JP2008109867A - 新規な酵素及びそれを含有する組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、又はトリス緩衝液で作用が阻害されず、かつ、キサンチンで作用が阻害されない尿酸オキシダーゼ、その尿酸オキシダーゼの効率よい製造方法、該尿酸オキシダーゼを含む組成物、及び、該尿酸オキシダーゼを用いた試料中の尿酸の測定方法が提供される。
【選択図】なし
Description
尿酸+O2+H2O→ 5−ヒドロキシイソウレア+H2O2(式1)
尿酸+O2+2H2O→ アラントイン+H2O2+CO2(式2)
(1)酵素作用:酸素と水の存在下、尿酸に作用して、5−ヒドロキシイソウレア、過酸化水素、及び二酸化炭素を生成する作用を有する。
(2)阻害作用:ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及び/又はトリス緩衝液で(1)の作用が阻害されない。かつ、キサンチンで(1)の作用が阻害されない。
(3)至適pH:6.3〜7.8。
(4)至適温度:55℃以上。
(5)作用適温の範囲:すくなくとも30〜60℃の範囲。
(6)安定性:安定化剤の非存在下、30℃、15分間で98%以上の活性を保持する。
<3> Lysobacter sp. T-15株(受託番号FERM P−21056)由来であることを特徴とする、<1>又は<2>に記載の尿酸オキシダーゼ。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、尿酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配:
<5> ラッカーゼ活性を併せ持つ、<1>から<4>のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ。
<6> ビリルビンオキシダーゼ活性を併せ持つ、<1>から<5>のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ。
<8> 受託番号FERM P−21056を有する、Lysobacter sp. T-15株。
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、かつ、尿酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列:
<11> <10>に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
<12> <11>に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に<1>から<6>のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを生成蓄積させ、該培養物から該尿酸オキシダーゼを採取することを特徴とする尿酸オキシダーゼの製造方法。
<14> <1>から<6>のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ又は<13>に記載の組成物を少なくとも含む、尿酸測定キット。
<15> キサンチン、硝酸イオン、及びハロゲン化物イオンからなる群から選ばれる1以上の成分を含む試料において、<1>から<6>のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ、<13>に記載の組成物、又は<14>に記載の尿酸測定キットを用いて尿酸を測定する方法。
本発明で使用しうる試料とは、尿酸を含有するものであれば特に限定されないが、尿酸を含有する海水、天然水、飲料、廃液、研究用試料の他、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げることができる。
なお、本菌株の同定にあたっては、同定実験は微生物の分類・同定実験法およびMicrobiological Methods(Vol. 3)に準じて行い、実験結果をBergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 3)、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、International Journal of Systematic BacteriologyおよびInternational Journal of Systematic Evolutionary Microbiologyに対比して同定を行った。
(1)天平板培地における生育
細菌培養用の培地として汎用されているLB(Luria-Bertani)寒天培地、TSB(Trypticase soy broth)寒天培地にて生育するが、LB培地およびTSB培地を10倍希釈した1/10 LB寒天培地及び1/10 TSB寒天培地、あるいはR2A寒天培地(Difco社製)、NM-1培地(International Journal of Systematic Bacteriology, Microlunatus phosphovorus gen. nov., sp. nov., a new gram-positive polyphosphate-accumulating bacterium isolated from activated sludge, 1995, Vol.45, pp.17-22, Nakamura K, Hiraishi A, Yoshimi Y, Kawarasaki M, Matsuda K, Kamagata Y.参照)等の低栄養寒天培地でより良好に生育する。培養温度30℃、培養pH 7.0、好気条件下で良好に生育する。
一様に生育するが、菌体濃度はOD (Optical Density) 600nm で 0.2 〜 0.4以下と低い値を示す。培養温度30℃、培養pH7.0、好気条件下で良好に生育する。
コロニーの形状は円形(直径2〜4 mm)であり、表面が滑らかで縁が丸く粘性がある。コロニーの色は黄色を呈する。また、不透明であり、光沢がある。滑走性は認められない。細胞形態は0.3〜0.5μm x 4〜7μmの長桿菌であり運動性はない。グラム染色試験は陰性を示す。Neisser染色試験は陽性を示す。
カタラーゼ試験およびオキシダーゼ試験ともに陽性を示す。
DNAのGC含量(GC mol% [HPLC])は67%であり、主たるイソプレノイドキノンはユビキノン-8 (UQ-8)である。また、主たる脂肪酸組成は以下の通りである;iso-C15:0 50%, iso-C16:0 16%, C16:1 10%, iso-C17:1 5%, C16:0 5%, anteiso-C15:0 5%, iso-C11:0-3OH 5%, iso- or anteiso-C11:0 4%。
