコンピュータ表示，構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示，およびアミノ酸の構造の標準コンピュータ表示を用いて達成する。ホモロジーモデリングは一般に，（ａ）既知構造を有する，および有さないポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることと，（ｂ）既知構造中の保存されたアミノ酸の座標を，構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移すこと，その結果生じる三次元構造を精密化することと，（ｄ）残りのポリペプチドの構造を構築することとを含む。当業者ならば，ステップ（ａ）における配列アラインメントステップから，２つのタンパク質間で保存されたアミノ酸を決定できることは承知している。
ホモロジーモデリングは，構造既知のポリペプチドの構造座標を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法は，ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造のコンピュータ表示，構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示，およびアミノ酸の構造の標準コンピュータ表示を用いて達成する。ホモロジーモデリングは一般に，（ａ）既知構造を有する，および有さないポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることと，（ｂ）既知構造中の保存されたアミノ酸の座標を，構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移すこと，その結果生じる三次元構造を精密化することと，（ｄ）残りのポリペプチドの構造を構築することとを含む。当業者ならば，ステップ（ａ）における配列アラインメントステップから，２つのタンパク質間で保存されたアミノ酸を決定できることは承知している。
前記の方法は当業者にはよく知られている（グリア(Greer)（１９８５）サイエンス(Science)２２８：１０５５頁）；ブランデル(Blundell)ら．Ａ（１９８８）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１７２：５１３頁。当業者によってホモロジーモデリングに利用できる例示的コンピュータプログラムとしては，アクセレリス社(Accelerys Inc.)によって流通されているインサイト(Insight)IIモデリングパッケージ中のホモロジーモジュールがある。
アミノ酸配列のアラインメントは，まず構造既知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列の上に置くことによって達成する。次いで，配列中のアミノ酸を比較し，相同であるアミノ酸の群（例えば，化学的性質−脂肪族，芳香族，極性または帯電において同様であるアミノ酸側鎖）を一緒にしてグループ化する。この方法によって，ポリペプチドの保存された領域が検出され，アミノ酸挿入または欠失が明らかとなる。このようなアラインメントおよび／または，配列アラインメントおよび解析ソフトウェアを用いて完全に電子的に実施できる。
構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすると，構造既知のポリペプチドのコンピュータ表示中の保存されたアミノ酸の構造を，構造が未知であるポリペプチドの対応するアミノ酸に移す。例えば，既知構造のアミノ酸配列中のチロシンをフェニルアラニン，未知構造のアミノ酸配列中の対応する相同アミノ酸で置き換えることができる。
非保存領域中に位置するアミノ酸の構造は，標準ペプチド幾何学または分子シミュレーション技術，例えば分子ダイナミクスのいずれかを用いて手作業で割り当てるべきものである。プロセスの最終ステップは，分子ダイナミクスおよび／またはエネルギー最小化を用いて全構造を精密化することによって達成する。ホモロジーモデリング法は当業者にはよく知られており，種々のタンパク質分子を用いて実施されている。例えば，セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ，ミオシン軽鎖タンパク質キナーゼの触媒ドメインに相当するポリペプチドの三次元構造が，ｃ−ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットからホモロジーモデリングされた。（ナイトン(Knighton)ら（１９９２）サイエンス２５８：１３０〜１３５頁）。
分子置換を用いる構造
分子置換は，構造既知のポリペプチドのＸ線回析データを，配列未知のポリペプチドのＸ線回析データに適用する方法である。この方法を利用して，振幅が既知である場合にのみ構造未知のポリペプチドのＸ線回析データを表す位相を規定することができる。Ｘ−ＰＬＯＲは，分子置換のために用いられる，広く用いられているコンピュータソフトウェアパッケージである。ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー３５５：４７２〜４７５頁。ＡＭＯＲＥは，分子置換に用いられるもう１つのプログラムである。ナバザ(Navaza)（１９９４）アクタ・クリスタログラフィカ(Acta Crystallographica)Ａ５０：１５７〜１６３頁。得られた構造は３Åより大きい二乗平均平方根偏差を示さないことが好ましい。
分子置換は，構造既知のポリペプチドのＸ線回析データを，配列未知のポリペプチドのＸ線回析データに適用する方法である。この方法を利用して，振幅が既知である場合にのみ構造未知のポリペプチドのＸ線回析データを表す位相を規定することができる。Ｘ−ＰＬＯＲは，分子置換のために用いられる，広く用いられているコンピュータソフトウェアパッケージである。ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー３５５：４７２〜４７５頁。ＡＭＯＲＥは，分子置換に用いられるもう１つのプログラムである。ナバザ(Navaza)（１９９４）アクタ・クリスタログラフィカ(Acta Crystallographica)Ａ５０：１５７〜１６３頁。得られた構造は３Åより大きい二乗平均平方根偏差を示さないことが好ましい。
分子置換の目標は，２種の結晶から得た電子回析データをマッチさせることによって単位セル中の原子の位置をアラインすることである。Ｘ−ＰＬＯＲなどのプログラムは４つのステップを含み得る。第1のステップは，単位セル中の分子数を決定することおよびそれらの間の角度を規定することであり得る。第２のステップは，単位セル中の分子の配向を規定するために回析データを回転させることを含み得る。第３のステップは，単位セル中の分子を正しく位置づけるために三次元の電子密度を翻訳することであり得る。Ｘ回析データの振幅および位相が決定されると，参照データセットから実験によって算出された電子回析マップと新規データセットから算出された電子回析マップとを比較することによってＲ因子を算出することができる。３０〜５０％の間のＲ因子は，この方法によって単位セル中の原子の配向が合理的に決定されていることを示す。プロセスの第４のステップは，本明細書に記載される，および当業者に公知の反復精密化技術を用いて新規電子密度マップを精密化することによってＲ因子を約２０％に低下させることであり得る。
ＮＭＲデータを用いる構造
Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標を，核磁気共鳴（ＮＭＲ）データからのポリペプチドの三次元構造の解明に向けて適用することができる。この方法は当業者には用いられている。（ビュートリッヒ(Wuthrich)（１９８６），ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク：１７６〜１９９頁；プフルグラス(Pflugrath)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１８９：３８３〜３８６頁；クライン(Kline)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１８９：３７７〜３８２頁）。ポリペプチドの二次構造は二次元ＮＮＲデータを用いることによって容易に決定されることが多いが，二次構造の個々の要素間の空間的関係は同じようには容易に決定できない。Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドの三次元構造を規定する座標は，ＮＭＲ分光学者を，関連構造のポリペプチド中の二次構造要素間のこういった空間的相互関係の理解へ導き得る。
Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標を，核磁気共鳴（ＮＭＲ）データからのポリペプチドの三次元構造の解明に向けて適用することができる。この方法は当業者には用いられている。（ビュートリッヒ(Wuthrich)（１９８６），ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク：１７６〜１９９頁；プフルグラス(Pflugrath)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１８９：３８３〜３８６頁；クライン(Kline)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１８９：３７７〜３８２頁）。ポリペプチドの二次構造は二次元ＮＮＲデータを用いることによって容易に決定されることが多いが，二次構造の個々の要素間の空間的関係は同じようには容易に決定できない。Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドの三次元構造を規定する座標は，ＮＭＲ分光学者を，関連構造のポリペプチド中の二次構造要素間のこういった空間的相互関係の理解へ導き得る。
二次構造要素間の空間的相関関係についての知識によって，二次元ＮＭＲ実験から得られる核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）データが大幅に単純化され得る。さらに，ＮＭＲ技術によって二次構造を決定した後に結晶学座標を適用することは，ポリペプチド配列中の特定のアミノ酸に関連するＮＯＥの割り当てが単純化されるだけで，ポリペプチド構造のＮＭＲ解析に大きくバイアスをかけるものではない。逆に言えば，ポリペプチドの二次構造を決定しながらＮＯＥデータを単純化するために結晶学座標を用いることは，タンパク質構造のＮＭＲ解析にバイアスをかける。
ＶＩＩＩ．構造座標を用いるｃ−Ｋｉｔ機能の調節剤の構造ベースの設計
構造ベースの調節剤設計および同定法は強力な技術であり，これは多種多様な潜在的調節剤および化学官能基を含むコンピュータデータベースの検索を含み得る。調節剤のコンピュータ化した設計および同定は，コンピュータデータベースが，化学ライブラリーよりも，しばしば１桁規模で多くの化合物を含むので有用である。構造ベースの薬物設計および同定の概説については，カンツ(kuntz)ら（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁，ガイダ(Guida)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチャラル・バイオロジー(Current Opinion in Structural Biology)４：７７７頁，コールマン(Colman)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー４：８６８頁参照。
構造ベースの調節剤設計および同定法は強力な技術であり，これは多種多様な潜在的調節剤および化学官能基を含むコンピュータデータベースの検索を含み得る。調節剤のコンピュータ化した設計および同定は，コンピュータデータベースが，化学ライブラリーよりも，しばしば１桁規模で多くの化合物を含むので有用である。構造ベースの薬物設計および同定の概説については，カンツ(kuntz)ら（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁，ガイダ(Guida)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチャラル・バイオロジー(Current Opinion in Structural Biology)４：７７７頁，コールマン(Colman)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー４：８６８頁参照。
構造座標によって規定されるポリペプチドの三次元構造を，これらの設計法によって利用できる。さらに，本明細書に記載される，ホモロジー，分子置換およびＮＭＲ技術によって決定されるキナーゼの三次元構造もまた調節剤設計および同定法に適用できる。
調節剤を同定するために，天然キナーゼの構造情報，特に，キナーゼの活性部位の構造情報を使用できる。しかし，キナーゼと1種以上の結合化合物との1種以上の共結晶から得られる構造情報を利用することは有利であり得る。また，結合化合物が試験化合物に共通する構造コアを有する場合にも有利であり得る。
分子データベースの検索による設計
合理的設計の一方法では，分子のデータベースから得た化合物のコンピュータ表示をドッキングすることによって調節剤を検索する。公的に入手可能なデータベースとしては，例えば以下のものがある：
ａ）モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＡＣＤ
ｂ）国立癌研究所製のＮＣＩ
ｃ）ケンブリッジ結晶データセンター製のＣＣＤＣ
ｄ）ケミカル・アブストラクト・サービス(Chemical Abstract Service)製のＣＡＳＴ
ｅ）ダーウェント・インフォメーション・リミテッド(Derwent Information Limited)製のダーウェント(Derwent)
ｆ）メイブリッジ・ケミカル・カンパニー(Maybridge Chemical Company)ＬＴＤ製のメイブリッジ(Maybridge)
ｇ）アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)製のアルドリッチ(Aldrich)
ｈ）チャップマン＆ホール(Chapman & Hall)製の天然物のディレクトリ。
合理的設計の一方法では，分子のデータベースから得た化合物のコンピュータ表示をドッキングすることによって調節剤を検索する。公的に入手可能なデータベースとしては，例えば以下のものがある：
ａ）モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＡＣＤ
ｂ）国立癌研究所製のＮＣＩ
ｃ）ケンブリッジ結晶データセンター製のＣＣＤＣ
ｄ）ケミカル・アブストラクト・サービス(Chemical Abstract Service)製のＣＡＳＴ
ｅ）ダーウェント・インフォメーション・リミテッド(Derwent Information Limited)製のダーウェント(Derwent)
ｆ）メイブリッジ・ケミカル・カンパニー(Maybridge Chemical Company)ＬＴＤ製のメイブリッジ(Maybridge)
ｇ）アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)製のアルドリッチ(Aldrich)
ｈ）チャップマン＆ホール(Chapman & Hall)製の天然物のディレクトリ。
このようなデータベースの１つ（モレキュラー・デザインズ・リミテッド・インホメーション・システムズ(Molecular Designs Limited Information Systems)によって流通されているＡＣＤ）には，合成によって誘導されたか，天然物である化合物が含まれている。当業者に利用できる方法によって，二次元で表されるデータセットを，三次元で表されるものへ変換することができる。これらの方法は，トライポス・アソシエイテス(Tripos Associates)製のＣＯＮＣＯＲＤまたはモレキュラー・シミュレーションズ・リミテッド(Molecular Simulations Limited)製のＤＥ−コンバーター(Converter)のようなコンピュータプログラムによって可能である。
当業者には，構造ベースの調節剤設計の複数の方法が知られている。（カンツ(Kuntz)ら，（１９８２），ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１６２：２６９頁，カンツら，（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁；メン(Meng)ら，（１９９２），ジャーナル・オブ・コンピュータ・ケミストリー(Journal of Computer Chemistry)１３：５０５頁；ボーム(Bohm)，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：６２３頁）。
合理的調節剤設計の当業者に広く用いられているコンピュータプログラムとして，カリフォルニア大学サンフランシスコ校製のＤＯＣＫがある。このコンピュータプログラムおよびそのようなプログラムによって利用される一般的な方法を，以下の３つの適用で説明する。これらの技術のいくつかに関するより詳細な情報は，アクセレリス・ユーザー・ガイド１９９５に見出すことができる。この目的に用いられる通常のコンピュータプログラムは，以下のステップまたは機能を含むプロセスを実施できる：
（ａ）タンパク質から既存の化合物を除去すること，
（ｂ）コンピュータプログラム（ＤＯＣＫなど）を用いて，または化合物を活性部位にインタラクティブに移動させることによって，別の化合物の構造を活性部位にドッキングすること，
（ｃ）化合物と活性部位原子間の空間を特性決定すること，
（ｄ）（ｉ）化合物と活性部位の間の空の空間にフィッティングでき，（ｉｉ）化合物と結合できる分子断片のライブラリーを検索すること，
（ｅ）前記で見出した断片を化合物に結合させ，新規の修飾された化合物を評価すること。
（ａ）タンパク質から既存の化合物を除去すること，
（ｂ）コンピュータプログラム（ＤＯＣＫなど）を用いて，または化合物を活性部位にインタラクティブに移動させることによって，別の化合物の構造を活性部位にドッキングすること，
（ｃ）化合物と活性部位原子間の空間を特性決定すること，
（ｄ）（ｉ）化合物と活性部位の間の空の空間にフィッティングでき，（ｉｉ）化合物と結合できる分子断片のライブラリーを検索すること，
（ｅ）前記で見出した断片を化合物に結合させ，新規の修飾された化合物を評価すること。
パート（ｃ）は，活性部位の原子と化合物の間に形成される幾何学および相補的相互関係を特性決定することを指す。好都合な幾何学的適合性は，化合物と活性部位原子間に，都合の悪い立体的相互作用を形成せずに相当な表面積が共有される場合に得られる。当業者ならば，本方法はパート（ｄ）および（ｅ）を省略し，多数の化合物のデータベースをスクリーニングすることによって実施できるということは気付くであろう。
キナーゼ機能の調節剤の構造ベースの設計および同定はアッセイスクリーニングとともに使用できる。化合物のより大きなコンピュータデータベース（約１０，０００種の化合物）を，ほんの数時間またはさらに短い間で検索できるので，コンピュータベースの方法によって，キナーゼ機能の潜在的調節剤として生化学または細胞アッセイにおいて試験される化合物を縮小できる。
構造ベースの調節剤設計についての前記の説明は，すべてを包含しているわけではなく，文献にはその他の方法も報告されており，使用することができる。例えば：
（１）ＣＡＶＥＡＴ：ケミカル・アンド・バイオロジカル・プロブレムズ・イン・モレキュラー・レコグニション(Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition)，中のバートレット(Bartlett)ら，（１９８９），ロバート(Roberts) ，Ｓ．Ｍ．，レイ(Ley) ，Ｓ．Ｖ．，キャンベル(Campbell)，Ｍ．Ｍ．編，ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー(Royal Society of Chemistry，ケンブリッジ１８２〜１９６頁。
（２）ＦＬＯＧ：ミラー(Miller)ら，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：１５３頁。
（３）ＰＲＯ 調節剤：クラーク(Clark)ら，（１９９５），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン９：１３頁。
（４）ＭＣＳＳ：ミランカー(Miranker)およびカープラス(karplus)，（１９９１），プロテインズ(Proteins)：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス(Structure, Function, and Genetics)１１：２９頁。
（５）ＡＵＴＯＤＯＣＫ：グッドセル(Goodsell)およびオルソン(Olson)，（１９９０），プロテインズ：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス８：１９５頁。
（６）ＧＲＩＤ：グッドフォード(Goodford)，（１９８５），ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)２８：８４９頁。
（１）ＣＡＶＥＡＴ：ケミカル・アンド・バイオロジカル・プロブレムズ・イン・モレキュラー・レコグニション(Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition)，中のバートレット(Bartlett)ら，（１９８９），ロバート(Roberts) ，Ｓ．Ｍ．，レイ(Ley) ，Ｓ．Ｖ．，キャンベル(Campbell)，Ｍ．Ｍ．編，ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー(Royal Society of Chemistry，ケンブリッジ１８２〜１９６頁。
（２）ＦＬＯＧ：ミラー(Miller)ら，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：１５３頁。
（３）ＰＲＯ 調節剤：クラーク(Clark)ら，（１９９５），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン９：１３頁。
（４）ＭＣＳＳ：ミランカー(Miranker)およびカープラス(karplus)，（１９９１），プロテインズ(Proteins)：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス(Structure, Function, and Genetics)１１：２９頁。
（５）ＡＵＴＯＤＯＣＫ：グッドセル(Goodsell)およびオルソン(Olson)，（１９９０），プロテインズ：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス８：１９５頁。
（６）ＧＲＩＤ：グッドフォード(Goodford)，（１９８５），ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)２８：８４９頁。
ｃ−Ｋｉｔとの複合体中の化合物を修飾することによる設計
潜在的調節剤として化合物を同定するもう１つの方法は，既存の調節剤をポリペプチド活性部位において修飾することである。例えば，調節剤のコンピュータ表示を，ｃ−Ｋｉｔ活性部位のコンピュータ表示内で修飾することができる。この技術のための詳細な指示は，例えば，ＬＵＤＩ中，アクセレリス・ユーザー・マニュアル(Accelerys User Manual)，１９９５に見出すことができる。調節剤のコンピュータ表示は，通常，化学基または複数の化学基を欠失させることまたは化学基または複数の化学基を付加することによって修飾する。
潜在的調節剤として化合物を同定するもう１つの方法は，既存の調節剤をポリペプチド活性部位において修飾することである。例えば，調節剤のコンピュータ表示を，ｃ−Ｋｉｔ活性部位のコンピュータ表示内で修飾することができる。この技術のための詳細な指示は，例えば，ＬＵＤＩ中，アクセレリス・ユーザー・マニュアル(Accelerys User Manual)，１９９５に見出すことができる。調節剤のコンピュータ表示は，通常，化学基または複数の化学基を欠失させることまたは化学基または複数の化学基を付加することによって修飾する。
化合物への各修飾の際に，修飾される化合物および活性部位の原子を，立体構造中でシフトすることができ，２つの分子間に形成される何らかの相補的相互作用とともに調節剤と活性部位原子間の距離のスコアをつけることができる。スコアリングは，好都合な幾何学的適合性および好都合な相補的相互作用が得られた時に完了できる。好都合なスコアを有する化合物が潜在的調節剤である。
ｃ−Ｋｉｔと結合する化合物の構造を修飾することによる設計
構造ベースの調節剤設計の第３の方法は，調節剤構築または調節剤検索コンピュータプログラムによって設計された化合物をスクリーニングすることである。こういった種類のプログラムの例は，モレキュラー・シミュレーションズ・パッケージ，カタリスト(Molecular Simulations Package,Catalyst)に見出すことができる。このプログラムを用いるための説明はモレキュラー・シミュレーションズ・ユーザー・ガイド（１９９５）に記録されている。この適用に用いられるその他のコンピュータプログラムとしては，モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＩＳＩＳ／ＨＯＳＴ，ＩＳＩＳ／ＢＡＳＥ，ＩＳＩＳ／ＤＲＡＷおよびトライポス・アソシエーテス(Tripos Associates)製のＵＮＩＴＹがある。
構造ベースの調節剤設計の第３の方法は，調節剤構築または調節剤検索コンピュータプログラムによって設計された化合物をスクリーニングすることである。こういった種類のプログラムの例は，モレキュラー・シミュレーションズ・パッケージ，カタリスト(Molecular Simulations Package,Catalyst)に見出すことができる。このプログラムを用いるための説明はモレキュラー・シミュレーションズ・ユーザー・ガイド（１９９５）に記録されている。この適用に用いられるその他のコンピュータプログラムとしては，モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＩＳＩＳ／ＨＯＳＴ，ＩＳＩＳ／ＢＡＳＥ，ＩＳＩＳ／ＤＲＡＷおよびトライポス・アソシエーテス(Tripos Associates)製のＵＮＩＴＹがある。
これらのプログラムは，化合物−キナーゼ複合体の三次元構造の活性部位から除去された化合物の構造上で動作させることができる。このような化合物上でプログラムを動作させることは，それが生物学的に活性な立体構造にあるために好ましい。
調節剤構築コンピュータプログラムとは，キナーゼまたはその他の生体分子と複合体を形成している化合物中の複数の化学基のコンピュータ表示を，コンピュータデータベースから得た複数の基で置き換えるために使用できるコンピュータプログラムである。調節剤検索コンピュータプログラムとは，コンピュータデータベースから，特定の生体分子と結合している化合物と同様の三次元構造および同様の化学基を有する化合物のコンピュータ表示を検索するために使用できるコンピュータプログラムである。
通常のプログラムは，以下の一般的なステップを用いることによって動作し得る：
（ａ）化合物を，水素結合ドナーまたはアクセプター，疎水性／親油性部位，正にイオン化可能な部位または負にイオン化可能な部位などの化学的特徴によってマッピングすること；
（ｂ）マッピングされた特徴に幾何学的制約を加えること；および
（ｃ）（ｂ）で作製したモデルでデータベースを検索すること。
通常のプログラムは，以下の一般的なステップを用いることによって動作し得る：
（ａ）化合物を，水素結合ドナーまたはアクセプター，疎水性／親油性部位，正にイオン化可能な部位または負にイオン化可能な部位などの化学的特徴によってマッピングすること；
（ｂ）マッピングされた特徴に幾何学的制約を加えること；および
（ｃ）（ｂ）で作製したモデルでデータベースを検索すること。
当業者ならば，（ｂ）のモデルには化合物のすべての可能な化学的特徴が存在する必要はないということも認識している。モデルのいずれかのサブセットを使用して，データベース検索のための種々のモデルを作製することができる。
分子スキャフォールドを用いる調節剤設計
本発明はまた，分子ファミリーに広く作用できる分子スキャフォールドと称される化合物を設計する方法，および／または分子スキャフォールドを使用して，そのようなファミリーの個々のメンバーまたは複数のメンバーを標的とするリガンドを設計する方法を利用できることが有利である。このような分子スキャフォールドを用いる設計は，参照によりその全文が本明細書に組み込まれる，ヒルト(Hirth)およびミルバーン(Milburn)，米国特許出願１０／３７７，２６８に記載されている。このような分子スキャフォールドを用いる設計および開発を，一部，以下に記載する。
本発明はまた，分子ファミリーに広く作用できる分子スキャフォールドと称される化合物を設計する方法，および／または分子スキャフォールドを使用して，そのようなファミリーの個々のメンバーまたは複数のメンバーを標的とするリガンドを設計する方法を利用できることが有利である。このような分子スキャフォールドを用いる設計は，参照によりその全文が本明細書に組み込まれる，ヒルト(Hirth)およびミルバーン(Milburn)，米国特許出願１０／３７７，２６８に記載されている。このような分子スキャフォールドを用いる設計および開発を，一部，以下に記載する。
好ましい実施形態では，分子はタンパク質であることができ，１）特定のタンパク質ファミリーに作用するよう化学的に設計されており，かつ／または，２）より分子スキャフォールドに近い挙動をする特性を有する，つまり，それらが，それらを注目するファミリー中の1種以上のタンパク質との結合に対して特異的にする化学的部分構造を有することを意味する化学化合物のセットを集めることができる。あるいは，個々の標的分子に対して選択的に活性である分子スキャフォールドを設計できる。
分子スキャフォールドの有用な化学的特性は，以下の特徴のうちの１以上を含み得るがそれに限定されるものではない：約３５０ダルトンより小さい，または約１５０〜約３５０ダルトンの間，または約１５０〜約３００ダルトンの間の平均分子量；ｃｌｏｇＰが３より低いこと；回転可能な結合数が４未満である；水素結合ドナーおよびアクセプターの数が５より少ないか，または４より少ないこと；極性表面積が５０Å2未満であること；スキャフォールドと結合しているコンビナトリアルライブラリーから得た化学置換基がタンパク質結合部位中のポケット中に突き出ることができるような配向でのタンパク質結合部位での結合；および置換基結合点に化学的に扱いやすい構造を有し，それを修飾でき，それによって迅速にライブラリー構築が可能となること。
「ｃｌｏｇＰ」とは，化合物の算出されたｌｏｇＰを意味し，「Ｐ」はオクタノールと水の間の分配計数を指す。
用語「分子の極性表面積（ＰＳＡ）」とは，分子中の極性原子（通常，酸素，窒素および結合されている水素）の表面寄与の合計を指す。極性表面積は薬物輸送特性，例えば腸内吸収または血液脳関門透過と十分に相関があることがわかっている。
コンビナトリアルライブラリーに含めるための，別個の化合物のさらなる有用な化学的特性としては，化合物の，少なくとも１種の注目するタンパク質との結合を妨害せず，ライブラリーメンバーに所望の特性を付与する化学部分を化合物に結合させる，例えば，ライブラリーメンバーを，注目する細胞および／または器官に活発に輸送されるようにする能力，または組織などの用途のため，およびプロテオミクスプロファイリング目的のクロマトグラフィーカラム（例えば，ビオチンなどの分子を介するストレプトアビジンカラム）などの装置を結合させる能力が挙げられる。
当業者ならば，使用するための特定の必要条件に応じてスキャフォールドまたはライブラリーメンバーが有すること望ましいものであり得るその他の特性，およびこういった特性を有する化合物も，同様に探し，同定することができるということを認識するであろう。アッセイのために化合物を選択する方法は，当業者には知られており，例えば，米国特許題６，２８８，２３４号，同６，０９０，９１２号，同５，８４０，４８５号に記載された方法および化合物があり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態では，本発明は，分子ファミリーの複数のメンバーと結合し，共通の分子スキャフォールドを含むリガンドを設計する方法を提供する。すなわち，化合物セットを，分子ファミリー，例えば，タンパク質ファミリーの複数のメンバーとの結合についてアッセイすることができる。複数のファミリーメンバーと結合する１種以上の化合物を，分子スキャフォールドとして同定できる。標的分子の結合部位でのスキャフォールドの配向が決定されており，化学的に扱いやすい構造が同定されている場合は，１種または数種の分子スキャフォールドから開始してリガンドのセットを合成して，複数のリガンドに到達することができ，ここで各リガンドは，スキャフォールドに対して変更されたまたは変化した結合親和性または結合特異性で分子ファミリーの別個の標的分子と結合する。したがって，同一の分子スキャフォールドに基づいて分子ファミリーの個々のメンバーを選択的に標的とし，それらに対して特異的に作用する複数の薬物リード分子が設計できる。
ＩＸ．結合アッセイ
