JP2008501331A - アッセイ試薬の安定化方法、安定化アッセイ試薬を収容した試薬容器およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)試薬容器の内側表面上に、被検体の検出に必要となる少なくとも2つの試薬、第一の試薬および第二の試薬を分配させる工程、および
b)該試薬から過剰の水を除去する工程
を包含し、
工程a)において、第一の試薬は、第二の試薬がその上に分配される内側表面の第二の領域からはっきりと隔たった、すなわち、なんらの重複もない内側表面の第一の領域上に分配される方法も提供する。該方法の特徴は、第一の試薬と第二の試薬が対を形成することであり、ここで、第一の試薬は酵素であり、第二の試薬は該酵素の基質であり、該対は核酸ポリメラーゼおよびその基質より構成されるものである。
a)中の反応体、
b)の阻害剤、
c)のアクチベーター、または
d)タンパク質、または
e)触媒する能力のある酵素
である被検体についての定性または定量アッセイを実行するのに適切でありうる。乾燥形態にあるこのようなアッセイ試薬の組成物を安定化させるために、酵素を、少なくとも1つの他のアッセイ試薬から分離でき、好ましい実施態様では、少なくとも1つの他のアッセイ試薬は酵素の基質であり得る。
a)中の反応体、または
b)の阻害剤、または
c)のアクチベーター、または
d)タンパク質、または
e)触媒する能力のある酵素
である被検体についての定性または定量アッセイを実行するのに適切でありうる。乾燥形態でこのようなアッセイ試薬の組成物を安定化するために、酵素に対する基質を、少なくとも1つの他のアッセイ試薬から分離でき、好ましい実施態様では、少なくとも1つの他のアッセイ試薬は、該基質に作用する能力のある酵素であり得る。
乾燥リアルタイムPCR試薬の安定化
材料および方法
閉鎖管PCRアッセイを、バチルス ズブチルス(Bacillus subtilis)に関して準備した。表1は、全てのプライマー(配列番号:1ja2)およびプローブ(配列番号:3ja4)オリゴヌクレオチドの配列および修飾を示す。ランタニド標識プローブの使用に基づいているPCRアッセイ化学は、Nurmiら(2002年)によって記述された。全てのPCR増幅は、1×HotMaster Taq緩衝液(エッペンドルフ(Eppendorf)、ドイツ);2.5mM MgCl2;0.2mM dNTPs;0.3μMフォアワードプライマーおよびリバーズプライマー;28nMランタニド標識プローブ;280nMクエンチャープローブおよび1.25単位のHotMaster Taqポリメラーゼ(エッペンドルフ、ドイツ)を含有する30μlの容量で行われた。
図1は、混合物として乾燥されたPCR試薬の不安定性を示す。図は、DNAポリメラーゼを含む全てのPCR成分を含有する混合物として乾燥された、前乾燥PCR試薬を使用して作成されたPCR反応から測定されるPCRサイクル21−43(x軸で)で得られるユーロピウムシグナル−対−ノイズ比(y軸で)を示す。PTC1(塗潰し三角形)およびPTC2(塗潰しひし形)は、バチルス・ズブチルスDNAがテンプレートとして添加された陽性対照反応を表す。NTC1(白抜き三角形)およびNTC2(白抜きひし形)は、テンプレートDNAの代わりに純水が添加された陰性対照反応を表す。陽性対照反応は、陰性対照反応について得られたプロットとなんら異ならない増幅プロットを示す。増幅シグナルはなく、DNAポリメラーゼを含む全PCR成分を含有する混合物として乾燥されたPCR試薬が安定でなかったことを示す。
乾燥cDNA合成試薬の安定化
材料および方法
インビトロ合成されたRNA種(Nurmiら、2002年)である定量(10000分子)のmmPSAを逆転写するために高容量cDNAアーカイブキット(アプライド・バイオシステムズ、米国)を使用して、逆転写反応を行った。陰性対照として、テンプレートRNAの代わりに水を含有する反応も行われた。3つの型の反応(a−c)を調製および比較した。
a.製造業者によって提供される指示にしたがって調製および作業された標準のcDNA合成反応(10μl体積)。
b.テンプレートRNAを除く全ての反応成分(緩衝液、dNTP、ランダム配列オリゴヌクレオチド・プライマーおよび逆転写酵素)が、反応容器の底に予め分配され、過剰の水が空気乾燥により除去された乾燥化学反応。サンプルRNAは、容量10μlの水で添加した。
c.逆転写酵素が反応容器の底の個別のスポット上に分配、乾燥され、そして逆転写酵素と残りのcDNA合成試薬(すなわち、緩衝液、ヌクレオチドおよびランダム配列オリゴヌクレオチド・プライマー)に占められた領域のあいだに重複がないことを除いて、前記(b)のように調製および作業した乾燥化学反応。
図3および表2は、残りの試薬から隔てられているスポット上で逆転写酵素を乾燥させることによって、いかにcDNA合成試薬が、乾燥形態で安定化されるかを示す。
Claims (13)