Lysobacter sp.T-15株の16S rRNA遺伝子のほぼ全長(1471 bp)の塩基配列を決定し、国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)を対象として相同性検索を実施した。具体的には、米国NCBIが提供するBLAST(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)検索を実施した。その結果を表1に示す。
(2)細胞形態:Lysobacter brunescensの細胞は7〜70μmと非常に長いが、Lysobacter sp. T-15株は4〜 7μm程度の長桿菌である。
(3)コロニーの形態:Lysobacter brunescensのコロニーは薄く広がるが、Lysobacter sp. T-15株は2〜4 mm程度の円形のコロニーを形成する。
(4)滑走性:Lysobacter brunescensは滑走性があるが、Lysobacter sp. T-15株では滑走性は認められない。
(5)寒天分解能:Lysobacter brunescensは寒天分解能を示すが、Lysobacter sp. T-15株では認められない。
(6)16S rRNA遺伝子配列:Lysobacter brunescensとLysobacter sp. T-15株の16S rRNA遺伝子の塩基配列は2.5%異なる。
本発明の酵素の尿酸を基質として用いたときの触媒反応式は式1である。生成物の5−ヒドロキシイソウレアは、非酵素的にアラントインにまで酸化されるので、見かけ上の反応式は式2である。
4 benzenediol + O2 → 4 benzosemiquinone + 2H2O(式3)
Bilirubin + O2 → biliverdin + H2O(式4)
1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))0.04ml、5mMの尿酸を0.023ml、及び蒸留水0.937mlからなる酵素活性測定溶液1mlを層長1cmの石英セル中で37℃2分間予備加温した後、40mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))で適当な濃度に希釈した本発明の尿酸オキシダーゼ液20μlを加え酵素反応を開始する。反応開始後1分後から2分後までの293nmにおける基質の吸光度差を測定する(As)。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する(Ab)。酵素活性1単位(1ユニット)は37℃で1分間に1マイクロモルの尿酸を変化する酵素量、上記反応液中での尿酸のミリモル吸光係数は12.6として、As−Abより酵素活性を求める。
40mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))、10U/mlのペルオキシダーゼ、1.5mMの4−アミノアンチピリン(4−AA)、0.04%のN,N’−ジメチルアニリン、1mMの尿酸からなる酵素活性測定溶液1mlを層長1cmの石英セル中で37℃2分間予備加温した後、40mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))で適当な濃度に希釈した本発明の尿酸オキシダーゼ液20μlを加え酵素反応を開始する。反応開始後1分後から2分後までの565nmにおける基質の吸光度差を測定する(As)。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する(Ab)。酵素活性1単位(1ユニット)は37℃で1分間に1マイクロモルの尿酸を変化する酵素量、上記反応液中でのキノンジイミン色素のミリモル吸光係数は23.56として、As−Abより酵素活性を求める。本明細書中では特に断らない限り、尿酸オキシダーゼ活性測定法2で尿酸オキシダーゼの活性を測定した。
100mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH4.5(25℃))、5mMのABTSからなる酵素活性測定溶液1mlを層長1cmの石英セル中で37℃2分間予備加温した後、10mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液20μlを加え酵素反応を開始する。反応開始後1分後から2分後までの420nmにおける基質の吸光度差を測定する(As)。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する(Ab)。酵素活性1単位(1ユニット)は37℃で1分間に1マイクロモルのABTSを変化する酵素量、上記反応液中で増加する420nmのミリモル吸光係数は36として、As−Abより酵素活性を求める。
1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0(25℃))0.1ml、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0(25℃))で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液0.02ml、及び蒸留水0.88mlからなる酵素活性測定溶液1mlを層長1cmの石英セル中で37℃1.5分間予備加温した後、基質として国際試薬(株)の干渉チェックAビリルビンF(成分はビリルビン)を0.9%NaClで20mg/dlに調製したものを20μl添加して酵素反応を開始し、反応開始後1分後から2分後までの450nmにおける基質の吸光度差を測定する(As)。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する(Ab)。酵素活性1単位(1ユニット)は37℃で1分間に1マイクロモルのビリルビンを変化する酵素量、上記反応液中でのビリルビンFのミリモル吸光係数は36として、As−Abより酵素活性を求める。
アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定溶液(0.5mMのL−アスコルビン酸、0.45mMのエチレンジアミン四酢酸を含む90mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5(25℃)))1mlを層長1cmの石英セル中で30℃5分間予備加温した後、0.05%BSAを含む10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5(25℃))で適当な濃度に希釈した本発明の酵素液0.1mlを混和して酵素反応を開始し、反応開始後1分後から5分後までの245nmにおけるL−アスコルビン酸の吸光度差を測定する(As)。盲検として蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定する(Ab)。この酵素液使用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(As−Ab)より酵素活性を求める。酵素活性1単位(1ユニット)は30℃で1分間に1マイクロモルのL−アスコルビン酸を変化する酵素量、上記反応液中でのL−アスコルビン酸のミリモル吸光係数は10として、As−Abより酵素活性を求める。
