JP2008237224A - ビフィドバクテリウム属細菌及びこれを含有する発酵乳飲食品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品を、pH4.3の酸で37℃30分間処理、次いで胆汁を1%含む溶液で37℃30分間連続処理したとき、これらの処理後の生残性が20%以上であるビフィドバクテリウム属細菌、及び当該細菌を含有する発酵乳飲食品。
【選択図】なし
Description
近年では、各種製造技術の向上等により、摂取し得る菌数そのものが増加しているため、ある程度の死滅が起こっても、これを許容して生理効果を期待することも可能である。また、ビフィドバクテリウム属細菌を含む発酵食品等の製造に際しては、保存時の生残性を改善するための様々な成分、例えばN−アセチルグルコサミン、パントテン酸、ペプチド類、ラクチュロース等の添加もなされているため、その作用により、摂取後の腸管への到達性も高まっていると考えられる。
また、本発明によれば、保存後でも腸内への到達速度の高いビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳飲食品を提供できる。
このようにして得られる発酵乳飲食品は、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。
すなわち、親株とするビフィドバクテリウム属細菌を使用して発酵乳を調製し、シロップを添加して発酵飲料品を作製した後、適当な容器に分注し冷蔵保存する。保存後の発酵飲料品に酸、胆汁処理を施し、処理後菌体を遠心分離により回収し、この菌体の中から酸、胆汁連続処理耐性の優れたものを選抜していくのである。
ビフィドバクテリウム・ブレーベ4052株(B. breve A)を親株とし、N−メチル−N′−ニトロソグアニジン(NTG)処理を施した菌体を嫌気脱脂乳培地にて培養後、その1mLを酸処理液(pH3.8)10mLに添加し、37℃で、8分間処理した。その1%量を嫌気脱脂乳培地に接種して、37℃、20時間培養した。培養後、10℃にて4日間保存後、その1mLを酸処理液(pH3.8)10mLに添加して、同様に処理を行った後、処理後の菌体を脱脂乳培地にて培養した。得られた培養物から単一のコロニーを数株選び、酸耐性を比較したところ、酸耐性の向上した株としてビフィドバクテリウム ブレーベN4株(B. breve B)が選抜された。この株は同時に胆汁耐性も向上していた。
脱脂粉乳 12%
酵母エキス 1%
システイン 0.03%
炭酸カルシウム 2%
窒素を20分吹き込んだ後にゴム栓をし、115℃、20分間オートクレーブ滅菌する。
100℃、90分間殺菌した18%全脂乳培地(0.03%酵母エキス添加)にB.breve A、B(N4株)及びB.bifidum C(YIT4007株)のシードカルチャーを接種し、34℃にて約20時間培養して、3種の発酵乳を得た。得られた発酵乳それぞれにぶどう糖果糖液糖を終濃度が8%となるように添加し、これを供試サンプルとした。このサンプルをガラス容器に分注し、ゴム栓をして空気の流入を遮断した状態で、10℃にて7日間保存した。
リン酸二水素カリウム 0.0225%
リン酸水素二カリウム 0.0225%
塩化ナトリウム 0.045%
硫酸アンモニウム 0.0225%
塩化カルシウム 0.00225%
硫酸マグネシウム 0.00225%
TOS(ヤクルト製) 1%
トリプチケースペプトン(BBL) 1%
酵母エキス(Difco) 0.1%
リン酸二水素カリウム 0.3%
リン酸水素二カリウム 0.45%
硫酸アンモニウム 0.3%
硫酸マグネシウム 0.02%
システイン塩酸塩 0.05%
Lab-Lemco powder(OXOID) 0.1%
寒天(Difco) 1.5%
ろ過滅菌した抗生剤としてCarbenicillin(Sigma)を1μg/mL添加する代わりに、Lincomycin(Sigma)を2μg/mL添加するほかはT−CBPCプレートと共通である。
その結果、3株のビフィズス菌で調製した発酵乳の回収性には以下の様な差がみられた。
実施例1の回収性を反映するin vitroのモデル系の検討を行った。この際、簡便さを優先し、処理は30分から1時間で終了する系を検討した。