本発明の方法は，化合物と標的分子との結合を検出できるアッセイを含み得る。統計的に有意水準でのこのような結合は，アッセイシグナルが標的分子との結合を表す，すなわちバックグラウンドとは区別されるという，少なくとも９０％の信頼水準を有することが好ましく，少なくとも９５，９７，９８，９９％またはより大きな信頼水準を有することがより好ましい。対照を用いて標的結合を非特異的結合と区別することが好ましい。本発明のアッセイはまた，標的分子との低親和性結合について化合物をアッセイすることを含み得る。種々の標的型について，結合を示す多種多様なアッセイが知られており，本発明に使用できる。タンパク質ファミリーにわたって広く作用する化合物は，その結合性が広いことから個々の標的に対して高親和性を有する可能性は低い。したがって，本明細書に記載されるアッセイは，低親和性，極めて低い親和性，および極度に低い親和性で結合する化合物の同定を考慮する。したがって，作用強度（すなわち結合親和性）は，有用である可能性のある結合化合物の第一義的なものでもなく，さらに最も重要なものでもない，同定のしるしである。むしろ，低親和性，極めて低い親和性または極度に低い親和性で結合する化合物でさえ，リガンド設計プロセスの次のフェーズに続けることができる分子スキャフォールドとして考えることができる。
本発明の方法は，化合物と標的分子との結合を検出できるアッセイを含み得る。統計的に有意水準でのこのような結合は，アッセイシグナルが標的分子との結合を表す，すなわちバックグラウンドとは区別されるという，少なくとも９０％の信頼水準を有することが好ましく，少なくとも９５，９７，９８，９９％またはより大きな信頼水準を有することがより好ましい。対照を用いて標的結合を非特異的結合と区別することが好ましい。本発明のアッセイはまた，標的分子との低親和性結合について化合物をアッセイすることを含み得る。種々の標的型について，結合を示す多種多様なアッセイが知られており，本発明に使用できる。タンパク質ファミリーにわたって広く作用する化合物は，その結合性が広いことから個々の標的に対して高親和性を有する可能性は低い。したがって，本明細書に記載されるアッセイは，低親和性，極めて低い親和性，および極度に低い親和性で結合する化合物の同定を考慮する。したがって，作用強度（すなわち結合親和性）は，有用である可能性のある結合化合物の第一義的なものでもなく，さらに最も重要なものでもない，同定のしるしである。むしろ，低親和性，極めて低い親和性または極度に低い親和性で結合する化合物でさえ，リガンド設計プロセスの次のフェーズに続けることができる分子スキャフォールドとして考えることができる。
「低親和性」での結合とは，標準条件下での解離定数（ｋd）が１μＭより大きい標的分子との結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋdが約１００μＭである結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋdが約１ｍＭである結合を意味する。「中程度の親和性」とは，標準条件下でのｋdが約２００ｎＭ〜約１μＭである結合を意味する。「中程度に高い親和性」とは，ｋdが約１ｎＭ〜約２００ｎＭの結合を意味する。「高親和性」での結合とは，標準条件下でのｋdが約１ｎＭより低い結合を意味する。例えば，低親和性結合は，標的分子の結合部位への低い適合のために，またはスキャフォールドもしくはリガンドの標的分子の結合部位との結合を引き起こすよう存在する，より高い親和性結合が生じる場合と比較して少数の非共有結合，もしくは弱い共有結合のために生じ得る。結合の標準条件とは，ｐＨ７．２，３７℃で１時間である。例えば，ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭバッファー，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ １５ｍＭ，ＡＴＰ ２μＭおよびウシ血清アルブミン１μｇ／ウェルの１００μｌ／ウェルを３７℃で１時間使用できる。
結合化合物はまた，標的分子の活性に対するその作用によって特性決定できる。したがって「低活性」化合物は，標準条件下で１μＭより高い阻害濃度（ＩＣ50）または励起濃度（ＥＣ50）を有する。「極めて低い活性」とは，標準条件下で約１００μＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「極度に低い活性」とは，標準条件下で約１ｍＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「中程度の活性」とは，標準条件下で２００ｎＭ〜１μＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「中程度に高い活性」とは，１ｎＭ〜２００ｎＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「高い活性」とは，標準条件下で１ｎＭより低いＩＣ50またはＥＣ50を意味する。ＩＣ50（またはＥＣ50）は，化合物が存在しない場合の活性と比較して，測定されている標的分子（例えば，酵素またはその他のタンパク質）活性の５０％の活性が失われる（または獲得される）化合物の濃度として規定される。活性は当業者に公知の方法を用いて，例えば，酵素反応の出現によって生じたいずれかの検出可能な産物またはシグナル，または測定されているタンパク質によるその他の活性を測定することによって測定できる。
結合アッセイに関連して，「バックグラウンドシグナル」とは，標的分子と結合する，試験化合物，分子スキャフォールド，またはリガンドの不在下において特定のアッセイの標準条件下で記録されるシグナルを意味する。当業者ならば，バックグラウンドシグナルを決定するための認められた方法が存在し，広く利用可能であるということは理解されよう。
「標準偏差」とは，分散の平方根を意味する。分散は分布がどのように広がっているかという尺度である。その平均から各数の平均偏差平方としてコンピュータによって計算される。例えば，数１，２および３については，平均は２であり，分散は以下である：
タンパク質ファミリーにわたって広く作用するスキャフォールドを設計または発見するためには，注目するタンパク質を，化合物収集物またはセットに対してアッセイできる。アッセイは酵素アッセイまたは結合アッセイであり得ることが好ましい。いくつかの実施形態では，スクリーニングされている化合物の可溶性を高め，次いで，低親和性で結合するものまたはバックグラウンドシグナルの標準偏差の約３倍大きなシグナルを生じるものを含む，アッセイにおいて活性を示すすべての化合物を解析することが望ましい場合がある。アッセイは適したアッセイであればいずれであってもよく，例えば，２種の結合パートナー間の結合親和性を測定する結合アッセイなどがある。本発明の実施において有用であり得る各種スクリーニングアッセイは当技術分野では公知であり，例えば米国特許第５，７６３，１９８号，同５，７４７，２７６号，同５，８７７，００７号，同６，２４３，９８０号，同６，２９４，３３０号および同６，２９４，３３０号に記載されたものがあり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
アッセイの種々の実施形態では，少なくとも１種の化合物，少なくとも約５％，少なくとも約１０％，少なくとも約１５％，少なくとも約２０％または少なくとも約２５％の化合物が低親和性で結合し得る。一般に，化合物の約２０％までが，スクリーニングアッセイにおいて活性を示すことができ，次いで，これらの化合物をハイスループット共結晶学，化合物を共通の構造特性（例えば，構造コアおよび／または形および極性特性）を有するクラスに分類するコンピュータによる解析，および活性を示す化合物間の共通化学構造の同定を用いて直接解析できる。
当業者ならば，決定は特定の状況の必要性にとって適切である基準に基づいたものであり得るということ，および決定はコンピュータソフトウェアプログラムによってなすことができるということは理解されよう。ほとんどどんな数のスキャフォールドも含んでクラスを作製でき，選択される基準は，任意の数のスキャフォールドが，有利であると思われる各クラスに到達するまで，徐々に厳しい基準に基づくものであり得る。
表面プラスモン共鳴
結合パラメーターは表面プラスモン共鳴を用いて，例えば，固定化された結合成分でコーティングされたビアコア(BIAcore)（登録商標）チップ（ビアコア，ジャパン(Biacore， Japan)）を用いて測定できる。表面プラスモン共鳴を用いて，ｓＦｖまたは標的分子に対するその他のリガンド間の反応の微視的結合定数および解離定数を特性決定する。このような方法は，参照により本明細書に組み込まれる以下の参照文献に概説されている。ベリー(Vely)Ｆら，（２０００）ホスホペプチド−ＳＨ２ドメイン相互作用を調べるためのビアコア（登録商標）解析(BIAcore(R) analysis to test phosphoペプチド-SH2 domain interactions)，メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１２１：３１３〜２１頁，リパロト(Liparoto)ら，（１９９９）インターロイキン−２受容体複合体のバイオセンサー解析(Biosensor analysis of the interleukin-2 receptor complex)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・レコグニッション(Journal of Molecular Recognition)１２：３１６〜２１頁，リップシュルツ(lipschultz)ら，（２０００）表面プラスモン共鳴を用いる複合体動力学の解析のための実験設計(Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance)，メソッヅ(Methods)２０（３）：３１０〜８頁，マルムクヴィスト(Malmqvist)，（１９９９）ビアコア：生体分子の相互作用を特性決定するための親和性バイオセンサーシステム(BIACORE: an 親和性 biosensor system for characterization of biomolecular interactions)，バイオケミカル・ソサイエティー・トランサクションズ２７：３３５〜４０頁，アルサン(Alfthan)，（１９９８）抗体工学におけるツールとしての表面プラスモン共鳴バイオセンサー(Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibody engineering)，バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニクス(Biosensors & Bioelectronics)１３：６５３〜６３頁，フィバッシュ(Fivash)ら，（１９９８）高分子相互作用のためのビアコア(BIAcore for macromolecular interaction)，カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)９，９７〜１０１頁，プライス(Price)ら，（１９９８）ＩＳＯＢＭ ＴＤ−４ワークショップでの概略報告：ＭＵＣ１ムチンに対する５６種のモノクローナル抗体の解析(Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop: analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin.)チューモア・バイオロジー(Tumour Biology)１９付録１：１〜２０頁，マルムクヴィスト(Marmqvist)ら，（１９９７）生体分子相互作用解析：タンパク質の機能解析のための親和性バイオセンサー技術(Biomolecular interaction analysis: 親和性 biosensor technologies for functional analysis of proteins)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１：３７８〜８３頁，オーシャネシー(O'Shannessy)ら，（１９９６），バイオセンサー技術によるリガンド結合の特性決定における偽一次速度式挙動から得た偏差の解釈(Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology)，アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２３６：２７５〜８３頁，マルムボリ(Malmborg)ら，（１９９５）抗体工学におけるツールとしてのビアコア(BIAcore as a tool in antibody engineering)，ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of lmmunological Methods.)１８３：７〜１３頁，ヴァン・レゲンモルテル(Van Regenmortel)，（１９９４）組換えタンパク質を特性決定するためのバイオセンサーの使用(Use of biosensors to characterize recombinant proteins)，デベロップメンツ・イン・バイオロジカル・スタンダーダイゼーション(Developments in Biological Standardization)８３：１４３〜５１頁およびオーシャネシー(O'Shannessy)，（１９９４）高分子相互作用の運動速度定数および平衡結合定数の決定：表面プラスモン共鳴文献の批評(Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature)，カレント・オピニオンズ・イン・バイオテクノロジー(Current Opinions in Biotechnology)５：６５〜７１頁。
結合パラメーターは表面プラスモン共鳴を用いて，例えば，固定化された結合成分でコーティングされたビアコア(BIAcore)（登録商標）チップ（ビアコア，ジャパン(Biacore， Japan)）を用いて測定できる。表面プラスモン共鳴を用いて，ｓＦｖまたは標的分子に対するその他のリガンド間の反応の微視的結合定数および解離定数を特性決定する。このような方法は，参照により本明細書に組み込まれる以下の参照文献に概説されている。ベリー(Vely)Ｆら，（２０００）ホスホペプチド−ＳＨ２ドメイン相互作用を調べるためのビアコア（登録商標）解析(BIAcore(R) analysis to test phosphoペプチド-SH2 domain interactions)，メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１２１：３１３〜２１頁，リパロト(Liparoto)ら，（１９９９）インターロイキン−２受容体複合体のバイオセンサー解析(Biosensor analysis of the interleukin-2 receptor complex)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・レコグニッション(Journal of Molecular Recognition)１２：３１６〜２１頁，リップシュルツ(lipschultz)ら，（２０００）表面プラスモン共鳴を用いる複合体動力学の解析のための実験設計(Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance)，メソッヅ(Methods)２０（３）：３１０〜８頁，マルムクヴィスト(Malmqvist)，（１９９９）ビアコア：生体分子の相互作用を特性決定するための親和性バイオセンサーシステム(BIACORE: an 親和性 biosensor system for characterization of biomolecular interactions)，バイオケミカル・ソサイエティー・トランサクションズ２７：３３５〜４０頁，アルサン(Alfthan)，（１９９８）抗体工学におけるツールとしての表面プラスモン共鳴バイオセンサー(Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibody engineering)，バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニクス(Biosensors & Bioelectronics)１３：６５３〜６３頁，フィバッシュ(Fivash)ら，（１９９８）高分子相互作用のためのビアコア(BIAcore for macromolecular interaction)，カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)９，９７〜１０１頁，プライス(Price)ら，（１９９８）ＩＳＯＢＭ ＴＤ−４ワークショップでの概略報告：ＭＵＣ１ムチンに対する５６種のモノクローナル抗体の解析(Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop: analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin.)チューモア・バイオロジー(Tumour Biology)１９付録１：１〜２０頁，マルムクヴィスト(Marmqvist)ら，（１９９７）生体分子相互作用解析：タンパク質の機能解析のための親和性バイオセンサー技術(Biomolecular interaction analysis: 親和性 biosensor technologies for functional analysis of proteins)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１：３７８〜８３頁，オーシャネシー(O'Shannessy)ら，（１９９６），バイオセンサー技術によるリガンド結合の特性決定における偽一次速度式挙動から得た偏差の解釈(Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology)，アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２３６：２７５〜８３頁，マルムボリ(Malmborg)ら，（１９９５）抗体工学におけるツールとしてのビアコア(BIAcore as a tool in antibody engineering)，ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of lmmunological Methods.)１８３：７〜１３頁，ヴァン・レゲンモルテル(Van Regenmortel)，（１９９４）組換えタンパク質を特性決定するためのバイオセンサーの使用(Use of biosensors to characterize recombinant proteins)，デベロップメンツ・イン・バイオロジカル・スタンダーダイゼーション(Developments in Biological Standardization)８３：１４３〜５１頁およびオーシャネシー(O'Shannessy)，（１９９４）高分子相互作用の運動速度定数および平衡結合定数の決定：表面プラスモン共鳴文献の批評(Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature)，カレント・オピニオンズ・イン・バイオテクノロジー(Current Opinions in Biotechnology)５：６５〜７１頁。
ビアコア（登録商標）は表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学特性を使用して，金／ガラスセンサーチップインターフェース，デキストランバイオセンサーマトリックスの表面に位置するデキストランマトリックスに結合しているタンパク質濃度の変化を検出する。簡潔には，タンパク質は既知の濃度でデキストランマトリックスと共有結合しており，タンパク質のリガンドをデキストランマトリックスを通して注入する。センサーチップ表面の反対側に向けられた近赤外線が反射され，また，金フィルム中にエバネセント波を誘導し，これが順に，共鳴角として知られる特定の角度での反射光の強度低下を引き起こす。センサーチップ表面の屈折率が変更されれば（例えば，リガンドの，結合されるタンパク質への結合によって），共鳴角のシフトが生じる。この角度シフトを測定でき，１０００ＲＵが１ｎｇ／ｍｍ2という表面タンパク質濃度の変化に相当するような共鳴単位（ＲＵ）として表す。これらの変化は，センサーグラム(sensorgram)のｙ軸に沿って時間に関して表示され，これはいずれかの生物反応の会合および解離を表す。
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ
ＨＴＳは通常自動化アッセイを用いて，所望の活性について多数の化合物を検索する。通常，ＨＴＳアッセイは，特定の酵素または分子に対して作用する化学物質についてスクリーニングすることによって新規薬物を見出すために用いる。例えば，ある化学物質が酵素を不活化する場合に，疾病を引き起こす細胞内プロセスの阻止において有効であるとわかる場合がある。ハイスループット法によって研究者が，ロボットハンドリングシステムおよび結果の自動解析を用いて各標的分子に対して何千もの種々の化学物質を極めて迅速にアッセイすることが可能になる。
ＨＴＳは通常自動化アッセイを用いて，所望の活性について多数の化合物を検索する。通常，ＨＴＳアッセイは，特定の酵素または分子に対して作用する化学物質についてスクリーニングすることによって新規薬物を見出すために用いる。例えば，ある化学物質が酵素を不活化する場合に，疾病を引き起こす細胞内プロセスの阻止において有効であるとわかる場合がある。ハイスループット法によって研究者が，ロボットハンドリングシステムおよび結果の自動解析を用いて各標的分子に対して何千もの種々の化学物質を極めて迅速にアッセイすることが可能になる。
本明細書において，「ハイスループットスクリーニング」または「ＨＴＳ」とは，ロボットスクリーニングアッセイを用いる，多数の化合物（ライブラリー），通常，数十〜数十万の化合物の迅速なインビトロスクリーニングを指す。ウルトラハイスループットスクリーニング（ｕＨＴＳ）は通常，１日当たり１００，０００より多くの試験に加速されたハイスループットスクリーニングを指す。
ハイスループットスクリーニングを達成するためには，サンプルをマルチコンテナ担体またはプラットフォームに保管することが有利である。マルチコンテナ担体によって，複数の候補化合物の同時測定反応が容易になる。マルチウェルマイクロプレートも担体として使用できる。このようなマルチウェルマイクロプレートおよび多数のアッセイにおけるその使用方法は当技術分野では公知であるだけでなく，市販もされている。
スクリーニングアッセイには，校正目的およびアッセイの要素の適切な操作を確認する目的で対照を含めることができる。通常は反応物のすべてを含むが化学ライブラリーのメンバーは含まないブランクウェルを含める。もう１つの例として，調節剤が探索されている酵素の既知の阻害剤（またはアクチベーター）を，アッセイの一サンプルと共にインキュベートしてもよく，得られた酵素活性の低下（または増加）をコンパレータまたは対照として用いる。当然のことながら，調節剤を酵素アクチベーターまたは阻害剤と組合せて，さもなくば既知の酵素調節剤の存在によって引き起こされる酵素活性化または抑圧を阻害する調節剤を見出すこともできる。同様に，スフィンゴ脂質標的に対するリガンドを探索する場合には，標的の既知のリガンドを対照／校正アッセイウェル中に存在させることができる。
スクリーニングアッセイの際の酵素反応および結合反応の測定
例えば，マルチコンテナ担体中で酵素反応および結合反応の進行を測定する技術は当技術分野では公知であり，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
例えば，マルチコンテナ担体中で酵素反応および結合反応の進行を測定する技術は当技術分野では公知であり，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
分光光度アッセイおよび分光蛍光アッセイは当技術分野では周知である。このようなアッセイの例としては，ゴードン(Gordon)，Ａ．Ｊ．およびフォード(Ford)，Ｒ．Ａ．（１９７２）ザ・ケミスツ・コンパニオン：ア・ハンドブック・オブ・プラティカル・データ，テクニーク・アンド・リファレンシズ(The Chemist's Companion: A Handbook Of Practical Data, Techniques, And References)ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク，４３７頁に記載されるような過酸化物の検出のための比色アッセイの使用が挙げられる。
蛍光分光分析法を使用して反応生成物の生成をモニターできる。蛍光法は，一般に，吸収法よりも感度が高い。蛍光プローブの使用は当業者にはよく知られている。概説については，バッシュフォード(Bashford)ら，（１９８７）スペクトロフォトメトリー・アンド・スペクトロフルオロメトリー：ア・プラクティカル・アプローチ(Spectrophotometry and Spectrofluorometry : A Practical Approach)，９１〜１１４頁，ＩＲＬプレス社(IRL Press Ltd.)およびベル(Bell)，（１９８１）スペクトロスコーピー・イン・バイオケミストリー(Spectroscopy In Biochemistry)，第１巻，１１５〜１９４頁，ＣＲＣプレス(CRC Press)。
分光蛍光法では，酵素を，標的酵素によって処理されるとその内部蛍光が変化する基質に曝露する。通常，基質は非蛍光であり，1以上の反応によってフルオロフォアに変換される。それだけには限らない例として，アンプレックス(Amplex)（登録商標）レッド試薬（モレキュラー・プローブス，オレゴン州，ユージーン）を用いてＳＭアーゼ活性を検出できる。アンプレックス（登録商標）レッドを用いてスフィンゴミエリナーゼ活性を測定するために，以下の反応が生じる。まず，ＳＭアーゼがスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドとホスホリルコリンが生じる。第２に，アルカリホスファターゼがホスホリルコリンを加水分解してコリンが生じる。第３に，コリンがコリンオキシダーゼによって酸化されてベタインとなる。最後に，Ｈ2Ｏ2が，ホースラディッシュぺルオキシダーゼの存在下で，アンプレックス（登録商標）レッドと反応して蛍光生成物，レゾルフィンを生じ，それからのシグナルは蛍光分光分析を用いて検出する。
蛍光偏光法（ＦＰ）は，大きな分子，例えば受容体タンパク質との結合の際に生じる，フルオロフォアの分子回転速度の低下と，それによって結合しているリガンドによる偏光蛍光発光が可能になることに基づいている。ＦＰは，平面偏光光での励起後にフルオロフォア発光の垂直および水平成分を測定することによって実験的に定まる。偏光発光は，フルオロフォアの分子回転が低下する場合に増加する。フルオロフォアは，大きな分子（すなわち，受容体）と結合し，フルオロフォアの分子回転を低下させる場合に大きな偏光シグナルを生じる。偏光シグナルの規模は，蛍光リガンド結合の程度と定量的に関連している。したがって，「結合している」シグナルの偏光は，高親和性結合の維持に応じて変わる。
ＦＰは均質な技術であり，反応は極めて迅速であり，平衡に到達するのに数秒〜数分かかる。試薬は安定であり，大きなバッチを調製でき，その結果高い再現性が得られる。これらの特性のために，ＦＰは高度に自動化可能であるとわかっており，単一の，予混，トレーサー−受容体試薬を用いて単一のインキュベーションで実施されることが多い。概説については，オーウィック(Owicki)ら，（１９９７），ハイスループットスクリーニングにおける蛍光偏光アッセイの適用(Application of Fluorescence Polarization Assays in High-Throughput Screening)，ジェネティック・エンジニアリング・ニュウス(Genetic Engineering News)１７：２７頁参照。
ＦＰは，その読み出した情報が発光光度と独立しているので特に望ましく(チェコビッチ(Checovich)，Ｗ．Ｊ．ら，（１９９５）ネイチャー３７５： ２５４〜２５６頁，ダンドリカー(Dandliker)，Ｗ．Ｂ．ら，（１９８１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)７４：３〜２８頁）したがって，蛍光発光をクエンチする着色化合物の存在には非感受性である。ＦＲおよびＦＲＥＴ（以下参照）は，スフィンゴ脂質受容体とそのリガンド間の相互作用をブロックする化合物を同定するのに適している。例えば，パーカー(Parker)ら，（２０００）蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体−リガンド結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assay)，ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング(Journal of Biomolecular Screening)５：７７〜８８頁参照。
ＦＰアッセイに使用できるスフィンゴ脂質に由来するフルオロフォアは市販されている。例えば，モレキュラープローブス(Molecular Probes)（オレゴン州，ユージーン）は，現在，スフィンゴミエリンおよび１種のセラミドフルオロフォアを販売している。これらは，それぞれＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ Ｃ５−スフィンゴミエリン），Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ Ｃ１２−スフィンゴミエリン）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬＣ５−セラミド)。米国特許第４，１５０，９４９号，(ゲンタマイシンのイムノアッセイ)には，フルオレセインチオカルバニルゲンタマイシンをはじめとするフルオレセイン標識したゲンタマイシンが開示されている。当業者に周知の方法を用いてさらなるフルオロフォアを調製できる。
例示的正常および偏光蛍光リーダーとしては，ポラリオン(POLARION)（登録商標）蛍光偏光システム（テカン(Tecan) ＡＧ，スイス，ホンブレッヒティコン(Hombrechtikon)）が挙げられる。その他のアッセイ用の一般的なマルチウェルプレートリーダー，例えばヴェルサマックス(VERSAMAX)（登録商標）リーダーおよびスペクトラマックス(SPECTRAMAX)（登録商標）マルチウェルプレートスペクトロフォトメーター（双方ともモレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices)）も利用できる。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は，相互作用を検出するためのもう1つの有用なアッセイであり，これは記載されている。例えば，ハイム(Heim)ら，（１９９６）カレント・バイオロジー(Current Biology)６：１７８〜１８２頁，ミトラ(Mitra)ら，（１９９６）ジーン(Gene)１７３：１３〜１７頁およびセルビン(Selvin)ら，（１９９５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２４６：３００〜３４５頁参照。ＦＲＥＴは，既知の励起および発光波長を有する，近接近している２種の蛍光物質間のエネルギーの移動を検出する。例としては，タンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として発現できる。２種の蛍光タンパク質が近接している場合，例えばタンパク質が標的分子と特異的に相互作用する場合に，共鳴エネルギーが，励起された分子から別のものへ移動し得る。結果として，サンプルの発光スペクトラムがシフトし，これを蛍光光度計，例えばｆＭＡＸマルチウェル蛍光光度計（モレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices），カリフォルニア州，サニーベール）によって測定することができる。
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は，標的分子との相互作用を検出するために特に有用なアッセイである。ＳＰＡは製薬産業において広く用いられており，記載されている（ハンゼルマン(Hanselman)ら，（１９９７）ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research)３８：２３６５〜２３７３頁，カール(kahl)ら，（１９９６）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２４３：２８２〜２８３頁，アンデンフレンド(Undenfriend)ら，（１９８７）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)１６１：４９４〜５００頁）。米国特許第４，６２６，５１３号および同４，５６８，６４９号および欧州特許第０，１５４，７３４号も参照。ある市販のシステムは，フラッシュプレート(FLASHPLATE)（登録商標）シンチラントコートされたプレート（ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ(NEN Life Science Products)，マサチューセッツ州，ボストン）を用いている。
