KR100866199B1 - 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도평가방법 - Google Patents
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Abstract
비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품을 산, 이어서 담즙으로 연속처리하고, 이들 처리 후의 생존성을 측정하는 것을 특징으로 하는 당해 발효유 음식품을 인간에게 경구 투여한 경우의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도 평가방법.
발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도를 간편하고 또한 정확하게 평가할 수 있다.
비피도박테리움속 세균, 발효유 음식품, 담즙, 생존성, 장내 도달도
Description
본 발명은 인간에게 경구로 투여된 발효유 음식품(fermented milk food or drink) 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도를 간편하게 평가하는 방법 및 상기 평가방법에 있어서 높은 생존성을 갖는 비피도박테리움속 세균에 관한 것이다.
비피도박테리움속 세균에 대해서는 장내 유해 세균의 억제작용이나 정장작용, 면역부활작용 등의 여러가지 생리작용이 보고되어 있다. 이 때문에 각종 발효유제품이나 생균제제 등의 형태로 다수의 시판품이 판매되고 있고, 현재는 확고한 시장을 형성하고 있다. 특히 발효유 음식품은 우수한 기호성을 가지고 있기 때문에 계속적으로 음용하기 쉬운 비피도박테리움속 세균의 투여에 적합한 것이다.
비피도박테리움속 세균의 생리효과의 대부분은 균이 장관에 도달한 후, 대사산물인 초산 등을 생산함으로써 나타내어진다. 이 때문에, 충분한 효과를 얻기 위해서는 균이 살아 있는 상태로 장에 도달하는 것이 필요해진다. 이러한 균의 장관으로의 도달성은 종래부터 균의 분변으로부터의 회수율을 지표로 하여 판단되고 있 다. 즉, 분변 중에 존재하는 생균수는 장관으로의 도달도를 반영하고 있기 때문에, 균을 투여한 인간의 분변을 회수하여 분변 중의 생존균수(회수율)를 측정함으로써 도달성의 확인이 이루어지고 있었던 것이다.
그런데, 비피도박테리움속 세균은 산 내성, 담즙 내성 등이 약하기 때문에, 일반적으로 장관으로의 도달율이 낮을 것으로 생각되고 있다. 즉, 균이 경구적으로 섭취되면 장으로의 도달 전에 위산이나 담즙 등에 의해 사멸되어 버릴 가능성도 있다.
근래에는, 각종 제조기술의 향상 등에 의해 섭취할 수 있는 균수 자체가 증가하고 있기 때문에, 어느 정도의 사멸이 발생하더라도 이를 허용하여 생리효과를 기대하는 것도 가능하다. 또한, 비피도박테리움속 세균을 포함하는 발효식품 등의 제조시에는, 보존시의 생존성을 개선하기 위한 여러가지 성분, 예를 들면 N-아세틸글루코사민, 판토텐산, 펩티드류, 락툴로오스(lactulose) 등의 첨가도 이루어지고 있기 때문에, 그 작용에 의해 섭취 후의 장관으로의 도달성도 높아지고 있는 것으로 생각된다.
그러나, 균의 생리효과를 보다 강하게 하기 위해서는 보다 많은 생균을 장관으로 도달시킬 필요가 있기 때문에, 더욱 큰 도달성의 향상이 요망된다. 하지만, 상기와 같이 장관으로의 도달성, 즉 분변으로부터의 회수율을 측정하기 위해서는, 인간으로의 투여시험이 필요해져 번잡하고 또한 장기간의 작업을 필요로 하기 때문에, 실제로 이러한 실험을 행하는 것은 매우 곤란했었다.
한편으로, 경구 섭취 후의 장벽이 되는 위산이나 담즙에 대해, 미리 내성을 부여한 균주를 작출한 내용의 보고도 몇 가지 되어 있다. 예를 들면, 일본국 특허공개 제(평)9-322762호 공보에는 산, 담즙염 및 산소 내성이 높은 비피도박테리움속 세균에 관하여 기재되어 있어, 이를 사용하면 성장 촉진물질을 가하지 않고 탈지유 등으로 호기조건하에서도 배양을 행할 수 있는 것으로 되어 있다. 또한, International Journal of Food Microbiology 47 (1999) 25~32에도, 산 및 담즙으로의 내성이 높은 비피도박테리움속 세균 2주가 기재되어 있다.
이러한 내성주를 사용하면 투여시 균의 장으로의 도달성이 향상되는 것도 생각할 수 있다. 따라서, 본 발명자 등은 상기와 같은 산 및 담즙으로의 내성이 높은 균주를 작출하고, 이를 사용하여 시럽 함유 발효유 음식품을 제조하고 인간으로의 투여를 행하여 그 분변으로부터의 회수율을 측정하였다. 그 결과, 상기 내성과 회수율은 반드시 상관하지 않는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 목적은 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도를 반영하는 간편하고 또한 정확한 평가계를 구축하는 것에 있다. 또한, 본 발명은 종래의 비피도박테리움속 세균 보다도 우수한 장내 도달성을 갖는 균주를 작출하여, 이를 사용한 비피도박테리움속 세균 함유 발효유 음식품을 제공하는 것에 있다.
