JP2008233076A - 液体サンプル中の微生物を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】液体サンプル中の微生物の検出のための方法、そして特に、例えば、唾液サンプル中の特定細菌のような齲食原性微生物の定量的または半定量的検出のための方法が記載される。さらに、試験細片および少なくとも2つの試験細片を用いる試験システムが記載され、これらは、記載される検出方法における使用のために適切である。また、本発明による検出方法を実施するためのキットもまた記載される。
【選択図】図1
Description
本発明は、液体サンプル中の微生物の検出のための方法に関する。本発明はまた、特に、例えば、唾液サンプル中の特定の細菌のような、齲食原生微生物の定量的または半定量的検出のための方法に関する。さらに、本発明は、試験細片(strip)、ならびに、記載される検出方法における使用のために適切である、少なくとも2つの記載される試験細片を有する試験システムに関する。最後に、本発明は、本発明による検出方法を実施するためのキットに関する。
当然の結果として、本発明の目的は、液体サンプル中の特定の微生物、好ましくは病原体微生物の存在が、信頼性良く、かつ再現可能に検出され得る、デバイスおよび方法を提供することである。これらの方法は、複雑な装置を用いずに実施するために適切であるべきであり、そして結果は、可能であれば、24時間、6時間以内、または1時間以内に利用可能になるべきである。これらのデバイスおよび方法は、さらに、サンプルの定量的または半定量的評価を調べることを可能にするべきである。
a)液体サンプルを受容するための第1の領域であって、免疫複合体を形成することによって検出されるべき微生物と反応し得る標識抗体を有する第1の領域;
b)上記第1の領域から間隔を置いた第2の領域であって、免疫複合体を形成することによって上記検出されるべき微生物と反応し得、そして試験細片上に固定化される捕捉抗体を有する第2の領域
を備え;
ここで、この試験細片は、この試験細片の第1の領域と移動溶媒との接触に際し、上記標識抗体がこの試験細片の第2の領域に移動し、上記第1の領域に付与される上記液体サンプル中の上記検出されるべき微生物の存在下で、上記標識抗体、上記捕捉抗体および上記微生物から免疫複合体が形成されて、この免疫複合体が上記試験細片の第2の領域中の上記標識抗体の標識によって検出され得るように設計され、そしてここで、上記標識によって提供されるシグナルの強度が、上記液体サンプル中の上記微生物の濃度に関する情報を提供する。
(項目1)
液体サンプル中の微生物の定量的または半定量的検出のための試験細片であって:
該液体サンプルを受容するための第1の領域であって、免疫複合体を形成することによって検出されるべき該微生物と反応し得る標識抗体を含む第1の領域;および
該第1の領域から間隔を置いた第2の領域であって、免疫複合体を形成することによって該検出されるべき微生物と反応し得、そして該試験細片上に固定化される捕捉抗体を含む第2の領域を備え、
ここで、該試験細片の該第1の領域と移動溶媒との接触に際し、該標識抗体が該試験細片の第2の領域に移動し、該第1の領域に付与される該液体サンプル中の該検出されるべき微生物の存在下で、該標識抗体と該捕捉抗体と該微生物とから免疫複合体が形成されて、該免疫複合体が該試験細片の該第2の領域中の該標識抗体の標識によって検出され得るように、該試験細片が設計され、そしてここで、該標識によって提供されるシグナルの強度が、該液体サンプル中の該微生物の濃度に関する情報を提供する、試験細片。
(項目2)
上記標識抗体および/または上記捕捉抗体が、モノクローナル抗体である、項目1に記載の試験細片。
(項目3)
上記標識抗体が、粒子に結合されている、項目1に記載の試験細片。
(項目4)
上記粒子が、コロイド状金またはコロシド状銀を含むか、またはコロイド状金またはコロシド状銀からなる、項目3に記載の試験細片。
(項目5)
上記標識抗体および上記捕捉抗体が、病原体細菌に対して指向されている、項目1に記載の試験細片。
(項目6)
上記病原体細菌が、口腔に存在する細菌である、項目5に記載の試験細片。
(項目7)
上記病原体細菌が、Streptococcus属、Lactobacillus属、Actinomyces属、Prevotella属、Actinobacillus属、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Fusobacterium属、Enterococcus属またはHelicobacter属の細菌の群から選択される、項目6に記載の試験細片。