標的分子は，種々の周知の手段によってシンチレータープレートと結合できる。融合タンパク質，例えば，ＧＳＴ，Ｈｉｓ６またはＦｌａｇ融合タンパク質と結合するよう誘導体化されているシンチラントプレートを利用できる。標的分子がタンパク質複合体または多量体である場合には，まず一方のタンパク質またはサブユニットをプレートに結合することができ，次いで，結合条件下で複合体のもう一方の成分を後で加えることができ，その結合している複合体が得られる。
通常のＳＰＡアッセイでは，発現プール中の遺伝子産物を放射標識しておき，これをウェルに加え，固定化された標的分子である固相およびウェル中のシンチラントコーティングとの相互作用を可能にする。アッセイを直ちに測定してもよいし，平衡に到達させることもできる。どちらにしても，放射標識がシンチラントコーティングと十分に近接する場合に，トップカウントＮＸＴ(TOPCOUNT NXT)（登録商標）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パッカード・バイオサイエンス社(Packard BioScience Co.)，コネチカット州，メリデン）などの装置によって検出可能なシグナルが生じる。放射標識された発現産物が標的分子と結合する場合には，放射標識は，検出可能なシグナルを生じるのに十分なほど長くシンチラントと近接しているままである。
対照的に，標的分子と結合しないか，短時間しか結合しない，標識されたタンパク質は，バックグラウンドを上回るシグナルを生じるのに十分なほど長い間シンチラントと近いままではない。ランダムなブラウン運動によって引き起こされるシンチラントの近くで過ごす時間もいずれも，有意な量のシグナルをもたらさない。同様に，発現ステップの際に用いられる，残存する組み込まれていない放射標識も存在し得るが，標的分子と相互作用しているというよりもむしろ溶液中にあるため，有意なシグナルは生成しない。これらの非結合相互作用は，それゆえ，あるレベルのバックグラウンドシグナルを引き起こすが，これは数学的に除去できる。多すぎるシグナルが得られる場合には，塩またはその他の修飾因子を，所望の特異性が得られるまでアッセイプレートに直接加えることができる（ニコールズ(Nichols)ら，（１９９８）アナリティカル・バイオケミストリー，２５７：１１２〜１１９頁）。
化合物および分子スキャフォールドのアッセイ
スキャフォールドの好ましい特徴としては，低分子量（例えば，３５０Ｄａ未満，または約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３００ダルトン）であることが挙げられる。スキャフォールドのｃｌｏｇＰは−１〜８であることが好ましく，６，５または４未満がより好ましく，３未満が最も好ましい。特定の実施形態では，ｃｌｏｇＰは，−１〜上限２，３，４，５，６または８の範囲であるか，０〜上限２，３，４，５，６または８の範囲である。回転可能な結合の好ましい数は，５未満であり，４未満がより好ましい。水素結合ドナーおよびアクセプターの数は６より小さいことが好ましく，５より小さいことがより好ましい。有用であり得るさらなる基準は，極性表面積が５未満である。特定の適用についての基準を同定するのに有用であり得る手引きは，リピンスキ(Lipinski)ら，（１９９７）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー２３，３〜２５頁に見出すことができ，これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
スキャフォールドの好ましい特徴としては，低分子量（例えば，３５０Ｄａ未満，または約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３００ダルトン）であることが挙げられる。スキャフォールドのｃｌｏｇＰは−１〜８であることが好ましく，６，５または４未満がより好ましく，３未満が最も好ましい。特定の実施形態では，ｃｌｏｇＰは，−１〜上限２，３，４，５，６または８の範囲であるか，０〜上限２，３，４，５，６または８の範囲である。回転可能な結合の好ましい数は，５未満であり，４未満がより好ましい。水素結合ドナーおよびアクセプターの数は６より小さいことが好ましく，５より小さいことがより好ましい。有用であり得るさらなる基準は，極性表面積が５未満である。特定の適用についての基準を同定するのに有用であり得る手引きは，リピンスキ(Lipinski)ら，（１９９７）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー２３，３〜２５頁に見出すことができ，これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
スキャフォールドは，スキャフォールドの置換部分をタンパク質結合部位のポケット中に位置させる立体配置で，所定のタンパク質結合部位と結合できることが好ましい。また，特に合成反応によって，化学的に修飾し，コンビナトリアルライブラリーを容易に作製できる，化学的に扱いやすい群を有することが，スキャフォールドの好ましい特徴であり得る。また，スキャフォールド上にその他の部分を結合でき，スキャフォールドと注目するタンパク質との結合を妨害しないが，スキャフォールドを所望の特性，例えば，スキャフォールドの細胞および／または器官への活発な輸送，解析を容易にするためにスキャフォールドをクロマトグラフィーカラムに結合されることを可能にすること，または別の所望の特性を達成させる位置を有することも好ましいことであり得る。分子スキャフォールドは標的分子と何らかの親和性で，例えば高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合できる。
したがって，前記の基準を利用して，所望の特質を有する，試験するための多数の化合物を選択することができる。記載した基準を有する多数の化合物は，市場で入手でき，方法が適用される個々の必要性に応じてアッセイのために選択できる。
「化合物ライブラリー」または「ライブラリー」とは，種々の化学構造を有する種々の化合物の収集物である。化合物ライブラリーはスクリーニング可能である。すなわち，その中の化合物ライブラリーメンバーをスクリーニングアッセイに付すことができる。好ましい実施形態では，ライブラリーメンバーは，約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３５０ダルトンという分子量を有し得る。ライブラリーの例は前記で示されている。
本発明のライブラリーは，標的分子と低親和性で結合する少なくとも１種の化合物を含み得る。候補化合物のライブラリーは，多数の異なるアッセイ，例えば前記のもの，例えば蛍光偏光アッセイによってアッセイできる。ライブラリーは，化学合成されたペプチド，ペプチドミメティックス，または大きいものであるか小さいものであり，焦点が絞られたものであるか焦点が絞られたものでない，コンビナトリアルケミカルのアレイからなっていてもよい。「焦点が絞られた」とは，化合物の収集物が，従前に特性決定された化合物および／またはファルマコフォア構造を用いて調製されていることを意味する。
化合物ライブラリーは，自然源から単離された分子，人工的に合成された分子，または１種以上の部分，例えば独立に単離されるか無作為に合成された部分を有するような方法で合成され，単離され，そうでなければ調製された分子を含み得る。化合物ライブラリー中の分子の種類としては，それだけには限らないが，有機化合物，ポリペプチドおよび核酸（それらの用語は本明細書に用いられる通りである），ならびにそれらの誘導体，コンジュゲートおよび混合物が挙げられる。
本発明の化合物ライブラリーは市場で購入でき，または調製でき，またはそれだけには限らないが，コンビナトリアルケミストリー技術，発酵法，植物および細胞抽出物手順などをはじめとするいずれかの手段によって獲得できる（例えば，クウィルラ(Cwirla)ら，（１９９０）バイオケミストリー(Biochemistry)，８７，６３７８〜６３８２頁，ホーテン(Houghten)ら，（１９９１）ネイチャー(Nature)，３５４，８４〜８６頁，ラム(Lam)ら，（１９９１）ネイチャー，３５４，８２〜８４頁，ブレナー(Brenner)ら，（１９９２），プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Prociidings of the National Academy of Sciences of the United States of America)，８９，５３８１〜５３８３頁，Ｒ．Ａ．ホーテン(Houghten)，（１９９３）トレンヅ・イン・ジェネティクス(Trends in Genetics)，９，２３５〜２３９頁，Ｅ．Ｒ．フェルダー(Felder)，（１９９４），チミア(Chimia)，４８，５１２〜５４１頁，ギャロップ(Gallop)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)，３７，１２３３〜１２５１頁，ゴードン(Gordon)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー，３７，１３８５〜１４０１，カレル(Carell)ら，（１９９５），ケミストリー・アンド・バイオロジー(Chemistry and Biology)，３，１７１〜１８３頁，マッデン(Madden)ら，パースペクティブス・イン・ドラッグ・ディスカベリー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design)２，２６９〜２８２頁，エレブル(Lebl)ら，（１９９５）バイオポリマーズ(Biopolymers)，３７，１７７〜１９８頁参照）；共有分子構造の周りに集められた小分子，種々の市販のおよび市販されていない群，天然物によって集められた化学物質の収集物，海洋生物，真菌，細菌および植物の抽出物。
好ましいライブラリーは，均一な反応混合物中に調製でき，ライブラリーのメンバーからの反応していない試薬の分離はスクリーニングに先立って必要ではない。多数のコンビナトリアルケミストリーアプローチが固体化学に基づいたものであるが，液相コンビナトリアルケミストリーはライブラリーを作製可能である（サン(Ｓｕｎ)ＣＭ．（１９９９）液相コンビナトリアルケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)，コンビナトリアル・ケミストリー＆ハイスループットスクリーニング(Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening)２：２２９〜３１８頁。
種々の種類の分子のライブラリーを，それから1以上の事前に選択した特質を有するメンバーを獲得するために調製するが，これは，それだけには限らないが，パラレルアレイ合成(ホートン(Houghton)，（２０００）アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー(Annual Reviews of Pharmacology and Toxicology)４０：２７３〜８２頁)，パラレルアレイおよび混合物ベースの合成コンビナトリアルケミストリー，液相コンビナトリアルケミストリー（メリット(Merritt)，（１９９８）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング(Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening)１：５７〜７２頁，液相コンビナトリアルケミストリー，コー(Coe)ら，（１９９８〜９９）モレキュラー・ディバーシティー(Molecular Diversity)４：３１〜８頁，液相コンビナトリアルケミストリー，サン(Sun)（１９９９）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２，２９９〜３１８頁，液相コンビナトリアル・ケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)；可溶性ポリマーでの合成(synthesis on soluble polymer)（グラバート(Gravert)ら，(１９９７)カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１：１０７〜１３頁），可溶性ポリマーでの合成：新規反応および小分子の構築(Synthesis on soluble polymers: new reactions and the construction of small molecules)などを含む種々の技術によって調製できる。例えば，ドーレ(Dolle)ら，（１９９９）ジャーナル・オブ・コンビナトリアル・ケミストリー(Journal of Combinatorial Chemistry)１：２３５〜８２頁，コンビナトリアルライブラリー合成の広範囲にわたる調査(Comprehensive survey of cominatorial library synthesis)：１９９８，フレイジンガー(Freidinger)ＲＭ．，(１９９９)ペプチドおよびタンパク質受容体の非ぺプチド性リガンド(Nonpeptidic ligands for ペプチド and protein receptors)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)およびクンヅ(Kundu)ら，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug Research)，５３：８９〜１５６頁，コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーの，ポリマーによって支持される合成(Combinatorial chemistry: polymer supported synthesis of ペプチド and non-ペプチド libraries)参照。化合物には，同定を容易にするために臨床的にタグをつけることができる（チャバラ(Chabala)（１９９５）カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー６：６３３〜９頁，固相コンビナトリアルケミストリーおよびリードを同定するための新規タギング法(Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads)）。
炭水化物のコンビナトリアル合成およびオリゴサッカライドを含むライブラリーは記載されている（シュバイツァー(Schweizer)ら，（１９９９）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー３：２９１〜８頁，炭水化物のコンビナトリアル合成(Combinatorial synthesis of carbohydrate)）。天然物ベースの化合物ライブラリーの合成も記載されている（ウェスヨハン(Wessjohann)，（２０００）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー４：３０３〜９頁，天然物ベースの化合物ライブラリーの合成(Synthesis of natural-product based compound libraries)）。
核酸のライブラリーは，それだけには限らない例として，アプタマーの単離のために，本明細書に記載されたものをはじめとする種々の技術によって調製される。ストレプトアビジン磁性ビーズ上に提示されたオリゴヌクレオチドおよびポリアミノオリゴヌクレオチドを含むライブラリーが知られている（マルキエヴィッツ(Markiewicz)ら，（２０００）合成オリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーおよびその適用(Synthetic oligoヌクレオチド combinatorial libraries and their applications)，ファルマコ(Farmaco)５５:１７４〜７頁）。核酸ライブラリーは，パラレルサンプリングと合わせることができ，自動質量分析（エンジャルバル(Enjalbal)Ｃ．マルチネス(Martinez)Ｊ．オーバグナック(Aubagnac)ＪＬ，(２０００)コンビナトリアルケミストリーにおける質量分析(Mass spectrometry in combinatorial chemistry)，マス・スペクトロメトリー・レビューズ(Mass Spectrometry Reviews)１９：１３９〜６１頁）およびパラレルタギング（ペリン(Perrin)ＤＭ，認識および触媒のための核酸：特色，制限および将来の展望(Nucleic acids for recognition and catalysis: landmarks, limitations, and looking to the future)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：２４３〜６９頁）などの複雑な手順をともなわず複雑度を低下できることが知られている。
ペプチドミメティックスは，コンビナトリアルケミストリーおよび固相合成を用いて同定されている（キム(Kim)ＨＯ．カーン(kahn)Ｍ．（２０００）合理的薬物設計とコンビナトリアルケミストリーの融合：ぺプチド二次構造ミメティックスの開発および適用(A merger of rational drug design and combinatorial chemistry : development and application of ペプチド secondary structure mimetics)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：１６７〜８３頁，アルオベイディ(al-obeidi)，（１９９８）モレキュラー・バイオテクノロジー(Molecular Biotechnology)９：２０５〜２３頁，ペプチドおよびぺプチドミメリックライブラリー(ペプチド and peptidomimetric libraries)。分子多様性および薬物設計(Molecular diversity and drug design)）。合成は完全に無作為であってもよく，一部既知ポリペプチドに基づいたものであってもよい。
ポリペプチドライブラリーは，種々の技術にしたがって調製できる。簡潔には，ファージディスプレイ技術を用いてポリペプチドリガンドを製造でき（グラム(Gram)Ｈ．，（１９９９）タンパク質分解およびシグナル伝達におけるファージディスプレイ(Phage display in proteolysis and signal transduction)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：１９〜２８頁），これをペプチドミメティックスの合成の基礎として使用できる。ポリペプチド，制約されたペプチド，タンパク質，タンパク質ドメイン，抗体，一本鎖抗体断片，抗体断片および抗体混合領域が，選択のために繊維状ファージ上にディスプレイされる。
ヒト一本鎖Ｆｖ抗体の個々の変異体の大きなライブラリーが製造されている。例えば，シーゲル(Siegel)ＲＷ．アレン(Allen)Ｂ，パブリック(Pavlik)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．ブラッドブリー(Bradbury)Ａ．，（２０００）ペプチド標的上で選択された一本鎖抗体を用いるタンパク質複合体のマススペクトル解析：機能ゲノム学への適用(Mass spectral analysis of a protein complex using single-chain antibodies selected on a ペプチド target: applications to functional genomics)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０２：２８５〜９３頁，ポール(Poul)ＭＡ．ベセリル(Becerril)Ｂ．ニールセン(Nielsen)ＵＢ．モリソン(Morisson)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２０００）ファージライブラリーからの腫瘍特異的インターナライジングヒト抗体の選択(Selection of tumor-specific internalizing ヒト antibodies from phage libraries.)出典ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０１：１１４９〜６１頁，アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２００１）抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖ抗体を作製するためのファージライブラリー(Phage libraries for generation of anti-botulinum scFv antibodies)，メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１４５：２１９〜４０頁，ヒューズ−ジョーンズ(Hughes-Jones)ＮＣ．バイ(Bye)ＪＭ．ゴリック(Gorick)ＢＤ．マークス(Marks)ＪＤ．アウエハント(Ouwehand)ＷＨ．，（１９９９）ＶＨおよびＶＬ生殖系列遺伝子を用いるＲｈ Ｆｖファージ−抗体の合成(Synthesis of Rh Fv phage-antibodies using VH and VL germline genes)，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(British Journal of Haematology)１０５：８１１〜６頁，マッコール(McCall)ＡＭ．アモロソ(Amoroso)ＡＲ．ソーテス(Sautes)Ｃ．マークス(Marks)ＪＤ．ウェイナー(Wiener)ＬＭ．，（１９９８）ヒトファージディスプレイライブラリーに由来する抗マウスＦｃγＲＩＩ一本鎖Ｆｖ断片の特性決定(Characterization of anti-mouse Fc gamma RII single-chain Fv fragments derived from ヒト phage display libraries)，イムノテクノロジー(Immunotechnology)４：７１〜８７頁，シーツ(Sheets)ＭＤ．アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．フィナーン(Finnern)Ｒ．サージェント(Sargent)Ｐ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．シーア(Schier)Ｒ．ヘミングセン(Hemingsen)Ｇ．ウォン(Wong)Ｃ．ゲルハルト(Gerhart)ＪＣ．マークス(Marks)ＪＤ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．，（１９９８）大きな非免疫ファージ抗体ライブラリーの効率的な構築：タンパク質抗原に対する高親和性ヒト一本鎖抗体の作製（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ９６：７９５で現れる印刷された誤植）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ９５：６１５７〜６２頁参照。
計算機化学（例えば，クンヅ(Kundu)Ｂ．カーレ(khare)ＳＫ．ラストギ(Rastogi)ＳＫ．，（１９９９）コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーのポリマーによって支持された合成(Combinatorial chemistry:polymer supported synthesis of ペプチド and non-ペプチド libraries)，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug research)５３：８９〜１５６頁）およびデータベース検索およびドッキング，ｄｅ ｎｏｖｏ薬物設計およびリガンド結合親和性の推定を用いる構造ベースのリガンドの使用（ジョセフ−マッカーシーＤ．，（１９９９）構造ベースのリガンド設計に対する計算論的アプローチ(Computational approaches to structure-based ligand design)，ファーマコロジ・アンド・セラピューティクス(Pharmacology & Therapeutics)８４：１７９〜９１頁，カークパトリック(Kirkpatrick)ＤＬ．ワトソン(Watson)Ｓ．ウルハク(Ulhaq)Ｓ．，（１９９９）構造ベースの薬物設計：コンビナトリアルケミストリーおよび分子モデリング(Stracture-based drug design: combinatorial chemistry and molecular modeling)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：２１１〜２１頁，エリゼーエフ(Eliseev)ＡＶ．レーン(lehn)ＪＭ．，（１９９９）ダイナミックコンビナトリアルケミストリー：分子ライブラリーの進化的形成およびスクリーニング(Dynamic combinatorial chemistry: evolutionary formation and screening of molecular braries)，カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology & Immunology)２４３：１５９〜７２頁，ボルガー(bolger)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２０３：２１〜４５頁，マーチン(Martin)，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：５８７〜６１３頁，ニードル(Niedle)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：４３３〜４５８頁，米国特許第６，１７８，３８４号）を含む精巧な戦略の助けを借りて，焦点が絞られた化学物質またはスマートケミカルおよびファルマコフォアライブラリーを設計することができる。
Ｘ．結晶学
結合化合物を決定した後，標的に結合している化合物の配向を決定する。この決定には，分子スキャフォールド化合物と標的との共結晶についての結晶学が含まれることが好ましい。大部分のタンパク質の結晶学的プラットフォームは，機器の物理的パラメーターと操作上の都合により最大約５００の，タンパク質標的に結合している化合物，リガンドまたは分子スキャフォールドの共複合体を解析するように，設計することができることが好ましい。結合活性を有するスキャフォールドの数が結晶学法の適用に都合のよい数を超える場合には，少なくとも１つの共通の化学構造を有していることまたは他の所望の特徴を有していることに基づいて，スキャフォールドを群別してもよいし，１以上のクラスから代表的な化合物を選択してもよい。所望の数のクラス（例えば，５００）が得られるまで，一層厳しい判定基準によってクラスを作成することができる。クラスは，例えば，全てがピロール環，ベンゼン環，または他の化学的特徴を有するクラスでは，分子スキャフォールド間の化学構造類似性に基づいたものであり得る。同様に，クラスが形態特徴，例えば，空間充填特徴に基づいたものであってよい。
結合化合物を決定した後，標的に結合している化合物の配向を決定する。この決定には，分子スキャフォールド化合物と標的との共結晶についての結晶学が含まれることが好ましい。大部分のタンパク質の結晶学的プラットフォームは，機器の物理的パラメーターと操作上の都合により最大約５００の，タンパク質標的に結合している化合物，リガンドまたは分子スキャフォールドの共複合体を解析するように，設計することができることが好ましい。結合活性を有するスキャフォールドの数が結晶学法の適用に都合のよい数を超える場合には，少なくとも１つの共通の化学構造を有していることまたは他の所望の特徴を有していることに基づいて，スキャフォールドを群別してもよいし，１以上のクラスから代表的な化合物を選択してもよい。所望の数のクラス（例えば，５００）が得られるまで，一層厳しい判定基準によってクラスを作成することができる。クラスは，例えば，全てがピロール環，ベンゼン環，または他の化学的特徴を有するクラスでは，分子スキャフォールド間の化学構造類似性に基づいたものであり得る。同様に，クラスが形態特徴，例えば，空間充填特徴に基づいたものであってよい。
共結晶学解析は，各スキャフォールドを，スクリーニングアッセイにおいて活性を示したスキャフォールドの濃度においてその標的と共複合体化することにより実施することができる。この共複合体化は，標的分子とともに低濃度の有機溶媒を使用し，その後，各スキャフォールドを有する標的を濃縮することにより達成することができる。好ましい実施形態では，これらの溶媒は５％未満の有機溶媒，例えば，水または別の水性溶媒中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エタノール，メタノールまたはエチレングリコールなどである。標的分子と複合体化した各スキャフォールドを，次いで，適した数（４および２０程度）の結晶化スクリーニング条件を用いてスクリーニングすることができる。好ましい実施形態では，約９６の結晶化スクリーニング条件を実施して，共複合体化および結晶化条件，ならびに標的分子の結合部位におけるスキャフォールドの配向についての十分な情報を得ることができる。さらに，結晶構造を解析して，結合しているスキャフォールドが，物理的に，分子ファミリーメンバーの結合部位内または１以上の結合ポケット内でどのように配向しているかを決定することができる。
タンパク質ファミリーに対してどれが最も適したスキャフォールドであるかを決定するためには，標的タンパク質に結合した化合物の原子座標を決定することが望ましい。そのため，原子座標を決定するにはＸ線結晶学的解析が最も好ましい。選択された化合物は，医薬品化学の適用についてさらに試験することができる。化合物は，医薬品化学用に選択することができ，標的分子におけるそれらの結合位置に基づいて試験される。例えば，化合物が結合部位に結合する場合には，標的分子の結合部位におけるその化合物の結合位置を，化合物の化学的に扱いやすい構造または部分構造において行われ得る化学に関して，さらに化合物のそのような修飾が標的の結合部位の構造または部分構造とどのように相互作用するのかについて検討することができる。従って，標的の結合部位およびスキャフォールドの化学を調査することで，より高い有効性および／または選択性でリガンドに到達するためのスキャフォールドの改変方法について決定することができる。このプロセスによって，共複合体から直接得られた構造および化学情報を利用することにより，有益な薬物製品をもたらすであろうリード化合物をより効率的かつ迅速に設計することが可能であり，結果，より直接的なリガンドの設計を可能にする。種々の実施形態では，結合する全てのスキャフォールドについて，または特定の親和性で結合するものだけ，例えば，高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合するものだけについて共結晶学を実施することが望ましい。また，親和性の任意の組合せで結合するスキャフォールドの選択について，共結晶学を実施することも有利であろう。
標準的なＸ線タンパク質回折研究，例えば，Ｘ線イメージプレート検出器またはシンクロトロンビームラインを用いるＲｉｇａｋｕ ＲＵ−２００（登録商標）（リガク(Rigaku)，日本，東京）を使用することによるなどを共結晶で実施し，標準的なＸ線検出器，例えばＣＣＤ検出器またはＸ線イメージプレート検出器などで回折データを測定することができる。
約２００の共結晶にＸ線結晶学を実施すると，通常，約５０の共結晶の構造がもたらされ，それによって化学における検証に約１０のスキャフォールドが提供され，最終的には標的分子に対して約５の選択的リードがもたらされる。
仮想アッセイ
提供する一セットの座標から複合体化された標的と化合物の三次元グラフを作成する市販のソフトウェアを使用して，化合物が標的に結合した場合にどのように配向されているかを図で示し，研究することができる（例えば，ＱＵＡＮＴＡ（登録商標），アクセレリス(Accelerys)，カリフォルニア州，サンディエゴ）。従って，標的の結合部位における結合ポケットの存在は，本発明において特に有用であり得る。これらの結合ポケットは，結晶学的構造決定によって示され，標的の結合部位への化合物の結合に関与する正確な化学的相互作用を示す。当業者ならば，その図を用いて，複合体において非占有スペースがどこに存在し，どの化学的部分構造がそのスペースを埋めるのに適したサイズおよび／または電荷特性を有しているのかを検討することにより，結合または別の所望の効果を強化するために，化学基を付加し，置換し，修飾し，または除去するスキャフォールドの場所を決定できることが分かるであろう。また，当業者ならば，結合部位内の領域がフレキシブルであり得，スキャフォールドの結合の結果としてその特性が変化することができ，所望の効果を達成するために，化学基をそういった領域に特異的にターゲッティングできることも分かるであろう。分子スキャフォールド上の特定の位置を，適した化学的部分構造が結合できる場所および立体構造，ならびにどの部位が最も有利な化学を利用可能にするのかについて検討することができる。