발명의 개시
이에 본 발명자 등은 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품에 있어서의 비피도박테리움속 세균의 분변으로부터의 회수율에 대해 검토해 온 바, 발 효유 음식품, 특히 시럽을 배합한 발효유 음식품에 있어서는, 제조 직후에는 비교적 회수율이 높지만, 제조로부터 1주일 정도 지나면 회수율의 저하가 현저한 것이 판명되었다. 발효유 음식품의 유통을 고려하면, 이 정도의 보존 후에도 충분히 높은 회수율을 확보할 필요가 있다. 따라서, 일주일 정도 보존한 비피도박테리움속 세균 및 시럽을 함유하는 발효유 음식품을 사용하여 추가로 검토한 결과, 산, 담즙의 연속처리 후의 생존성을 측정하면, 경구 투여한 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도를 간편하고 또한 정확하게 평가할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 이 산, 담즙의 연속처리 후의 생존성을 지표로 하여, 어느 값 이상의 생존성을 갖는 균주를 함유하는 발효유 음식품은, 제조로부터 1주일 정도 경과해도 우수한 장내 도달성이 얻어지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품을 산, 이어서 담즙으로 연속처리하고, 이들 처리 후의 생존성을 측정하는 것을 특징으로 하는, 당해 발효유 음식품을 인간에게 경구 투여한 경우의 당해 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도 평가방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 평가방법에 의한 생존성이 20% 이상인 비피도박테리움속 세균 및 해당 세균을 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움속 세균 함유 발효유 음식품을 제공하는 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서의 평가 대상은 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품이라면 어느 것을 사용해도 된다. 예를 들면, 비피도박테리움속 세균을 GAM 배지(닛스이제약회사 제품) 등의 영양배지에서 배양하고, 이것을 종균으로 하여 유배지(milk medium)에서 추가로 배양을 행하여 얻어진 발효유에 시럽을 첨가한 발효유 음식품을 들 수 있다. 특히, 시럽을 함유하는 발효유 음식품 속에서는 보존시에 비피도박테리움속 세균의 장내 도달성이 저하되어 버리기 때문에, 시럽을 포함하는 것을 대상으로 한 경우에 본 발명의 평가방법이 유효하다. 여기에서 젖으로서는 우유(전지유) 및 그 가공품인 탈지유, 기타 산양, 양 등의 짐승의 젖 등, 더 나아가서는 식물성 두유 등을 들 수 있다. 시럽으로서는 글루코오스, 수크로오스, 과당 포도당 액당, 포도당 과당 액당, 봉밀 등의 당류, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 락티톨(lactitol), 팔라티니트(palatinit) 등의 당알코올을 들 수 있다. 시럽의 함유량은 0.1~10중량% 정도가 바람직하다. 당해 발효유 음식품에는 비피도박테리아속 세균을 1 ×107~5 ×109 cfu/mL, 특히 1 ×108~1 ×109 cfu/mL 포함하는 것이 바람직하다. 5 ×109을 초과하는 균수에서는 포함되는 균에 대한 산이나 담즙의 부하가 충분하지 않아 정확한 판정이 불가능하다. 또한, 1 ×107 미만에서는 반대로 개개의 균에 대한 산이나 담즙의 부하가 지나치게 크기 때문에 적당하지 않다.
또한, 당해 발효유 음식품에는 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 레시틴 등의 유화제, 한천, 젤라틴, 카라기난(carageenan), 구아 검(guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 펙틴, 로커스트 빈 검(locust bean gum) 등 의 증점(안정)제를 배합할 수 있다. 이 밖에도 비타민 A, 비타민 B류, 비타민 C, 비타민 E 등의 각종 비타민류나 허브추출액 등을 배합하는 것도 가능하다.
발효유 음식품의 제조에는 비피도박테리움속 세균 이외의 균을 병용하는 것도 가능하다. 이러한 균으로서는 예를 들면 락토바실루스 아시도필루스 Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 가세리(L. gasseri), 락토바실루스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실루스 부히네리(L. buchneri), 락토바실루스 카제이(L. casei), 락토바실루스 죤소니(L. johnsonii), 락토바실루스 갈리나룸(L. gallinarum), 락토바실루스 아밀로보러스(L. amylovorus), 락토바실루스 브레비스(L. brevis), 락토바실루스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실루스 케피어(L. kefir), 락토바실루스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실루스 크리스파터스(L. crispatus), 락토바실루스 델브루엑키 서브스피시즈 델브루엑키(L. delbrueckii subsp. delbrueckii), 락토바실루스 델브루엑키 서브스피시즈 불가리쿠스(L. delbrueckii subsp. bulgaricus) 등의 락토바실루스속 세균, 스트렙토코커스 서모필루스(Streptococcus thermophilus) 등의 스트렙토코커스속 세균, 락토코커스 락티스 서브스피시즈 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis), 락토코커스 락티스 서브스피시즈 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris) 등의 락토코커스속 세균, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속 세균, 사마로마이세스 세레비시에(Saccharomyses cerevisiae), 토룰라스포라 델브루엑키 (Torulaspora delbrueckii), 캔디다 케피어(Candida kefir) 등의 사마로마이세스속, 토룰라스포라속, 캔디다속 등에 속하는 효모 등을 바람직한 미생물로서 들 수 있다.
그 중에서도 상기 락토바실루스속 세균, 스트렙토코커스속 세균 및 락토코커스속 세균으로부터 선택되는 유산균 중 1종 이상을 병용하여 발효유 음식품을 제조하면 높은 기호성을 얻을 수 있기 때문에, 계속적인 음용이 용이하고 또한 장내 도달도 또는 회수율의 향상효과도 높기 때문에 바람직하다.
