JP2008212161A - 植物細胞によるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法であって、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、該植物細胞を培養する工程、および該植物細胞の培養液を回収する工程、を含む前記方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、上記糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、および上記植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
植物培養細胞を用いた外来タンパク質の製造が行われている。例えば、タバコ培養細胞を用い以下のヒト有用タンパク質の製造が試みられている:
GM−CSF(James EA, Wang C, Wang Z, Reeves R, Shin JH, Magnuson NS, Lee JM, Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. Protein Expr Purif. 19, 131-138 (2000))、IL−2およびIL−4(Magnuson NS, Linzmaier PM, Reeves R, An G, HayGlass K, Lee JM, Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture. Protein Expr Purif. 13, 45-52 (1998))、免疫グロブリン(Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G, Lee JM, Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells. Protein Expr Purif. 7, 220-228 (1996))、エリスロポエチン(Matsumoto S, Ishii A, Ikura K, Ueda M, Sasaki R, Expression of human erythropoietin in cultured tobacco cells, Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1249-1252 (1993))、α1−アンチトリプシン(Terashima M, Murai Y, Kawamura M, Nakanishi S, Stoltz T, Chen L, Drohan W, Rodriguez RL, Katoh S, Production of functional human alpha 1-antitrypsin by plant cell culture. Appl Microbiol Biotechnol. 52, 516-523 (1999))など。
本発明は、上記従来の課題を解決し、植物細胞において、安定であって、本来の生理活性を保持し、かつアレルゲンとならない糖鎖構造を持つ糖タンパク質を分泌生産する方法、このような糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質を提供することを目的とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
実施例を用いて本発明を説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、制限するものではない。
β1−4ガラクトース転移酵素(hGT)(EC2.4.1.38)は、すでにクローン化されており、400アミノ酸からなる一次構造が明らかにされている(Masri, K.Aら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 657-663 (1988))。
Masri らの報告を参考にし、以下のようなプライマーを作製した。
hGT−5Eco:5’−AAAGAATTCGCGATGCCAGGCGCGCGTCCCT−3’(配列番号1)
hGT−2Sal:3’−TCGATCGCAAAACCATGTGCAGCTGATG−5’(配列番号2)
hGT−7Spe:3’−ACGGGACTCCTCAGGGGCGATGATCATAA−5’(配列番号3)
hGT6Spe:5’−AAGACTAGTGGGCCCCATGCTGATTGA−3’(配列番号4)
鋳型DNAは、Clontech社から購入したヒトゲノムDNA、ヒト胎盤cDNA、ヒト腎臓cDNAを用いた。
(i)ヒトゲノムDNAを鋳型とし、hGT−5EcoとhGT−7Speとをプライマーに用い;および(ii)ヒト胎盤cDNAを鋳型とし、hGT−2SalとhGT6Speとをプライマーに用いた、2つの組み合わせで以下の条件でPCR反応を行い、hGTをコードする領域を含む0.4kbおよび0.8kbの断片を得た。
鋳型DNA1μl、10×PCR緩衝液5μl、dNTPs(200μM)4μl、プライマー(10pmol)、Tagポリメラーゼ(宝酒造(株))0.5μl(Tubポリメラーゼの場合は0.2μl)に水を加えて50μlとした。
第1段階:サイクル数1、変性(94℃)5分、アニーリング(55℃)1分、伸長(72℃)2分。
第2段階:サイクル数30、変性(94℃)1分、アニーリング(55℃)1分、伸長(72℃)2分。
第3段階:サイクル数1、変性(94℃)1分、アニーリング(55℃)2分、伸長(72℃)5分。
(1)hGTは大腸菌で活性型として発現することが報告されている(Aoki, D ら、EMBO J., 9, 3171, (1990)およびNakazawa, Kら、J. Biochem. 113, 747 (1993))。
得られた耐性株についてT−DNA中の、CaMV35Sプロモーター−hGT遺伝子cDNA−NOSターミネーターを含む2.2kbの断片がタバコ培養細胞のゲノムDNA中に組み込まれていることをサザン解析により確認した。上記の各耐性株からゲノムDNAを調製し、EcoRI、HindIII で消化した後、サザン解析を行った。
(タバコ培養細胞GT6株細胞外分泌糖タンパク質の調製)
Murashige-Skoog 培地用混合塩類(和光純薬)を用いて調製した改変Murashige-Skoog 培地で、7日間培養したタバコ培養細胞GT6株の培養液を、室温で2,000rpm で10分間遠心分離し、得られた上清をGT6株培養液として回収し、本実施例に用いた。得られた上清を、dH2 O(脱イオン水)に対し透析し(1×105 倍希釈)、凍結乾燥した。
凍結乾燥して得たサンプルを100℃で10時間ヒドラジン分解することにより、糖鎖の切り出しを行った。ヒドラジン分解物に過剰のアセトンを加え4℃、10,000rpm で20分間遠心分離することで糖鎖を沈殿させた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および無水酢酸存在下で糖鎖をNアセチル化した後、Dowex 50×2(室町化学工業)を用いて脱塩処理し、0.1Nアンモニア水で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム(1.8×180cm)で通すことで、N結合型糖鎖を回収した。
回収したN結合型糖鎖を2アミノピリジンを用いてPA化した。PA化試料を3%酢酸水溶液で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム(1.8×180cm)に通すことで、PA化糖鎖を精製した。
PA化糖鎖構造は、reversed-phase(RP)およびsize-fractionation (SF)HPLCの利用、エキソグリコシダーゼ消化による二次元糖鎖マッピング、そしてIS−MS/MS分析を行うことで解析した。HPLC(高速液体クロマトグラフィー)分析では、Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometer を持つJasco 880-PU HPLC を用い、励起および蛍光波長を各々310nm、380nmとして蛍光強度を測定した。
βガラクトシダーゼ(Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各PA化糖鎖を5mUのβガラクトシダーゼを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)の下で、37℃で2日間反応させた。同様に、Nアセチルグルコサミニダーゼ(Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各PA化糖鎖を5mUのNアセチルグルコサミニダーゼを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)の下で、37℃で2日間反応させた。また、αマンノシダーゼ(Jack bean; Sigma)酵素消化反応については、10mM酢酸亜鉛および10μUのαマンノシダーゼを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.88)の下で、37℃で2日間反応させた。各酵素消化反応は100℃で3分間煮沸することで停止させ、12,000rpm で10分間遠心した後、上清をHPLCに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
IS−MS/MS分析は、Perkin-Elmer Sciex API-III triple-quadrupole mass spectrometerを用いて行った。スキャンは0.5Da間隔で行った。
上述した様に、透析後、凍結乾燥したGT6株細胞培養液由来糖タンパク質を基質として用いた。1mg/ml BSA、0.5% Triton CF−54、2μM CMP−シアル酸、6mU α2,6−シアリルトランスフェラーゼ(ラット肝臓由来)(和光純薬)および400μg GT6株細胞培養液由来糖タンパク質を含む62.5mMカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の下で、37℃で5時間シアル酸転移酵素反応を行った。コントロール実験には、基質に400μg BY2株細胞培養液由来糖タンパク質および40μg胎児アシアロフェツイン(ウシ胎児血清;Sigma)を用いた。
シアル酸転移酵素反応物について12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いて130Vで2時間SDS−PAGEを行った後、1mA/cm2 の定電流下で50分間ニトロセルロース膜への転移を行った。レクチンブロッティングは、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合SNAレクチン(EY Laboratories, Inc.)を、0.05% Tween−20を含むPBS溶液で200倍希釈して使用した。ブロッティング後、PODイムノステインキット(和光純薬)を用いて染色した。
GT6株培養液より調製したPA化糖鎖は、RP−HPLCおよびSF−HPLCを利用して精製した(それぞれ図4Aおよび図4B)。図4Aは、RP−HPLCによるPA化産物のピークを示す。各ピーク(1〜6)を回収後、それぞれSF−HPLCに供した(図4B)。
上記ピークA(図6のI)のIS−MS分析から求めた分子量(m/z 1354.8)は、GalGlcNAcMan3 GlcNAc2 −PA(1354.27)に一致した。また、IS−MS/MS分析により得られたシグナル、m/z 1192.5、m/z 990.5、m/z 827.5、m/z 665.5、m/z 503.0、m/z 300.0は、各々、GlcNAcMan3 GlcNAc2 −PA(1192.13)、Man3 GlcNAc2 −PA(988.94)、Man2 GlcNAc2 −PA(826.80)、ManGlcNAc2 −PA(664.66)、GlcNAc2 −PA(502.52)、GlcNAc−PA(299.33)であると推定され、ピークAはこれらの構造を含むことが示唆された(データは示さず)。
GT6株培養液由来糖タンパク質、BY2株培養液由来糖タンパク質およびアシアロフェツインを基質として、インビトロシアル酸転移酵素反応を行った。それぞれの反応物を、ニトロセルロース膜への転移後、レクチン染色を行った結果、基質がアシアロフェツイン(図13、レーン1)、およびGT6株培養液由来糖タンパク質(図13、レーン2)のレクチン染色は陽性であった。一方、BY2株培養液由来糖タンパク質(図13、レーン3)のレクチン染色は陰性であった。このことから、タバコ培養細胞GT6株培養液由来糖タンパク質糖鎖は、シアル酸転移酵素反応の基質となることが示された。
(非形質転換体BY2株培養細胞が分泌する糖タンパク質の解析)
(細胞外分泌糖タンパク質の調製)
GT6株の代わりにBY2株を用いたことを除いて、上記GT6株の場合と同様の方法により、凍結乾燥した培養上清サンプルを得た。
Sephadex G-25 super fineゲル濾過カラム(1.8×180cm)の代わりに、TSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム(2.5×30cm)を用いたことを除いて、上記GT6株の場合と同様の方法により、N結合型糖鎖を回収した。
回収したN結合型糖鎖を2アミノピリジンを用いてPA化した。PA化試料を0.1Nアンモニア水溶液で平衡化したTSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム(2.5×30cm)に通すことで、PA化糖鎖を精製した。
Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometerを持つJasco 880-PU HPLCの代わりに、HITACHI FL Detector L-7480を持つHITACHI HPLCシステムを用いたことを除いて、上記GT6株の場合と同様の方法により、PA化糖鎖を分画および解析した。