提供する一セットの座標から複合体化された標的と化合物の三次元グラフを作成する市販のソフトウェアを使用して，化合物が標的に結合した場合にどのように配向されているかを図で示し，研究することができる（例えば，ＱＵＡＮＴＡ（登録商標），アクセレリス(Accelerys)，カリフォルニア州，サンディエゴ）。従って，標的の結合部位における結合ポケットの存在は，本発明において特に有用であり得る。これらの結合ポケットは，結晶学的構造決定によって示され，標的の結合部位への化合物の結合に関与する正確な化学的相互作用を示す。当業者ならば，その図を用いて，複合体において非占有スペースがどこに存在し，どの化学的部分構造がそのスペースを埋めるのに適したサイズおよび／または電荷特性を有しているのかを検討することにより，結合または別の所望の効果を強化するために，化学基を付加し，置換し，修飾し，または除去するスキャフォールドの場所を決定できることが分かるであろう。また，当業者ならば，結合部位内の領域がフレキシブルであり得，スキャフォールドの結合の結果としてその特性が変化することができ，所望の効果を達成するために，化学基をそういった領域に特異的にターゲッティングできることも分かるであろう。分子スキャフォールド上の特定の位置を，適した化学的部分構造が結合できる場所および立体構造，ならびにどの部位が最も有利な化学を利用可能にするのかについて検討することができる。
標的タンパク質への化合物の結合力を理解することにより，どの化合物をスキャフォールドとして使用するのが最も有利なのか，そしてリガンドの設計においてどの特性を操作するのが最も効果的なのかが明らかになる。当業者ならば，立体結合，イオン結合，水素結合，および他の影響力が標的−化合物複合体の維持または強化の一因として考えられるということが分かるであろう。脱溶媒和ペナルティーのような他のエネルギー効果を明らかにするために，自動計算法，例えばドッキングおよび／または自由エネルギー摂動（ＦＥＰ）でさらなるデータを得てもよい。選択された化合物は，標的との化学的相互作用についての情報を得るために，または化合物の結合の選択性を高め得る化学修飾を解明する目的で使用することができる。
共結晶構造のデータを用いて，コンピュータモデル，例えば，相同性モデル（すなわち，既知の，実験的に得られた構造に基づくもの）を構築することができる。標的分子がタンパク質または酵素である場合には，相同性モデルの作成に好ましい共結晶構造が，モデリングされるタンパク質配列の結合部位において高い配列同一性を有し，それらのタンパク質は選択的に同じクラスおよび／またはフォールドファミリー内のものとなる。タンパク質クラスの活性部位において保存される残基の知識を用いて，結合部位を厳密に表す相同性モデルを選択することができる。さらに，相同性モデルを使用して，標的タンパク質に対するアポまたは共結晶構造が存在する代替物タンパク質の構造情報をマッピングすることができる。
仮想スクリーニング法，例えば，ドッキングはまた，スキャフォールド，化合物および／またはコンビナトリアルライブラリーメンバーの，相同性モデルとの結合形態ならびに親和性の予測にも使用できる。このデータを用い，コンピュータソフトウェアを使って「仮想実験」を実施することにより，多大な資源をセーブすることができ，当業者ならば，実際にリガンドを合成し，共結晶化を行う必要なく，どの化合物が適したスキャフォールドまたはリガンドであるのかを決定することが可能になる。このようにして，どの化合物が実際の合成および共結晶化に値するかを決定することができる。このような化学的相互作用を理解することは，標的タンパク質とより有利に相互作用し，および／または他のものよりも一タンパク質ファミリーメンバーに対して選択性の高い薬物の発見および設計に役立つ。従って，これらの原理を適用することにより，優れた特性を有する化合物を発見することができる。
もちろん，共結晶の形成を促すために，標的分子製剤に共結晶化を促進する添加剤を含めることができる。タンパク質または酵素の場合では，調べるスキャフォールドをタンパク質製剤に添加し，それが濃度約１ｍｇ／ｍｌで存在することが好ましい。また，製剤が０％〜１０％（ｖ／ｖ）間の有機溶媒，例えば，ＤＭＳＯ，メタノール，エタノール，プロパンジオールもしくは１，３ ジメチルプロパンジオール（ＭＰＤ）またはそれらの有機溶媒のいくつかの組合せを含んでいてもよい。化合物を，好ましくは有機溶媒に濃度約１０ｍＭに溶かし，それをタンパク質サンプルに濃度約１００ｍＭに添加する。次いで，タンパク質−化合物複合体をタンパク質の終濃度，約５〜約２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。複合体化および濃縮ステップは，９６-ウェルフォーマットの濃縮装置（例えば，アミコン社(Amicon Inc.)，ニュージャージー州，ピスカタウェイ）を用いて実施できることが好都合である。結晶化している製剤中に存在するバッファーおよび他の試薬は，結晶化を促進するかまたは結晶化条件に適合する他の成分，例えばＤＴＴ，プロパンジオール，グリセロールを含み得る。
結晶化実験は，濃縮したタンパク質−化合物複合体の少分量（１μｌ）を９６ウェルフォーマットに入れ，９６結晶化条件下でサンプリングすることにより準備できる（他のスクリーニングフォーマット，例えば，９６ウェルより大型のプレートも使用できる）。結晶は，一般に９６ウェル結晶化プレートを異なる温度に置くことを含み得る標準的な結晶化プロトコールを用いて得ることができる。必要に応じて，各タンパク質−化合物複合体について温度以外の因子を変えた共結晶化も検討することができる。例えば，大気圧，光または酸素の有無，重量の変化および多くの他の変数は全て調べることができる。当業者ならば，変化させ，検討することが有利であり得る他の変数が分かるであろう。
リガンドの設計および調製
リガンドの設計および調製は，活性なスキャフォールドセット間で共通する化学構造を検討することにより，構造および／または共結晶化データがあってもなくても実施することができる。このプロセスでは，構造−活性仮説を立てることができ，相当な数のスキャフォールド（低親和性で結合するものを含む）に存在することが分かった化学構造が，スキャフォールドの結合にいくらかの影響を及ぼしていると仮定することができる。この結合が生物系（例えば，治療される哺乳類）において起こる場合には，それが所望の生化学的効果を誘導すると推測することができる。最大結合数および／または構造−活性仮説の誤りを立証するために，新規または改変スキャフォールドまたはスキャフォールドから得られたコンビナトリアルライブラリーを調べることができる。次いで，残った仮説を用いて，所望の結合および生化学的効果を達成するリガンドを設計できる。
リガンドの設計および調製は，活性なスキャフォールドセット間で共通する化学構造を検討することにより，構造および／または共結晶化データがあってもなくても実施することができる。このプロセスでは，構造−活性仮説を立てることができ，相当な数のスキャフォールド（低親和性で結合するものを含む）に存在することが分かった化学構造が，スキャフォールドの結合にいくらかの影響を及ぼしていると仮定することができる。この結合が生物系（例えば，治療される哺乳類）において起こる場合には，それが所望の生化学的効果を誘導すると推測することができる。最大結合数および／または構造−活性仮説の誤りを立証するために，新規または改変スキャフォールドまたはスキャフォールドから得られたコンビナトリアルライブラリーを調べることができる。次いで，残った仮説を用いて，所望の結合および生化学的効果を達成するリガンドを設計できる。
しかし，多くの場合では，所望の結合効果（例えば，より高い親和性でのまたはより高い選択性での結合）を達成するためのスキャフォールド改変法の検討には，共結晶学データを有していることが好ましい。タンパク質および酵素の場合では，共結晶学データにより，分子スキャフォールドが結合部位に結合しているタンパク質の結合ポケットが示され，スキャフォールド上の化学的に扱いやすい基に修飾を加えることができることは明らかである。例えば，タンパク質結合部位またはポケットにある小容量のスペースが，スキャフォールドをその容量を埋める小さな化学基を含むように修飾することによって埋めることができる。空隙容量が埋まることによって，より強い結合親和性が生じ，またはタンパク質ファミリーの別のメンバーとの望ましくない結合がなくなると考えられる。同様に，共結晶学データにより，スキャフォールド上の化学基を欠失させることで結合の障害が少なくなり，その結果としてより強い結合親和性または特異性が生じ得ることも示すことができる。
タンパク質の結合部位またはポケットに位置する帯電した化学基の存在をうまく利用することが望ましい。例えば，正電荷を有する基に，分子スキャフォールド上に導入した負に帯電した基を補ってもよい。こうすることによって結合親和性または結合特異性が高まり，その結果，より所望のリガンドが得られると考えられる。多くの場合では，タンパク質結合部位またはポケットの領域は，それらの領域におけるアミノ酸の違いに基づいて，あるファミリーメンバーが別のものに変わることが知られている。このような領域が化学的付加を受けると，化合物を，あるタンパク質標的に対して他のものよりも特異的であることを可能にし，またはより強い親和性で結合することを可能にする特定の相互作用（例えば，疎水性相互作用，静電相互作用またはエントロピー相互作用）が生じるか，または消失する場合があり，そうすることによって，特定のファミリーメンバーに対してより強い選択性または親和性を有する化合物を合成することが可能になる。加えて，特定の領域に，他の領域よりもフレキシブルであることが知られているアミノ酸が含まれていてもよい。これは，タンパク質の二次構造，例えばαヘリックスまたはβ鎖の要素を結ぶループに含まれるアミノ酸に見られることが多い。これらのフレキシブルな領域を化学的部分の付加の対象として，注目するタンパク質標的と化合物との間で生じる特定の相互作用の可能性を高めることもできる。また，インシリコで仮想スクリーニング法を行って，タンパク質ファミリーまたはクラスのメンバーに関する化学的付加，除去，修飾および／または置換の化合物への影響を評価することもできる。
スキャフォールドへの化学構造または部分構造の付加，除去または修飾は，任意の適した化学的部分を用いて実施することができる。例えば，以下の部分（一例として挙げており，限定を意図したものではない）を利用することができる：水素，アルキル，アルコキシ，フェノキシ，アルケニル，アルキニル，フェニルアルキル，ヒドロキシアルキル，ハロアルキル，アリール，アリールアルキル，アルキルオキシ，アルキルチオ，アルケニルチオ，フェニル，フェニルアルキル，フェニルアルキルチオ，ヒドロキシアルキル−チオ，アルキルチオカルバミルチオ，シクロヘキシル，ピリジル，ピペリジニル，アルキルアミノ，アミノ，ニトロ，メルカプト，シアノ，ヒドロキシル，ハロゲン原子，ハロメチル，酸素原子（例えば，ケトンまたはＮ−オキシドを形成する）または硫黄原子（例えば，チオール，チオン，ジアルキルスルホキシドまたはスルホンを形成する）が利用できる部分の例の全てである。
利用できる構造または部分構造のさらなる例として，アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよいアリール；式−ＮＸ2Ｘ3のアミン（式中，Ｘ2およびＸ3は，水素，飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択される）；ハロゲンまたはトリハロメチル；式−ＣＯＸ4のケトン（式中，Ｘ4はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；式−（Ｘ5）nＣＯＯＨのカルボン酸または式（Ｘ6）nＣＯＯＸ7のエステル（式中，Ｘ5，Ｘ6およびＸ7はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，ｎは０または１である）；式（Ｘ8）nＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ8）nＯＸ9のアルコキシ部分（式中，Ｘ8およびＸ9は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよく，ｎは０または１である）；式ＮＨＣＯＸ10のアミド（式中，Ｘ10はアルキル，ヒドロキシルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよい）；ＳＯ2，ＮＸ11Ｘ12（式中，Ｘ11およびＸ12は水素，アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよい，単素環または複素環部分；式−ＣＨＯのアルデヒド；式−ＳＯ2Ｘ13のスルホン（式中，Ｘ13は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；ならびに式−ＮＯ2のニトロである。
分子スキャフォールドおよびリガンド上の結合部位の同定
キナーゼおよびその他の酵素のリガンドの同定および開発に加えて，結合部位における分子スキャフォールドまたは他の結合化合物の配向を決定することにより，結合分子の別の成分への結合についてエネルギー的に許容される部位の同定が可能になる。このような部位では，結合される成分の存在に伴ういかなる自由エネルギーの変化も，化合物とキナーゼとの結合を，結合が壊れる程度に不安定化することはないはずである。好ましくは，結合に伴う結合エネルギーが少なくとも４ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきであり，より好ましくは少なくとも６ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１５ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきである。特定の部位に結合が存在することによって結合エネルギーが３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下，４ｋｃａｌ／ｍｏｌ，５ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは１５ｋｃａｌ／ｍｏｌしか低下しないことが好ましい。
キナーゼおよびその他の酵素のリガンドの同定および開発に加えて，結合部位における分子スキャフォールドまたは他の結合化合物の配向を決定することにより，結合分子の別の成分への結合についてエネルギー的に許容される部位の同定が可能になる。このような部位では，結合される成分の存在に伴ういかなる自由エネルギーの変化も，化合物とキナーゼとの結合を，結合が壊れる程度に不安定化することはないはずである。好ましくは，結合に伴う結合エネルギーが少なくとも４ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきであり，より好ましくは少なくとも６ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１５ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきである。特定の部位に結合が存在することによって結合エネルギーが３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下，４ｋｃａｌ／ｍｏｌ，５ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは１５ｋｃａｌ／ｍｏｌしか低下しないことが好ましい。
多くの場合では，適した結合部位が，結合化合物が結合部位に結合される際に溶媒に露出される部位である。いくつかの場合では，過剰のエネルギーコストを負担することなく酵素の一部に微小変位を起こす結合部位を使用できる。露出部位は種々の方法によって同定することができる。例えば，図形表示または三次元モデルを利用して露出部位を同定できる。図形表示（コンピュータディスプレーなど）では，結合部位に結合されている化合物のイメージを視覚的に検証して，この原子または基が，溶媒に露出し，こうした原子または基での結合が酵素と結合化合物の結合を妨げないように配向されている，化合物の原子または基を明示することができる。結合のエネルギーコストは，結合とエントロピー変化によってもたらされるであろう変化または変形に基づいて算出することができる。
数多くの異なる種類の成分を結合することができる。熟練者ならば，種々の結合に用いられる化学を熟知している。結合することができる成分の例としては，それだけには限らないが，中でも，固相成分，例えばビーズ，プレート，チップおよびウェル；直接または間接標識；リンカー（トレースレスリンカーであってよい）が挙げられる。このようなリンカーは，それら自身が他の成分，例えば，固相媒体，標識および／または結合部分と結合していてもよい。
化合物の結合エネルギーと分子を別の成分と結合するための結合エネルギーへの影響は，種々の入手可能なソフトウェアのいずれかを使用するかまたは手動計算により概算することができる。一例が以下のとおりである。
ｃ−ｋｉｔに対する異なる有機分子の結合エネルギーを評価するために計算を行った。検討する有機分子に，Ｇｌｅｅｖｅｃ，ｃ−ｋｉｔと結合すると確認されている化合物，そしていくつかのリンカーを含めた。
タンパク質−リガンド複合体間の結合エネルギー計算値は，トライポス(Tripos)製ソフトウェアスイートのＦｌｅｘＸ ｓｃｏｒｅ（Ｂｏｈｍスコアリング関数の実行）を使用して得た。その方程式の形を以下の式で示す：
ΔＧbind＝ΔＧtr＋ΔＧhb＋ΔＧion＋ΔＧlipo＋ΔＧarom＋ΔＧrot
（式中，ΔＧtrはリガンドの回転および並進エントロピーの総合損失である定数項であり，ΔＧhbはリガンドとタンパク質間で形成される水素結合であり，ΔＧionはリガンドとタンパク質間のイオン相互作用であり，ΔＧlipoはタンパク質−リガンド接触面に相当する親油性相互作用であり，ΔＧaromはタンパク質の芳香環とリガンド間の相互作用であり，そしてΔＧrotは結合時にリガンドにおける回転可能な結合を制限するエントロピーペナルティーである）。
ΔＧbind＝ΔＧtr＋ΔＧhb＋ΔＧion＋ΔＧlipo＋ΔＧarom＋ΔＧrot
（式中，ΔＧtrはリガンドの回転および並進エントロピーの総合損失である定数項であり，ΔＧhbはリガンドとタンパク質間で形成される水素結合であり，ΔＧionはリガンドとタンパク質間のイオン相互作用であり，ΔＧlipoはタンパク質−リガンド接触面に相当する親油性相互作用であり，ΔＧaromはタンパク質の芳香環とリガンド間の相互作用であり，そしてΔＧrotは結合時にリガンドにおける回転可能な結合を制限するエントロピーペナルティーである）。
この方法により，結晶構造が存在する標的タンパク質に対してリード化合物が有するべき自由エネルギーが評価される（その自由エネルギーがフレキシブルリンカーのエントロピーペナルティーである）。従って，それを用いて，リンカーがスクリーニングされた分子と結合することによって生じた自由エネルギーペナルティー，およびリンカーの自由エネルギーペナルティーを克服するためにリード化合物が有するべき結合エネルギーを評価することができる。この方法では溶媒和を計上していないため，リンカーを別の結合複合体，例えばビオチン：ストレプトアビジン複合体などを介して固相に結合する場合ではエントロピーペナルティーを過大評価する可能性がある。
共結晶は，ｃ−Ｋｉｔの残基とＦＬＴ−３の対応する残基とをスーパーインポーズすることによりアラインした。タンパク質に水素原子を添加し，Ｓｙｂｙｌ内のアンバー(AMBER)９５パラメーターを用いて原子電荷を得た。トライポス製Ｓｙｂｙｌモデルリングスイートで，記載した化合物の修飾を行った。
これらの計算により，所与の標的と強く結合する化合物の結合エネルギー計算値が−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低く，一方，優れたスキャフォールドまたは最適化されていない結合化合物の結合親和性計算値が−１５〜−２０の範囲であり得ることが示される。リンカー，例えばエチレングリコールまたはヘキサトリエンとの結合に対する自由エネルギーペナルティーは，一般に＋５〜＋１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であると推定される。
リンカー
本発明において使用するのに適したリンカーには多くの異なる種類のものが有り得る。リンカーは，結合化合物や特定用途に利用する別の成分との結合に適合するリンカー化学などの因子に基づき，特定用途に向けて選択することができる。さらなる因子としては，それだけには限らないが，リンカー長，リンカーの安定性およびリンカーを適切な時期に除去する能力が挙げられる。例示的リンカーとしては，それだけには限らないが，ヘキシル，ヘキサトリエニル，エチレングリコールおよびペプチドリンカーが挙げられる。また，例えば，プラケット(Plunkett)，Ｍ．Ｊ．およびエルマン(Ellman)，Ｊ．Ａ．，（１９９５），ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry)６０：６００６頁に記載されているように，トレースレスリンカーを使用することもできる。
本発明において使用するのに適したリンカーには多くの異なる種類のものが有り得る。リンカーは，結合化合物や特定用途に利用する別の成分との結合に適合するリンカー化学などの因子に基づき，特定用途に向けて選択することができる。さらなる因子としては，それだけには限らないが，リンカー長，リンカーの安定性およびリンカーを適切な時期に除去する能力が挙げられる。例示的リンカーとしては，それだけには限らないが，ヘキシル，ヘキサトリエニル，エチレングリコールおよびペプチドリンカーが挙げられる。また，例えば，プラケット(Plunkett)，Ｍ．Ｊ．およびエルマン(Ellman)，Ｊ．Ａ．，（１９９５），ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry)６０：６００６頁に記載されているように，トレースレスリンカーを使用することもできる。
結合化合物との結合に利用される典型的な官能基としては，それだけには限らないが，カルボン酸，アミン，ヒドロキシルおよびチオールが挙げられる（それらの例は，「低分子量化合物ライブラリーの固体支持体上でのコンビナトリアルおよびパラレル合成(Solid-supported combinatorial and parallel synthesis of small molecular weight compound libraries)」；（１９９８）テトラヘドロン・オーガニック・ケミストリー・シリーズ第１７巻;ペルガモン(Tetrahedron organic chemistry series Vol. 17; Pergamon);８５頁；に見出すことができる）。
標識
前記のとおり，結合化合物または結合化合物と結合しているリンカーに，標識を結合することもできる。このような結合は，直接的（結合化合物に直接結合される）でもよいし，または間接的（結合化合物と直接または間接的に結合している成分に結合される）でもよい。このように標識することによって化合物の検出が直接あるいは間接的に可能になる。標識の結合は，従来の化学を用いて実施することができる。標識としては，例えば，蛍光標識，放射性同位元素，光散乱粒子，吸光性粒子，磁性粒子，酵素および特異的結合剤（例えば，ビオチンまたは抗体標的部分）が挙げられる。
前記のとおり，結合化合物または結合化合物と結合しているリンカーに，標識を結合することもできる。このような結合は，直接的（結合化合物に直接結合される）でもよいし，または間接的（結合化合物と直接または間接的に結合している成分に結合される）でもよい。このように標識することによって化合物の検出が直接あるいは間接的に可能になる。標識の結合は，従来の化学を用いて実施することができる。標識としては，例えば，蛍光標識，放射性同位元素，光散乱粒子，吸光性粒子，磁性粒子，酵素および特異的結合剤（例えば，ビオチンまたは抗体標的部分）が挙げられる。
固相媒体
結合化合物と直接または間接的に結合できる成分のさらなる例として，種々の固相媒体が挙げられる。リンカーと標識の結合と同様に，固相媒体との結合も従来の化学を用いて実施できる。このような固相媒体としては，例えば，ビーズ，ナノ粒子および繊維などの小型成分（例えば，懸濁液中またはゲルもしくはクロマトグラフィーマトリックス中のもの）が挙げられる。同様に，固相媒体として，プレート，チップ，スライドおよびチューブなどのより大きなものも挙げられる。多くの場合では，このようなものの一部分にのみ（例えば，一般に平面上の一スポットもしくは他の局所要素にまたは一ウェルもしくはウェルの一部に）結合化合物が結合される。
結合化合物と直接または間接的に結合できる成分のさらなる例として，種々の固相媒体が挙げられる。リンカーと標識の結合と同様に，固相媒体との結合も従来の化学を用いて実施できる。このような固相媒体としては，例えば，ビーズ，ナノ粒子および繊維などの小型成分（例えば，懸濁液中またはゲルもしくはクロマトグラフィーマトリックス中のもの）が挙げられる。同様に，固相媒体として，プレート，チップ，スライドおよびチューブなどのより大きなものも挙げられる。多くの場合では，このようなものの一部分にのみ（例えば，一般に平面上の一スポットもしくは他の局所要素にまたは一ウェルもしくはウェルの一部に）結合化合物が結合される。
生物剤の同定
タンパク質についての構造情報を入手することによってまた，有用な生物剤，例えば抗体開発のためのエピトープの同定，活性に影響を及ぼすと思われる突然変異部位の同定，標識，リンカー，ペプチドおよび固相媒体などの物質とタンパク質の結合を可能にする結合部位の同定もなされる。
タンパク質についての構造情報を入手することによってまた，有用な生物剤，例えば抗体開発のためのエピトープの同定，活性に影響を及ぼすと思われる突然変異部位の同定，標識，リンカー，ペプチドおよび固相媒体などの物質とタンパク質の結合を可能にする結合部位の同定もなされる。
抗体（Ａｂｓ）には，バイオテクノロジー，医薬および診断法をはじめとする種々の分野で多様な用途があり，実際に，生命科学研究では抗体は最も有効なツールの１つである。タンパク質抗原に対して向けられたＡｂｓは，線状または天然の三次元（３Ｄ）エピトープのいずれかを認識することができる。３Ｄエピトープを認識するＡｂｓの獲得には，免疫原として天然タンパク質全体（または未変性のコンホーメーションをとる一部分）を使用する必要があるが，残念ながら，これは様々な技術的な理由（例えば，天然タンパク質があまり入手できず，タンパク質が毒性を有し，または高密度抗原提示を利用することが望ましい）から必ずしも選択されない。このような場合には，ペプチドを用いた免疫を代替法とする。もちろん，この方法によって生じたＡｂｓは，線状エピトープを認識するが，起源の天然タンパク質については認識する場合も認識しない場合もある。それでもやはり，それらのＡｂｓは標準的な実験室応用（ウエスタンブロットなど）にとって有用である。免疫原として使用するペプチドの選択は，特定の選抜ルールに従い，および／またはエピトープ予測ソフトウェアを使用することにより成し遂げることができる。
抗原ペプチドの予測法は絶対確実というものではないが，タンパク質由来のどのペプチド断片に抗原性がある可能性が高いかを判定するのに従うことができるいくつかのルールがある。これらのルールもまた，特定のペプチドに対するＡｂが天然タンパク質を認識する可能性を高めることに基づく。
１．抗原ペプチドは，溶媒露出領域に位置し，疎水性および親水性残基の両方を含まなければならない。
既知３Ｄ構造のタンパク質の場合，種々のプログラム（とりわけ，ＤＳＳＰ，ＮＡＣＥＳＳまたはＷＨＡＴＩＦなど）を使用して溶媒露出度を決定できる。
３Ｄ構造が分かっていない場合は，以下のウェブサーバーのいずれかを用いて，露出度を予測する：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰｒｅｄＡｃｃ（ｃ） ＡＣＣｐｒｏ
既知３Ｄ構造のタンパク質の場合，種々のプログラム（とりわけ，ＤＳＳＰ，ＮＡＣＥＳＳまたはＷＨＡＴＩＦなど）を使用して溶媒露出度を決定できる。
３Ｄ構造が分かっていない場合は，以下のウェブサーバーのいずれかを用いて，露出度を予測する：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰｒｅｄＡｃｃ（ｃ） ＡＣＣｐｒｏ
２．ヘリックス領域に位置するペプチドを避け，二次構造（ＳＳ）モチーフを結ぶ長いループに存在するペプチドを選択することが好ましい。これにより，Ａｂが天然タンパク質を認識する可能性が高まる。このようなペプチドは，例えば，結晶構造または結晶構造をベースとする相同性モデルから同定できる。
既知３Ｄ座標を有するタンパク質の場合，ブルックヘブンデータバンクにある関連エントリーの配列関連性からＳＳを得ることができる。ＰＤＢｓｕｍサーバーでは，ｐｄｂレコードのＳＳ解析も提供している。
二次構造が全く得られない場合には，以下のサーバーのいずれかから予測を得る：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰＳＩ−ＰＲＥＤ，ＮＮＳＰなど
既知３Ｄ座標を有するタンパク質の場合，ブルックヘブンデータバンクにある関連エントリーの配列関連性からＳＳを得ることができる。ＰＤＢｓｕｍサーバーでは，ｐｄｂレコードのＳＳ解析も提供している。
二次構造が全く得られない場合には，以下のサーバーのいずれかから予測を得る：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰＳＩ−ＰＲＥＤ，ＮＮＳＰなど
３．可能ならば，タンパク質のＮおよびＣ末端領域にあるペプチドを選択する。タンパク質のＮおよびＣ末端領域は，通常溶媒露出し，構造化されていないため，それらの領域に対するＡｂｓも天然タンパク質を認識する可能性が高い。
４．細胞表面糖タンパク質の場合，最初のペプチドからＮ−グリコシル化に関するコンセンサス部位を含むものを排除する。
Ｎ−グリコシル化部位は，ＳｃａｎｐｒｏｓｉｔｅまたはＮｅｔＮＧｌｙｃを使用して，検出することができる。
Ｎ−グリコシル化部位は，ＳｃａｎｐｒｏｓｉｔｅまたはＮｅｔＮＧｌｙｃを使用して，検出することができる。
さらに，抗原決定基の予測を目的とする，実験により決定したエピトープの種々の生理化学的性質（フレキシビリティ，親水性度，露出度）に基づくいくつかの方法が公開されており，それらの方法を使用することができる。Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘおよびＰｒｅｄｉｔｏｐがその例である。
抗原決定基の予測を目的とする最も簡単な方法は，恐らく，実験により決定したエピトープのアミノ酸残基の頻度に基づくコラスカー(Kolaskar)およびトンガオンカー(Tongaonkar)の方法であろう（コラスカーおよびトンガオンカー（１９９０）タンパク質抗原の抗原決定基の予測のための半経験的方法(A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens.)。ＦＥＢＢＳレター(Letter) ２７６（１〜２）：１７２〜１７４頁）。予測アルゴリズムは以下のとおり動作する：
１．各オーバーラッピング７量体の平均的な傾向を算出し，その結果を７量体の中央の残基（ｉ＋３）に割り当てる。
２．タンパク質全体の平均を算出する。
３．（ａ）タンパク質全体の平均が１．０より大きい場合には，平均的な傾向が１．０より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
３．（ｂ）タンパク質全体の平均が１．０より小さい場合には，タンパク質全体の平均より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
４．全ての残基が上記ステップ３により選択される８量体（原本書類では６量体）を見つけ出す。
１．各オーバーラッピング７量体の平均的な傾向を算出し，その結果を７量体の中央の残基（ｉ＋３）に割り当てる。
２．タンパク質全体の平均を算出する。
３．（ａ）タンパク質全体の平均が１．０より大きい場合には，平均的な傾向が１．０より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
３．（ｂ）タンパク質全体の平均が１．０より小さい場合には，タンパク質全体の平均より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
４．全ての残基が上記ステップ３により選択される８量体（原本書類では６量体）を見つけ出す。
コラスカーおよびトンガオンカーの方法は，ＧＣＧパッケージからでも入手することが可能であり，その方法はコマンドｅｇｃｇで動作する。
また，結晶構造により，その残基での突然変異によってタンパク質の活性が変更する可能性がある残基の同定も可能になる。このような残基としては，例えば，基質と相互作用する残基，保存された活性部位の残基，および三次の相互作用に関わる秩序二次構造の領域内にある残基が挙げられる。活性に作用する可能性が高い突然変異は，異なる分子関係によって異なる。活性に作用する活性部位での突然変異は，通常，電荷−電荷または水素結合相互作用を排除し，または立体的干渉をもたらす置換または欠失である。活性に作用する可能性が高い二次構造領域または分子相互作用領域での突然変異としては，例えば，領域の疎水性／親水性を変更するか，または活性部位付近もしくはその部位を含む領域に，活性部位の重要な残基が置き換わるのに十分な変形を導入する置換が挙げられる。このような置換および／もしくは欠失ならびに／または挿入は認識されるため，突然変異の予測される構造および／またはエネルギー効果は，従来のソフトウェアを使用して算出できる。
ＸＩ．キナーゼ活性アッセイ