발효유 음식품의 제조는 일반적인 방법에 따르면 되고, 예를 들면 발효유를 제조하는 경우에는 먼저 살균한 유배지에 비피도박테리움속 세균을 단독 또는 유산균과 동시에 접종 배양하고, 이것을 균질화 처리하여 발효유 베이스를 얻는다. 이어서, 별도로 조제한 시럽 용액을 첨가 혼합하여 호모게나이저 등으로 균질화하고, 추가로 향료를 첨가하여 최종 제품으로 마무리하면 된다.
이와 같이 하여 얻어지는 발효유 음식품은 소프트 타입, 과일 향료 타입, 고체형상, 액체 형상 등 어느 하나의 형태의 제품으로 하는 것도 가능하다.
또한, 산, 담즙 연속처리에 사용하는 발효유 음식품은 배양종료 후 저온에서 보존하기 시작한 날을 0일로 하여(시럽 함유 발효유 음식품이라면 시럽 및 비피도박테리움속 세균을 혼합한 날을 0일로 하여) 7일간 보존한 음식품이 바람직하다. 또한, 그 pH는 5.0~5.8인 것이 바람직하다.
또한, 사용하는 비피도박테리움속 세균의 균종은 특별히 한정되지 않지만 인간 유래의 세균이 바람직하고, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 론검(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 아돌레스센티스(B. adolescentis), 비 피도박테리움 카테뉼라텀(B. catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테뉼라텀(B. pseudocatenulatum) 등이 보다 바람직하고, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 론검이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 산, 이어서 담즙에 의한 연속처리란 상기 발효유 음식품을 산으로 처리한 후, 연속하여 담즙처리를 행하는 처리를 말한다. 여기에서, 연속처리란 산처리한 발효유 음식품을 즉시 내지 균의 활성을 회복시키지 않고 담즙처리하는 것을 의미하고, 균의 활성을 회복시키지 않는다는 것은 산처리액으로의 중화제의 첨가나 완충제 또는 배지에서의 희석 등, 균의 활성을 적극적으로 회복시키는 처리를 행하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 산처리란 초산, 젖산, 구연산, 사과산, 호박산, 낙산, 프로피온산 등의 유기산, 또는 염산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산을 첨가하여, 비피도박테리움속 세균의 가장 적합한 pH 보다도 산성으로 한 액에, 발효유 음식품을 첨가하여 장애를 부여하는 처리를 말하는 것이다. 사용하는 산은 특별히 한정되지 않지만, 비피도박테리움속 세균의 균주에 따라서는 염의 존재에 의해 생육에 장애를 받는 것도 있고, 그 영향은 회수율과의 상관관계에 있어서 무시할 수 없는 경우도 있기 때문에 유기산을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 초산, 젖산 또는 염산을 사용하면 장내 도달도와의 상관성이 높아지기 때문에 바람직하다.
산처리용 산 함유액의 pH는 3.0~5.5 정도, 특히 4.0~4.5 정도로 하는 것이 바람직하다. pH 5.5 이상에서는 일반 발효유제품 자체의 pH 보다 높은 값으로 되어 버리는 경우가 대부분으로, 비피도박테리움속 세균에 약간의 장애 밖에 부여할 수 밖에 없는 한편, pH 3.0 미만에서는 스트레스가 지나치게 강하기 때문에 극히 단신간 동안에 대부분의 균이 사멸되어 버리기 때문에, 어느 경우도 처리 후의 생존성에 관하여 균주간의 차를 검출할 수 없기 때문이다.
또 산 함유액에 발효유 음식품을 첨가한 후의 처리는 비피도박테리움속 세균의 생육 가능온도, 즉 30~42℃ 정도에서 1~60분간 정도 행하면 되고, 특히 36~38℃ 정도에서 10~30분간 정도 처리하는 것이 생체조건의 반영이나 시험의 간편성면에서 바람직하다.
본 발명에서는 이어서 산처리 후의 발효유 음식품에 대해 담즙처리를 행한다. 즉, 상기 산처리 후의 발효유 음식품을 직접 담즙용액에 첨가하여 처리를 행한다. 담즙처리의 조건도 특별히 한정되지 않지만 0.1~5% 정도의 담즙 또는 담즙염 및 중화제로서 인산나트륨을 첨가한 용액을 사용하여, 산처리 후의 발효유 음식품의 첨가 후에는 30~42℃에서 1~240분간 정도의 처리를 행하면 된다. 특히, 장내 도달도와의 상관관계를 높여 균주간 내성의 차이를 명확하게 하기 위해서는, 0.5~2% 정도의 담즙 또는 담즙염을 첨가하여 발효유 음식품의 첨가 후에는 36~38℃에서 30~60분간 정도의 처리를 행하는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 산, 담즙 연속처리는 7일간 보존한 비피도박테리움속 세균(최초 발생 균수 약 1 ×108 정도)을 함유하는 발효유 음식품을 사용하여, pH 4.3의 산으로 36~38℃에서 10~30분, 이어서 1%의 담즙으로 36~38℃에서 30~60분간의 처리이다.
상기 산, 담즙 연속처리로서 특히 바람직한 조건을 구체적으로 들자면 이하와 같이 된다. 먼저, 초산에 의해 pH 4.3으로 조정한 산처리액 10 mL에 발효유 음식품 1 mL를 첨가하여 37℃에서 30분간 처리한다. 처리 후에는 바로 이 산처리액 1 mL를 담즙을 1% 포함하는 담즙처리액 10 mL에 첨가하고, 계속해서 37℃에서 30분간 처리한다. 이 조건이라면 대상이 되는 균주의 종류에 상관 없이 장내 도달도와 거의 동일한 생존성을 이끌어내는 것이 가능하여, 균주간의 생존성의 차이도 명확하게 판정하는 것이 가능하다.
