JP2008220823A - 遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ - Google Patents
遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008220823A JP2008220823A JP2007066656A JP2007066656A JP2008220823A JP 2008220823 A JP2008220823 A JP 2008220823A JP 2007066656 A JP2007066656 A JP 2007066656A JP 2007066656 A JP2007066656 A JP 2007066656A JP 2008220823 A JP2008220823 A JP 2008220823A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- hydrogel
- ophthalmic lens
- plasmid dna
- monomer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 18
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 abstract 1
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 7
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 7
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 5
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 5
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- SEILKFZTLVMHRR-UHFFFAOYSA-N 2-phosphonooxyethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOP(O)(O)=O SEILKFZTLVMHRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 3
- -1 2-hydroxypropyl Chemical group 0.000 description 2
- DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-1,1,1-trifluorobutane Chemical compound FC(F)(F)CCCBr DBCAQXHNJOFNGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Substances CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropyl methacrylate Chemical compound CC(O)COC(=O)C(C)=C VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUMACXVDVNRZJZ-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(C)COC(=O)C(C)=C RUMACXVDVNRZJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNSFRPWPOGYVLO-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCCO GNSFRPWPOGYVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003923 Hereditary Corneal Dystrophies Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DAKWPKUUDNSNPN-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane triacrylate Chemical compound C=CC(=O)OCC(CC)(COC(=O)C=C)COC(=O)C=C DAKWPKUUDNSNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQHMGFSAURFQAF-UHFFFAOYSA-N [2-hydroxy-3-(2-methylprop-2-enoyloxy)propyl] 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(O)COC(=O)C(C)=C OQHMGFSAURFQAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 206010011005 corneal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- OIWOHHBRDFKZNC-UHFFFAOYSA-N cyclohexyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OC1CCCCC1 OIWOHHBRDFKZNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- UJKWLAZYSLJTKA-UHFFFAOYSA-N edma Chemical compound O1CCOC2=CC(CC(C)NC)=CC=C21 UJKWLAZYSLJTKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003560 epithelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