活性調節剤についてアッセイしおよび／または特定のキナーゼもしくは群またはキナーゼ群の調節剤の特異性を決定するために，キナーゼ活性についてのいくつかの異なるアッセイを利用できる。以下の実施例に記載されているアッセイの他，当業者ならば，利用できる他のアッセイを知っており，特定の用途に向けてアッセイを改変できる。例えば，使用できるアッセイはキナーゼに関する多数の研究論文に記載されている。例えば，有用なアッセイは，Fryburgら，米国特許公開2002/0165237,Thompsonら，米国特許公開2002/0009764,Pamukcuら，米国特許出願09/046,739,およびPamukcuら,米国特許6,500,610に記載されている。
活性調節剤についてアッセイしおよび／または特定のキナーゼもしくは群またはキナーゼ群の調節剤の特異性を決定するために，キナーゼ活性についてのいくつかの異なるアッセイを利用できる。以下の実施例に記載されているアッセイの他，当業者ならば，利用できる他のアッセイを知っており，特定の用途に向けてアッセイを改変できる。例えば，使用できるアッセイはキナーゼに関する多数の研究論文に記載されている。例えば，有用なアッセイは，Fryburgら，米国特許公開2002/0165237,Thompsonら，米国特許公開2002/0009764,Pamukcuら，米国特許出願09/046,739,およびPamukcuら,米国特許6,500,610に記載されている。
ｃ−Ｋｉｔに使用できるキナーゼ活性についてのアッセイは，実施例に記載した手順を用い，精製されたｃ−Ｋｉｔを用いる以下の手順に従って実施できる。
さらなる代替アッセイでは結合測定を使用できる。例えば，この種のアッセイは，蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）フォーマット，またはストレプトアビジンまたはリン特異的抗体と結合しているドナーおよびアクセプター試薬を変更することによるアルファスクリーン(ΑlphaScreen)（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法(amplified luminescent proximity homogeneous assay)）フォーマットの使用のいずれかにフォーマットできる。
ＸＩＩ．有機合成技術
コンピュータベースの調節剤設計および同定の汎用性は，コンピュータプログラムによってスクリーニングされる構造の多様性にある。コンピュータプログラムにより，極めて多数の分子を含むデータベースを検索することができ，酵素とすでに複合体を形成している調節剤を多種多様な化学的官能基で修飾することができる。この化学的多様性の結果として，キナーゼ機能調節剤候補が予測できない化学形態をとり得る。これらの調節剤候補を構築するという課題に対応する技術分野では，多様な有機合成技術が存在する。これらの有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な参照文献情報源に詳述されている。このような参照文献の一例に，１９９４年３月，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌがある。従って，有機化学合成の当業者ならば，コンピュータベースの方法で同定されたキナーゼ機能の調節剤候補を合成するのに有用な技術を容易に利用することができる。
コンピュータベースの調節剤設計および同定の汎用性は，コンピュータプログラムによってスクリーニングされる構造の多様性にある。コンピュータプログラムにより，極めて多数の分子を含むデータベースを検索することができ，酵素とすでに複合体を形成している調節剤を多種多様な化学的官能基で修飾することができる。この化学的多様性の結果として，キナーゼ機能調節剤候補が予測できない化学形態をとり得る。これらの調節剤候補を構築するという課題に対応する技術分野では，多様な有機合成技術が存在する。これらの有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な参照文献情報源に詳述されている。このような参照文献の一例に，１９９４年３月，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌがある。従って，有機化学合成の当業者ならば，コンピュータベースの方法で同定されたキナーゼ機能の調節剤候補を合成するのに有用な技術を容易に利用することができる。
ＸＩＩＩ．投与
本方法および化合物は，一般にヒト患者に対する治療に使用することができるが，同様に，他の脊椎動物，例えば，他の霊長類，スポーツ用動物およびペット，例えば，ウマ，イヌおよびネコにおける類似または同一疾病を治療する目的でも使用することができる。
本方法および化合物は，一般にヒト患者に対する治療に使用することができるが，同様に，他の脊椎動物，例えば，他の霊長類，スポーツ用動物およびペット，例えば，ウマ，イヌおよびネコにおける類似または同一疾病を治療する目的でも使用することができる。
適した投与形は，一部，使用または投与経路，例えば，経口経路，経皮経路，経粘膜経路，吸入または注射（非経口）による経路に応じて変わる。このような投与形によって化合物を標的細胞に到達させることが可能にならなくてはならない。他の因子については，当技術分野では周知であり，それらには，毒性や化合物または組成物の作用を遅延させる投与形などの考慮が含まれる。技術および製剤については，一般にレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第１８版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン，１９９０（参照により本明細書の一部とされる）に見られる。
化合物は，プロドラッグとして製剤することができる。本明細書において用いる場合，"プロドラッグ"との用語は，代謝されたときに所望の活性化合物を与える化合物を表す。典型的には，プロドラッグは不活性であるか，または活性化合物より低い活性を有するが，取り扱い，投与，または代謝特性に有利な点を与えることができる。例えば，あるプロドラッグは活性化合物のエステルであり，代謝の間に，エステル基が切断されて，活性な薬剤が生成する。また，あるプロドラッグは酵素的に活性化されて，活性化合物を生成するか，または，さらなる化学反応を経て，活性化合物が生成する化合物である。
化合物は，製薬上許容される塩として製剤できる。製薬上許容される塩は，それらの投与量および投与濃度において無毒の塩である。このような塩を調製することで，化合物の生理学的作用を妨げることなく，その物理的特徴が変わり，薬理学的使用が容易になり得る。物理的性質の有用な変化としては，経粘膜投与を容易にするための融点の低下および，より高濃度の薬物の投与を容易にするための溶解度の上昇が挙げられる。
製薬上許容される塩としては，酸付加塩（硫酸塩，塩化物，塩酸塩，フマル酸塩，マレイン酸塩，リン酸塩，スルファミン酸塩，酢酸塩，クエン塩，乳酸塩，酒石酸塩，メタンスルホン酸塩，エタンスルホン酸塩，ベンゼンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホン酸塩，シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩を含むものなど）が挙げられる。製薬上許容される塩は，酸（塩酸，マレイン酸，硫酸，リン酸，スルファミン酸，酢酸，クエン酸，乳酸，酒石酸，マロン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，シクロヘキシルスルファミン酸，フマル酸およびキナ酸など）から得ることができる。
また，製薬上許容される塩として，塩基性付加塩（酸性官能基（カルボン酸またはフェノールなど）が存在している場合にベンザチン，クロロプロカイン，コリン，ジエタノールアミン，エチレンジアミン，メグルミン，プロカイン，アルミニウム，カルシウム，リチウム，マグネシウム，カリウム，ナトリウム，アンモニウム，アルキルアミンおよび亜鉛を含むものなど）も含まれる。例えば，レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第１９版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン第２巻，１４５７頁，１９９５参照。このような塩は，適した対応塩基を用いて調製することができる。
製薬上許容される塩は，標準的な技術により調製することができる。例えば，遊離塩基形態の化合物を適した溶媒（適した酸を含む水溶液またはアルコール水溶液など）に溶かし，その後，溶液を蒸発させることにより単離する。もう１つの例では，遊離塩基と酸を有機溶媒中で反応させることにより塩を調製する。
異なる化合物の製薬上許容される塩が複合体として存在していてもよい。複合体の例としては，８−クロロテオフィリン複合体（例えば，ジメンヒドリナート：ジフェンヒドラミン ８−クロロテオフィリン（１：１）複合体；ドラマミン(Dramamine)に類似）および種々のシクロデキストリン包接化合物が挙げられる。
医薬組成物を製造するために担体または賦形剤を使用することができる。担体または賦形剤は，化合物の投与を容易にするように選択する。担体の例としては炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖（ラクトース，グルコースまたはスクロースなど）またはデンプンタイプ，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油，ポリエチレングリコールおよび生理的に適合する溶媒が挙げられる。生理的に適合する溶媒の例としては，注射用蒸留水（ＷＦＩ）の滅菌溶液，生理食塩水およびデキストロースが挙げられる。
化合物は，静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，経口，経粘膜，直腸，吸入または経皮をはじめ，種々の経路によって投与することができる。経口投与が好ましい。経口投与用には，例えば，化合物をカプセル剤，錠剤および液体製剤（シロップ剤，エリキシル剤および濃縮ドロップ剤など）のような従来の経口投与形に製剤することができる。
経口用医薬製剤は，例えば，活性化合物を固体賦形剤と合わせ，得られた混合物を場合によって粉砕し，必要に応じて，錠剤または糖衣錠コアを得るために適した補助剤を加えた後，その顆粒混合物を加工することにより得ることができる。適した賦形剤としては，特に，糖類（ラクトース，スクロース，マンニトールまたはソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば，トウモロコシデンプン，コムギデンプン，コメデンプン，ジャガイモデンプン，ゼラチン，トラガカントガム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）），および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）のような増量剤がある。必要に応じて，架橋ポリビニルピロリドン，寒天またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤を添加してよい。
糖衣錠コアには適したコーティングを施す。このために，濃縮糖溶液を使用でき，濃縮糖溶液には，例えば，アラビアガム，タルク，ポリ−ビニルピロリドン，カルボポール(carbopol)ゲル，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，ならびに適した有機溶媒または溶媒混合物を場合によって含めてもよい。確認用または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために，錠剤または糖衣錠コーティング剤に染料または色素を添加してよい。
経口使用可能な医薬製剤としては，ゼラチンからできた押し込み型カプセル剤（「ゲルキャップ」），ならびにゼラチンと可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）からできた密閉ソフトカプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤には，有効成分が，増量剤（ラクトースなど），結合剤（デンプンなど）および／または滑沢剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど），さらに，場合によって安定剤と混合した状態で含まれる。ソフトカプセル剤では，活性化合物が適した液体（脂肪油，流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に溶解または懸濁してもよい。さらに，安定剤を添加してもよい。
また，注射（非経口投与）（例えば，筋肉内，静脈内，腹腔内および／または皮下）を用いてもよい。注射用には，本発明の化合物を滅菌溶液，好ましくは生理的に適合するバッファーまたは溶液（生理食塩水，ハンクス溶液またはリンガー溶液など）中に製剤する。さらに，化合物を固体形態に製剤し，それを使用直前に再溶解しまたは懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた製造することができる。
経粘膜，吸入，または経皮手段による投与もまたあり得る。経粘膜または経皮投与用には，バリアに浸透させるのに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は，当技術分野では一般に知られており，それらとしては，例えば，経粘膜投与には，胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに，浸透しやすくするために界面活性剤を使用してよい。経粘膜投与は，例えば，鼻腔用スプレーまたは坐剤（直腸または膣）によって行ってよい。
吸入用には，本発明の化合物を乾燥粉体または適当な溶液，懸濁液，またはエアロゾルとして製剤することができる。粉体および溶液は，当該技術分野において知られる適当な添加物とともに製剤することができる。例えば，粉体は，適当な粉体ベース，例えば，ラクトースまたはスターチを含むことができ，溶液は，プロピレングリコール，滅菌水，エタノール，塩化ナトリウムおよび他の添加物，例えば，酸，アルカリおよびバッファ塩を含むことができる。そのような溶液または懸濁液は，スプレー，ポンプ，アトマイザー，またはネブライザなどを用いて吸入により投与することができる。本発明の化合物はまた，他の吸入療法，例えば，プロピオン酸フルチカゾン，ジプロピオン酸ベクロメタゾン，トリアムシノロン・アセトニド，ブデソニド，およびフロ酸モメタゾン等のコルチコステロイド；アルブテロール，サルメテロールおよびホルモテロール等のベータアゴニスト；臭化イプラトロプリウムまたはチオトロピウム等の抗コリン剤；トレプロスチナールおよびイロプロスト等の血管拡張剤；ＤＮＡａｓｅ等の酵素；治療用タンパク質；イムノグロブリン抗体；一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド；トブラマイシン等の抗生物質；ムスカリンレセプターアンタゴニスト；ロイコトリエンアンタゴニスト；サイトカインアンタゴニスト；プロテアーゼ阻害剤；クロモリンナトリウム；ネドクリルナトリウム；およびナトリウムクロモグリケートとともに用いてもよい。
組み合わせでの使用には，本発明の化合物と１またはそれ以上の他の吸入治療剤，および任意の製剤，例えば，投与されたときにその治療活性を維持するように２つの化合物が化学的に結合している製剤とを一緒にデリバリーすることも含まれることが理解される。組み合わせ使用には，共製剤または化学的に結合した化合物の製剤を投与すること，または，化合物を別々の製剤として投与することが含まれる。別々の製剤は，同じ吸入デバイスからデリバリーすることにより一緒に投与してもよく，別々の吸入デバイスから一緒に投与してもよく，この場合，一緒に投与するとは，互いに短時間の間に投与されることを意味する。本発明の化合物と１またはそれ以上の追加の吸入治療剤との共製剤には，１つの吸入デバイスにより投与することができるように材料を一緒にした調製物が含まれ，これは例えば，１つの製剤中に組み合わせられた別々の化合物，または化学的に結合しているがなおそれらの生物学的活性を維持するように修飾されている化合物を含む。
投与すべき種々の化合物の量は，標準的な手順により化合物ＩＣ50，化合物の生物学的半減期，患者の年齢，背格好および体重，ならびに患者の関連疾患などの因子を考慮して決定することができる。これらの重要性およびその他の因子については，当業者には周知である。一般に，用量は治療される患者のｋｇ当たり約０．０１〜５０ｍｇ間，好ましくは０．１〜２０ｍｇ間である。複数回投与を用いてよい。
ｃ−Ｋｉｔの操作
ヒトをはじめとする種々の哺乳類由来のｃ−Ｋｉｔの全長コード配列およびアミノ酸配列が分かっているため，組換えｃ−Ｋｉｔのクローニング，構築，組換えタンパク質の生産および精製，ｃ−Ｋｉｔの他の生物への導入，ならびにｃ−Ｋｉｔのその他の分子生物学的操作は容易に行われる。
ヒトをはじめとする種々の哺乳類由来のｃ−Ｋｉｔの全長コード配列およびアミノ酸配列が分かっているため，組換えｃ−Ｋｉｔのクローニング，構築，組換えタンパク質の生産および精製，ｃ−Ｋｉｔの他の生物への導入，ならびにｃ−Ｋｉｔのその他の分子生物学的操作は容易に行われる。
核酸操作，例えば，サブクローニング，プローブ標識（例えば，クレノウポリメラーゼ，ニックトランスレーション，増幅を用いるランダム−プライマー標識），配列決定，ハイブリダイゼーションなどのための技術については，科学文献や特許文献（例えば，サムブロック(Sambrook)編，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）第１〜３巻，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory)，（１９８９）；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，オーズベル編，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York)（１９９７）；ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー：ハイブリダイゼーション・ウィズ・ヌクレイック・アシッド・プローブズ，パートＩ。セオリー・アンド・ヌクレイック・アシッド・プレパレーション，ティーセン編，エルゼビア，ニューヨーク(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y.)（１９９３）参照）において詳細に開示されている。
核酸配列は，ＰＣＲ，等温法，ローリングサークル法などのような増幅法を用いて，さらなる使用のために必要に応じて増幅することができ，それらの方法は当業者ならば周知である。例えば，サイキ，ＰＣＲプロトコール中の「ゲノムＤＮＡの増幅」，イニス編，アカデミック・プレス，カリフォルニア州，サンディエゴ(Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA)１９９０，１３〜２０頁；ワラム(Wharam)ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research)。２００１年，２９：Ｅ５４−Ｅ５４；ハフナー(Hafner)ら，バイオテクニークス(Biotechniques)２００１年；３０：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁；チョン(Zhong)ら，バイオテクニークス２００１年；３０：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁参照。
核酸，ベクター，キャプシッド，ポリペプチドなどは，当業者ならば周知の，多数ある一般的手段のいずれかによって解析し，定量することができる。これらの手段としては，例えば，分析生化学的方法（ＮＭＲ，分光測光法，Ｘ線撮影法，電気泳動，キャピラリー電気泳動，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびハイパーディフュージョンクロマトグラフィー(hyperdiffusion chromatography)など），種々の免疫学的方法（例えば，液体またはゲル沈降反応，免疫拡散法，免疫電気泳動，放射性免疫測定法（ＲＩＡ），酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ），免疫蛍光測定法），サザン解析，ノーザン解析，ドットブロット解析，ゲル電気泳動（例えば，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），核酸もしくは標的またはシグナル増幅法，放射性標識法，シンチレーション計測およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
本発明の方法の実施に使用される核酸の準備および操作は，ゲノムサンプルからクローニングし，必要に応じて，例えば，ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離または増幅したインサートをスクリーニングし，再クローニングすることにより行うことができる。本発明の方法に使用される核酸の供給源としては，例えば，哺乳類人工染色体（ＭＡＣ），例えば，米国特許第５，７２１，１１８号；同６，０２５，１５５号参照；ヒト人工染色体，例えば，ローゼンフェルド(Rosenfeld)（１９９７）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)１５：３３３〜３３５頁参照；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体，例えば，ウーン(Woon)（１９９８）ゲノミクス(Genomics)５０：３０６〜３１６頁参照；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ），例えば，カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁参照；コスミド，組換えウイルス，ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
本発明の核酸は，プロモーターに機能しうる形で連結され得る。プロモーターは，核酸の転写を命令する核酸制御配列の一モチーフまたはアレイであり得る。プロモーターは，転写開始部位付近に必須核酸配列（例えば，ポリメラーゼII系プロモーターの場合には，ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた，場合によって，転写開始部位から数千塩基対ほどのところに存在し得る遠位エンハンサーまたはレプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターとは，大抵の環境および発生条件下で機能するプロモーターである。「誘導」プロモーターとは，環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターとは，ある生物の特定の組織タイプでは機能するが，同じ生物のそれ以外の組織タイプでは機能しないプロモーターである。「機能しうる形で連結される」とは，核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２核酸配列との機能的連結（この連結により，発現制御配列が第２配列に対応する核酸の転写を命令する）を意味する用語である。
本発明の核酸はまた，発現ベクターおよびクローニング媒体（例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列）にも提供され得る。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体には，ウイルス粒子，バキュロウイルス，ファージ，プラスミド，ファージミド，コスミド，フォスミド，細菌人工染色体，ウイルスＤＮＡ（例えば，ワクシニア，アデノウイルス，ファウルポックスウイルス(foul pox virus)，仮性狂犬病およびＳＶ４０誘導体），Ｐ１由来人工染色体，酵母プラスミド，酵母人工染色体および特定の目的宿主に特異的な他のベクター（バチルス属(Bacillus)，アスペルギルス属(Aspergillus)および酵母など）が含まれる。本発明のベクターには，染色体，非染色体および合成ＤＮＡ配列が含まれる。数多くの適したベクターが，当業者には公知であり，市販されている。
本発明の核酸を，必要に応じて，通常の分子生物学的方法を用いて種々のベクターのいずれかにクローニングすることができる；増幅した核酸をインビトロでクローニングする方法については，例えば，米国特許第５，４２６，０３９号に開示されている。増幅した配列のクローニングを容易にするために，制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む」ことができる。科学文献や特許文献において詳細に記載されている種々の従来の技術によって，ベクターをゲノムに導入するかまたは細胞の細胞質または核に導入し，発現させてもよい。例えば，ロバーツ(Roberts)（１９８７）ネイチャー(Nature)３２８：７３１頁；シュネイダー(Schneider)（１９９５）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)６４３５：１０；サムブロック(Sambrook)，ティーセンまたはオーズベル参照。ベクターは自然源から単離することができるし，ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供給元から入手することができるし，または合成または組換え法により調製することもできる。例えば，本発明の核酸は，細胞で安定してまたは一時的に発現される発現カセット，ベクターまたはウイルス（例えば，エピソーム発現系）で発現させることができる。発現カセットおよびベクターに選択マーカーを組み込んで，形質転換細胞および配列に選択可能な表現型を与えることができる。例えば，宿主ゲノムへ組み込む必要がないように，選択マーカーがエピソームでの保持および複製のためにコードするものであってよい。
１つの観点においては，本発明のペプチドまたはポリペプチドのインシトゥー発現のために，本発明の核酸をインビボで投与する。核酸は，「裸のＤＮＡ」として（例えば，米国特許第５，５８０，８５９号参照）投与することができるし，または発現ベクター（例えば，組換えウイルス）の形で投与することもできる。核酸は下記のように，腫瘍周辺または腫瘍内を含む任意の経路によって投与することができる。インビボで投与されるベクターは，組換えにより改変したエンベロープまたは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルス（好ましくはバキュロウイルス科(baculoviridiae)，パルボウイルス科(parvoviridiae)，ピコルノウイルス科(picornoviridiae)，ヘルペスウイルス科(herpesveridiae)，ポックスウイルス科(poxviridae)，アデノウイルス科(adenoviridiae)，またはピコルナウイルス科(picornnaviridiae)から選択される）を含むウイルスゲノム由来のものであってよい。親ベクターの性質それぞれの有利な長所を生かしたキメラベクターもまた使用してよい（例えば，フェン(Feng)（１９９７）ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)１５：８６６〜８７０頁参照）。このようなウイルスゲノムは，組換えＤＮＡ技術により，本発明の核酸を含むように改変することができ，複製欠損性であるか，条件付きで複製するかまたは複製能を有するようにさらに操作することができる。別の態様では，ベクターがアデノウイルスゲノム（例えば，ヒトアデノウイルスゲノム由来の複製能のないベクター，例えば，米国特許第６，０９６，７１８号；同６，１１０，４５８号；同６，１１３，９１３号；同５，６３１，２３６号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノム由来のものである。レトロウイルスベクターとしては，ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ），ギボンザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ），サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる。例えば，米国特許第６，１１７，６８１号；同６，１０７，４７８号；同５，６５８，７７５号；同５，４４９，６１４号；ブッシュシェール(Buchscher)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Journal of Virology)６６：２７３１〜２７３９頁；ヨハン(Johann)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー６６：１６３５〜１６４０頁）参照。例えば，核酸およびペプチドのインビトロ生産において，ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法において，標的核酸を細胞に形質導入するために，アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクターを使用することができる，例えば，米国特許第６，１１０，４５６号；同５，４７４，９３５号；オカダ(Okada)（１９９６）ジーン・セラピー(Gene Therapy)３：９５７〜９６４頁参照。
本発明はまた，融合タンパク質，ならびにそれらをコードする核酸にも関する。本発明のポリペプチドは，異種ペプチドまたはポリペプチド（安定性の上昇または精製の簡易化などの所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチドなど）と融合することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドを合成し，例えば，より免疫原性の高いペプチドを生産する目的で，組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するために，抗体および抗体を発現しているＢ細胞を同定および単離するために，など，それに連結される１以上のさらなるドメインとの融合タンパク質として発現させることもできる。検出および精製を容易にするドメインとしては，例えば，固定化金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド，固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン，ならびにＦＬＡＧＳ エクステンション／アフィニティー精製システム（イムネックス社(Immunex Corp)，ワシントン州，シアトル）で利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に，切断可能なリンカー配列（第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（インビトロゲン(インビトロgen)，カリフォルニア州，サンディエゴ）など）を含めることにより精製が容易になる。例えば，発現ベクターには，６個のヒスチジン残基と連結されたエピトープをコードする核酸配列，それに続いてチオレドキシンとエンテロキナーゼ切断部位が含まれる（例えば，ウィリアムス(Williams)（１９９５）バイオケミストリー３４：１７８７〜１７９７頁；ドベリ(Dobeli)（１９９８）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)１２：４０４〜４１４頁参照）。ヒスチジン残基により検出および精製を容易にする一方で，エンテロキナーゼ切断部位により融合タンパク質の残留物からエピトープを精製するための手段を提供する。一態様では，本発明のポリペプチドをコードする核酸が，翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を命令することが可能なリーダー配列により適切な段階で構成される。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関する技術については，科学文献や特許文献（例えば，クロール(Kroll)（１９９３） ＤＮＡ・アンド・セル・バイオロジー（DNA and Cell Biology)１２：４４１〜５３頁参照）において詳細に開示されている。
本発明の核酸およびポリペプチドは，例えば，スクリーニングおよび診断法に用いるために固相支持体に結合することができる。固相支持体としては，例えば，メンブレン（例えば，ニトロセルロースまたはナイロン），マイクロタイターディッシュ（例えば，ＰＶＣ，ポリプロピレンまたはポリスチレン），試験管（ガラスまたはプラスチック），ディップスティック（例えば，ガラス，ＰＶＣ，ポリプロピレン，ポリスチレン，ラテックスなど），微量遠心管，またはガラス，シリカ，プラスチック，金属もしくはポリマービーズ，あるいは他の支持体（紙など）が挙げられる。一固相支持体には，ペプチドに対して操作したヒスチジンタグに対する特異性によって結合する金属（例えば，コバルトまたはニッケル）含有カラムを使用する。