상기 산, 담즙 연속처리에 의한 생존성은 발효유 음식품 중의 처리 전의 생균수와 처리 후의 생균수를 비교함으로써 측정할 수 있다. 즉, 처리 전의 생균수에 대한 처리 후의 생균수의 비율을 구하면 된다. 또한, 생균수는 일반적인 방법에 따라 측정할 수 있다.
이와 같은 산, 담즙 연속처리에 대한 비피도박테리움속 세균의 생존성은 발효유 음식품 인간 경구 투여시의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도와 강한 상관관계를 나타낸다. 즉, 산, 담즙 연속처리에 의한 생존성의 고저는, 발효유 음식품 인간 경구 투여시에 있어서의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도의 고저와 상관하는 파라미터가 되고 있는 것이다. 이것은 산처리에 의해 활성이 저하된 비피도박테리움속 세균에 대해 추가로 담즙으로 처리를 행함으로써 부여되는 스트레스가, 인간 장관내에서의 그것과 유사하기 때문으로 생각되지만 확실하지는 않다.
또한, 본 발명의 장내 도달도란 비피도박테리움속 세균 및 시럽을 포함하는 발효유 음식품을 인간에게 경구 투여한 경우에, 상기 투여 균수에 대해 장내에 도 달하는 균수의 비율을 말한다. 장내로의 도달균수는 분변으로부터의 회수균수와 거의 동등하다고 생각되고 있기 때문에, 실제로는 후자의 측정결과를 장내 도달균수로 하고 있다.
이에 대해, 산처리 또는 담즙처리를 각각 단독으로 행한 경우의 균의 생존성을 측정해도 장내 도달도 또는 회수율과의 상관관계는 얻을 수 없고, 또 산처리 후 시간을 경과시켜 담즙처리한 경우, 담즙처리한 후에 산처리하는 경우 등에도 장내 도달도 또는 회수율에 상관하는 생존성을 얻을 수는 없다.
종래의 비피도박테리움속 세균은 예를 들면 발효유제품 등의 음식품의 제조에 사용된 경우에, 제조 직후에 음식되면 충분한 장내 도달도 또는 회수율을 얻을 수 있지만, 1주일 정도 냉장 보존된 후에는 장내 도달도 또는 회수율이 저하되어 버리는 것이었다. 특히 발효유 음식품 중에 시럽을 포함하는 것으로 그 경향이 현저했지만, 본 발명의 평가방법에 의해 높은 생존성을 가지는 것이 확인된 주는, 발효유 음식품 등의 형태로 1주일의 보존을 거친 후에도 우수한 장내 도달도 또는 회수율을 유지할 수 있는 균주이다.
즉, 본 발명에서는 상기의 산, 담즙 연속처리에 대해 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상의 생존성을 갖는 균주를 새롭게 작출하고, 이 균주를 사용하여 제조한 발효유 음식품은 1주일 정도의 보존을 행해도 제조 직후와 동등한 장내 도달도 또는 회수율을 가지고 있는 것을 확인하였다. 특히, 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 균수가 높은 경우에는, 균의 장내 도달균수가 높을 것으로 예측하기 쉽지만, 1주일 보존한 경우 균의 장내 도달율이 저하되기 쉬워, 실제 도달균 수가 감소하는 사실이 본 발명자 등의 연규결과로부터 밝혀졌다.
그러나, 1 ×108 cfu/mL 이상의 인간 유래의 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품으로서, 당해 발효유 음식품을 1주일 냉장 보존한 후, 10배량의 초산에 의해 pH 4.3으로 조정한 산처리액으로 37℃에서 30분간 처리하고, 추가로 이 산처리액을 10배량의 1% 담즙산으로 37℃에서 30분간 처리한 후의 발효유 음식품 중의 균의 생존성이 20% 이상인 발효유 음식품이라면, 1주일 보존 후 인간 음용시에 있어서의 장내로의 도달균수로서 1 ×107 cfu/g 정도를 확보할 수 있기 때문에, 이러한 균수 및 균의 생존성을 구비하는 발효유 음식품은 특히 바람직하다. 1 ×107 cfu/g 정도의 도달균수를 확보할 수 있다면 장내 유해균이라 불리고 있는 박테로이데스속(Bacteroides spp.)세균이나 클로스트리디움속(Clostridium spp.)세균 등의 번식을 억제할 수 있기 때문이다.
산, 담즙 연속처리에서 높은 생존성을 갖는 비피도박테리움속 세균의 균종도 특별히 한정되지 않고, 상기에 예시한 인간 유래의 각 균종 등 어느 하나를 사용해도 높은 장내 도달도 또는 회수율을 기대할 수 있다. 그 중에서도, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 비피덤 및 비피도박테리움 론검은 유아나 고령자로의 생리효과나 안전성이 잘 확인되어 있기 때문에 바람직하다.
이러한 산, 담즙 연속처리 내성이 높은 균주의 제작은 예를 들면 이하에 나타내는 방법에 따라 행할 수 있다.
즉, 친주(親株)로 하는 비피도박테리움속 세균을 사용하여 발효유를 조제하 고, 시럽을 첨가하여 발효 음료품을 제작한 후, 적당한 용기에 분주하여 냉장 보존한다. 보존 후의 발효 음료품에 산, 담즙처리를 하여 처리 후 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 이 균체 중에서 산, 담즙 연속처리 내성이 우수한 것을 선택해 가는 것이다.