- サンプルからの少なくとも1つの生物学的または化学的被検体の検出および/または定量のための試薬容器であって、該試薬容器が、体積を囲む内側表面を含み、少なくとも1つの被検体の検出および/または定量のための少なくとも1つの分析の体積分析的反応が起こり、被検体の分析の少なくとも2つの試薬は、該内側表面上で乾燥され、少なくとも第一の該試薬は、少なくとも第二の該試薬が乾燥されている内側表面の第二の領域から明らかに隔たった、すなわち、なんらの重複もない内側表面の第一の領域で乾燥されているものであって、第一の試薬および第二の試薬は、第一の試薬が酵素であり、第二の試薬が該酵素の基質である対を形成し、該対は、核酸ポリメラーゼおよびその基質より構成されることを特徴とする試薬容器。
- 第一の試薬が、逆転写酵素であることを特徴とする請求項1記載の試薬容器。
- 試薬容器が、2つ以上の試薬の対を包含し、各対が、検出されるべき生物学的および/または化学的被検体の第一および第二の試薬より構成され、各対の第一の試薬は、その対の第二の試薬が乾燥された内側表面の該対についての第二の領域から明らかに隔たった、すなわち、なんらの重複もない内側表面の該対についての第一の領域上で乾燥されたことを特徴とする請求項1または2記載の試薬容器。
- 試薬容器が、2つ以上の生物学的および/または化学的被検体の検出のためのものであり、該試薬容器は、1つ以上の試薬の対を包含し、各対は、検出されるべき、各対について同じであるかまたは異なっている、生物学的および/または化学的被検体に関する第一および第二の試薬より構成され、各対の第一の試薬は、その上に同じ対の第二の試薬が乾燥された内側表面の、各対について第二の領域から明らかに隔てられた、すなわちなんらの重複もない内側表面の、上記対についての第一の領域上で乾燥されたことを特徴とする請求項1または2記載の試薬容器。
- サンプルおよび場合により緩衝液を除き、各被検体の分析の全試薬が、試薬容器の内側表面上で乾燥されたことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載の試薬容器。
- 試薬がその上で乾燥された、明らかに隔てられた領域が、1μmから2cmまで、好ましくは0.1mmから5mmまでの直径を有するドットであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載の試薬容器。
- サンプルからの生物学的または化学的被検体の検出および/または定量のための乾燥アッセイ試薬を、試薬容器の内側表面上で安定化させる方法であって、
a)試薬容器の内側表面の上に被検体の検出に必要とされる少なくとも2つの試薬、第一の試薬および第二の試薬を分配させる工程、および
b)試薬から過剰の水を除去する工程
を包含し、
工程a)で、第一の試薬は、第二の試薬がその上に分配される内側表面の第二の領域からはっきりと隔たった、すなわち、なんらの重複もない内側表面の第一の領域の上に分配され、第一の試薬と第二の試薬が、第一の試薬が酵素であり、第二の試薬が該酵素の基質である対を形成し、該対が核酸ポリメラーゼおよびその基質より構成されるものであることを特徴とする方法。 - 第一の試薬が、逆転写酵素であることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 試薬容器が、2つ以上の試薬の対を包含し、各対は、検出されるべき生物学的および/または化学的被検体の少なくとも第一および第二の試薬より構成され、工程a)において、各対の第一の試薬は、同じ対の第二の試薬がその上に分配される内側表面の各対の第二の領域からはっきりと隔たった、すなわち、なんらの重複もない内側表面の各対についての第一の領域の上に分配されることを特徴とする請求項7または8記載の方法。
- 試薬容器が、2つ以上の生物学的および/または化学的被検体の検出および/または定量ためのものであり、試薬の対を含む該試薬容器は、各対について同じであるかまたは異なっている、検出されるべき生物学的および/または化学的被検体についての少なくとも第一および第二の試薬より構成され、工程a)において、各対の第一の試薬は、その上に同じ対の第二の試薬が分配される内側表面の、各対についての第二の領域から明らかに隔たった、すなわちなんらの重複もない内側表面の、各対についての第一の領域上に分配されることを特徴とする請求項7または8記載の方法。
- 工程a)において、サンプルおよび場合により緩衝液を除き、被検体の分析、または各被検体の分析の全試薬が、試薬容器の内側表面上に分配されることを特徴とする請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)において、過剰の水が、空気乾燥または凍結乾燥によって除去されることを特徴とする請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ、逆転写酵素を利用するアッセイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、免疫PCRアッセイ、核酸配列に基づくアッセイ(NASBA)、近接ライゲーションアッセイ、リガーゼ連鎖反応(LCR)アッセイ、ローリングサークル増幅(RCA)アッセイ、および鎖置換増幅(SDA)アッセイより構成される群から選択されるアッセイを行うための請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬容器の使用。
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