Nアセチルグルコサミニダーゼ(Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各PA化糖鎖を3mUのNアセチルグルコサミニダーゼを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.45)の下で、37℃で2日間反応させた。また、αマンノシダーゼ(Jack bean; Sigma)酵素消化反応については、10mM酢酸亜鉛および10μUのαマンノシダーゼを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)の下で、37℃で2日間反応させた。各酵素消化反応は100℃で3分間煮沸することで停止させ、12,000rpm で10分間遠心した後、上清をHPLCに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
上記GT6株の場合と同様の方法により行った。
BY2培養液より調製したPA化糖鎖もまた、RP−およびSF−HPLCを利用して精製した(図14Aおよび14B)。図14Aは、RP−HPLCによるPA化産物のピークを示している。各フラクション(I〜X)を回収後、それぞれSF−HPLCに供した(図14B)。
図14Bに示すピークV−4、VII −3およびVIII−4のIS−MS/MS分析の結果、分子量(m/z)は、それぞれ、1639.0、1476.5、1314.5で、SF−HPLCの溶出位置とを考え併せると、個々のピークに存在する糖鎖構造は、PA化高マンノース糖鎖Man7 GlcNAc2 −PA、Man6 GlcNAc2 −PAおよびMan5 GlcNAc2 −PAに一致した(データ示さず)。
外来遺伝子、すなわち、35S−Cla(Kawaoka et al., J. Ferment. Bioeng., 78, 49-53 (1994))から得られたホース・ラディシュ・ペルオキシダーゼ遺伝子を、ベクターpBI 101 HmB(Akama et al., Plant Cell Rep. 12, 7-11 (1992))のHindIII とSacI部位に挿入し、そしてGT6株内に導入した。G6株の得られたクローン(GT−HRP−5、GT−HRP−19)を培養した後、上清を回収し、そして標準的な等電点電気泳動に供した。結果として、図19に示すように、HRPのpI 7.8の電気泳動バンドが、クローンGT−HRP−5、GT−HRP−19の上清中に検出され、そしてこのことにより、外来タンパク質も、GalT遺伝子により形質転換された植物細胞から分泌されたことを確認した。さらに図20は、上述のように、標準的SDS−PAGE電気泳動により分離された、クローンGT−HRP−5により分泌されたタンパク質のレクチン染色の結果を示す。RCA120染色は、GT−HRP−5が陽性シグナルをもつことを示し(図20(C))、そしてそれゆえ、分泌されたHRPが、ガラクトースが付加された糖鎖構造をもっていたことが示された。
本発明により、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、この糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が提供される。本発明のヒト型の糖鎖を持つ糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖を持つために、抗原性を有さない。それゆえ、ヒトを含む動物への投与のために有用である。
Claims (18)
- ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
上記植物細胞を培養する工程、を含む前記方法。 - 前記ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記外部糖鎖が直鎖状構造を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記外部糖鎖が分岐状構造を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造である、請求項4に記載の方法。
- 前記糖タンパク質がフコースまたはキシロースを含まない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物細胞の培養液を回収する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- インビトロで糖または糖鎖を付加する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、かつ、上記糖鎖付加機構によって糖鎖を付加されたタンパク質を分泌し得る植物細胞であって、上記糖鎖付加機構が、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖を付加し、ここで上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を有する、前記植物細胞。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法によって得られるヒト型糖鎖を有する糖タンパク質。
- ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
該酵素を細胞内小器官で発現させる工程、を含む前記方法。 - 非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素のための遺伝子により形質転換された植物細胞であり、ここで、上記酵素が上記植物細胞内に局在し、その結果、上記植物細胞は、ヒト型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成することができる、前記植物細胞。
- 前記糖鎖構造が、付加されたガラクトース残基を含む、請求項12に記載の植物細胞。
- 前記糖鎖構造が、β1,2−キシロース又はα1,3−フコースを含まない、請求項13に記載の植物細胞。
- 前記糖鎖構造が、GlcNAc1 Man3 GlcNAc2 、GlcNAc1 Man5 GlcNAc2 、GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 、及びGlcNAc1 Man4 GlcNAc2 から成る群から選ばれる(N−アセチルグルコサミン)1-2 (マンノース)2-5 (N−アセチルグルコサミン)2 のN結合型糖鎖に付加されたガラクトース残基を含む、請求項12に記載の植物細胞。
- 前記酵素が、前記植物内の細胞内小器官内に局在する、請求項12に記載の植物細胞。
- 請求項12に記載の植物細胞から再生された植物。
- 請求項17に記載の植物から生産された種子。
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