상기의 방법에 사용하는 비피도박테리움속 세균도 어느 균종이어도 되고, 상기와 동일한 이유에서 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 비피덤 및 비피도박테리움 론검으로부터 선택되는 균을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 농축법에 의해 특히 산, 담즙 연속처리에서 높은 생존성을 갖는 균주로 인정된 2주 YIT 4125주 및 YIT 4126주는 전자를 비피도박테리움 브레베 YIT 4125(FERM BP-7813)로 하고, 후자를 비피도박테리움 브레베 YIT 4126(FERM BP-7814)로 하여, 각각 2000년 10월 27일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키현 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6)에 기탁하고 있다.
또한, 상기 방법에 의하지 않고도 자외선조사나 니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄설폰산(EMS) 등 돌연변이 유도제 등에 의한 처리를 행하여 산, 담즙 연속처리에서의 높은 생존성을 갖는 주를 선택하는 것도 가능하다.
이들 작출방법, 또는 기타 방법으로 얻어진 산, 담즙 연속처리에서 높은 생존성을 갖는 비피도박테리움속 세균은 모두 높은 장내 도달도 또는 회수율을 나타내는 것이다. 또한, 상기 2균주는 모두 산, 담즙 연속처리 후의 생존성이 35% 이상인 우수한 균주이다.
또한, 본 발명은 상기 산, 담즙 연속처리에서의 높은 생존성을 갖는 비피도박테리움속 세균 및 시럽을 함유하는 발효유 음식품에 관한 것이다. 발효유 음식품의 형태로서는 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지는 않는다.
참고예 1
비피도박테리움 브레베 4052주(B. breve A)를 친주로 하여 N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG)처리를 행한 균체를 혐기 탈지유 배지에서 배양 후, 그 1 mL를 산처리액(pH 3.8) 10 mL에 첨가하여 37℃에서 8분간 처리하였다. 그 1% 양을 혐기 탈지유 배지에 접종하여 37℃에서 20시간 배양하였다. 배앙 후, 10℃에서 4일간 보존 후, 그 1 mL를 산처리액(pH 3.8) 10 mL에 첨가하여 동일하게 처리를 행한 후, 처리 후의 균체를 탈지유 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양물로부터 단일 콜로니를 몇 주 선택하여 산 내성을 비교한 바, 산 내성이 향상된 주로서 비피도박테리움 브레베 N4주(B. breve B)가 선발되었다. 이 주는 동시에 담즙 내성도 향상되어 있었다.
혐기 탈지유 배지의 조성
탈지분유 12%
효모추출액 1%
시스테인 0.03%
탄산칼슘 2%
질소를 20분 불어 넣은 후에 고무 마개를 덮고, 115℃에서 20분간 오토클레이브 멸균한다.
실시예 1
100℃, 90분간 살균한 18% 전지유 배지(0.03% 효모추출액 첨가)에 B. breve A, B(N4주) 및 B. bifidum C(YIT 4007주)의 시드 컬쳐를 접종하여 34℃에서 약 20시간 배양하여 3종의 발효유를 얻었다. 얻어진 발효유 각각에 포도당 과당 액당을 최종농도가 8%가 되도록 첨가하여 이것을 시험에 제공하는 샘플로 하였다. 이 샘플을 유리용기에 분주하고 고무 마개를 덮어 공기의 유입을 차단한 상태로 10℃에서 7일간 보존하였다.
이들 샘플에 대해서 인간에 있어서의 음용 후의 분변으로의 비피더스균의 회수성을 측정하였다. 건강한 성인 남자 18명(평균 연령 33세)을 무작위로 세 군으로 나눠, 각 균주로 조제한 발효유를 1일 100 mL, 3일간 음용하게 하였다. 음용 종료일의 다음날, 변을 회수하여 혐기 희석수로 단계 희석하여 선택 플레이트에 발생하는 콜로니수로부터 회수균수를 산출하였다. B. breve A, B주에 대해서는 T-CBPC 플레이트를 B. bifidum C주에 대해서는 T-LCM 플레이트를 사용하였다.
혐기 희석수의 조성
인산 이수소 칼륨 0.0225%
인산 수소 이칼륨 0.0225%
염화 나트륨 0.045%
황산 암모늄 0.0225%
염화 칼슘 0.00225%
황산마그네슘 0.00225%
상기 조성을 증류수에 용해한 후, 질소를 불어 넣어 혐기상태로 하고, 고무 마개를 덮어 공기의 유입을 차단하여 오토클레이브 살균(121℃, 15분)한다.
T-CBPC 플레이트의 조성
TOS(야구르트제품) 1%
트립티케이스 펩톤(Trypticase peptone)(BBL) 1%
효모추출액(Difco) 0.1%
인산 이수소 칼륨 0.3%
인산 수소 이칼륨 0.45%
황산 암모늄 0.3%
황산 마그네슘 0.02%
시스테인 염산염 0.05%
Lab-Lemco powder(OXOID) 0.1%
한천(Difco) 1.5%
상기 조성을 증류수에 용해 후, 115℃에서 15분간 오토클레이브 살균한다. 50℃까지 냉각 후, 여과 멸균한 Carbenicillin(Sigma) 및 Streptmycinaulfate (Sigma)를 각각 최종농도가 1 ㎍/mL, 0.5%가 되도록 첨가하여 한천 평판을 제작한다.