まず、消化管の中で最初に通過する胃のモデルとして、酸処理に対する耐性を評価した。酸処理液としては、小林らの方法(日細菌誌、29、691−697、1974)を参考にし、ビスィズス菌培地に酸を加え、pHを下げた溶液を用いた。
トリプチケースペプトン(BBL) 1%
酵母エキス(Difco) 0.5%
トリプトース(Difco) 0.3%
塩化ナトリウム 0.2%
クエン酸−アンモニウム 0.2%
システイン塩酸塩 0.05%
ラクトース 1%
ピルビン酸 0.1%
ツイーン80 0.1%
硫酸マグネシウム 0.0575%
硫酸第一鉄 0.0034%
硫酸マンガン 0.012%
酸処理液のpHに関して検討した結果、pHを3.8以上に設定すれば1〜30分の処理後の生残菌数が測定可能であったため、pH3.8の酸処理液を用いることとした。
pH3.8の酸処理液10mLに、実施例1で用いた3種のサンプルを1mL加え、37℃でインキュベートした。処理中に適宜サンプリングを行い、生菌数測定を行った。得られたデータより死滅速度を測定した結果以下のようになった。
次に腸に到達した場合を考えて、胆汁処理に対する耐性を比較した。酸処理と同様、処理時間や生菌数が測定可能かを考慮した場合、oxgallを用いた以下の組成の処理液が適当であると判断した。
トリプチケースペプトン(BBL) 1%
酵母エキス(Difco) 0.5%
トリプトース(Difco) 0.3%
リン酸水素二ナトリウム12水塩 2.03%
リン酸二水素ナトリウム2水塩 0.156%
クエン酸二アンモニウム 0.2%
システイン塩酸塩 0.05%
ラクトース 1%
ピルビン酸 0.1%
ツイーン80 0.1%
硫酸マグネシウム 0.0575%
硫酸第一鉄 0.0034%
硫酸マンガン 0.012%
Oxgallの濃度について検討した結果、Oxgall濃度を1%以下に設定すれば1〜30分の処理後の生残菌数が測定可能であったため、1%のOxgallを含む胆汁処理液を用いることとした。1% Oxgallを含む胆汁処理液10mLに、実施例1で用いた3種のサンプルを1mL加え、37℃にて30分間処理し、処理後の生菌数を測定した。得られたデータより、胆汁処理による生残率を算出した結果以下のようになった。
消化管を通過する際は、胃と腸を連続して通過することを考慮し、in vitro処理も酸処理と胆汁処理を連続して行ってみた。この酸、胆汁連続処理の場合は、酸の処理液のpHを4.3以上にし、胆汁処理液に含まれるOxgall濃度を1%と設定すれば処理後の生残菌数の測定が可能であった。すなわち、以下のような処理を酸胆汁連続処理として行った。
pH4.3に酢酸を用いて調整した酸処理液10mLに、実施例1で用いたシロップ入り発酵乳を1mL加え、37℃にて30分間処理した。処理後の酸処理液1mLをただちに1% Oxgallを含む胆汁処理液に添加し、更に37℃、30分間処理した。この酸胆汁連続処理後の菌の生残率を3株間で比較すると以下のようになった。
この連続処理による評価を、以下の方法で胆汁耐性を付与した育種株B.breve NE株(D株)において行った。
B. breve A株を元株として、まず変異処理を行った。5μg/mL NTGを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)と、B. breve の洗浄菌体を1:1で混合し、37℃で30分処理したのち、リン酸緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した。この菌体を栄養培地に1%接種し、37℃で16時間培養した。
このNTG処理した菌体に、更にEMS処理を行った。0.4% EMSを含む50mM リン酸緩衝液(pH7.0)と上記培養菌体を1:1で混合し、37℃で30分処理したのち、リン酸緩衝液(pH7.0)で2回洗浄した。この菌体を栄養培地に1%接種し、37℃で16時間培養した。
この菌株とC株を用い、実施例1と同様にシロップ入り発酵乳を調製し、10℃、7日間保存したサンプルを用いて実施例4と同様の方法により酸胆汁連続耐性を比較すると以下の様な結果となった。
連続処理による耐性評価と飲用回収性が相関する可能性が高いことが見出されたので、連続処理による菌株の育種を行い、得られた耐性株の飲用回収性について検討した。