【課題】本発明の課題は、遺伝子の異常に起因する疾患に関与する異常遺伝子に対する遺伝子治療を容易に行えるハイドロゲル製眼用レンズを提供することである。
【解決手段】本発明は、リン酸基を有するハイドロゲルを２価の金属イオンを含有する水溶液中に浸漬する処理を施した後、遺伝子を担持させてなることを特徴とするハイドロゲル製眼用レンズである。また、本発明は、前記リン酸基を有するハイドロゲルが、少なくともリン酸基を有するモノマーと非イオン性の親水性モノマーからなるゲルであることを特徴とする上記ハイドロゲル製眼用レンズである。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、リン酸基を有するハイドロゲルを２価の金属イオンを含有する水溶液中に浸漬する処理を施した後、遺伝子を担持させてなることを特徴とするハイドロゲル製眼用レンズである。また、本発明は、前記リン酸基を有するハイドロゲルが、少なくともリン酸基を有するモノマーと非イオン性の親水性モノマーからなるゲルであることを特徴とする上記ハイドロゲル製眼用レンズである。
【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子治療に用いることができるハイドロゲル製眼用レンズに関するものである。更に詳しくは、眼組織の細胞内に遺伝子を効果的に導入できるリン酸基を有するハイドロゲル製眼用レンズに関する。
遺伝的な疾患は、細胞内で発現される遺伝子の変異によって起こることが知られている。このような遺伝的な疾患の治療としては、異常細胞内に正常な遺伝子を導入する方法が有望である。
従来、遺伝子の細胞への導入は、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームを用いる方法などが適宜選択されて行われている。なかでもリン酸カルシウム法は、特殊な器具を必要としない利点があるが、遺伝子の導入効率が低い欠点がある。この欠点により、リン酸カルシウム法は培養細胞への遺伝子導入法として用いられているものの、生体内での細胞への遺伝子導入法としては利用されていない。
最近では生体内に直接遺伝子を導入する試みとして、遺伝子を含んだリポソームを作製し、注射などにより投与する方法や遺伝子を担持した生分解性高分子を外科的手法で、直接、生体組織に導入する手法がとられている。
リポソームを用いた例として、哺乳類動物細胞内で発現可能な遺伝子ＤＮＡを組み込んだ発現用ベクターを内包したリポソームを含有する点眼剤がある（特許文献１参照）。これは、遺伝子の異常に起因する眼疾患に関与する異常遺伝子ＤＮＡに対する遺伝子治療を目的として、点眼により眼細胞へ遺伝子を導入する方法である。しかし、遺伝子は点眼後速やかに涙液により希釈されてしまうので、角膜との接触時間をできるだけ長くする工夫が必要となる。
さらに、生分解性高分子に遺伝子を担持させ、その高分子の崩壊と共に遺伝子が徐放され、高い遺伝子導入効率が得られる方法がある（特許文献２、３、４参照）。例えば、アニオン性遺伝子を効率良く担持できるカチオン性生分解性高分子がある。これは、カチオン性ゼラチンにイオン的な相互作用によりアニオン性の遺伝子を担持させて生体内へ埋植し、ゼラチンの分解と共に遺伝子が持続的に放出されることで高効率で細胞へ遺伝子を導入できる技術である。しかしながらこの方法では、細胞へ導入される遺伝子は、分解したカチオン性ゼラチンとの複合体として生体内に残存してしまい、分解物の安全性やゼラチンと遺伝子の複合体のサイズなどにより遺伝子の導入効率が変化してしまうなどの問題が懸念される。
また、コラーゲンなどのハイドロゲルにリン酸カルシウムの顆粒を取り込ませ、このリン酸カルシウムによって遺伝子を細胞へ導入する方法がある（特許文献５参照）。この方法では、リン酸カルシウムの顆粒を含んだハイドロゲルをペレット等の所望の形状に加工すれば直接生体内へ挿入することが可能となり、また、ゲル状であるため注射によって投与することが可能となる。しかしながら、本発明で対象とする眼組織のなかでも角膜は、高い透明性を保つことが必要不可欠であるが、カルシウムの沈着により角膜は白濁することが知られており、眼組織に対してこの方法を用いることはできない。
特開平１０−６７６８８号公報
特開２００１−１９９９０３号公報
特開２００３−２８６２００号公報
特開２００３−１６９８４４号公報
特開２００４−２８３１３８号公報
本発明は、遺伝子の異常に起因する疾患に関与する異常遺伝子に対する遺伝子治療を容易に行えるハイドロゲル製眼用レンズを提供することを目的としている。さらに詳しくは、細胞内で発現可能な遺伝子を担持して良好な徐放効果を発揮できる実用的な遺伝子治療用のハイドロゲル製眼用レンズを提供することを目的としている。
本発明は、リン酸基を有するハイドロゲルを２価の金属イオンを含有する水溶液中に浸漬する処理を施した後、遺伝子を担持させてなることを特徴とするハイドロゲル製眼用レンズである。
また、本発明は、前記リン酸基を有するハイドロゲルが、少なくともリン酸基を有するモノマーと非イオン性の親水性モノマーからなるゲルであることを特徴とする上記ハイドロゲル製眼用レンズである。
また、本発明は、前記２価の金属イオンがカルシウムイオンであることを特徴とし、さらに、前記遺伝子がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする上記ハイドロゲル製眼用レンズである。
本発明のハイドロゲル製眼用レンズは、眼組織の細胞とりわけ角膜に対して悪影響を与えることなく眼組織の細胞内で発現可能な遺伝子を２４時間以上にわたり放出し、眼組織の細胞へ効率よく遺伝子を導入することができる遺伝子治療用の遺伝子放出デバイスとして実用的なものである。