T-LCM 플레이트의 조성
여과 멸균한 항생제로서 Carbenicillin(Sigma)을 1 ㎍/mL 첨가하는 대신에, Lincomycin(Sigma)을 2 ㎍/mL 첨가하는 것 이외에는 T-CBPC 플레이트와 공통이다.
그 결과, 3주의 비피더스균으로 조제한 발효유의 회수성에는 이하와 같은 차가 보였다.
| 균주 | A | B | C |
| 최초 발생 균수 | 3.99 ×108 | 3.16 ×108 | 7.94 ×108 |
| 회수균수 | 4.79 ×104 | 4.37 ×105 | 9.55 ×106 |
실시예 2
실시예 1의 회수성을 반영하는 in vitro의 모델계의 검토를 행하였다. 이 때, 간편함을 우선으로 하여 처리는 30분에서 1시간으로 종료하는 계를 검토하였다.
먼저, 소화관 중에서 최초로 통과하는 위의 모델로서, 산처리에 대한 내성을 평가하였다. 산처리액으로서는 고바야시 등의 방법(Japanese Journal of Bacteriology, 29, 691-697 (1974))을 참고로 하여, 비피더스균 배지에 산을 가하여 pH를 낮춘 용액을 사용하였다.
산처리액의 조성
트립티케이스 펩톤(BBL) 1%
효모추출액(Difco) 0.5%
트립토오스(Difco) 0.3%
염화 나트륨 0.2%
구연산-암모늄 0.2%
시스테인 염산염 0.05%
락토오스 1%
피루브산(Pyruvic acid) 0.1%
트윈 80 0.1%
황산 마그네슘 0.0575%
황산 제1철 0.0034%
황산 망간 0.012%
상기 조성을 증류수에 용해한 후, 초산 등의 산을 첨가하여 pH 3~5.5로 조정하여 121℃에서 15분 오토클레이브 멸균한다.
산처리액의 pH에 관하여 검토한 결과, pH를 3.8 이상으로 설정하면 1~30분 처리 후의 생존 균수가 측정 가능하였기 때문에, pH 3.8의 산처리액을 사용하기로 했다.
pH 3.8의 산처리액 10 mL에 실시예 1에서 사용한 3종의 샘플을 1 mL 가하여 37℃에서 배양하였다. 처리 중에 적절히 샘플링을 행하여 생균수를 측정하였다. 얻어진 데이터로부터 사멸속도를 측정한 결과 이하와 같이 되었다.
| 균주 | A | B | C |
| 산처리 중의 사멸속도(1분당 사멸균수의 로그값) | 0.55 | 0.38 | 0.51 |
이 결과로부터 산처리에 의한 사멸속도에 관해서는 B주가 가장 양호하여, 실시예 1에 나타내는 실제 음용 회수균수의 순서와 모순이 보였다.
실시예 3
다음에 장에 도달한 경우를 생각하여 담즙처리에 대한 내성을 비교하였다. 산처리와 동일하게 처리시간이나 생균수가 측정 가능한지를 고려한 경우, oxgall을 사용한 이하의 조성의 처리액이 적당하다고 판단했다.
담즙처리액의 조성
트립티케이스 펩톤(BBL) 1%
효모추출액(Difco) 0.5%
트립토오스(Difco) 0.3%
인산 수소 이나트륨 12수염 2.03%
인산 이수소 나트륨 2수염 0.156%
구연산 이암모늄 0.2%
시스테인 염산염 0.05%
락토오스 1%
피루브산 0.1%
트윈 80 0.1%
황산 마그네슘 0.0575%
황산 제1철 0.0034%
황산 망간 0.012%
상기 조성을 증류수에 용해한 후, Oxgall(Difco)을 0.1~5% 가하여 용해하고, 수산화나트륨용액을 사용하여 pH 8.0으로 조정하여 121℃에서 15분 오토클레이브 멸균한다.
Oxgall의 농도에 대해서 검토한 결과, Oxgall 농도를 1% 이하로 설정하면 1~30분 처리 후의 생존 균수가 측정 가능하였기 때문에, 1%의 Oxgall을 포함하는 담즙처리액을 사용하기로 했다. 1% Oxgall을 포함하는 담즙처리액 10 mL에 실시예 1에서 사용한 3종의 샘플을 1 mL 가하여 37℃에서 30분간 처리하고, 처리 후의 생균수를 측정하였다. 얻어진 데이터로부터 담즙처리에 의한 생존률을 산출한 결과 이하와 같이 되었다.
| 균주 | A | B | C |
| 담즙처리 후의 생존률(%) | <0.1 | 60 | 30 |
담즙에 대한 내성에 대해서도 B주가 가장 양호하여, 실제 회수성과의 모순이 보였다.
실시예 4
소화관을 통과할 때는 위와 장을 연속해서 통과하는 것을 고려하여, in vitro 처리도 산처리와 담즙처리를 연속해서 행해 보았다. 이 산, 담즙 연속처리의 경우는, 산의 처리액의 pH를 4.3 이상으로 하고, 담즙처리액에 포함되는 Oxgall 농도를 1%로 설정하면 처리 후의 생존 균수의 측정이 가능했다. 즉, 이하와 같은 처리를 산, 담즙 연속처리로 행하였다.