(項目8)
上記病原体細菌が、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus sanguis、Streptococcus gordonii、Streptococcus mitis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus casei、Lactobacillus rhamnosus、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis、Actinomyces naeslundii、Treponema denticola、Fusobacterium nucleatum、Prevotella intermedia、Enterococcus faecalis、Treponema denticola、またはHelicobacter pyloriの群から選択される、項目7に記載の試験細片。
(項目9)
上記標識抗体および上記捕捉抗体が、病原体酵母に対して指向されている、項目1に記載の試験細片。
(項目10)
上記酵母が、Candida属、Cryptococcus属、Malassecia属またはBlastoschizomyces属の酵母の群から選択される、項目9に記載の試験細片。
(項目11)
上記酵母が、Candida albicans、Candida krusei、Candida tropicalis、Candida glabrata、Candida lusitaniae、Candida parapsilosis、Cryptococcus neoformans、またはBlastoschizomyces capitatusから選択される、項目10に記載の試験細片。
(項目12)
上記第1の領域が、上記検出されるべき微生物で、またはその免疫学的に活性な一部分でドープされる、項目1に記載の試験細片。
(項目13)
上記第1の領域が、上記検出されるべき微生物の検出に必要な量の90%を含む、項目12に記載の試験細片。
(項目14)
液体サンプル中の微生物の定量的または半定量的検出のための方法であって、
該液体サンプルを項目1に記載の試験細片上に付与する工程、
該試験細片を移動溶媒と接触させる工程、
該試験細片を、該試験細片の上記第1の領域と移動溶媒との接触に際し上記標識抗体が該試験細片の上記第2の領域に移動する条件下でインキュベートする工程、および
該試験細片の該第2の領域中のシグナルを検出する工程、を包含し;
ここで、該標識によって提供される該シグナルが、該液体サンプル中の該微生物の濃度に関する情報を提供する、方法。
(項目15)
上記サンプルが唾液サンプルであり、そしてStreptococcus mutansおよびLactobacillus sp.が2つの試験細片を用いて同時に検出される、項目14に記載の方法。
(項目16)
第1の試験細片上の標識抗体および/または捕捉抗体がSWLA1であり、そして第2の試験細片上の標識抗体および/または捕捉抗体がSWLA5である、項目15に記載の方法。
(項目17)
微生物の定量的または半定量的検出のためのキットであって、少なくとも1つの項目1に記載の試験細片を含む、キット。
(項目18)
緩衝液、標識試薬および/または上記標識抗体を検出するための検出試薬をさらに含む、項目17に記載のキット。
(項目19)
2つの項目1に記載の試験細片、および2対のアパーチャを備えるハウジングを含む試験システムであって、該対のアパーチャの各々が、第1のアパーチャおよび該第1のアパーチャから間隔をおいた第2のアパーチャ、ならびに該2つの試験細片のための入口アパーチャを含み、ここで、該2つの試験細片が該入口アパーチャを通り、該試験細片の間隔を置いた2つの領域が各場合において該第1のアパーチャおよび該第2のアパーチャを通って接近可能である様式で該ハウジング中に挿入され得るように、該入口アパーチャならびに該2対の第1のアパーチャおよび第2のアパーチャが配列される、システム。
(項目20)
上記第2のアパーチャを通って接近可能である上記試験細片の上記領域が、上記捕捉抗体を含む、項目19に記載の試験システム。
(項目21)
上記第1のアパーチャを通って接近可能である上記試験細片の上記領域が、上記標識抗体を含む、項目20に記載の試験システム。
(項目22)
齲食発生のリスクの決定のための方法であって:
液体サンプルを項目1に従って構築された試験細片に付与する工程、および齲食発生のリスクの指標である、該サンプル中に存在する微生物および/またはその濃度に対するシグナルを分析する工程、を包含する、方法。
液体サンプル中の微生物の検出のための方法、そして特に、例えば、唾液サンプル中の特定細菌のような齲食原性微生物の定量的または半定量的検出のための方法が記載される。さらに、試験細片および少なくとも2つの試験細片を用いる試験システムが記載され、これらは、記載される検出方法における使用のために適切である。また、本発明による検出方法を実施するためのキットもまた記載される。
本明細書で用いられるとき、用語「試験細片」は、細長いマトリックスまたはメンブレンをいい、好ましくは、このマトリックスまたはメンブレンを通る液体または移動溶媒の毛管現象力によって仲介される側方流れを可能にする材料からなる。液体サンプル中の異なる物質のこのようなクロマトグラフィー分離を可能にする適切な材料としては、例えば、セルロースまたはニトロセルース、ガラスファイバー、ナイロン、紙、綿、または、試験細片タイプの材料であって、ガラス、シリコーン、プラスチック、および適切なチャネルが導入された金属の材料が挙げられる。適切な試験細片は、異なる形態で異なる製造業者から市販され入手可能である(例えば、Schleicher&SchuellからのPrima40、60または80メンブレン)。
a)液体サンプルを上記で規定されるような試験細片上に付与する工程、
b)この試験細片と移動溶媒とを接触させる工程、
c)この試験細片を、この試験細片の第1の領域と移動溶媒との接触に際し、標識抗体がこの試験細片の第2の領域に移動する条件下でインキュベートする工程、および
d)この試験細片の第2の領域中のシグナルを検出する工程を包含し、
ここで、標識によって提供される上記シグナルの強度が、上記液体サンプル中の微生物の濃度に関する情報を提供する。
試験シグナル > コントロール線:最も高い濃度
試験シグナル = コントロール線:第2番目に高い濃度
試験シグナル < コントロール線:第2番目に低い濃度
試験シグナル =0または<<コントロール線:最も低い濃度
誤りを避けるために、濃度の評価が、常に、シグナルに基づいて生じ得るように、すべての調査について少なくとも弱いシグナルを得るための試みがなされるべきである。
1.1 試験細片の製造
メンブレンおよび不織布のような、毛細管活性でクロマトグラフィーを行い得る平坦材料を、自己接着性フィルム上に固定する。すべての材料は、互いに毛細管接触しており、そして液体の流れが試験細片の一方の端部から他方に通過することを可能にする。これらの材料の組み立てを、カセット中の入口アパーチャに、移動緩衝液および/またはサンプルを50μlを超える容量で吸引し、そしてそれを一定に放出する吸引不織布が存在するような様式で行う。この吸引不織布は、放出不織布と接触しており、この放出不織布は、各場合において少なくとも1つの移動可能な抗体結合複合体を付与される。試験感度を増加するために、この放出不織布は、抗原、すなわち、微生物の全体細胞で、好ましくは、対応するエピトープを含む細胞のフラグメントでドープされ得る。細胞フラグメント、例えば、細胞壁フラグメントは、以下のセクション1.6に記載される方法に従って調製され得る。代表的には、サンプルは、放出不織布材料上に付与される。この放出不織布の後るに、結合した抗体抗原と捕捉抗体とのサンドイッチ複合体の形成が起こる多孔性メンブレンが存在する。メンブレンの末端に、さらなる不織布材料が、吸引不織布と類似の様式で固定され、これは、付与された液体を集め、そしてその結果、試験細片全体上の液体の連続的毛細管流れを保証する。
1.2 唾液の収集
唾液サンプルを、異なる患者から、最初、パラフィンペレットを噛むことによって唾液の形成を誘導することにより得た。試験被験体あたり1つのペレットを用いた。唾液は、測定ビーカー中に30mlの合計容量で集めた。最初の30秒の間に集めた唾液は棄て、そして次の5分間の間に形成された唾液を集め、そして次にさらなる調査のために用いた。
1.3 唾液の調整
試験細片上の全体の唾液の流速は、適切なクロマトグラフィー緩衝液によって一様にされ得る。代表的には、この緩衝液は、1分以内に不織布収集材料に到達する。抗原−抗体反応および/またはサンドイッチ複合体の形成は、しかし、クロマトグラフィープロセスの相全体、すなわち、液体が吸引不織布から収集不織布にまだ流れ得る間の長さだけ起こる。最大シグナル強度は、クロマトグラフィーの開始後最初の30分以内に発生し、次いで少なくともさらなる30分の間、安定なままである。
1.4 サンプルの試験デバイス上への付与
得られた15μlの唾液サンプルを、ピペットにより本発明に従って試験細片上に付与した。唾液の高粘度の結果として、クロマトグラフィー分離は、移動溶媒の添加により開始する。この場合、移動溶媒として、好ましくは、以下の組成の緩衝液を用いる:20mM TRIS、0.5%ウシ血清アルブミン、0.5%スクロース、0.7%ドデシル硫酸ナトリウム、0.5% Tween 80、1%硫酸ナトリウム、0.3%コール酸ナトリウム、0.095%アジ化ナトリウム、0.05% ProClin 300。pHは、塩酸で9.0の値に調節される。移動溶媒として働く緩衝液を、試験デバイスのリザーバー中に移す。次に、試験デバイスから突出する試験細片の端部を少なくとも15秒(最大120秒)の間、緩衝液中に浸漬する。その結果として、クロマトグラフィーが開始される。
1.5 シグナル強度の評価
結果を、60分以内、好ましくは5〜30分以内で、参照標準との比較により読み取り得る。この場合には、S.mutansの所定の濃度で得た光学的標準を参照標準として用いた。
1.6 S.mutansの細胞壁フラグメントの調製
24時間の間培養されたS.mutansの液体培養物の10mlのアリコートをS.Mutans細胞壁フラグメントの調製のために用いた。1%SDSをこのアリコートに加え、そしてこのアリコートを、10000×gで8分間遠心分離した。上清液を棄てた後、ペレットを、5mlのPBS中に再懸濁した。次いで、0.25gのCellytic Express(Sigma−Aldrich)を添加し、そしてこの溶液を、37℃で30分間インキュベートした。5000×gで1分間遠心分離し、そして上清液を棄てた後、このペレットを1mlのPBS中に再懸濁した。得られた溶液を2lのPBSに対して2度20時間、100kDaカットオフの透析膜を用いて透析した。透析後、PBS中に溶解した細胞壁フラグメントを、反応チューブに移し、そして−80℃で貯蔵した。最後のステップでは、これらのフラグメントを凍結乾燥した。この方法によって調製された細胞壁フラグメントは、使用に際し、脱イオン水または別の適切な溶媒中に再懸濁され得、そしてそれらは、試験細片上に直接付与され得る。
Claims (22)
- 液体サンプル中の微生物の定量的または半定量的検出のための試験細片であって:
該液体サンプルを受容するための第1の領域であって、免疫複合体を形成することによって検出されるべき該微生物と反応し得る標識抗体を含む第1の領域;および
該第1の領域から間隔を置いた第2の領域であって、免疫複合体を形成することによって該検出されるべき微生物と反応し得、そして該試験細片上に固定化される捕捉抗体を含む第2の領域を備え、
ここで、該試験細片の該第1の領域と移動溶媒との接触に際し、該標識抗体が該試験細片の第2の領域に移動し、該第1の領域に付与される該液体サンプル中の該検出されるべき微生物の存在下で、該標識抗体と該捕捉抗体と該微生物とから免疫複合体が形成されて、該免疫複合体が該試験細片の該第2の領域中の該標識抗体の標識によって検出され得るように、該試験細片が設計され、そしてここで、該標識によって提供されるシグナルの強度が、該液体サンプル中の該微生物の濃度に関する情報を提供する、試験細片。 - 前記標識抗体および/または前記捕捉抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1に記載の試験細片。
- 前記標識抗体が、粒子に結合されている、請求項1に記載の試験細片。
- 前記粒子が、コロイド状金またはコロシド状銀を含むか、またはコロイド状金またはコロシド状銀からなる、請求項3に記載の試験細片。
- 前記標識抗体および前記捕捉抗体が、病原体細菌に対して指向されている、請求項1に記載の試験細片。
- 前記病原体細菌が、口腔に存在する細菌である、請求項5に記載の試験細片。
- 前記病原体細菌が、Streptococcus属、Lactobacillus属、Actinomyces属、Prevotella属、Actinobacillus属、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Fusobacterium属、Enterococcus属またはHelicobacter属の細菌の群から選択される、請求項6に記載の試験細片。
- 前記病原体細菌が、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus sanguis、Streptococcus gordonii、Streptococcus mitis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus casei、Lactobacillus rhamnosus、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythensis、Actinomyces naeslundii、Treponema denticola、Fusobacterium nucleatum、Prevotella intermedia、Enterococcus faecalis、Treponema denticola、またはHelicobacter pyloriの群から選択される、請求項7に記載の試験細片。
- 前記標識抗体および前記捕捉抗体が、病原体酵母に対して指向されている、請求項1に記載の試験細片。
- 前記酵母が、Candida属、Cryptococcus属、Malassecia属またはBlastoschizomyces属の酵母の群から選択される、請求項9に記載の試験細片。
- 前記酵母が、Candida albicans、Candida krusei、Candida tropicalis、Candida glabrata、Candida lusitaniae、Candida parapsilosis、Cryptococcus neoformans、またはBlastoschizomyces capitatusから選択される、請求項10に記載の試験細片。
- 前記第1の領域が、前記検出されるべき微生物で、またはその免疫学的に活性な一部分でドープされる、請求項1に記載の試験細片。
- 前記第1の領域が、前記検出されるべき微生物の検出に必要な量の90%を含む、請求項12に記載の試験細片。
- 液体サンプル中の微生物の定量的または半定量的検出のための方法であって、
該液体サンプルを請求項1に記載の試験細片上に付与する工程、
該試験細片を移動溶媒と接触させる工程、
該試験細片を、該試験細片の前記第1の領域と移動溶媒との接触に際し前記標識抗体が該試験細片の前記第2の領域に移動する条件下でインキュベートする工程、および
該試験細片の該第2の領域中のシグナルを検出する工程、を包含し;
ここで、該標識によって提供される該シグナルが、該液体サンプル中の該微生物の濃度に関する情報を提供する、方法。 - 前記サンプルが唾液サンプルであり、そしてStreptococcus mutansおよびLactobacillus sp.が2つの試験細片を用いて同時に検出される、請求項14に記載の方法。
- 第1の試験細片上の標識抗体および/または捕捉抗体がSWLA1であり、そして第2の試験細片上の標識抗体および/または捕捉抗体がSWLA5である、請求項15に記載の方法。
- 微生物の定量的または半定量的検出のためのキットであって、少なくとも1つの請求項1に記載の試験細片を含む、キット。
- 緩衝液、標識試薬および/または前記標識抗体を検出するための検出試薬をさらに含む、請求項17に記載のキット。
- 2つの請求項1に記載の試験細片、および2対のアパーチャを備えるハウジングを含む試験システムであって、該対のアパーチャの各々が、第1のアパーチャおよび該第1のアパーチャから間隔をおいた第2のアパーチャ、ならびに該2つの試験細片のための入口アパーチャを含み、ここで、該2つの試験細片が該入口アパーチャを通り、該試験細片の間隔を置いた2つの領域が各場合において該第1のアパーチャおよび該第2のアパーチャを通って接近可能である様式で該ハウジング中に挿入され得るように、該入口アパーチャならびに該2対の第1のアパーチャおよび第2のアパーチャが配列される、システム。
- 前記第2のアパーチャを通って接近可能である前記試験細片の前記領域が、前記捕捉抗体を含む、請求項19に記載の試験システム。
- 前記第1のアパーチャを通って接近可能である前記試験細片の前記領域が、前記標識抗体を含む、請求項20に記載の試験システム。
- 齲食発生のリスクの決定を補助するための方法であって:
液体サンプルを請求項1に従って構築された試験細片に付与する工程、および齲食発生のリスクの指標である、該サンプル中に存在する微生物および/またはその濃度に対するシグナルを分析する工程、を包含する、方法。
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