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2の酵素活性測定溶液中に、表2中に示した濃度でNaCl、KCl、NaBr、Na2SO4、NaNO3またはCH3COONaを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)の活性を測定した。無添加の場合を100%としたときの相対値を表2に示した。表2で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼはNaCl、KCl、NaBr、NaNO3で濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2の酵素活性測定溶液中に、10mMのNaCl、KCl、Na2SO4、およびCH3COONaを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ、Candida sp.由来尿酸オキシダーゼ(東洋紡社製)、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼ(東洋紡社製)の活性を測定した。無添加の場合を100%としたときの相対値を表3に示した。表3で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来、Candida sp.由来、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼはNaCl、KClで反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
従来の尿酸オキシダーゼはキサンチンにより強く酵素反応が阻害されることが報告されている(非特許文献9)。前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2の酵素活性測定溶液中に、1mMのキサンチンを添加し、本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの活性を測定した。無添加の場合を100%としたときの相対値を表4に示した。表4から明らかなように、Arthrobacter globiformis由来、Candida sp.由来、およびBacillus sp.由来尿酸オキシダーゼはキサンチンで濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
非特許文献10では、汎用される緩衝液であるTrisHCl緩衝液によって従来の尿酸オキシダーゼの酵素反応が阻害される事が報告されている。前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2の酵素活性測定溶液中のリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)濃度を、表5中に示した濃度のTrisHCl緩衝液(pH7.0)に変更して本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの活性を測定した。無添加の場合を100%としたときの相対値を表5に示した。表5で明らかなように、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼはTrisHCl緩衝液の濃度依存的に反応が阻害されるにもかかわらず、本発明の尿酸オキシダーゼは同条件では、反応が阻害されない特徴をもつことが分かった。
本発明の尿酸オキシダーゼとArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼの、NaClによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットによりKi値を算出した。図3が本発明の尿酸オキシダーゼで図3がArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼのNaClによる阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットである。図2及び3中、白丸(○)は0mM、黒丸(●)は50mM、白三角(△)は100mM、黒四角(▲)は150mM、白四角(□)は200mMのNaClを示す。また、図2及び図3の各勾配をNaCl濃度に対してプロットした阻害反応のラインウェーバー・バーク逆数プロットの2次プロットを図4に示した。図4中、白丸(○)は本発明の尿酸オキシダーゼ、黒丸(●)はArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼを示す。図4より、本発明の尿酸オキシダーゼは実用上問題にならない程度の非常に弱い阻害をNaClによって受け、Kiは約200mMであることが分かる。一方、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼは実用上問題になる程度の強い阻害をNaClによって受け、Kiは約5.7mMであることが分かった。また、図2より本発明の尿酸オキシダーゼがNaClによって受ける阻害形式は拮抗形で、図3よりArthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼがNaClによって受ける阻害形式は非拮抗形であり、お互いに異なることが明らかになった。図2及び図3中Vは反応速度を表し、[I]は阻害剤の濃度を表す。
本発明の酵素の尿酸に対する至適pHを求めた。至適pHを測定するための測定溶液は緩衝液を変化し、前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2と同じ方法で求めた。図5に、緩衝液として、pH4.2からpH5.2の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH5.9からpH7.4の範囲はリン酸カリウム緩衝液、pH7.8からpH10.0の範囲はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合の、尿酸に対する最大活性を100%とした相対値を示した。本発明の酵素の尿酸に対して相対活性が85%以上となるのはpH6.3から7.8の間であり、至適pHは中性付近であった。
本発明の酵素の国際試薬(株)の干渉チェックAビリルビンC及びビリルビンFに対する至適pHを求めた。至適pHを測定するための測定溶液は1Mの各緩衝液0.1ml、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0(25℃))で適当に希釈した酵素液0.02ml、及び蒸留水0.78mlからなる酵素活性測定溶液1mlを使用して上記ビリルビンオキシダーゼ活性測定法と同じ方法で酵素反応速度を求めた。pH変化に伴うビリルビンC及びビリルビンFのミリモル吸光係数の変化は考慮しなかった。図6に、緩衝液として、pH3.3からpH5.5の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH4.8からpH6.1の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH6.0からpH7.4の範囲はリン酸カリウム緩衝液、pH7.5からpH9.6の範囲はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合のビリルビンC(図中、黒丸(●)印)またはビリルビンF(図中、白丸(○)印)に対する最大活性を100%とした相対値を示した。本発明の酵素のビリルビンCに対する至適pHは5付近、ビリルビンFに対する至適pHは中性付近であった。
本発明の酵素のABTSに対する至適pHを求めた。至適pHを測定するための測定溶液は緩衝液を変化し、前記ラッカーゼ活性測定法と同じ方法で求めた。図7に、緩衝液として、pH3.2からpH4.2の範囲は酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH4.8からpH6.2の範囲はクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、pH6.3からpH6.9の範囲はリン酸カリウム緩衝液を使用した場合の、ABTSに対する最大活性を100%とした相対値を示した。本発明の酵素のABTSに対する至適pHは4付近であった。
前記尿酸オキシダーゼ活性測定法1の活性測定法で、反応温度を25から58度まで変化して本発明の尿酸オキシダーゼの反応速度を測定した。その結果をアレニウスプロットして図8に示した。図8で明らかなように、本発明の尿酸オキシダーゼの至適温度は少なくとも55℃以上であり、作用温度の範囲は少なくとも30℃から60℃であった。また、図8で明らかなように、アレニウスプロットは二相性を示し、活性化エネルギーは25から36.5℃の間は62kJ/mol、39.5から58℃の間は37kJ/molであった。図中Tは絶対温度を示す。
本発明の尿酸オキシダーゼを0.03mg/mlになるように40mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0(25℃))中に溶解し、各温度で15分間熱処理した後の尿酸オキシダーゼの残存活性を前記尿酸オキシダーゼ活性測定法2に従って測定した。その結果を図9に示した。図9で明らかなように本発明の尿酸オキシダーゼは、安定化剤の非存在下、30℃、15分間で98%以上の活性を保持する。
本発明の酵素の尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸またはABTSを基質とした場合の反応速度を測定し、比活性(μmol/mim/mg)を算出して表6にまとめた。また、比較のためにラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼの尿酸、ビリルビン、アスコルビン酸、およびABTSを基質とした場合の比活性(μmol/mim/mg)も同時に示した。なお、表6中(a)はApplied and Environmental Microbiology, 2006, 72, 972-975、(b)はThe Journal of biological chemistry, 2002, 277, 18849-18859、(c)はBiochemistry, 1999, 38, 3034-3042、(d)はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560から引用した値であり、*はVmaxであることを示す。表6で明らかなように本発明の酵素は尿酸オキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性及びビリルビンオキシダーゼ活性を同時にもち、従来報告のあるラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼとは全く異なる特徴をもつ新規な酵素であることがわかった。
Lysobacter sp. T-15を培養し本発明の尿酸オキシダーゼを精製した場合、図10のSDS−PAGEの写真で示されるように約31000と32000の分子量と測定され(レーン1の矢印)、Superdex 200 ppで分子量測定した場合、図11で示されるように約120800±10000の分子量と推察された。配列番号2で表わされるアミノ酸配列をコードする本発明の尿酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換え体プラスミドを含む形質転換体を培養し本発明の尿酸オキシダーゼを精製した場合、図10のSDS−PAGEの写真で示されるように約67000の分子量と測定された(レーン2の矢印)。アミノ酸一次配列からの計算値は64516であった。図中白丸(○)は酵素活性(U/ml)を、黒丸(●)は分子量(kDa)を示す。
本発明の尿酸オキシダーゼの等電点はキャリアーアンホラインを用いた電気泳動法にて約pH5.2±0.5であった。
本発明の酵素の尿酸、国際試薬(株)の干渉チェックAビリルビンF、アスコルビン酸及びABTSに対する見かけのKmとVmaxを測定した。上記の各酵素活性測定法に従い、各基質の酵素活性測定溶液中の濃度を、表7に示した各Km値の1/10倍から10倍の間で5つ以上の異なる濃度になるように調製して、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより各見かけのKm値とVmax値を算出した。表7に、比較のためにBacillus subtilis由来CotA(旭化成ファーマ株式会社製)、Arthrobacter globiformis由来尿酸オキシダーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)、Trachderma tsunodae由来ビリルビンオキシダーゼ(宝酒造株式会社製)、Acremonium sp.由来アスコルビン酸オキシダーゼ(旭化成ファーマ株式会社製)、及びTrametes versicolor由来ラッカーゼ(シグマ社製)の各見かけのKm値とVmax値もまとめて示した。なお、表中(a)はApplied and Environmental Microbiology, 2006, 72, 972-975、(b)はThe Journal of biological chemistry, 2002, 277, 18849-18859、(c)はBiochemistry, 1999, 38, 3034-3042、(d)はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560、(d)はJ. Microbiology, 2005, 43, 555-560から引用した値であり、±は僅かに反応することを示し、―は全く反応しないことを示す。表7で明らかなように、本発明の酵素は尿酸オキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性及びビリルビンオキシダーゼ活性を併せもち、従来報告のある尿酸オキシダーゼはもとより、ラッカーゼタイプのマルチ銅オキシダーゼ、すなわち、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びラッカーゼとは全く異なる特徴をもつ新規な酵素であることがわかった。
本発明の配列番号2のアミノ酸番号1から661で表される尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列のN末端側及びC末端側は、アミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチドまたはT7タグ、Hisタグ、Sタグ、Trxタグ、CBDタグ、DsbAタグ、GSTタグ、Nusタグなどが挙げられる。
<培養>
Lysobacter sp. T-15は次のような培地で培養した;1Lあたり、硫酸アンモニウム 0.5g、グルタミン酸ナトリウム 0.5g、コハク酸ナトリウム 0.5g、酢酸ナトリウム0.5g、酵母エキス0.5g、カザミノ酸 0.5g、チオ硫酸ナトリウム 0.5g、EDTA3Na 24.66mg、硫酸鉄7水和物 5.55mg、硫酸マグネシウム7水和物 123.25 mg、塩化カルシウム2水和物 14.7mg、塩化ナトリウム 117mg、硫酸マンガン4水和物 0.558mg、硫酸亜鉛7水和物 0.144mg、硝酸コバルト7水和物 0.146mg、硫酸銅5水和物 0.126mg、モリブデン酸ナトリウム2水和物 0.121mg、硼酸 0.155mg、ニコチン酸 1mg、チアミン 1mg、ビオチン 1mg、パラアミノ安息香酸 0.5mg、ビタミンB12 0.01mg、パントテン酸カルシウム 0.5mg、ピリドキシン塩酸塩 0.5mg、葉酸 0.5mg。該培地をオートクレーブ滅菌(113℃20分)してLysobacter sp. T-15を接種し、30℃で好気的に24時間培養した。培養終了後、培養物を7,000rpmで20分間遠心し集菌した。
<DNAの抽出>
実施例1で培養したLysobacter sp. T-15の菌体の一部を50mMのトリス−塩酸(pH8.0)、50mMのEDTA、15%シュークロースを含む1mg/mlリゾチーム溶液で37℃、10分処理した後、SDSを最終濃度0.25%になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール/クロロホルム=1:1混合液を加え、30分攪拌した後、12,000rpmで15分遠心分離処理をして水層を回収した。回収した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)を混合後、2倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムDNAをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムDNAを、10mMトリス−塩酸(pH8.0)、1mMのEDTA水溶液(TEバッファー)20mlに溶解し、20mg/mlのRNaseAを200μl加え、37℃で1時間保温し、混在しているRNAを分解した。次いで、等量のフェノール/クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)と2倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムDNAを分離した。この染色体を50mlのTE(10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、1mMのEDTA(pH8.0))に溶解し、TE飽和のフェノールとクロロホルムの1対1混和液20mlを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層20mlに3Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)2mlとエタノール50mlを加え、撹拌後−70℃で5分間冷却した後、遠心分離(2,000G、4℃、15分)し、沈澱した染色体を75% エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりLysobacter sp. T-15のDNA標品約1mgを得た。
<細胞抽出液の取得方法>
実施例1で集菌した菌体を、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離(15,000G、5分、4℃)し、上清を取得して細胞抽出液とした。
<本発明の尿酸オキシダーゼの精製法>
実施例3で調製した粗酵素液は、そのまま10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したDEAE sep.FF(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に吸着させた。10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で充分に洗浄した後、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度20%になるように硫酸アンモニウム添加し、20%の硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したPhenyl sep.FF(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に吸着して20及び0%の硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したG−25(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)で脱塩した後、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したQ sep.HP(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に吸着し、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分を10mMのリン酸緩衝液pH7.0で平衡化したG−25で脱塩して10mMのリン酸緩衝液pH7.0及び100mMの硫酸銅で平衡化したChelating sep. FF(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に吸着し、0及び1Mのイミダゾールを含む10mMのリン酸緩衝液pH7.0を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したG−25で脱塩した後、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したハイドロキシアパタイト(バイオラッド社製)に吸着し、0及び1Mのリン酸緩衝液pH7.5を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は0.15Mを含む10mMのリン酸緩衝液pH7.0で平衡化したSuperdex 200 pp(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)でゲルろ過した。図11はこのSuperdex 200 ppカラムクロマトグラフィーの結果である。得られた活性画分は図10のSDS−PAGEの写真で示されるように約31000と32000の分子量と測定された(レーン1の矢印)。実施例5の精製結果をまとめて表8に示した。得られた酵素液は青色を呈し、その吸収スペクトルは図12の様であった。
<本発明の酵素の部分アミノ酸配列決定>
1Mウレア pH8に溶解した実施例4で得た本発明の酵素1mgを、アミノペプチダーゼLys−CもしくはAsp−Nで断片化した(37℃17時間)。断片は定法に従い0.1%のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−水系の逆相カラムクロマトグラフィーで分離精製しエドマン分解法にて部分アミノ酸配列を決定した。
<放射性DNAプローブの作製>
実施例5で決定された本発明酵素の部分アミノ酸配列のうち、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸番号298から307に相当する配列を元に遺伝子クローニングに使用するオリゴヌクレオチドプローブを設計し、配列番号3で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを外部機関(ベックス社)に合成依託して作製した。完成したオリゴヌクレオチド200ngをT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー(50mMのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、10mMの塩化マグネシウム、10mMの2−メルカプトエタノール)、及び740kBq(キロベクレル)の[γ−32P]ATP(NEN社販売)存在下、8.5uのT4ポリヌクレオチドキナーゼで37℃、30分間反応させ、ラジオアイソトープ32Pを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。
<本発明の酵素遺伝子含有DNAフラグメントの検定>
実施例2で取得したLysobacter sp. T-15の染色体DNA(10μg)を各種制限酵素で切断し、1.5%アガロースゲル(タカラバイオ社製アガロースゲルH14、40mMのTris−酢酸緩衝液(pH7.4)、2mMのEDTA)で150V、1.5時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン(PALL社製:バイオダインA)にDNAを移行させた。
<遺伝子ライブラリーの作成>
実施例2で取得したLysobacter sp. T-15の染色体DNA10μgを制限酵素XhoIで切断し、常法に従い約8kbのDNAフラグメントを分離した。このDNAフラグメントを、制限酵素SalIで切断しアルカリフォスファターゼ(以下BAPと略称)1uで切断末端を脱リン酸化した1μgのpUC119と、DNAライゲーションキット(DNA Ligation Kit)で連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ・JM109(東洋紡績社製)をトランスフォーメーションし、50μg/mlアンピシリン含有LB(バクトトリプトン(DIFCO社製)10g/l、酵母エキス(DIFCO社製)5g/l、NaCl 10g/l)1.5%寒天平板培地にて一夜培養し、約2,000個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
<本発明の酵素遺伝子含有クローンのスクリーニング>
実施例8で得られた遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン(PALL社製:バイオダインA)にレプリカし、このメンブレンに添付のマニュアルに従って菌体のDNAを固定した。
<組み換えプラスミドの抽出と酵素遺伝子塩基配列の決定>
実施例9で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを50μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地1.5mlに植菌し37℃で16時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドに挿入された染色体断片の塩基配列を外部機関(BMR社)に依頼して解析したところ、実施例5で決定した本発明の酵素の部分アミノ酸配列をコードする構造遺伝子領域が確認された。この構造遺伝子領域と周辺の塩基配列を決定して本発明の酵素遺伝子の塩基配列とした。本発明の酵素遺伝子の塩基配列と、コードされるアミノ酸配列を配列番号1及び配列番号2にそれぞれ示した。
<遺伝子組換え酵素発現用プラスミド作製>