초산을 사용하여 pH 4.3으로 조정한 산처리액 10 mL에 실시예 1에서 사용한 시럽이 든 발효유를 1 mL 가하여 37℃에서 30분간 처리하였다. 처리 후의 산처리액 1 mL를 바로 1% Oxgall을 포함하는 담즙처리액에 첨가하고, 추가로 37℃에서 30분 간 처리하였다. 이 산, 담즙 연속처리 후의 균의 생존률을 3주 사이에서 비교하였더니 이하와 같이 되었다.
| 균주 | A | B | C |
| 연속처리 후의 생존률(%) | <1 | 3 | 10 |
이 연속처리에 의한 평가에서는 실시예 1에 나타내는 실제 회수성의 순서와의 일치가 보였다. 즉, 산 또는 담즙의 단독처리에서는 처리 후의 생존률은 B주가 가장 높았던 것에 대해, 산, 담즙 연속처리에서는 처리 후의 생존률은 C주가 가장 높아 실제 음용 회수성과의 일치가 보였다. 따라서, in vitro 연속처리의 결과를 토대로 음용 회수성을 예측할 수 있는 가능성이 있는 것이 발견되었다.
실시예 5
이 연속처리에 의한 평가를 이하의 방법으로 담즙 내성을 부여한 육종주 B. breve NE주(D주)에서 행하였다.
B. breve A주를 원주(元株)로 하여 먼저 변이처리를 행하였다. 5 ㎍/mL NTG를 포함하는 50 mL 인산완충액(pH 7.0)과 B. breve의 세척 균체를 1:1로 혼합하여 37℃에서 30분 처리한 후, 인산완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 이 균체를 영양배지에 1% 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다.
이 NTG 처리한 균체에 추가로 EMS 처리를 행하였다. 0.4% EMS를 포함하는 50 mM 인산완충액(pH 7.0)과 상기 배양 균체를 1:1로 혼합하여 37℃에서 30분 처리한 후, 인산 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 이 균체를 영양배지에 1% 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다.
이 균체를 최초 발생 종균(0.03% 효모추출액 첨가)으로서 시드 컬쳐를 제작하여, 100℃에서 90분간 멸균한 18% 전지유 배지에 접종하고 34℃에서 약 20시간 배양하여 발효유를 조제하였다. 여기에, 최종농도가 8%가 되도록 포도당 과당 액당을 가하여 유리용기에 분주한 후, 고무 마개를 덮어 10℃에서 10일간 보존하였다. 보존 후의 샘플을 10 mL 취해 실시예 4에서 나타내는 조성의 2% Oxgall을 포함하는 담즙처리액 100 mL에 가하여 37℃에서 30분간 담즙처리하였다. 처리 후, 5000 ×g, 10분간 원심하여 균체를 회수하고, 한천 평판에 도말하여 얻어진 배양물로부터 단일 콜로니를 몇 주 선택하여 내성이 향상된 D주를 얻었다.
이 균주와 C주를 사용하여 실시예 1과 동일하게 시럽이 든 발효유를 조제하여 10℃에서 7일간 보존한 샘플을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 산, 담즙 연속내성을 비교하였더니 이하와 같은 결과가 되었다.
| 균주 | D | C |
| 최초 발생 균수 | 2.1 ×108 | 5.3 ×108 |
| 연속처리 후의 생존 균수 | 3.7 ×107 | 9.3 ×107 |
| 생존률 | 18% | 18% |
이들 샘플에 대해 동시에 음용 시험을 행하였다. 건강한 성인 12명을 두 군으로 나눠, 실시예 5에서 조제한 시럽이 든 발효유 2종을 각각 1일 100 mL, 3일간 음용하게 하였다. 음용 종료일의 다음 날, 변을 회수하여 혐기 희석수로 단계 희석하고, 선택 플레이트에 발생하는 콜로니수로부터 회수균수를 산출하였다. B. breve D주에 대해서는 T-CBPC 플레이트를, B. bifidum C주에 대해서는 T-LCM 플레이트를 사용하였다. 그 결과를 이하에 나타낸다.
| 균주 | D | C |
| 회수균수(로그) | 6.26 | 6.44 |
이들 결과로부터 담즙처리만을 행하여 육종한 D주는 산, 담즙 연속처리 후의 생존성이 20%에는 이르지 못하고, 음용 회수균수도 1 ×107에 못 미치는 것을 알 수 있었다.
실시예 6
연속처리에 의한 내성 평가와 음용 회수성이 상관할 가능성이 높은 사실이 발견되었기 때문에, 연속처리에 의한 균주의 육종을 행하여 얻어진 내성주의 음용 회수성에 대해 검토하였다.
A주를 원주로 하여 시드 컬쳐를 제작하여 135℃에서 3.5초 UHT 살균한 20% 전지유(0.03% 효모추출액 첨가)에 접종하고, 34℃에서 약 20시간 배양하여 발효유를 얻었다. 여기에, 팔라티노오스(Palatinose)를 최종농도가 10%가 되도록 가하여 유리용기에 분주하고, 고무 마개를 덮어 공기의 유입을 차단한 상태에서 10℃에서 11일간 보존하였다. 보존 후의 샘플을 10 mL 취해 실시예 4에 나타내는 조성의 pH 4.3으로 조제한 산처리액 100 mL에 첨가하여 37℃에서 30분간 처리하였다. 처리액의 10 mL를 바로 1% Oxgall을 포함하는 담즙처리액에 가하여 37℃에서 30분간 처리하였다. 이 후, 5640 ×g으로 10분간 원심하여 균체를 회수하고, 한천 평판에 도말하여 얻어진 배양물로부터 단일 콜로니를 몇 주 선택하여 산, 담즙 연속내성이 향상된 균주 B. breve YIT 4125주(이하, 4125주라고도 한다) 및 YIT 4126주(이하, 4126주라고도 한다)를 얻었다.