本発明者は、遺伝子治療に用いる遺伝子を眼組織の細胞へ導入する手段として、リン酸基を有するハイドロゲル製眼用レンズで効果的に当該遺伝子を放出する方法、特に、アニオン性を示す当該遺伝子とハイドロゲル中のリン酸基がカルシウムイオンに代表される２価の金属イオンを介して形成される錯体を利用する方法を鋭意検討して得られた知見に基づくものである。
すなわち本発明は、遺伝子治療に用いる遺伝子を効果的に利用するために、リン酸基を有するハイドロゲル製眼用レンズを２価の金属イオン存在下で処理することで、高効率で当該遺伝子を担持、放出するものである。具体的には、アニオン性を示す遺伝子と当該ハイドロゲル間に適度な相互作用を発揮させて、当該遺伝子を効果的に担持し徐放させるものである。
本発明で好ましく用いられる遺伝子治療に用いる遺伝子としては、分子構造内にアニオン性官能基を少なくとも１つ以上含有するプラスミドＤＮＡが挙げられる。プラスミドＤＮＡは環状ＤＮＡであり、そのままでも利用することが可能であるが、目的とする治療に合わせて所望の遺伝子を抱合させることもできる。例えば、膠様滴状角膜ジストロフィーは角膜上皮に重度のアミロイド沈着を生じる常染色体劣性の遺伝子疾患である。この疾患は、角膜にアミロイドが沈着するため、透明性が失われ、視力が低下する。そして、これまでにこの原因遺伝子がＭ１Ｓ１（membrane component, chromosome 1, surface marker 1）遺伝子であることが見出されている。このＭ１Ｓ１遺伝子をプラスミドＤＮＡに組み込ませてキャリアとし、目的とする眼細胞へ導入することができる。例えば、あらかじめカルシウムイオン存在下で処理された本発明のハイドロゲル製眼用レンズを目的とする遺伝子、特にプラスミドＤＮＡを溶解した水溶液に浸漬すれば、当該レンズ中にプラスミドＤＮＡを包括させることができる。
水溶液中の遺伝子濃度は、その溶解度や目的細胞内への導入するための最小有効濃度及び最大安全濃度などにより、各々の遺伝子毎に適宜選定されるべきものであるが、通常、０．００１〜０．１μg/μLの濃度が好ましい。
本発明は、ハイドロゲル中のリン酸基と遺伝子が２価の金属イオンを介して錯体を形成することで、眼組織の細胞に対して遺伝子を持続的に放出するものであり、リン酸基を有するモノマーを用いることに特徴があり、リン酸基を有するモノマーとしては下記構造式（Ｉ）および／又は（II）で示される化合物であることが好ましく、式（Ｉ）で示される化合物であるメタクリルオキシエチルホスフェート（MOEP; n=2）であることが特に好ましい。また本発明のハイドロゲル製眼用レンズは、リン酸基を有するモノマーの含有量に応じて遺伝子の担持量も変化させることが可能となり、目的とする細胞に応じて適宜選択することができるが、リン酸基を有するモノマーの使用量は、用いる非イオン性の親水性モノマーに対してリン酸基を有するモノマーを５０重量％以下で使用することが好ましい。リン酸基を有するモノマーの含有量が５０重量％を超えるとゲルが脆くなり、実用的ではない。
本発明で用いる非イオン性の親水性モノマーとしては、少なくとも１種以上の親水基を分子内に有し、かつ非イオン性であればいかなるものでも可能である。例えば、2-ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、2-ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、2, 3-ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及び2-ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、2-ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、N-ビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを２種以上併用することもできる。親水性モノマーの配合量は、リン酸基の配合量との関係で決まるが、好ましくは全モノマー中５０〜９５重量％の範囲である。これら親水性モノマーも適宜選択すれば、ハイドロゲル製眼用レンズの含水率を変化させることができる。
本発明は、上記成分に加えて、さらに任意の共重合可能なモノマーを使用することができる。例えばハイドロゲル製眼用レンズの網目構造の形成及び機械強度の調節を図る場合には架橋性モノマーを用いると良い。架橋性モノマーとしては、例えばエチレングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリルアミド、2-ヒドロキシ-1, 3-ジメタクリロキシプロパン、トリメチロールプロパントリアクリレートなどが挙げられる。架橋性モノマーの使用量は、主成分モノマー１００重量％に対して、外部で０．１〜４．０重量％が好ましい。特に好ましくは、０．１〜１．０重量％である。架橋性モノマーが０．１重量％より少ないときは、ハイドロゲル製眼用レンズの形状安定性に顕著な効果が見られず、４．０重量％より多くなると架橋効果が過剰となりハイドロゲル製眼用レンズが脆くなり好ましくない。
その他の共重合成分として、ハイドロゲル製眼用レンズの含水率や膨潤率の調節作用、目的とする遺伝子の担持量の微調整などを図るために、疎水性モノマーを本発明の効果を阻害しない範囲で用いることができる。疎水性モノマーとしては、本発明の必須成分である親水性モノマーやリン酸基を有するモノマーと相溶性があれば、いかなるものでも可能であるが、例えばメチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、2, 2, 2-トリフルオロメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどを挙げることができる。