A株を元株としてシードカルチャーを作製し、135℃、3.5秒UHT殺菌した20%全脂乳(0.03%酵母エキス添加)に接種し、34℃にて約20時間培養して発酵乳を得た。ここに、パラチノースを終濃度が10%になるように加え、ガラス容器に分注し、ゴム栓をして空気の流入を遮断した状態で、10℃、11日間保存した。保存後のサンプルを10mLとり、実施例4に示す組成のpH4.3に調製した酸処理液100mLに添加し、37℃にて30分間処理した。処理液の10mLをただちに1% Oxgallを含む胆汁処理液に加え、37℃にて30分間処理した。この後、5640×gで10分間遠心して菌体を回収し、寒天平板に塗抹し、得られた培養物から単一のコロニーを数株選び、酸、胆汁連続耐性の向上した菌株 B. breve YIT4125株(以下、4125株ともいう)及びYIT4126株(以下、4126株ともいう)を得た。
また、このサンプルについて飲用試験も行った。健康な成人男子10名を2群に分け、4125株又はA株で調製したサンプルのいずれかを1日100mL、3日間飲用してもらい、飲用終了の翌日の便を回収、投与菌の回収性をT−CBPCプレートを用いて測定した。1週間の間隔を置いて各群のボランティアに、前回と異なるサンプルを飲用してもらい、回収菌数を求めた。この2回分の結果は菌株ごとにまとめ、その平均値を回収菌数とした。
以上の保存7日目の製品における酸、胆汁連続処理後の生残性結果と、飲用回収性結果、及び7日間保存中の製品中の生菌数の変化率を表7に示した。なお、この場合の変化率とは、低温保存中の1日あたりに減少する生菌数を対数で表したものである。
更に、保存中の製品中生菌数の変化率も小さく、高菌数が維持されていた。
以上の結果から、この酸胆汁連続処理後の生残性が20%以上であれば、飲用時の回収菌数が107 cfu/mLになることがわかった。
上記サンプルについて、引き続き10℃、3週間の保存試験を行った。3週間保存後の製品中生菌数の生残率を表8に示した。
次に市販製品について検討を行った。市販のシロップ入りビフィドバクテリウム属細菌含有発酵乳(発酵乳E)及び4125株により作製した実施例6の発酵乳(いずれも7日保存相当)の酸胆汁連続耐性を実施例4と同様に測定した。
同時に健康成人1名がそれぞれの製品を1週間の間隔を空けて昼食後に飲用し、翌日の便に含まれる製品由来のビフィドバクテリウム属細菌数を測定した。製品由来のビフィドバクテリウム属細菌数は、まずTOSプレート(実施例1のT−CBPCプレートを抗生物質を加えずに作製したもの)で、糞便中のビフィドバクテリウム属細菌のみを選択的に生育させ、その中からRandam Amplified Polymorphic DNA Fingerprinting(RAPD法)を用いて製品由来のビフィドバクテリウム属細菌を同定し、その存在割合から回収菌数を算出した。結果を表9に示す。
Claims (6)
- ビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品を、pH4.3の酸で37℃30分間処理、次いで胆汁を1%含む溶液で37℃30分間連続処理したとき、これらの処理後の生残性が20%以上であるビフィドバクテリウム属細菌。
- ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム又はビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項1記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- ビフィドバクテリウム・ブレーベYIT 4125株又はビフィドバクテリウム・ブレーベ YIT4126株である請求項1又は2記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のビフィドバクテリウム属細菌を含むことを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳飲食品。
- 7日間保存した当該発酵乳飲食品を、pH4.3の酸で37℃30分間処理、次いで胆汁を1%含む溶液で37℃30分間連続処理したとき、これらの処理後のビフィドバクテリウム属細菌の生残性が20%以上である請求項4記載の発酵乳飲食品。
- 更に、シロップを含有する請求項4又は5記載の発酵乳飲食品。
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