配列番号4のPCR用プライマー(センス)と配列番号5のPCR用プライマー(アンチセンス)を合成依託して作製し、PCRで配列番号1のDNAを増幅した。PCR溶液組成は、KOD DNAポリメラーゼ1μl、10倍濃縮のKOD DNAポリメラーゼに添付の緩衝液5μl、1mM塩化マグネシウム2μl、0.2mM dNTP7.5μl、10μg/ml 実施例2で取得したLysobacter sp. T-15の染色体DNA 10μl、10pmol/μl センスプライマー5μl、アンチセンスプライマー5μl、蒸留水14.5μlからなる。PCR条件は、(1)98℃15秒、(2)65℃20秒、及び(3)72℃60秒からなるサイクルを1サイクルとして、これを30サイクル行った。増幅したPCR産物はNdeIとBamHIで切断して精製し、これをpET−21aのNdeIとBamHIの切断部位に挿入し、本発明の尿酸オキシダーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。また、PCR産物を定法により末端平滑化し、pUC118とpUC119のSmaI切断部位に挿入し、本発明の尿酸オキシダーゼ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。pET−21aによって構築されたプラスミドは定法によってエシェリヒア・コリ BL21(DE3)に形質転換した。pUC119によって構築されたプラスミドは定法によってエシェリヒア・コリ JM109に形質転換した。
<形質転換大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製>
実施例11で作成したプラスミドを導入したエシェリヒア・コリBL21(DE3)またはエシェリヒア・コリ JM109を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に接種し、37℃で培養し、培養液の600nmの吸光度が0.6になったときに培養温度を24℃に低下してlacプロモーター誘導剤である1mMのIPTGを添加した。その後、24℃でさらに4時間培養し、遠心分離(15,000G、1分、4℃)により集菌し、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離(15,000G、5分、4℃)し、上清を取得して細胞抽出液とした。
<形質転換大腸菌からの本発明の尿酸オキシダーゼ精製法>
実施例12で調製した粗酵素液は、そのまま10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したQ sep.BB(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製)に吸着させた。10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で充分に洗浄した後、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度20%になるように硫酸アンモニウム添加し、20%の硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したPhenyl sep.FFに吸着して20及び0%の硫酸アンモニウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したG−25で脱塩した後、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したQ sep. HPに吸着し、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したG−25で脱塩した後、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したハイドロキシアパタイトに吸着し、0及び1Mのリン酸緩衝液pH7.5を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は0.15Mを含む10mMのリン酸緩衝液pH7.0で平衡化したSuperdex 200 ppでゲルろ過した。得られた活性画分は図10のSDS-PAGEの写真で示されるように約67000の分子量と測定された(レーン2の矢印)。実施例13の精製結果をまとめて表9に示した。
<本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸の定量>
1)本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定試薬の調製
本発明の尿酸オキシダーゼを用いた尿酸測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
50mM リン酸緩衝液 pH 7.0
50mM リン酸緩衝液 pH 7.0
5U/ml ペルオキシダーゼ(シグマ社製)
0.03% 4−AA
0.03% DAOS(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, sodium salt)
1mU/ml 実施例13にて調製した本発明の尿酸オキシダーゼ
日水製薬(株)のスイトロールNを用いて0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/dlの検量線用尿酸標準液を調製し、日立7080形自動分析機を用いて測定した。日立7080形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、2ポイントエンド測定、サンプル量4μl、試薬1は210μl、試薬2は70μl、測定主波長600nm、副波長700nmとした。その結果、図13に示すように尿酸濃度と吸光度の変化量はR2=0.9950で直線状にプロットされ、吸光度変化測定で尿酸の定量が可能であった。
<本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬の調製、及び該測定試薬を用いた検体の測定値と、市販の血清中尿酸測定試薬(デタミナーL UA(協和メデックス株式会社製))を用いた同検体の測定値との比較>
本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
1−1)試薬1
40mM リン酸緩衝液 pH 7.0
10U/ml ペルオキシダーゼ
0.03% DAOS
40mM リン酸緩衝液 pH 7.0
0.03% 4−AA
0.5mM EDTA−2Na
10U/ml 実施例13にて調製した本発明の尿酸オキシダーゼ
日立7080形自動分析機を用いてヒト血清70検体を上記試薬とデタミナーL UAキットを用いて測定した。日立7080形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、Rate−A測定(20−24ポイント)、サンプル量4μl、試薬1は210μl、試薬2は70μl、測定主波長600nm、副波長700nmとした。デタミナーL UAキットは添付文書に従って使用した。測定値はデタミナーL UAキット用のキャリブレータを用いた。測定結果の相関図を図14に示したように、相関式がY=1.01X−0.55、相関係数がR2=0.9922であり、良好な相関が示された。これは本発明の尿酸オキシダーゼを用いた血清中尿酸測定試薬で、ヒト血清中の尿酸を精度良く測定できることを示している。
<本発明の酵素を用いたビリルビンF及びビリルビンCの定量>