本発明の特徴は、リン酸基を有するハイドロゲルを２価の金属イオンを含有する水溶液中に浸漬する処理を施した後、遺伝子を担持させてなることである。これは、該ハイドロゲル製眼用レンズ中のリン酸基と遺伝子とで２価の金属イオンを介した錯体を形成することで、ハイドロゲル中に遺伝子を効率よく担持させることを目的としている。本発明における２価の金属イオンとしては、生体に対して安全性が高い金属イオンであれば利用可能であるが、アルカリ土類金属イオン、両性金属イオンであり、例えばマグネシウム、鉄、銅、亜鉛などが挙げられるが、より好ましくはカルシウムイオンである。例えばカルシウムイオンを用いた場合、カルシウムイオンが結合したハイドロゲル製眼用レンズに遺伝子を担持させることで、このカルシウムイオンを介したリン酸基−カルシウム−遺伝子で構成される錯体を形成することができる。この適度な結合力で構成される錯体を該ハイドロゲル製眼用レンズ中に形成させ、眼組織の細胞へハイドロゲル製眼用レンズを接触させることで生体内のイオンと置換し、遺伝子−カルシウム若しくは遺伝子−カルシウム−遺伝子の結合様式で細胞へ遺伝子を導入することが可能となる。この方法により、従来の細胞への遺伝子導入方法であるリン酸カルシウム法と同様な形態で遺伝子を導入することができ、さらに眼用レンズ形状であるため眼細胞との接触時間が長くなるため、遺伝子の導入効率も向上する。
ハイドロゲル製眼用レンズを処理する水溶液の２価の金属イオン濃度は、ハイドロゲル中のリン酸基の含有量に応じて適宜選択することが可能であるが、３〜１００mMの範囲が好ましいが、より好ましくは１０mM程度である。３mM未満の水溶液で該ハイドロゲル製眼用レンズを処理してもリン酸基−金属イオン−遺伝子から成る錯体の形成効率が低くなり、ハイドロゲル製眼用レンズ中の遺伝子の担持量も低くなる。また、１００mMを超える濃度で処理をすると該ハイドロゲル製眼用レンズの表面にカルシウムが凝集し、結晶化し、析出する場合がある。また、本処理は、２価の金属イオンを含有した水溶液に常温下で該ハイドロゲル製眼用レンズを１時間以上浸漬し、その後、遺伝子水溶液に浸漬すればよいが、処理温度は４０℃を超えない程度が好ましい。また、処理時間は、１時間以上であれば適宜選択することが可能であるが、３時間以上の処理では、ハイドロゲル中の金属イオンが過剰となるため３時間を超えない程度が好ましい。
本発明のハイドロゲル製眼用レンズの製造に際しては、まず上記モノマーの混合物に重合開始剤を添加し、さらに撹拌・溶解させる。重合開始剤としては、ラジカル重合開始剤であればいかなるものでも使用でき、重合開始剤の添加量としては、モノマー総量に対して外部で１０〜３５００ppm程度が好ましい。重合は上記モノマー混合液を金属、ガラス、プラスチックなどの所望の成形型に入れ、密閉して行う。
上記の重合終了後、常温に冷却し、得られた重合物を成形型から取り出し、必要に応じて切削、研磨加工する。得られた重合物は水和膨潤させてハイドロゲル製眼用レンズとする。この水和膨潤に使用される液体（膨潤液）としては、例えば水、生理食塩水、等張性緩衝液などが挙げられる。前記膨潤液を６０〜１００℃に加温し、一定時間浸漬させ、速やかに水和膨潤状態にする。また、前記膨潤処理により、重合体中に含まれる未反応性モノマーを除去することも可能となる。
次に、pH８〜１０に調整した緩衝液中へ常温で１時間程度浸漬させてアルカリ処理を施した後、ハイドロゲル製眼用レンズを純水で十分に洗浄し、あらかじめ調整しておいた２価の金属イオン、好ましくはカルシウムイオンを含有した水溶液に浸漬する。処理後、ハイドロゲル製眼用レンズを純水で十分に洗浄し、あらかじめ調整しておいた遺伝子を溶解させた水溶液中に浸漬する工程で本発明のハイドロゲル製眼用レンズが得られる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本実施例では遺伝子としてプラスミドＤＮＡを用いた。
（評価方法）
＜形状安定性の評価＞
プラスミドＤＮＡ放出前後の眼用レンズを生理食塩水中で、コンタクトレンズ投影機を用いて評価した。プラスミドＤＮＡ放出前の眼用レンズに対して、形状の変化が認められない場合は○、変形が認められた場合は×とした。
＜形状安定性の評価＞
プラスミドＤＮＡ放出前後の眼用レンズを生理食塩水中で、コンタクトレンズ投影機を用いて評価した。プラスミドＤＮＡ放出前の眼用レンズに対して、形状の変化が認められない場合は○、変形が認められた場合は×とした。
＜光線透過率の測定＞
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを、紫外−可視分光光度計（UV-3150: 島津製作所）を用いて光線透過率を測定した。
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを、紫外−可視分光光度計（UV-3150: 島津製作所）を用いて光線透過率を測定した。
＜含水率の測定＞
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズの含水率を「ハイドロゲルレンズの含水率測定（ISO10339: 1997）」に準じて測定した。
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズの含水率を「ハイドロゲルレンズの含水率測定（ISO10339: 1997）」に準じて測定した。
＜遺伝子放出性の測定＞
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを、２５℃、３mLの生理食塩水へ浸漬して、１時間ごとにその放出量をアガロースゲルによる電気泳動法にて測定した。測定の標準マーカーとして１ｋｂｐを用いた。２４時間にわたってプラスミドＤＮＡの放出が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを、２５℃、３mLの生理食塩水へ浸漬して、１時間ごとにその放出量をアガロースゲルによる電気泳動法にて測定した。測定の標準マーカーとして１ｋｂｐを用いた。２４時間にわたってプラスミドＤＮＡの放出が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