固相支持体への分子の結合は，直接（すなわち，分子が固相支持体と接する）でもよいし，または間接（「リンカー」が支持体に結合されており，このリンカーと目的の分子が結合する）的でもよい。分子は，共有結合により（例えば，システイン残基の単一反応性チオール基を利用（例えば，コリウオド(Colliuod)（１９９３）バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjugate Chemistry)４：５２８〜５３６頁参照））または非共有結合により，具体的に言えば，例えば，固定化抗体（例えば，シューマン(Schuhmann)（１９９１） Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． ３： ３８８〜３９１頁；ルー(Lu)（１９９５）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６７：８３〜８７頁参照；ビオチン／ストレプトアビジン系（例えば，イワネ(Iwane)（１９９７）バイオフィジオロジー・アンド・バイオケミストリー・リサーチ・コミュニケーションズ(Biophysiology . Biochemistry Research Communications)２３０：７６〜８０頁を参照）；金属キレート化，例えば，Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム（例えば，Ｎｇ （１９９５）ラングミュア(Langmuir)１１：４０４８〜５５頁を参照）；ポリヒスチジン融合物の結合用，金属キレート化自己組織化単分子膜（例えば，シーガル(Sigal)（１９９６）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６８：４９０〜４９７頁参照）を介して，固定化することができる。
間接結合は，市販されている種々のリンカーを用いて得ることができる。反応性末端は，種々の官能基のいずれかであり，それらとしては，それだけには限らないが：アミノ反応末端（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル，イミドエステル，アルデヒド，エポキシド，ハロゲン化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネートおよびハロゲン化ニトロアリールなど）；およびチオール反応末端（二硫化ピリジル，マレイミド，チオフタルイミドおよび活性ハロゲンなど）が挙げられる。ヘテロ二官能性架橋剤は，２つの異なる反応性末端（例えば，アミノ反応性末端とチオール反応性末端）を有するものであり，一方，ホモ二官能性試薬は，２つの同じ反応性末端（例えば，スルフヒドリル含有化合物の架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ））を有するものである。スペーサーは，さまざまな長さであってよく，脂肪族でも芳香族でもよい。市販のホモ二官能性架橋剤の例としては，それだけには限らないが，ジメチルアジポイミデート二塩酸塩（ＤＭＡ）；ジメチルピメリミデート二塩酸塩（ＤＭＰ）；およびジメチルスベリミデート二塩酸塩（ＤＭＳ）などのイミドエステルが挙げられる。ヘテロ二官能性試薬としては，市販の活性ハロゲン−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤（Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＬＡＢ）など）およびスルホスクシンイミジル誘導体（スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）（ピアス(Pierce)）など）が挙げられる。別のカップリング剤がＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（ピアス・ケミカルズ(Pierce Chemicals)，イリノイ州，ロックフォード）のようなチオール開裂可能なヘテロ二官能性薬剤である。
また，本発明のポリペプチドおよびペプチドを固相支持体に結合するために抗体を使用することもできる。これはペプチド特異的抗体をカラムに結合することによって直接行われるか，または例えば，既知エピトープ（例えば，タグ（例えば，ＦＬＡＧ，ｍｙｃ）または適した免疫グロブリン定常領域配列（「イムノアドヘシン」，例えば，カポン(Capon)（１９８９）ネイチャー３７７：５２５〜５３１頁（１９８９）参照）に結合された，モチーフを有するペプチドを含むように融合タンパク質キメラを作製することによっても行われる。
本発明の核酸またはポリペプチドをアレイに固定化するか，または塗布してもよい。組成物（例えば，小分子，抗体，核酸など）のライブラリーを本発明の核酸またはポリペプチドの活性と結合し，またはそれを調整するそれらの能力についてスクリーニングし，またはモニタリングするために，アレイを使用することができる。例えば，本発明の一態様では，モニタリングパラメーターが本発明の核酸を含む遺伝子の転写物発現である。アレイまたは「バイオチップ」上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによる，細胞の転写物，または細胞の転写物を代表するか，もしくは細胞の転写物と相補的である核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより，細胞の１以上または全ての転写物を測定することができる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることによって，細胞の転写物の一部または全てを同時に定量することができる。また，ゲノム核酸を含むアレイを用いて，本発明の方法によって作製した新たな操作株の遺伝子型を決定することもできる。また，ポリペプチドアレイを用いて，複数のタンパク質を同時に定量することもできる。
本明細書において「アレイ」または「マイクロアレイ」または「バイオチップ」または「チップ」とは，複数の標的エレメントであり，各標的エレメントが，支持体表面の規定範囲に固定化された，規定量の１以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸を含んでいる。本発明の方法の実施において，既知アレイならびに／またはアレイの作製および使用の方法全て，またはそれらの変形を，例えば，米国特許第６，２７７，６２８号；同６，２７７，４８９号；同６，２６１，７７６号；同６，２５８，６０６号；同６，０５４，２７０号；同６，０４８，６９５号；同６，０４５，９９６号；同６，０２２，９６３号；同６，０１３，４４０号；同５，９６５，４５２号；同５，９５９，０９８号；同５，８５６，１７４号；同５，８３０，６４５号；同５，７７０，４５６号；同５，６３２，９５７号；同５，５５６，７５２号；同５，１４３，８５４号；同５，８０７，５２２号；同５，８００，９９２号；同５，７４４，３０５号；同５，７００，６３７号；同５，５５６，７５２号；同５，４３４，０４９号に開示されているように，全部または一部において組み込むことができる；例えば，ＷＯ９９／５１７７３；ＷＯ９９／０９２１７；ＷＯ９７／４６３１３；ＷＯ９６／１７９５８も参照；例えば，ジョンストン(Johnston)（１９９８）カレント・バイオロジー(Current Biology)８：Ｒ１７１〜Ｒ１７４頁；シューマー(Schummer)（１９９７）バイオテクニークス２３：１０８７〜１０９２頁；カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁；ソリナス−トルド(Solinas-Toldo)（１９９７）ジーンズ・クロモソームス・アンド・キャンサー(Genes,Chromosomes & Cancer)２０：３９９〜４０７頁；ボウテル（Bowtell）（１９９９）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)付録２１：２５〜３２頁も参照。公開されている米国特許出願番号２００１００１８６４２；同２００１００１９８２７；同２００１００１６３２２；同２００１００１４４４９；同２００１００１４４４８；同２００１００１２５３７；同２００１０００８７６５も参照。
宿主細胞および形質転換細胞
本発明はまた，本発明の核酸配列，例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列または本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は，当業者ならばよく知っている，原核細胞，真核細胞（細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，哺乳類細胞，昆虫細胞または植物細胞など）を含む宿主細胞のいずれかであり得る。典型的な細菌細胞としては，大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ），放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内のさまざまな種が挙げられる。典型的な昆虫細胞としては，ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９が挙げられる。典型的な動物細胞としては，ＣＨＯ，ＣＯＳもしくはボーズ(Bowes)黒色腫またはマウスもしくはヒト細胞系が挙げられる。適切な宿主の選択は，当業者の能力の範囲内である。
本発明はまた，本発明の核酸配列，例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列または本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は，当業者ならばよく知っている，原核細胞，真核細胞（細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，哺乳類細胞，昆虫細胞または植物細胞など）を含む宿主細胞のいずれかであり得る。典型的な細菌細胞としては，大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ），放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内のさまざまな種が挙げられる。典型的な昆虫細胞としては，ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９が挙げられる。典型的な動物細胞としては，ＣＨＯ，ＣＯＳもしくはボーズ(Bowes)黒色腫またはマウスもしくはヒト細胞系が挙げられる。適切な宿主の選択は，当業者の能力の範囲内である。
ベクターは，種々の技術のいずれかを用いて宿主細胞に導入でき，それらの技術には，形質転換，トランスフェクション，形質導入，ウイルス感染，遺伝子銃またはＴｉ媒介性遺伝子導入が含まれる。具体的な方法として，リン酸カルシウムトランスフェクション，ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション，リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。
操作した宿主細胞は，プロモーターを活性化し，形質転換体を選択し，または本発明の遺伝子を増幅する必要に応じて改変した従来の培養液で培養することができる。適した宿主株を形質転換し，宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後，適切な手段（例えば，温度シフトまたは化学的誘導）によって選択したプロモーターを誘導でき，細胞に所望のポリペプチドまたはその断片を生産させるために，それらをさらなる期間培養できる。
細胞は，遠心分離により回収し，物理的または化学的手段により破砕することができ，得られた未精製の抽出物をさらなる精製用に確保しておく。タンパク質の発現に使用した微生物細胞は，任意の便宜な方法によって破砕することができ，その方法としては，凍結融解サイクリング，音波処理，機械的破砕または細胞溶解剤の使用が挙げられる。このような方法については，当業者ならば周知である。発現したポリペプチドまたは断片は，回収し，組換え細胞培養物から，硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿，酸抽出，陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー，ホスホセルロースクロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする方法によって精製することができる。必要に応じて，ポリペプチド構造を完成させる際に，タンパク質リフォールディング段階を用いることができる。必要に応じて，最終精製段階で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。
組換えタンパク質を発現させるために，種々の哺乳類細胞培養系も使用することができる。哺乳類発現系の例としては，サル腎臓繊維芽細胞ＣＯＳ−７系および適合ベクター由来のタンパク質を発現することが可能な他の細胞系（Ｃ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系など）が挙げられる。
宿主細胞による構築物を従来どおりに使用して，組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産することができる。組換え生産方法において使用する宿主によって，ベクターを含む宿主細胞によって生産されるポリペプチドは，グリコシル化されていてもよく，グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた，開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいても含まなくてもよい。
また，本発明のポリペプチドを生産するために，無細胞翻訳系を使用することもできる。無細胞翻訳系は，ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に機能しうる形で連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用する。いくつかの態様では，インビトロ転写反応を行う前にＤＮＡ構築物を線状化する。次いで，転写されたｍＲＮＡを適した無細胞翻訳抽出物（ウサギ網状赤血球抽出物など）とともにインキュベートして，所望のポリペプチドまたはその断片を生産する。
発現ベクターには，形質転換宿主細胞選択用の表現型形質を提供するために１以上の選択マーカー遺伝子を含めることができる。（真核細胞培養物にはジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性など，または大腸菌においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性など）。
哺乳類細胞における一時的発現では，目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを，哺乳類発現ベクター，例えば，インビトロゲン社(Invitorogen Corporation)（米国，カリフォルニア州，サンディエゴ；カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市販されているｐｃＤＮＡ１に組み込むことができる。このベクターは，真核細胞系でのｃＤＮＡ発現用および原核生物におけるｃＤＮＡ解析用に設計された４．２ｋｂの多機能プラスミドベクターであり，ベクターには，ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー，スプライスセグメントおよびポリアデニル化シグナル，ＳＶ４０およびポリオーマウイルス複製起点，ならびに配列決定および突然変異誘発のために一本鎖ＤＮＡをレスキューするＭ１３複製起点，センスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の生産のためのＳｐ６およびＴ７ ＲＮＡプロモーターおよびＣｏｌ Ｅ１様高コピープラスミド複製起点が組み込まれている。ポリリンカーは，ＣＭＶプロモーターの下流（およびＴ７プロモーターの３'）に適切に配置されている。
まず，ｐｃＤＮＡＩポリリンカーの適切な制限部位に組み込まれた上記ファージミドからｃＤＮＡインサートを外す。ジャンクションから配列決定を実施して，ｐｃＤＮＡＩにおける正確な挿入方向を確認する。次いで，得られたプラスミドを，一時的発現のために，選択した哺乳類細胞宿主，例えば，サル由来の，繊維芽細胞様ＣＯＳ−１系統細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州，ロックビルよりＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０として入手可能）に導入する。
タンパク質をコードするＤＮＡの一時的発現では，例えば，サムブロックら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル１９８９，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー・ニューヨーク１６．３０〜１６．３７によって記載されている手法に従って，ＤＥＡＥ媒介性ＤＮＡトランスフェクションによりＣＯＳ−１細胞を１０6 ＣＯＳ細胞当たり約８μｇ ＤＮＡでトランスフェクトし，クロロキンで処理する。典型的な方法は以下のとおりである。簡潔には，ＣＯＳ−１細胞を密度５×１０6細胞／ディッシュにてプレーティングし，その後，ＦＢＳ補給ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間増殖させる。次いで，培地を除去し，細胞をＰＢＳ，続いて，培地で洗浄する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥＡＥデキストラン（０．４ｍｇ／ｍｌ），１００μＭクロロキン，１０％ＮｕＳｅｒｕｍ，ＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含むトランスフェクション溶液を細胞に１０ｍｌ量適用する。３７℃にて３時間のインキュベーション後，上記のように細胞をＰＢＳと培地で洗浄し，その後，１０％ＤＭＳＯのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１分間ショックを与える。細胞を１０％ＦＢＳ補給培地で２〜３日間増殖させ，インキュベーション終了時にディッシュを氷上に置き，氷冷ＰＢＳで洗浄した後，細胞を掻きとって取り出す。次いで，細胞を１０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により回収し，タンパク質発現にその後使用するために細胞ペレットを液体窒素で凍結する。凍結細胞の一定分量の融解物のノーザンブロット解析により，保存下の細胞における受容体コードｃＤＮＡの発現を確認する。
同様に，安定したトランスフェクト細胞系も，例えば，宿主として２つの異なる細胞種：ＣＨＯ Ｋ１およびＣＨＯ Ｐｒｏ５を使用して調製することができる。これらの細胞系を構築するために，関連タンパク質についてコードするｃＤＮＡを，安定した発現が可能な哺乳類発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン(インビトロgen)）に組み込むことができる。この部位への挿入ではｃＤＮＡがサイトメガロウイルスプロモーターの発現制御下，ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位とターミネーターの上流，選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０初期プロモーターにより制御される）を含むベクターバックグラウンド内に置かれる。
上記のように構築したプラスミドを導入するための典型的なプロトコールは，以下のとおりである。まず，宿主ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ補給ＭＥＭ培地に密度５×１０5にて播種する。２４時間増殖させた後，プレートに新鮮培地を追加し，３時間後，リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法（サムブロックら，前掲）により細胞をトランスフェクトする。簡潔には，ＤＮＡ ３μｇを混合し，カルシウム緩衝液とともに室温にて１０分間インキュベートする。同量のリン酸緩衝液を加え，懸濁液を室温にて１５分間インキュベートする。次ぎに，インキュベートした懸濁液を細胞に４時間適用し，除去し，１５％グリセロール含有培地で細胞にショックを与える。３分後，細胞を培地で洗浄し，通常の増殖条件において２４時間インキュベートする。Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）含有１０％ＦＢＳ補給α−ＭＥＭ培地でネオマイシンに耐性を示す細胞を選択する。約２〜３週間後，Ｇ４１８耐性細胞のコロニーをそれぞれ単離し，クローン選抜した後，アッセイ用に増殖させる。
本発明に含まれる多数の例が以下に記載される。ほとんどの場合，代替の手法を用いることもできる。以下の例は例示を意図しており，本発明の範囲を制限または限定するものではない。
実施例１：Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5が水素である式Ｉａの化合物の合成
スキーム−１
式Ｉａ［式中，Ｒ2は，アラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである］
スキーム−１
工程−１−化合物２の合成
化合物２は，市販の７−アザインドールから，文献に記載の方法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７，ｐ．４５７）にしたがって合成した。
化合物２は，市販の７−アザインドールから，文献に記載の方法（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７，ｐ．４５７）にしたがって合成した。
工程−２−式ＩＩの化合物の合成
式ＩＩの化合物は，ＴＨＦまたはエーテル等の非プロトン性溶媒中で塩基（例えば，ＢｕＬｉ，ＮａＨ）を用いて脱プロトン化し，アニオンを塩化シリル（例えばＴＩＰＳ）または無水物（例えばＢｏｃ無水物）と反応させることにより合成した。生成物は，標準的な方法（氷冷ブラインでクエンチし，後処理し，フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製）により単離した。
式ＩＩの化合物は，ＴＨＦまたはエーテル等の非プロトン性溶媒中で塩基（例えば，ＢｕＬｉ，ＮａＨ）を用いて脱プロトン化し，アニオンを塩化シリル（例えばＴＩＰＳ）または無水物（例えばＢｏｃ無水物）と反応させることにより合成した。生成物は，標準的な方法（氷冷ブラインでクエンチし，後処理し，フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製）により単離した。
工程−３−式１ａの化合物の合成
式Ｉａの化合物は，式ＩＩの化合物をクロロギ酸イソプロピル（またはクロロギ酸エチル）と，室温でトルエン中で反応させて，３−クロロメチル中間体を得ることにより合成した。この中間体を−７８℃に冷却し，ただちに，グリニヤール試薬（または有機リチウム試薬）とシアン化銅およびＬｉＣｌの溶液との反応により生成した有機銅試薬と反応させた。混合物を−７８℃で１時間撹拌し，次に室温まで暖めた。反応を４：１塩化アンモニウム：水酸化アンモニウムの溶液でクエンチした。反応液を通常の方法により後処理し，フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して，窒素保護生成物を得た。最終生成物は，保護基（Ｂｏｃ，ＴＩＰＳ）を標準的な条件（ＴＦＡまたはＮＨ4Ｆ）を用いて室温で脱保護することにより得た。
式Ｉａの化合物は，式ＩＩの化合物をクロロギ酸イソプロピル（またはクロロギ酸エチル）と，室温でトルエン中で反応させて，３−クロロメチル中間体を得ることにより合成した。この中間体を−７８℃に冷却し，ただちに，グリニヤール試薬（または有機リチウム試薬）とシアン化銅およびＬｉＣｌの溶液との反応により生成した有機銅試薬と反応させた。混合物を−７８℃で１時間撹拌し，次に室温まで暖めた。反応を４：１塩化アンモニウム：水酸化アンモニウムの溶液でクエンチした。反応液を通常の方法により後処理し，フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して，窒素保護生成物を得た。最終生成物は，保護基（Ｂｏｃ，ＴＩＰＳ）を標準的な条件（ＴＦＡまたはＮＨ4Ｆ）を用いて室温で脱保護することにより得た。
スキーム−２
式Ｉａ［式中，Ｒ2はアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである］
工程−１−化合物３の合成
化合物３は，市販の７−アザインドール，化合物１を水中で２時間加熱還流しながらヘキサメチルテトラミンおよび酢酸と反応させることにより合成した。冷却した後，所望の生成物を沈殿させ，濾過により回収した。
化合物３は，市販の７−アザインドール，化合物１を水中で２時間加熱還流しながらヘキサメチルテトラミンおよび酢酸と反応させることにより合成した。冷却した後，所望の生成物を沈殿させ，濾過により回収した。
工程−２−式ＩＩＩの化合物の合成
式ＩＩＩ（Ｐは保護基である）の化合物は，化合物３を適当な試薬と，溶媒（例えば，ＴＨＦ）中で，典型的には室温で１２−１８時間反応させて，保護基（例えば，ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルジアンヒドリド）および塩基（例えば水素化ナトリウム）を導入することにより合成した。生成物は，一般的な方法（例えば抽出）により単離することができる。
式ＩＩＩ（Ｐは保護基である）の化合物は，化合物３を適当な試薬と，溶媒（例えば，ＴＨＦ）中で，典型的には室温で１２−１８時間反応させて，保護基（例えば，ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルジアンヒドリド）および塩基（例えば水素化ナトリウム）を導入することにより合成した。生成物は，一般的な方法（例えば抽出）により単離することができる。
工程−３−式ＩＶの化合物の合成
式ＩＶの化合物は，式ＩＩＩの化合物を，不活性雰囲気下で，典型的には−１０℃に冷却ながら，溶媒（例えば１，２−ジメトキシエタン）中で式Ｒ24ＭｇＣｌ（臭化フェニルマグネシウム）のグリニヤール試薬と，または溶媒（例えばＴＨＦ）中で同等の求核剤と反応させることにより合成した。反応液を，典型的には室温まで暖め，１２−１８時間撹拌した。所望の生成物は，逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
式ＩＶの化合物は，式ＩＩＩの化合物を，不活性雰囲気下で，典型的には−１０℃に冷却ながら，溶媒（例えば１，２−ジメトキシエタン）中で式Ｒ24ＭｇＣｌ（臭化フェニルマグネシウム）のグリニヤール試薬と，または溶媒（例えばＴＨＦ）中で同等の求核剤と反応させることにより合成した。反応液を，典型的には室温まで暖め，１２−１８時間撹拌した。所望の生成物は，逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
工程−４−式Ｉａ（Ｒ2はアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである）の化合物の中間体の合成
式Ｉａの化合物の中間体は，式ＩＶの化合物を，溶媒（例えばエタノール）中で，還元剤（例えば水素化ホウ素ナトリウム）と，典型的には８０℃に加熱して，１−４時間反応させることにより合成した。メタノールを加えることにより反応をクエンチさせ，濃縮し，逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
式Ｉａの化合物の中間体は，式ＩＶの化合物を，溶媒（例えばエタノール）中で，還元剤（例えば水素化ホウ素ナトリウム）と，典型的には８０℃に加熱して，１−４時間反応させることにより合成した。メタノールを加えることにより反応をクエンチさせ，濃縮し，逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
工程−５−Ｒ2がアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24がアリールまたはヘテロアリールである式Ｉａの化合物の合成
Ｒ2がアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24がアリールまたはヘテロアリールである式Ｉａの化合物は，工程４からの中間体を適当な溶媒（例えばジオキサン）中で適当な試薬と反応させて保護基Ｐ（例えば塩酸）を除去することにより合成した。最終生成物は，標準的な方法（例えば逆相調製用高速液体クロマトグラフィー）により単離した。
Ｒ2がアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24がアリールまたはヘテロアリールである式Ｉａの化合物は，工程４からの中間体を適当な溶媒（例えばジオキサン）中で適当な試薬と反応させて保護基Ｐ（例えば塩酸）を除去することにより合成した。最終生成物は，標準的な方法（例えば逆相調製用高速液体クロマトグラフィー）により単離した。
スキーム−３
式Ｉａ［式中，Ｒ2はＣ（Ｏ）Ｒ24であり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである］
工程−１−式Ｉｂ（Ｒ2はアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである）の化合物の合成
式Ｉｂ（Ｒ2はアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである）の化合物は，化合物１を，不活性な溶媒（例えば塩化メチレン）中で，不活性雰囲気下で（例えばアルゴン），活性化剤（例えば臭化メチルマグネシウムおよび二塩化亜鉛または無水塩化アルミニウム）およびアリール酸塩化物（例えば，塩化ベンゾイル）またはヘテロアリール酸塩化物（塩化ニコチン酸）と，室温でまたは還流まで加熱して，１８−２４時間反応させることにより合成した。生成物は，標準的な方法（例えば，抽出およびシリカゲルクロマトグラフィー）により単離した。
式Ｉｂ（Ｒ2はアラルキルまたはヘテロアラルキルであり，Ｒ24はアリールまたはヘテロアリールである）の化合物は，化合物１を，不活性な溶媒（例えば塩化メチレン）中で，不活性雰囲気下で（例えばアルゴン），活性化剤（例えば臭化メチルマグネシウムおよび二塩化亜鉛または無水塩化アルミニウム）およびアリール酸塩化物（例えば，塩化ベンゾイル）またはヘテロアリール酸塩化物（塩化ニコチン酸）と，室温でまたは還流まで加熱して，１８−２４時間反応させることにより合成した。生成物は，標準的な方法（例えば，抽出およびシリカゲルクロマトグラフィー）により単離した。
実施例２：鍵となる中間体ジメチル−（１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−アミン（６）の合成
スキーム−４
スキーム−４
工程−１−ジメチル−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−アミン（２）の合成
三ツ口丸底フラスコに，イソプロピルアルコール（３２０．０ｍＬ）を加え，次に１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（７．１０ｇ，６０．１ｍｍｏｌ），ジメチルアミン塩酸塩（５．４ｇ，０．０６６ｍｏｌ），およびホルムアルデヒド（２．０ｇ，０．０６６ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌し，次に３０分間還流した。懸濁溶液を真空下で蒸発乾固させた。残渣に水（６０．０ｍＬ，３．３３ｍｏｌ）および濃塩酸（６．０ｍＬ，０．２０ｍｏｌ）を加えた。水層をエーテルで抽出し，水性層を炭酸カリウムで中和した。水性層を塩化メチレンで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮して，生成物を取得し，これをさらにエーテルで洗浄し，乾燥して，生成物２（７．１ｇ，収率＝６７．４％）を白色固体として得た。
三ツ口丸底フラスコに，イソプロピルアルコール（３２０．０ｍＬ）を加え，次に１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（７．１０ｇ，６０．１ｍｍｏｌ），ジメチルアミン塩酸塩（５．４ｇ，０．０６６ｍｏｌ），およびホルムアルデヒド（２．０ｇ，０．０６６ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌し，次に３０分間還流した。懸濁溶液を真空下で蒸発乾固させた。残渣に水（６０．０ｍＬ，３．３３ｍｏｌ）および濃塩酸（６．０ｍＬ，０．２０ｍｏｌ）を加えた。水層をエーテルで抽出し，水性層を炭酸カリウムで中和した。水性層を塩化メチレンで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮して，生成物を取得し，これをさらにエーテルで洗浄し，乾燥して，生成物２（７．１ｇ，収率＝６７．４％）を白色固体として得た。
工程−２−ジメチル−（１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−アミン（４）の合成
丸底フラスコに，７−アザグラミン２（５．３８ｇ，３０．７ｍｍｏｌ），およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ），および水素化ナトリウム（１．３５ｇ，３３．８ｍｏｌ）を加えた。反応液に，塩化トリイソプロピルシリル（６．８ｍＬ，０．０３２ｍｏｌ）を加えた。反応液を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（ｂｉｏｔａｇｅ）で精製して，生成物３（６．０ｇ，収率＝５８．８％）を無色成状物として得た。
丸底フラスコに，７−アザグラミン２（５．３８ｇ，３０．７ｍｍｏｌ），およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ），および水素化ナトリウム（１．３５ｇ，３３．８ｍｏｌ）を加えた。反応液に，塩化トリイソプロピルシリル（６．８ｍＬ，０．０３２ｍｏｌ）を加えた。反応液を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（ｂｉｏｔａｇｅ）で精製して，生成物３（６．０ｇ，収率＝５８．８％）を無色成状物として得た。
工程−３−３−クロロメチル−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５）の合成
丸底フラスコに，化合物３（５００．０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）およびトルエン（５．０ｍＬ，０．０４７ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。反応混合物に，トルエン（１．６ｍＬ）中の１．０Ｍクロロギ酸イソプロピルを室温でゆっくり加えた。反応混合物をさらに２時間撹拌して，所望の生成物５を取得し，精製することなく次の工程で用いた。
丸底フラスコに，化合物３（５００．０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）およびトルエン（５．０ｍＬ，０．０４７ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。反応混合物に，トルエン（１．６ｍＬ）中の１．０Ｍクロロギ酸イソプロピルを室温でゆっくり加えた。反応混合物をさらに２時間撹拌して，所望の生成物５を取得し，精製することなく次の工程で用いた。
工程−４−３−（６−クロロ−ピリジン−３−イルメチル）−１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（６，Ｘ＝Ｃｌ）の合成
丸底フラスコに，５−ヨード−２−クロロ−ピリジン（３１５．０ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）または５−ヨード−２−ブロモ−ピリジンおよびテトラヒドロフラン（１２．０ｍＬ，０．１５ｍｏｌ）を−４０℃で，窒素雰囲気下で加えた。反応液に，テトラヒドロフラン（０．７２ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）中の２．０Ｍの塩化イソプロピルマグネシウムを加えた。反応混合物を−４０℃で４０分間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル２：１）は，出発物質がないことを示した。反応混合物にテトラヒドロフラン中の，０．６ＭのＣｕＣＮ・２ＬｉＣｌ（２．４ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５分間放置し，亜リン酸トリメチル（０．２９ｍＬ，２．４ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後，この溶液を，化合物５（３１５．０ｍｇ，対応するグラミン４（３２３ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）からインシトゥーで製造）およびトルエン（８．０ｍＬ）を含む丸底フラスコに入れた。反応液を２０℃で４０時間撹拌した。反応混合物を水に注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：１０）で精製して，生成物６（Ｘ＝Ｃｌ）（２３０ｍｇ，収率＝５９．０％）を白色固体として得た。化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）についての反応条件，後処理法および精製は，化合物６（Ｘ＝Ｃｌ）の合成と同じである。
丸底フラスコに，５−ヨード−２−クロロ−ピリジン（３１５．０ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）または５−ヨード−２−ブロモ−ピリジンおよびテトラヒドロフラン（１２．０ｍＬ，０．１５ｍｏｌ）を−４０℃で，窒素雰囲気下で加えた。反応液に，テトラヒドロフラン（０．７２ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）中の２．０Ｍの塩化イソプロピルマグネシウムを加えた。反応混合物を−４０℃で４０分間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル２：１）は，出発物質がないことを示した。反応混合物にテトラヒドロフラン中の，０．６ＭのＣｕＣＮ・２ＬｉＣｌ（２．４ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５分間放置し，亜リン酸トリメチル（０．２９ｍＬ，２．４ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後，この溶液を，化合物５（３１５．０ｍｇ，対応するグラミン４（３２３ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）からインシトゥーで製造）およびトルエン（８．０ｍＬ）を含む丸底フラスコに入れた。反応液を２０℃で４０時間撹拌した。反応混合物を水に注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：１０）で精製して，生成物６（Ｘ＝Ｃｌ）（２３０ｍｇ，収率＝５９．０％）を白色固体として得た。化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）についての反応条件，後処理法および精製は，化合物６（Ｘ＝Ｃｌ）の合成と同じである。
実施例３：鍵となる中間体（６−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−メタノン（７）の合成
スキーム−５
スキーム−５
丸底フラスコに，三塩化アルミニウム（１６．０ｇ，０．１２ｍｏｌ）および塩化メチレン（１００．０ｍＬ）を窒素雰囲気下で加えた。反応混合物に二塩化メチレン（２０．０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（３．２ｇ，０．０２７ｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で７０．０分間撹拌し，次に塩化メチレン（１０．０ｍＬ）中の塩化６−クロロピリジン−３−カルボニル８（５．４ｇ，０．０３１ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。メタノール（１０ｍＬ）を反応混合物に加え，溶媒を真空下で留去した。残渣を水に注加し，沈殿した生成物を濾過により除去した。水性層を酢酸エチルで抽出し，次に有機層を乾燥し，濃縮し，単離した固体と合わせて，７（６．２ｇ，収率＝８８．６％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝２５８）。
実施例４：ベンジル−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（９）（化合物１−１，表１）の合成
スキーム−６
スキーム−６
工程−１−ベンジル−［５−（１−トリイソプロピルシラニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（１０）の合成
丸底フラスコに，化合物６（１６０．０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ），ベンジルアミン（０．１ｍＬ，０．９０ｍｍｏｌ），酢酸パラジウム（１７．０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ），トルエン（１０．０ｍＬ），カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８０．０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）および２−（ジ−ｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（３１．４ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。反応液を３時間還流撹拌した。ＴＬＣおよびＭＳは出発物質がないことを示した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：２０）で精製して，生成物１０（１１０ｍｇ，収率＝５８．５％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝４７１）。
丸底フラスコに，化合物６（１６０．０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ），ベンジルアミン（０．１ｍＬ，０．９０ｍｍｏｌ），酢酸パラジウム（１７．０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ），トルエン（１０．０ｍＬ），カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８０．０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）および２−（ジ−ｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（３１．４ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。反応液を３時間還流撹拌した。ＴＬＣおよびＭＳは出発物質がないことを示した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：２０）で精製して，生成物１０（１１０ｍｇ，収率＝５８．５％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝４７１）。
工程−２−ベンジル−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（９）の合成
丸底フラスコに，化合物１０（４００．０ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ），テトラヒドロフラン（２０．０ｍＬ）およびフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（２４０ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２０℃で３０分間撹拌した。ＴＬＣは，出発物質がないことを示した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：１０）で精製して，生成物９（表１，化合物１−１）（２２０ｍｇ，収率＝８２．４％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３１５）。
丸底フラスコに，化合物１０（４００．０ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ），テトラヒドロフラン（２０．０ｍＬ）およびフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（２４０ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２０℃で３０分間撹拌した。ＴＬＣは，出発物質がないことを示した。反応混合物を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：１０）で精製して，生成物９（表１，化合物１−１）（２２０ｍｇ，収率＝８２．４％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３１５）。
実施例５：（６−ベンジルアミノ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−メタノン（１１）（化合物１−２，表１）の合成
スキーム−７
スキーム−７
圧力チューブ中に，化合物７（２７０．０ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ），ベンジルアミン（０．７ｍＬ，０．００６ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（２５．０ｍＬ）を窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を１８５℃で６０時間加熱した。反応混合物を濃縮して，ほとんどの溶媒を除去し，次に，残渣を水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：２０）で精製して，生成物１１（表１，化合物１−２）（３０ｍｇ，収率＝８．７％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３２９）。
下記の追加の化合物は，この経路により，ベンジルアミンの代わりに，それぞれ４−フルオロベンジルアミン，３−フルオロベンジルアミン，４−トリフルオロメチルベンジルアミンおよびチオフェン−２−イルメチルアミンを用いて得た。
［６−（４−フルオロ−ベンジルアミノ）−ピリジン−３−イル］−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−メタノン（Ｍ＋１＝３４７．０）
［６−（３−フルオロ−ベンジルアミノ）−ピリジン−３−イル］−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−メタノン（Ｍ＋１＝３４７．１）
（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−［６−（４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−ピリジン−３−イル］−メタノン（Ｍ＋１＝３９６．９）
（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−｛６−［（チオフェン−２−イルメチル）−アミノ］−ピリジン−３−イル｝−メタノン（Ｍ＋１＝３３５．０）
実施例６：［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−アミン（１２）（化合物１−３，表１）の合成
スキーム−８
スキーム−８
工程−１−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−［６−（４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−ピリジン−３−イル］−メタノン（１３）の合成
圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ）フラスコに，化合物７（３．５ｇ，０．０１４ｍｏｌ）および４−（トリフルオロメチル）ベンジルアミン（９．０ｇ，０．０５１ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（３０．０ｍＬ，０．３７ｍｏｌ）および酢酸パラジウム（２００．０ｍｇ，０．８９０ｍｍｏｌ）および２−（ジ−ｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（２００．０ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１８０℃で一晩撹拌し，水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮した。残渣に酢酸（１５．０ｍＬ）およびＨ2Ｏ（５．０ｍＬ）を加えた。反応混合物を１００℃で５時間撹拌し，濃縮して酢酸を除去した。次に，残渣を水性Ｎａ2ＨＣＯ3で処理し，酢酸エチルで抽出した。有機層を洗浄し，乾燥し，濃縮し，精製して，生成物１３（１．０ｇ，収率＝１８．５％）を淡黄色固体として得た（Ｍ＋１＝３９７）。
圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ）フラスコに，化合物７（３．５ｇ，０．０１４ｍｏｌ）および４−（トリフルオロメチル）ベンジルアミン（９．０ｇ，０．０５１ｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（３０．０ｍＬ，０．３７ｍｏｌ）および酢酸パラジウム（２００．０ｍｇ，０．８９０ｍｍｏｌ）および２−（ジ−ｔ−ブチルホスフィノ）ビフェニル（２００．０ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１８０℃で一晩撹拌し，水に注加し，酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮した。残渣に酢酸（１５．０ｍＬ）およびＨ2Ｏ（５．０ｍＬ）を加えた。反応混合物を１００℃で５時間撹拌し，濃縮して酢酸を除去した。次に，残渣を水性Ｎａ2ＨＣＯ3で処理し，酢酸エチルで抽出した。有機層を洗浄し，乾燥し，濃縮し，精製して，生成物１３（１．０ｇ，収率＝１８．５％）を淡黄色固体として得た（Ｍ＋１＝３９７）。
工程−２−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−［６−（４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−ピリジン−３−イル］−メタノール（１４）の合成
丸底フラスコに，化合物１３（２１０．０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロホウ酸ナトリウム（８０．０ｍｇ，２．１１ｍｍｏｌ）を加え，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）およびエタノール（２０．０ｍＬ）に溶解した。反応液を室温で一晩撹拌し，水に注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：２０）で精製して，生成物１４（６３ｍｇ，収率＝３０％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３９９）。
丸底フラスコに，化合物１３（２１０．０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロホウ酸ナトリウム（８０．０ｍｇ，２．１１ｍｍｏｌ）を加え，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）およびエタノール（２０．０ｍＬ）に溶解した。反応液を室温で一晩撹拌し，水に注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，バイオタージ（塩化メチレン／メタノール１：２０）で精製して，生成物１４（６３ｍｇ，収率＝３０％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３９９）。
工程−３−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−アミン（１２）の合成
丸底フラスコに，化合物１４（２００．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ，０．０６５ｍｏｌ）およびトリエチルシラン（３．０ｍＬ，０．０１９ｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３０分間撹拌し，水性炭酸水素ナトリウムに注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，精製して，純粋な生成物１２（表１，化合物１−３）（１２０．０ｍｇ，収率＝６２．８％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３８３）。
丸底フラスコに，化合物１４（２００．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ，０．０６５ｍｏｌ）およびトリエチルシラン（３．０ｍＬ，０．０１９ｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３０分間撹拌し，水性炭酸水素ナトリウムに注加し，生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，精製して，純粋な生成物１２（表１，化合物１−３）（１２０．０ｍｇ，収率＝６２．８％）を白色固体として得た（Ｍ＋１＝３８３）。
実施例７：（４−メトキシ−ベンジル）−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（１５）（化合物１−４，表１）の合成
化合物１５（表１，化合物１−４）は，スキーム−６に示されるように，化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）を出発物質として用い，ベンジルアミンの代わりに４−メトキシベンジルアミンを用いて合成した（Ｍ＝３４４．４）。
実施例８：（４−クロロ−ベンジル）−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（１６）（化合物１−５，表１）の合成
化合物１６（表１，化合物１−５）は，スキーム−６に示されるように，化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）を出発物質として用い，ベンジルアミンの代わりに４−クロロベンジルアミンを用いて合成した（Ｍ＝３４８．８）。
実施例９：（４−フルオロ−ベンジル）−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（１７）（化合物１−６，表１）の合成
化合物１７（表１，化合物１−６）は，スキーム−６に示されるように，化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）を出発物質として用い，ベンジルアミンの代わりに４−フルオロベンジルアミンを用いて合成した（Ｍ＝３３２．４）。
実施例１０：（４−メチル−ベンジル）−［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−アミン（１８）（化合物１−７，表１）の合成
化合物１８（表１，化合物１−７）は，スキーム−６に示されるように，化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）を出発物質として用い，ベンジルアミンの代わりに４−メチルベンジルアミンを用いて合成した（Ｍ＝３２８．４）。
実施例１１：［５−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イルメチル）−ピリジン−２−イル］−チオフェン−２−イルメチル−アミン（１９）（化合物１−８，表１）の合成
化合物１９（表１，化合物１−８）は，スキーム−６に示されるように，化合物６（Ｘ＝Ｂｒ）を出発物質として用い，ベンジルアミンの代わりに２−チエニル−メチルアミンを用いて合成した（Ｍ＝３３０．４）。
実施例１２：ｃＫｉｔキナーゼドメインおよびｃ−Ｋｉｔ配列の構築
ｃ−ＫｉｔｃＤＮＡ配列は，ＮＣＢＩ，例えば，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２２２（配列番号２）として入手可能である。この配列を用いて，ｃ−ＫｉｔＤＮＡ配列を市販のライブラリ（例えば，ｃＤＮＡライブラリ）からクローニングすることができ，または慣用のクローニング法により合成することができる。
ｃ−ＫｉｔｃＤＮＡ配列は，ＮＣＢＩ，例えば，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２２２（配列番号２）として入手可能である。この配列を用いて，ｃ−ＫｉｔＤＮＡ配列を市販のライブラリ（例えば，ｃＤＮＡライブラリ）からクローニングすることができ，または慣用のクローニング法により合成することができる。
慣用のクローニング法を用いて，３つのｃ−Ｋｉｔポリペプチドをコードするコンストラクトを調製し，これを用いてｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインポリペプチドを発現させた。そのような活性なｃ−Ｋｉｔキナーゼドメイン配列の１つは，残基Ｐ５５１−Ｓ９４８を含み，残基Ｑ６９４−Ｔ７５３が欠失している。
実施例１３：ｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインの発現および精製
精製したｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインは，慣用の発現および精製方法を用いて得ることができる。例示的方法は，例えば，Ｌｉｐｓｏｎら（米国特許公開２００４０００２５３４（米国特許出願番号１０／６００，８６８，２００３年６月２３日出願），その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
精製したｃ−Ｋｉｔキナーゼドメインは，慣用の発現および精製方法を用いて得ることができる。例示的方法は，例えば，Ｌｉｐｓｏｎら（米国特許公開２００４０００２５３４（米国特許出願番号１０／６００，８６８，２００３年６月２３日出願），その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
実施例１４：結合アッセイ
結合アッセイは種々の方法，例えば，当該技術分野において知られる種々の方法により実施することができる。例えば，上述するように，結合アッセイは，蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）フォーマットを用いて，またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを用いて実施することができる。
結合アッセイは種々の方法，例えば，当該技術分野において知られる種々の方法により実施することができる。例えば，上述するように，結合アッセイは，蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）フォーマットを用いて，またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを用いて実施することができる。
あるいは，リガンドのＡＴＰ−結合部位への結合を測定しうる任意の方法を用いることができる。例えば，蛍光リガンドを用いることができる。ｃ−Ｋｉｔに合すると，放出される蛍光は偏光される。阻害剤の結合により一旦置き換えられれば，偏光は減少する。
競合結合アッセイによる化合物のＩＣ５０の測定（ただし，ＫIは阻害剤結合の解離定数であり；ＫDは，基質結合の解離定数である）。この系についてＩＣ５０，すなわち阻害剤結合定数および基質結合定数は，以下の式にしたがって相互に関係づけることができる。
放射性標識した基質を用いた場合：
標識基質の量が少ない場合：
ＩＣ50〜ＫI
ＩＣ50〜ＫI
実施例１５：ｃ−Ｋｉｔ活性のアッセイ
ｃ−Ｋｉｔおよび他のキナーゼのキナーゼ活性の潜在的調節剤の効果は，当該技術分野において知られる種々の多様なアッセイ，例えば，生化学的アッセイ，細胞系アッセイ，およびインビボ試験（例えば，モデル系試験）において測定することができる。そのようなインビトロおよび／またはインビボアッセイおよび試験を本発明において用いることができる。
ｃ−Ｋｉｔおよび他のキナーゼのキナーゼ活性の潜在的調節剤の効果は，当該技術分野において知られる種々の多様なアッセイ，例えば，生化学的アッセイ，細胞系アッセイ，およびインビボ試験（例えば，モデル系試験）において測定することができる。そのようなインビトロおよび／またはインビボアッセイおよび試験を本発明において用いることができる。
例示的生化学アッセイにおいては，ｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性は，以下のアッセイフォーマットにおいて測定することができる。
例示的生化学アッセイ
ｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性の阻害についてのＩＣ50値を測定した。ここでは，ペプチド基質のリン酸化の阻害を化合物濃度の関数として測定した。化合物１−３，１−５，１−６，および１−７（表１）および１−９および１−１２（実施例５）を２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解した。３０μｌを１２０μｌのＤＭＳＯに加えて希釈し（４ｍＭ），１μｌをアッセイプレートに加えた。次にこれを１：３で連続希釈（５０μｌを１００μｌのＤＭＳＯに加える）し，合計８点を調整した。各希釈の後にプレートを１０秒間激しく撹拌した。次に希釈したサンプルを１μｌのアリコートでアッセイプレートに加えた。８μｌの基質（ビオチン−（Ｅ4Ｙ）3，Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，０．２ｍｇ／ｍｌ，ＤＭＳＯ中），ＰＥアルファＰＹ２０（アクセプタ）およびストレプトアビジン（ドナー）ビーズ（ＰＹ２０ アルファスクリーニングキット，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．カタログ＃６７６６０１Ｍ）を５．５ｍｌのキナーゼバッファ（５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２，５ｍＭＭｇＣｌ2，５ｍＭＭｎＣｌ2，０．１％ＮＰ−４０，５０μｇ／ｍｌＢＳＡ）中で混合した。プラスミドＰ１３３２（ｐＥＴ−Ｎ６ＢＩ−ＰＴＰ，Ｎ−末端非切断性Ｈｉｓタグおよび２シストロンＰＴＰ）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることによりＣ−Ｋｉｔキナーゼドメイン（開始アミノ酸Ｍ５５１，終了アミノ酸Ｋ９４９）を調製し，溶液に加え，よく混合した。これをポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウエルで分配し，次に１０μｌをアッセイプレートの各ウエルに移し，プレートを２０秒間振盪して混合した（最終ｃ−Ｋｉｔは５０ｎｇ／ウエル）。ＡＴＰ（１００ｍＭストック）１μｌを５ｍｌのキナーゼバッファで希釈し，溶液をよく混合し，ウエルあたり５０μｌをポリプロピレンプレートに移し，次にウエルあたり１０μｌをアッセイプレートに移した（最終ＡＴＰ１０μＭ）。プレートを３０秒間振盪し，次に３０℃で３０分間インキュベートした。ウエルあたり５μｌの停止バッファ（５０ｍＭＥＤＴＡ，キナーゼバッファ中）を加え，室温で３０分間インキュベートし，次にＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダーでウエルごとのシグナルを読んだ。リン酸化された基質によりＰＹ２０抗体の結合が生じ，シグナルがキナーゼ活性と相関するように，ドナーおよびアクセプタビーズが会合する。シグナル対化合物濃度を用いてＩＣ50を決定した。化合物１−３，１−５，１−６および１−７（表１）は，最終反応容量２５μｌ中，８ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）中のｃ−Ｋｉｔ（ｈ）（５−１０ｍＵ），０．２ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｎＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍｌポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１，１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよびγ−33Ｐ−ＡＴＰ（約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ），および適当な濃度の化合物を用いて，同様にアッセイした。室温で４０分間インキュベートし，５μｌの３％リン酸を加えることにより停止した。停止した１０μｌの各サンプルをＦｉｌｔｅｒｍａｔＡに移し，７５ｍＭリン酸で３回，メタノールで１回洗浄し，乾燥し，シンチレーションカウンター（Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡにて実行）で測定した。すべての化合物は，これらのアッセイの少なくとも１つにより測定して，１μＭ未満のＩＣ50を有していた。
例示的生化学アッセイ
ｃ−Ｋｉｔキナーゼ活性の阻害についてのＩＣ50値を測定した。ここでは，ペプチド基質のリン酸化の阻害を化合物濃度の関数として測定した。化合物１−３，１−５，１−６，および１−７（表１）および１−９および１−１２（実施例５）を２０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解した。３０μｌを１２０μｌのＤＭＳＯに加えて希釈し（４ｍＭ），１μｌをアッセイプレートに加えた。次にこれを１：３で連続希釈（５０μｌを１００μｌのＤＭＳＯに加える）し，合計８点を調整した。各希釈の後にプレートを１０秒間激しく撹拌した。次に希釈したサンプルを１μｌのアリコートでアッセイプレートに加えた。８μｌの基質（ビオチン−（Ｅ4Ｙ）3，Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，０．２ｍｇ／ｍｌ，ＤＭＳＯ中），ＰＥアルファＰＹ２０（アクセプタ）およびストレプトアビジン（ドナー）ビーズ（ＰＹ２０ アルファスクリーニングキット，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．カタログ＃６７６６０１Ｍ）を５．５ｍｌのキナーゼバッファ（５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２，５ｍＭＭｇＣｌ2，５ｍＭＭｎＣｌ2，０．１％ＮＰ−４０，５０μｇ／ｍｌＢＳＡ）中で混合した。プラスミドＰ１３３２（ｐＥＴ−Ｎ６ＢＩ−ＰＴＰ，Ｎ−末端非切断性Ｈｉｓタグおよび２シストロンＰＴＰ）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させることによりＣ−Ｋｉｔキナーゼドメイン（開始アミノ酸Ｍ５５１，終了アミノ酸Ｋ９４９）を調製し，溶液に加え，よく混合した。これをポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウエルで分配し，次に１０μｌをアッセイプレートの各ウエルに移し，プレートを２０秒間振盪して混合した（最終ｃ−Ｋｉｔは５０ｎｇ／ウエル）。ＡＴＰ（１００ｍＭストック）１μｌを５ｍｌのキナーゼバッファで希釈し，溶液をよく混合し，ウエルあたり５０μｌをポリプロピレンプレートに移し，次にウエルあたり１０μｌをアッセイプレートに移した（最終ＡＴＰ１０μＭ）。プレートを３０秒間振盪し，次に３０℃で３０分間インキュベートした。ウエルあたり５μｌの停止バッファ（５０ｍＭＥＤＴＡ，キナーゼバッファ中）を加え，室温で３０分間インキュベートし，次にＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダーでウエルごとのシグナルを読んだ。リン酸化された基質によりＰＹ２０抗体の結合が生じ，シグナルがキナーゼ活性と相関するように，ドナーおよびアクセプタビーズが会合する。シグナル対化合物濃度を用いてＩＣ50を決定した。化合物１−３，１−５，１−６および１−７（表１）は，最終反応容量２５μｌ中，８ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）中のｃ−Ｋｉｔ（ｈ）（５−１０ｍＵ），０．２ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭＭｎＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍｌポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１，１０ｍＭ酢酸Ｍｇおよびγ−33Ｐ−ＡＴＰ（約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ），および適当な濃度の化合物を用いて，同様にアッセイした。室温で４０分間インキュベートし，５μｌの３％リン酸を加えることにより停止した。停止した１０μｌの各サンプルをＦｉｌｔｅｒｍａｔＡに移し，７５ｍＭリン酸で３回，メタノールで１回洗浄し，乾燥し，シンチレーションカウンター（Ｕｐｓｔａｔｅ ＵＳＡ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡにて実行）で測定した。すべての化合物は，これらのアッセイの少なくとも１つにより測定して，１μＭ未満のＩＣ50を有していた。
別の生化学および細胞系アッセイ
一般に，任意のタンパク質キナーゼアッセイを，ｃ−Ｋｉｔとともに用いるよう適合させることができる。例えば，Ｌｉｐｓｏｎら，米国特許公開２００４０００２５３４（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されているアッセイ（例えば，生化学的および細胞系アッセイ）を本発明において用いることができる。
一般に，任意のタンパク質キナーゼアッセイを，ｃ−Ｋｉｔとともに用いるよう適合させることができる。例えば，Ｌｉｐｓｏｎら，米国特許公開２００４０００２５３４（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されているアッセイ（例えば，生化学的および細胞系アッセイ）を本発明において用いることができる。
一例として，Ｍ−０７ｅ細胞株（ＤＳＭＺカタログ＃ＡＣＣ１０４）の増殖は，ｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼレセプターに結合してこれを活性化するＳＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）により刺激される。ｃ−Ｋｉｔキナーゼの阻害剤はＳＣＦにより媒介されるキナーゼ活性化を低下または排除し，その結果，ＳＣＦで刺激された細胞の細胞増殖が低下する。細胞成長に及ぼす化合物濃度の影響からこの阻害を測定して，ＩＣ50値を評価する。Ｍ−０７ｅ細胞をウエルあたり５ｘ１０4細胞で，１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ＃ＳＨ３００７１．０３）を補充したイスコーブ培地１Ｘ（ＭＯＤ，Ｃｅｌｌ ＧｒｏＭｅｄｉａｔｅｃｈ カタログ＃１５−０１６−ＣＶ）５０μｌの細胞培養液中で９６ウエル細胞培養プレートに播種した。化合物１−３および１−５（表１）をＤＭＳＯ中に０．１ｍＭの濃度で溶解し，１：３で８点の連続希釈を作成し，１００μｌの細胞培養液（最終濃度０．８％ＤＭＳＯ）中最終濃度１，０．３３，０．１１，０．０３７，０．０１２，０．００４１，０．００１４および０．０００４６μＭで細胞に加えた。細胞はまた，陽性対象としてスタウロスポリンで処理した。２０μｌの細胞培養液中６００ｎｇ／ｍｌＳＣＦを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＣＦキット リガンド カタログ＃ＰＨＣ２１１５）で加えることにより細胞を刺激した。細胞を３７℃，５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ 細胞生存アッセイ カタログ＃Ｇ７５７３）および基質を室温に平衡化し，酵素／基質（組換え蛍ルシフェラーゼ／甲虫ルシフェリン）を再構築した。細胞プレートを室温で３０分間平衡化させ，次に等量のＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧｌｏＲｅａｇｅｎｔを加えることにより溶解させた。プレートをプレート振盪器で２分間混合して，細胞を溶解させ，次に室温で１０分間インキュベートした。プレートをＶｉｃｔｏｒ ＷａｌｌａｃＩＩで，発光を用いて，ウエル当たり０．１ｓで読むよう改変されたプロトコルで読んだ。発光の読みはＡＴＰ含有量を評価し，これは細胞数と直接相関するため，化合物濃度の関数としての読みを用いてＩＣ50値を決定することができる。いずれの化合物も１μＭ未満のＩＣ50を有していた。
この細胞系アッセイを用いてリン酸化を評価することができる。サンプルを上述したように成長阻害アッセイ用に調製し，Ｍ−０７ｅ細胞のみをウエルあたり２ｘ１０5細胞で９６ウエルフィルタープレートに播種した。上述のように，細胞を化合物とともに３７℃で１時間インキュベートし。次にＳＣＦを最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで加え，３７℃で１０分間インキュベートすることにより刺激した。遠心分離により培養液を除去し，３０μｌの溶解バッファ（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，５ｍＭＮａＦ，１ｍＭバナジン酸ナトリウム，１０ｍＭベータ−グリセロリン酸，ＥＤＴＡなし；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｒｏｃｈｅカタログ＃１８７３５８０）を加え氷上に３０分間静置することにより細胞を溶解させた。溶解物の１５μｌのアリコートを取り出し，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅイムノアッセイキット：ヒトｃ−Ｋｉｔ［ｐＹ８２３］（カタログ＃ＫＨＯ０４０１）にしたがって，アリコートをアッセイプレート中で８５μｌの希釈バッファで希釈し，室温で２時間インキュベートし，プレートを洗浄バッファで４回洗浄することにより，アッセイした。検出抗体（１００μｌ）をプレートに加え，サンプルを室温で１時間インキュベートし，次に洗浄バッファで４回洗浄した。ＨＲＰ抗ウサギ抗体（１００μｌ）を加え，サンプルを室温で３０分間インキュベートし，次に洗浄バッファで４回洗浄した。安定化色原体（１００μｌ）を加え，サンプルを室温で１５−２５分間インキュベートし，次に洗浄バッファで４回洗浄した。停止溶液（１００μｌ）を加え，サンプルをＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒリーダーで４５０ｎｍで読んだ。吸光度を化合物濃度に対してプロットし，ＩＣ50濃度を決定した。いずれの化合物も１μＭ未満のＩＣ50を有していた。
インビボモデル系の試験
インビボ試験のためには，使用するための適当な動物モデル系を選択することができる。例えば，多発性硬化症用には，齧歯類実験アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が一般に用いられる。この系はよく知られており，例えば，Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６，Ｃｅｌｌ ８５：２９９−３０２およびＳｅｃｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ５：８１３−８２１，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
インビボ試験のためには，使用するための適当な動物モデル系を選択することができる。例えば，多発性硬化症用には，齧歯類実験アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が一般に用いられる。この系はよく知られており，例えば，Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６，Ｃｅｌｌ ８５：２９９−３０２およびＳｅｃｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ５：８１３−８２１，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
同様に,他のモデル系を選択して，本発明において用いることができる。
実施例１６：ｃ−Ｋｉｔおよび他のキナーゼの部位特異的変位誘発
ｃ−Ｋｉｔおよび他のキナーゼ（ならびに興味ある他の配列）の変異誘発は，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｄｓ．Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．（１９９５）ＩＳＢＮ１−８９８４８６−０１−８，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ Ｂｏｘ１，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．，に記載されている方法にしたがって行うことができる。
ｃ−Ｋｉｔおよび他のキナーゼ（ならびに興味ある他の配列）の変異誘発は，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｄｓ．Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．（１９９５）ＩＳＢＮ１−８９８４８６−０１−８，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ Ｂｏｘ１，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．，に記載されている方法にしたがって行うことができる。
インビトロ部位特異的変異誘発はタンパク質構造−機能相関，遺伝子発現およびベクターの改変を研究するために非常に貴重な手法である。文献にはいくつかの方法がみられるが，これらの方法の多くはテンプレートとして一本鎖ＤＮＡを必要とする。その理由は，歴史的に，再アニーリングを防止するために相補鎖を分離することが必要であったからである。部位特異的変異誘発においてＰＣＲを用いることによって，変性工程を用いて相補鎖を分離し，ＰＣＲプライマーの効率的な重合を可能とすることにより，鎖分離を行うことができる。したがって，ＰＣＲ部位特異的方法は，事実上いかなる二本鎖プラスミド中にも部位特異的変異を取り込ませることができ，Ｍ１３系のベクターや一本鎖レスキューを必要としない。
ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発を行う場合には，任意の（望ましくない）二次部位変異のクローン増殖を防止するためにＰＣＲの間のサイクル数を減少させることがしばしば望ましい。限定されたサイクリングにより生成物の収率が低下することは，出発テンプレート濃度を増加させることにより補う。選択を用いて反応から来る親分子の数を減少させる。また，１つのＰＣＲプライマーセットを用いるために，長いＰＣＲ法を最適化することが望ましい。さらに，いくつかの熱安定性ポリメラーゼのエクステンダーゼ活性のため，ＰＣＲプライマーの一方または両方に変異が組み込まれているＰＣＲ生成産物の末端と末端とをライゲーションさせる前に，手順の中に末端を磨く工程を組み込むことがしばしば必要である。
以下のプロトコルは，部位特異的変異誘発のための容易な方法を提供し，以下の工程を組み込むことにより上述の望ましい特徴を達成する：（ｉ）テンプレート濃度を慣用のＰＣＲ条件より約１０００倍増加させる；（ｉｉ）サイクル数を２５−３０から５−１０に減少させる；（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３，ここでＡ残基はメチル化されている）を加えて，親ＤＮＡに対して選択する（注：Ｅ．ｃｏｌｉのほぼすべての一般的な株から単離されたＤＮＡは配列５−ＧＡＴＣ−３でＤａｍ−メチル化されている）；（ｉｖ）ＰＣＲの信頼性を１０ｋｂまで高めるためにＰＣＲミックス中でＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒを使用する；（ｖ）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ産物の末端を磨く，および（ｖｉ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で効率的な分子内ライゲーションを行う。
プラスミドテンプレートＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌｅ）を，２５μｌの１ｘ変異誘発バッファ（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５；８ｍＭＭｇＣｌ２；４０ｕｇ／ｍｌＢＳＡ）中に１２−２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（このうちの１つは５’リン酸を含んでいなければならない），各２５０μＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，２．５ＵのＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むＰＣＲカクテルに加える。
ＰＣＲサイクルパラメータは以下のとおりである：９４℃４分間，５０℃２分間，７２℃２分間を１サイクル，次に，９４℃１分間，５４℃２分間および７２℃１分間を５−１０サイクル（工程１）。
親テンプレートＤＮＡおよび新たに合成されたＤＮＡを取り込んだ直線化した変異誘発プライマーをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これにより，インビボメチル化親テンプレートおよびハイブリッドＤＮＡがＤｐｎＩで消化され，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより直線状ＰＣＲ産物上のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基が除かれる。
反応液を３７℃で３０分間インキュベートし，次に７２℃に移してさらに３０分間インキュベートする（工程２）。
変異誘発バッファ（１ｘ，１１５μｌ，０．５ｍＭＡＴＰを含む）を，ＤｐｎＩ消化，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ処理ＰＣＲ産物に加える。
溶液を混合し，１０μｌを新たなマイクロフュージチューブに入れ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２−４Ｕ）を加える。
ライゲーション溶液を３７℃で６０分以上インキュベートする（工程３）。
処置した溶液をコンピテントＥ．ｃｏｌｉにトランスフォーメーションする（工程４）。
上述したＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発に加えて，他の方法も利用可能である。例えば，以下に記載されている方法：Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８７６４−８７８５；およびＰｒｏｍｅｇａのＧｅｎｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）部位特異的変異誘発システムを用いる方法がある。
本明細書において引用されるすべての特許および他の参考文献は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示しており，表および図面を含めその全体を，それぞれの参考文献の全体が個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
当業者は，本発明は，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に好ましい態様の代表的なものとして記載される方法，変種および組成物は，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，その改変および他の用途をなすであろう。これらの改変は本発明の精神の中に包含され，特許請求の範囲により定義される。
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。例えば，式Ｉの追加の化合物および／または投与の種々の方法を与える変形物を用いることができる。すなわち，そのような追加の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではなく，そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の同等物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語または他の代替物のグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループのすべての個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
また，特に断らない限り，ある態様について種々の数値が与えられている場合，追加の態様は，任意の２つの異なる数値を範囲の終点としてとることにより記述される。そのような範囲もまた本明細書に記載される発明の範囲内である。
すなわち，追加の態様も本発明の範囲内であり，特許請求の範囲の範囲内である。
配列表
配列番号1 GenBank NP＿000213
配列番号2 GenBank NM＿000222
配列番号1 GenBank NP＿000213
配列番号2 GenBank NM＿000222
Claims (36)
- ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法であって，
前記被験者に，有効量の次式：
［式中，
Ｒ1およびＲ5は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，および−ＮＲ22Ｒ23からなる群より選択され；
Ｒ3およびＲ4は，独立して，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，および−Ｓ（Ｏ）nＲ21からなる群より選択され；
Ｒ2は，水素，ハロ，ヒドロキシ，置換されているオキシ，チオール，置換されているチオール，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル，任意に置換されていてもよい低級アルキニル，任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ16Ｒ17，−ＮＲ22Ｒ23，−Ｓ（Ｏ）nＲ21，および−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4からなる群より選択され，
ここで，
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−，−Ｃ（Ｓ）−，−ＣＨ2Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（Ｓ）ＣＨ2−，−Ｏ−，−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ2）−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，
Ｒaは，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
ここで，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，および，フルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
ここで，
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲であり；
Ｒ16およびＲ17は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素はアルケン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない）；任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；または
Ｒ16およびＲ17は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｒ20は，ヒドロキシル，置換されているオキシ，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−は，アルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｃ（Ｘ）−は，アルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ21は，水素（ただしｎ＝０），任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−は，アルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，−Ｓ（Ｏ）n−は，アルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，および任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ22およびＲ23は，独立して，水素，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルケニル（ただし，窒素は，アルケン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよい低級アルキニル（ただし，窒素はアルキン結合のアルファ炭素には結合していない），任意に置換されていてもよいシクロアルキル，任意に置換されていてもよいシクロアルキルアルキル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリル，任意に置換されていてもよいヘテロシクリルアルキル，任意に置換されていてもよいアリール，任意に置換されていてもよいアラルキル，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，任意に置換されていてもよいヘテロアラルキル，−Ｃ（Ｘ）Ｒ20，−Ｃ（Ｘ）ＮＲ16Ｒ17，および−Ｓ（Ｏ）2Ｒ21からなる群より選択され；または
Ｒ22およびＲ23は，窒素と一緒になって，任意に置換されていてもよい５−７員の複素環またはヘテロアリール環であり；
Ｘは，ＯおよびＳからなる群より選択され；および
ｎは，０，１，または２であり；
ただし，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，およびＲ5の少なくとも１つは水素ではない］
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，または異性体を投与することを含む方法。 - 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態が不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連するものである，請求項１記載の方法。
- 前記不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達は肥満細胞のものである，請求項２記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，肥満細胞症，喘息，慢性関節リウマチまたは慢性鼻炎である，請求項１記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，細胞増殖性疾患，線維性疾患，または代謝性疾患である，請求項１記載の方法。
- 前記細胞増殖性疾患は癌である，請求項５記載の方法。
- 前記癌は，白血病，肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，胃腸管の癌，中枢神経系の癌，女性生殖系の癌，神経外胚葉起源の肉腫，または神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成である，請求項６記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は多発性硬化症である，請求項１記載の方法。
- 次の構造：
Ｒ2は，Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり；
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｃ（Ｏ）−，−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2−，−Ｃ（Ｓ）−，−ＣＨ2−Ｃ（Ｓ）−，−Ｃ（Ｓ）ＣＨ2−，−Ｏ−，−Ｓ−，−Ｓ（Ｏ2）−および−ＮＲa−からなる群より選択され，
式中，Ｒaは，水素，低級アルキル，および，フルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
ここで，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換されている低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内である］
からなる群より選択され；
ただし，Ｒ2は以下の基ではなく：
の化合物，またはその薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，および異性体。 - Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4が以下の基：
- Ｘ1は，メチレンおよび置換メチレンからなる群より選択される，請求項１０記載の化合物。
- Ｘ1はジフルオロメチレンである，請求項１１記載の化合物。
- Ｘ1は−Ｃ（Ｏ）−である，請求項１０記載の化合物。
- Ｘ2はフェニレンである，請求項１０記載の化合物。
- Ｘ2は１または２個の窒素原子を含む，請求項１０記載の化合物。
- Ｘ2は，ピリジンジイル，ピリミジンジイル，ピラジンジイル，およびピリダジンジイルからなる群より選択される，請求項１５記載の化合物。
- Ｘ2は，
- Ｘ4は，
- Ｘ3は，
Ｒbは，水素および低級アルキルからなる群より選択され；および
Ｒcは，メチレンおよび置換メチレンからなる群より選択される，請求項１８記載の化合物。 - Ｘ3は−ＮＨＣＨ2−である，請求項１９記載の化合物。
- Ｘ3は−ＮＨＣ（Ｏ）−である，請求項１０記載の化合物。
- Ｘ2はヘテロアリールである，請求項２１記載の化合物。
- Ｘ3は
Ｒbは，水素および低級アルキルからなる群より選択される，請求項１０記載の化合物。 - Ｘ4は，
Ｒdは，それぞれの場合について，独立して，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲である，請求項１０記載の化合物。 - Ｘ4は，
- Ｘ4は，アルキルおよび置換アルキルからなる群より選択される，請求項１０記載の化合物。
- 次の構造：
Ｒ2は，Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4であり；
Ｘ1は，低級アルキレン，置換低級アルキレン，−Ｏ−，−Ｓ−，および−ＮＲa−からなる群より選択され，
ここで，Ｒaは，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，−ＮＲa−の窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；
Ｘ2は，アリーレンおよびヘテロアリーレンからなる群より選択され；
Ｘ3は，
Ｒbは，それぞれの場合について，独立して，水素，低級アルキル，およびフルオロ，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルコキシ，またはアミノで置換された低級アルキルからなる群より選択され，ただし，ＮＲbの窒素に結合した炭素では，ヒドロキシル，アルコキシ，チオール，チオアルキルオキシまたはアミノで置換されておらず；および
Ｒcは，アルキレンおよび置換アルキレンからなる群より選択される］
からなる群より選択され；および
Ｘ4は，アルキル，置換アルキル，および
Ｃ2は，アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒdは，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，任意に置換されていてもよい低級アルコキシ，任意に置換されていてもよいアルキルチオ，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよいアミン，任意に置換されていてもよいアミド，カルボキシル，ヒドロキシル，任意に置換されていてもよいアリール，アリールオキシ，任意に置換されていてもよい複素環，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，およびスルホニルアミノからなる群より選択され；および
ｍは０−２の範囲内であり；
ただし，前記化合物は，
前記化合物は，
を有する化合物，またはその薬学的に許容しうる塩，プロドラッグ，または異性体，および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。 - Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4が
- ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態に罹患しているかまたはそのリスクを有する被験者を治療する方法であって，前記被験者に有効量の請求項２８記載の組成物を投与することを含む方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達に関連するものである，請求項２９記載の方法。
- 前記不適切に制御されているキナーゼシグナル伝達は肥満細胞のものである，請求項３０記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，肥満細胞症，喘息，または慢性鼻炎である，請求項３０記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は，細胞増殖性疾患，線維性疾患，または代謝性疾患である，請求項３０記載の方法。
- 前記細胞増殖性疾患は癌である，請求項３３記載の方法。
- 前記癌は，白血病，肥満細胞腫瘍，小細胞肺癌，精巣癌，胃腸管の癌，中枢神経系の癌，女性生殖系の癌，神経外胚葉起源の肉腫，または神経線維腫症にともなうシュワン細胞新形成である，請求項３４記載の方法。
- 前記ｃ−Ｋｉｔに媒介される疾病または状態は多発性硬化症である，請求項３０記載の方法。
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