이들 주 및 A주를 사용하여 실시예 6 처음과 동일한 방법으로 시럽이 든 발효유를 조제하여 10℃에서 7일간 보존 후, 실시예 4와 동일한 방법으로 산, 담즙 연속처리 후의 생존 균수를 구하였다.
또한, 이 샘플에 대해 음용 시험도 행하였다. 건강한 성인 남자 10명을 두 군으로 나눠, 4125주 또는 A주로 조제한 샘플 중 어느 하나를 1일 100 mL, 3일간 음용하게 하여, 음용 종료 다음 날의 변을 회수하여, 투여균의 회수성을 T-CBPC 플레이트를 사용하여 측정하였다. 일주일의 간격을 두고 각 군의 지원자에게 전회와 다른 샘플을 음용하게 하여 회수균수를 구하였다. 이 2회분의 결과는 균주마다 정리하여 그 평균값을 회수균수로 하였다.
이상의 보존 7일째의 제품에 있어서의 산, 담즙 연속처리 후의 생존성 결과와 음용 회수성 결과 및 7일간 보존 중인 제품 중의 생균수의 변화율을 표 7에 나타내었다. 또한, 이 경우의 변화율이란 저온 보존 중의 1일당 감소하는 생균수를 로그로 나타낸 것이다.
| 균주 | A | 4125주 | 4126주 |
| 최초 발생 균수 | 3.7 ×108 | 3.3 ×108 | 3.7 ×108 |
| 연속처리 후의 생존 균수 | 7.8 ×105 | 1.3 ×108 | 2.1 ×108 |
| 생존률 | 0.2% | 39.4% | 56.8% |
회수균수
| 균주 | A | 4125주 | 4126주 |
| 회수균수(로그값) | 6.4 | 7.0 | Not test |
제품 중의 생균수 변화율
| 균주 | A | 4125주 |
| 1일당 생균수 변화율(로그값) | 0.22 | 0.05 |
여기에서 얻어진 4125주 및 4126주는 산, 담즙 내성이 20% 이상이었다. 또한, 4125주의 음용시의 회수균수는 1 ×107 이상이었다.
더욱이, 보존 중의 제품 중 생균수의 변화율도 작아 높은 균수가 유지되어 있었다.
이상의 결과로부터, 이 산, 담즙 연속처리 후의 생존성이 20% 이상이라면 음용시의 회수균수가 107 cfu/mL이 되는 것을 알 수 있었다.
상기 샘플에 대해서 계속해서 10℃에서 3주간의 보존 시험을 행하였다. 3주간 보존 후의 제품 중 생균수의 생존률을 표 8에 나타내었다.
| 균주 | A | 4125주 |
| 3주 후의 생존률 | 21.0% | 69.6% |
얻어진 4125주는 3주간 보존해도 제품 중의 균의 생존률이 양호하였다.
실시예 7
이어서 시판 제품에 대해서 검토를 행하였다. 시판되고 있는 시럽이 든 비피도박테리움속 세균 함유 발효유(발효유 E) 및 4125주에 의해 제작한 실시예 6의 발효유(모두 7일 보존 상당)의 산, 담즙 연속내성을 실시예 4와 동일하게 측정하였다.
동시에 건강한 성인 1명이 각각의 제품을 1주일 간격을 두고 점심식사 후에 음용하여, 다음 날의 변에 포함되는 제품 유래의 비피도박테리움속 세균수를 측정하였다. 제품 유래의 비피도박테리움속 세균수는 먼저 TOS 플레이트(실시예 1의 T-CBPC 플레이트를 항생물질을 첨가하지 않고 제작한 것)에서, 분변 중의 비피도박테리움속 세균만을 선택적으로 생육시키고, 그 중에서 Randam Amplified Polymorphic DNA Fingerprinting(RAPD법)을 사용하여 제품 유래의 비피도박테리움속 세균을 동정하여 그 존재 비율로부터 회수균수를 산출하였다. 결과를 표 9에 나타낸다.
| 제품 | 시판품 E | 4125주 |
| 최초 발생 균수 | 5.2 ×107 | 1.7 ×108 |
| 산, 담즙 처리 후의 생존 균수 | 8.5 ×106 | 7.3 ×107 |
| 생존률 | 16.3% | 42.9% |
회수균수
| 균주 | E | 4125주 |
| 회수균수(로그) | <6.89 | 7.20 |
시판되고 있는 시럽이 든 발효유에 대해서도 산, 담즙 연속처리 후의 생존률이 20% 미만이고, 음용 회수율도 1 ×107 cfu/mL에 못 미쳤다.
본 발명에 의하면 발효유 음식품 중의 비피도박테리움속 세균의 장내 도달도를 간편하고 또한 정확하게 평가할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 보존 후에도 장내로의 도달도가 높은 비피도박테리움속 세균 함유 발효유 음식품을 제공할 수 있다.
Claims (9)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품을 7일간 보존하고, 산으로 37℃에서 30분간 처리, 이어서 담즙으로 37℃에서 30분간 연속처리하고, 이들 처리 후의 생존성을 측정했을 때의 생존성이 20% 이상인 비피도박테리움속 세균으로서, 비피도박테리움 브레베 YIT 4125주 또는 비피도박테리움 브레베 YIT 4126주인 비피도박테리움속 세균.
- 제6항의 비피도박테리움속 세균을 포함하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움속 세균을 함유하는 발효유 음식품.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 추가로 시럽을 함유하는 발효유 음식품.
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