＜涙液への放出性評価＞
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを家兎へ装着し、１時間ごとに涙液を５μＬ、キャピラリー管にて採取した。採取した涙液中のプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法にて増幅させ、アガロースゲルを用いた電気泳動で涙液中のプラスミドＤＮＡの存在を確認した。電気泳動には、標準マーカーとして１ｋｂｐを用いた。１２時間にわたって涙液中でプラスミドＤＮＡの存在が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを家兎へ装着し、１時間ごとに涙液を５μＬ、キャピラリー管にて採取した。採取した涙液中のプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法にて増幅させ、アガロースゲルを用いた電気泳動で涙液中のプラスミドＤＮＡの存在を確認した。電気泳動には、標準マーカーとして１ｋｂｐを用いた。１２時間にわたって涙液中でプラスミドＤＮＡの存在が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
＜家兎角膜上皮細胞導入性の評価＞
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを家兎へ装着し、装着後の家兎角膜上皮細胞を採取し、４８時間培養し、蛍光顕微鏡で観察した。プラスミドＤＮＡが導入された細胞は、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）により蛍光で発色することでプラスミドＤＮＡの角膜上皮細胞への導入性を評価した。角膜上皮細胞への導入が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
プラスミドＤＮＡ担持後のレンズを家兎へ装着し、装着後の家兎角膜上皮細胞を採取し、４８時間培養し、蛍光顕微鏡で観察した。プラスミドＤＮＡが導入された細胞は、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）により蛍光で発色することでプラスミドＤＮＡの角膜上皮細胞への導入性を評価した。角膜上皮細胞への導入が認められた場合には○、認められない場合には×とした。
（実施例１）
メタクリルオキシエチルホスフェート（MOEP; n=2）１０重量％、2-ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）９０重量％に対して、アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）０．３重量％（外部）を添加して十分に窒素置換をしながら約１時間撹拌した。撹拌後、モノマー混合液を眼用レンズ用のプラスチック製の成形型に入れ、５０〜１００℃の範囲で２５時間かけて昇温して重合させた。重合体は容器から取り出し、約８０℃の蒸留水中に約４時間浸漬して水和膨潤させて本実施例の眼用レンズとした。この眼用レンズを、pH８に調整したリン酸緩衝液（PBS）へ室温で１時間浸漬してアルカリ処理を施した後、十分に純水にて洗浄した。洗浄後の眼用レンズを、１０mMの塩化カルシウム水溶液へ室温で２時間浸漬、その後、純水で洗浄し、プラスミドＤＮＡ（CLONTEC社）の０．１μg/μL水溶液３mL中に２５℃、４８時間浸漬させることでプラスミドＤＮＡを担持させた。プラスミドＤＮＡが担持した眼用レンズを蒸留水３mL中に２５℃、２４時間浸漬し、遊離のプラスミドＤＮＡを除去した後に、上記の各種評価を行った。
メタクリルオキシエチルホスフェート（MOEP; n=2）１０重量％、2-ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）９０重量％に対して、アゾビスイソブチロニトリル（AIBN）０．３重量％（外部）を添加して十分に窒素置換をしながら約１時間撹拌した。撹拌後、モノマー混合液を眼用レンズ用のプラスチック製の成形型に入れ、５０〜１００℃の範囲で２５時間かけて昇温して重合させた。重合体は容器から取り出し、約８０℃の蒸留水中に約４時間浸漬して水和膨潤させて本実施例の眼用レンズとした。この眼用レンズを、pH８に調整したリン酸緩衝液（PBS）へ室温で１時間浸漬してアルカリ処理を施した後、十分に純水にて洗浄した。洗浄後の眼用レンズを、１０mMの塩化カルシウム水溶液へ室温で２時間浸漬、その後、純水で洗浄し、プラスミドＤＮＡ（CLONTEC社）の０．１μg/μL水溶液３mL中に２５℃、４８時間浸漬させることでプラスミドＤＮＡを担持させた。プラスミドＤＮＡが担持した眼用レンズを蒸留水３mL中に２５℃、２４時間浸漬し、遊離のプラスミドＤＮＡを除去した後に、上記の各種評価を行った。
（実施例２〜８）
表１に示す組成にて、実施例１と同様な操作で水和膨潤した眼用レンズを得た。この眼用レンズを表１に示すカルシウムイオン濃度に調整した塩化カルシウム水溶液で処理し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを担持させて、上記の各種評価を行った。
表１に示す組成にて、実施例１と同様な操作で水和膨潤した眼用レンズを得た。この眼用レンズを表１に示すカルシウムイオン濃度に調整した塩化カルシウム水溶液で処理し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを担持させて、上記の各種評価を行った。
（比較例１〜２）