1)本発明の酵素を用いたビリルビンF及びビリルビンC測定試薬の調製
本発明の酵素を用いたビリルビンF及びビリルビンC測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
100mM リン酸緩衝液 pH 7.2
0.2% コール酸ナトリウム
0.5mM EDTA−2Na
100mM リン酸緩衝液 pH 7.2
0.02% TX−100
0.5mM EDTA−2Na
4U/ml 実施例13にて調製した本発明の酵素
国際試薬(株)の干渉チェックAビリルビンF及びビリルビンCを0.9%NaCl水で希釈した0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/dlの検量線用標準液を、日立7080形自動分析機を用いて測定した。日立7080形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、2ポイントエンド測定、サンプル量10μl、試薬1は200μl、試薬2は50μl、測定主波長450nm、副波長546nmとした。図中黒丸(●)はビリルビンC,白丸(○)はビリルビンFを示す。その結果、図15に示すようにビリルビンF及びビリルビンC濃度と吸光度の変化量はそれぞれR2=0.9991、R2=0.9996で直線状にプロットされ、波長450nmの吸光度変化測定でビリルビンF及びビリルビンCの定量が可能であった。
<本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調製、及び該測定試薬を用いた検体の測定値と、市販の血清中総ビリルビン測定試薬(イアトロT−Bilキット)を用いた同検体の測定値との比較>
1)本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬の調製
本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬として以下に示した試薬キットを調製した。
100mM リン酸緩衝液 pH 7.2
0.2% コール酸ナトリウム
0.5mM EDTA−2Na
100mM リン酸緩衝液pH 7.2
0.02% TX−100
0.5mM EDTA−2Na
4U/ml 実施例13にて調製した本発明の酵素
日立7080形自動分析機を用いてヒト血清70検体を上記試薬とイアトロT−Bilキット(三菱化学イアトロン社製)を用いて測定した。日立7080形自動分析機の上記試薬の分析パラメーターは、2ポイントエンド測定(15−31ポイント)、サンプル量10μl、試薬1は200μl、試薬2は50μl、測定主波長450nm、副波長546nmとした。イアトロT−Bilキットは添付文書に従って使用した。測定値はイアトロT−Bilキット用のキャリブレータを用いて総ビリルビン濃度に換算した。測定結果の相関図を図16に示したように、相関式がY=0.98X+1.38、相関係数がR2=0.930であり、良好な相関が示された。これは本発明の酵素を用いた血清中総ビリルビン測定試薬で、ヒト血清中の総ビリルビンを精度良く測定できることを示している。
Claims (15)
- 下記特性を有する尿酸オキシダーゼ。
(1)酵素作用:酸素と水の存在下、尿酸に作用して、5−ヒドロキシイソウレア、過酸化水素、及び二酸化炭素を生成する作用を有する。
(2)阻害作用:ハロゲン化物イオン、硝酸イオン、及び/又はトリス緩衝液で(1)の作用が阻害されない。かつ、キサンチンで(1)の作用が阻害されない。
(3)至適pH:6.3〜7.8。
(4)至適温度:55℃以上。
(5)作用適温の範囲:すくなくとも30〜60℃の範囲。
(6)安定性:安定化剤の非存在下、30℃、15分間で98%以上の活性を保持する。 - 610±20nmに吸収スペクトルが存在することを特徴とする、請求項1に記載の尿酸オキシダーゼ。
- Lysobacter sp. T-15株(受託番号FERM P−21056)由来であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の尿酸オキシダーゼ。
- 下記(a)又は(b)の何れかのアミノ酸配列からなる尿酸オキシダーゼ。
(a)配列番号2で表わされるアミノ酸配列;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、尿酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配: - ラッカーゼ活性を併せ持つ、請求項1から4のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ。
- ビリルビンオキシダーゼ活性を併せ持つ、請求項1から5のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを生産することを特徴とする微生物。
- 受託番号FERM P−21056を有する、Lysobacter sp. T-15株。
- 以下の(a)または(b)の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(a)配列番号1で表される塩基配列;
(b)配列番号1で表される塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、かつ、尿酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列: - 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項10に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項11に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項1から6のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを生成蓄積させ、該培養物から該尿酸オキシダーゼを採取することを特徴とする尿酸オキシダーゼの製造方法。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼを含有する組成物。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ又は請求項13に記載の組成物を少なくとも含む、尿酸測定キット。
- キサンチン、硝酸イオン、及びハロゲン化物イオンからなる群から選ばれる1以上の成分を含む試料において、請求項1から6のいずれか1項に記載の尿酸オキシダーゼ、請求項13に記載の組成物、又は請求項14に記載の尿酸測定キットを用いて尿酸を測定する方法。
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