表１に示す組成にて、実施例１と同様な操作で水和膨潤した眼用レンズを得た。この眼用レンズを表１に示すカルシウムイオン濃度に調整した塩化カルシウム水溶液で処理し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを担持させて、上記の各種評価を行った。
表１に示す組成にて、実施例１と同様な操作で水和膨潤した眼用レンズを得た。この眼用レンズを表１に示すカルシウムイオン濃度に調整した塩化カルシウム水溶液で処理し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを担持させて、上記の各種評価を行った。
なお、［表１］中の記号は、以下の通りである。
MOEP メタクリルオキシエチルホスフェート
HEMA 2-ヒドロキシエチルメタクリレート
HPMA ヒドロキシプロピルメタクリレート
NVP N-ビニルピロリドン
AAm アクリルアミド
EDMA エチレングリコールジメタクリレート
HEMA 2-ヒドロキシエチルメタクリレート
HPMA ヒドロキシプロピルメタクリレート
NVP N-ビニルピロリドン
AAm アクリルアミド
EDMA エチレングリコールジメタクリレート
Claims (4)
- リン酸基を有するハイドロゲルを２価の金属イオンを含有する水溶液中に浸漬する処理を施した後、遺伝子を担持させてなることを特徴とするハイドロゲル製眼用レンズ。
- 前記リン酸基を有するハイドロゲルが、少なくともリン酸基を有するモノマーと非イオン性の親水性モノマーからなるゲルであることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル製眼用レンズ。
- 前記２価の金属イオンがカルシウムイオンであることを特徴とする請求項１または２に記載のハイドロゲル製眼用レンズ。
- 前記遺伝子がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のハイドロゲル製眼用レンズ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007066656A JP5132958B2 (ja) | 2007-03-15 | 2007-03-15 | 遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007066656A JP5132958B2 (ja) | 2007-03-15 | 2007-03-15 | 遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008220823A true JP2008220823A (ja) | 2008-09-25 |
| JP5132958B2 JP5132958B2 (ja) | 2013-01-30 |
Family
ID=39840093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007066656A Active JP5132958B2 (ja) | 2007-03-15 | 2007-03-15 | 遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5132958B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101820710B1 (ko) * | 2016-06-27 | 2018-03-08 | (주)지오메디칼 | 고함수율 및 단백질흡착억제 하이드로겔 콘택트렌즈 및 그 제조방법 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1067688A (ja) * | 1996-08-26 | 1998-03-10 | Mitsubishi Chem Corp | リポソーム点眼剤 |
| WO2003093337A1 (fr) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. | Hydrogel a structure de reseau a semi-interpenetration et procede de production associe |
| JP2004305313A (ja) * | 2003-04-03 | 2004-11-04 | Seed Co Ltd | 薬物徐放性眼用レンズ |
| WO2006084275A2 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Auburn University | Contact drug delivery system |
| JP2006525446A (ja) * | 2003-05-02 | 2006-11-09 | ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 治療薬デリバリー用ドラッグ放出生分解性繊維 |
-
2007
- 2007-03-15 JP JP2007066656A patent/JP5132958B2/ja active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1067688A (ja) * | 1996-08-26 | 1998-03-10 | Mitsubishi Chem Corp | リポソーム点眼剤 |
| WO2003093337A1 (fr) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. | Hydrogel a structure de reseau a semi-interpenetration et procede de production associe |
| JP2004305313A (ja) * | 2003-04-03 | 2004-11-04 | Seed Co Ltd | 薬物徐放性眼用レンズ |
| JP2006525446A (ja) * | 2003-05-02 | 2006-11-09 | ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 治療薬デリバリー用ドラッグ放出生分解性繊維 |
| WO2006084275A2 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Auburn University | Contact drug delivery system |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101820710B1 (ko) * | 2016-06-27 | 2018-03-08 | (주)지오메디칼 | 고함수율 및 단백질흡착억제 하이드로겔 콘택트렌즈 및 그 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5132958B2 (ja) | 2013-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2705390B2 (en) | Medical devices having homogeneous charge density and methods for making same | |
| JP3645919B2 (ja) | 非環状モノマーを導入された眼レンズポリマー | |
| JP7160350B2 (ja) | 生体組織透明化法及びその試薬 | |
| JP4379778B2 (ja) | 薬物徐放性眼用レンズ | |
| JPS63246718A (ja) | コンタクトレンズの表面処理用レンズ溶液 | |
| JP2009517508A (ja) | 高屈折率を有するポリマー組成物 | |
| TW201827892A (zh) | 用於隱形眼鏡的單體組合物、用於隱形眼鏡的聚合物及其製備方法、以及隱形眼鏡及其製造方法 | |
| JP2017513596A (ja) | コンタクトレンズおよび眼内レンズのための（メタ）アクリルアミドポリマー | |
| JP2010281956A (ja) | 湿潤性ハイドロゲルコンタクトレンズ及びその製造方法 | |
| JP2007056220A (ja) | コンタクトレンズの製造方法およびそれにより得られたコンタクトレンズ | |
| JPH10339857A (ja) | 薬剤徐放性コンタクトレンズの製法およびそれによってえられた薬剤徐放性コンタクトレンズ | |
| JP2015163698A (ja) | 生体適合性ポリマーの調製方法、生体適合性ポリマーおよびそれらの使用 | |
| JPWO2015159942A1 (ja) | アニオン性薬物含有医療用デバイス | |
| JP2014514422A (ja) | 疎水性セグメントを含有するマクロ開始剤 | |
| JP5132958B2 (ja) | 遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ | |
| CN1269889A (zh) | 模制品制造方法 | |
| JP4879554B2 (ja) | ポストインプリント可能なヒドロゲル材料の製造方法 | |
| CN106999629B (zh) | 用于眼科装置的低水含量丙烯酸酯-丙烯酰胺共聚物 | |
| JP4855782B2 (ja) | 眼の遺伝子治療に用いられるハイドロゲル製眼用レンズ | |
| EP1750160A1 (en) | Method for producing protein adsorption-preventing ocular lens material | |
| JP4937491B2 (ja) | カチオン性高分子ゲル及びそれを用いた薬物徐放性高分子ゲル | |
| KR101311134B1 (ko) | 약물 서방성 의료용 디바이스 | |
| JP2001142034A (ja) | ソフトコンタクトレンズ材料及び製造方法 | |
| TWI826534B (zh) | 隱形眼鏡用單體組合物及隱形眼鏡用聚合物、以及隱形眼鏡及其製造方法 | |
| JP4124610B2 (ja) | 薬物徐放性コンタクトレンズ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100219 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100302 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100219 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100729 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20100730 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100901 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120214 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121106 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121107 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151116 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5132958 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |