JP2008100930A - エラスターゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】少量の使用でも高いエラスターゼ阻害作用を発揮するエラスターゼ阻害剤を提供する。
【解決手段】下記の一般式（１）
【化１】

〔式中、ＲＣＯは炭素数８〜１８の直鎖もしくは分岐鎖の飽和または不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ^１はタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖を示し、ｎは３〜３０で、Ｍは一価もしくは二価の金属原子（ただし、二価の金属原子の場合は１／２当量）、ＮＨ_４または有機アミン化合物のオニウムを示す〕で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩でエラスターゼ阻害剤を構成する。上記加水分解タンパクとしてはアミノ酸重合度が３〜１０のものが特に好ましく、そのタンパク源としては、コラーゲン、シルク、カゼイン、大豆タンパクまたはエンドウ豆タンパクが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、エラスターゼの活性を阻害する作用を有するエラスターゼ阻害剤に関する。

真皮の細胞外マトリックスでは、恒常的に合成・分解を繰り返す機能が働いていて、外的・内的刺激により真皮の細胞外マトリックスが損傷した場合、その損傷部位を修復しやすい状態にするため、コラーゲン線維やエラスチン線維などを分解する体内酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ群、以下、「ＭＭＰｓ」という）が働くと言われている。ところが、長期間の紫外線被爆や加齢などによって、上記の恒常的合成・分解機能が低下していくため、自然老化性や光老化性のシワやタルミが進行すると言われている。

皮膚の弾力性は、真皮に存在するコラーゲン線維とエラスチン線維などの細胞外マトリックスによって保たれていて、特に、エラスチン線維はコラーゲン線維間を繋ぐバネのような役割をしているため、この部分が損傷すると皮膚の弾力性が失われ、シワやタルミの原因になると考えられる。このエラスチン線維を分解する働きを有するＭＭＰｓの一つにエラスターゼがあり、このエラスターゼの働きを阻害することによってシワやタルミを軽減することができると考えられる。

これまでにも、上記のような皮膚の損傷を抑制するために、加水分解タンパクを主成分とするエラスターゼ阻害剤が提案されている（特許文献１、２および非特許文献１）。

エラスターゼは、ペプチド鎖中の低分子の中性アミノ酸（アラニン、グリシン、セリン、バリンなど）を認識し、その認識アミノ酸のＣ末端側のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸であると、そのＣ末端側のアミド結合を加水分解により切断する基質特異性が低いプロテアーゼである。そのため、それら低分子の中性アミノ酸を多く含むタンパク質や加水分解タンパクは、エラスターゼによって分解される基質の一つになり得る。その結果、それら低分子の中性アミノ酸を多く含むタンパク質や加水分解タンパクは、エラスターゼの活性に対して、皮膚の弾性成分と拮抗（競争）的に働き、エラスターゼの活性を阻害する阻害剤として機能することになる。

しかしながら、加水分解タンパクが皮膚の弾性成分より優先的にエラスターゼによって分解されて、エラスターゼの皮膚の弾性成分に対する働きを阻害するという報告は見られない。これは、加水分解タンパクが皮膚の弾性成分に対する拮抗阻害剤として充分なエラスターゼ阻害作用を有するためには、皮膚の弾性成分に対する加水分解タンパクの相対量を多くしなければ有効なエラスターゼ阻害作用が得られないためであると考えられる。

特開２００５−３４３８８７号公報 特開２００４−１８２６８７号公報 フレグランスジャーナル；２００４（８），ｐ．４９−５４

従って、本発明は、上記のような事情に鑑み、少量の使用でもエラスターゼに対して高い阻害作用を有するエラスターゼ阻害剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、下記の一般式（１）

〔式中、ＲＣＯは炭素数８〜１８の直鎖もしくは分岐鎖の飽和または不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ^１はタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖を示し、ｎは３〜１５で、Ｍは一価もしくは二価の金属原子（ただし、二価の金属原子の場合は１／２当量）、ＮＨ_４または有機アミン化合物のオニウムを示す〕で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩が高いエラスターゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するにいたった。この本発明の加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤は、上記の皮膚の弾性成分と拮抗的に働くという記載からも明らかなように、それ自身もエラスターゼの活性により加水分解を受け、それ自身以外のタンパク質、加水分解ペプチド、その誘導体などに対するエラスターゼの活性を阻害するものである。

そして、上記加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩の中でも、コラーゲン、シルク、カゼイン、大豆タンパク、エンドウ豆タンパクなどをタンパク源とする加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩が、高いエラスターゼ阻害作用を有している。

本発明のエラスターゼ阻害剤は、少量の使用でもエラスターゼの活性を阻害することができるエラスターゼ阻害作用を有している。

本発明のエラスターゼ阻害剤を構成する一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩における加水分解タンパクとしては、例えば、コラーゲン（その変性物のゼラチンを含む）、シルク、ケラチン、カゼイン、コンキオリン、鳥卵の卵黄タンパク、卵白タンパク、大豆タンパク、小麦タンパク、トウモロコシタンパク、米（米糠）タンパク、エンドウ豆タンパク、ゴマタンパク、ジャガイモタンパクなどの動植物由来のタンパク、あるいは酵母菌、キノコ類（担子菌）、クロレラなどから分離した微生物由来のタンパク質を、酸、アルカリ、酵素またはそれらの併用で部分的に加水分解して得られる加水分解タンパクが挙げられる。

上記の加水分解タンパクの中でも、コラーゲン、シルク、カゼイン、大豆タンパク、エンドウ豆タンパクなどを加水分解したものは、Ｎ−アシル化誘導体にしたときにエラスターゼ阻害作用が高く、特に好ましい。

加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の加水分解タンパク部分は、エラスターゼが結合しやすく、かつ、高い水溶性と分散性を有し、皮膚への浸透性がよい分子量のものが好ましい。そのため、加水分解タンパク部分のアミノ酸重合度は、上記一般式（１）において、ｎが３〜１５（数平均分子量で約３００〜約１８００）のものが適しており、３〜１０（数平均分子量で約３００〜約１２００）のものがより好ましい。加水分解タンパク部分のアミノ酸重合度が上記より大きくなると、すなわち、上記一般式（１）において、ｎが１５より大きくなると、皮膚への浸透性が低下し、加水分解タンパク部分のアミノ酸重合度が上記より小さい場合は、すなわち、上記一般式（１）において、ｎが３より小さい場合は、加水分解タンパク部分へのエラスターゼの結合性が悪くなる。なお、加水分解タンパクは、アミノ酸重合度が異なるペプチドの混合物として得られるため、ｎの値は平均値である。

本発明のエラスターゼ阻害剤を構成する一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩の加水分解タンパク部分は、例えば、本出願人取得の特許第１１４４７４４号公報に記載されているような方法で得ることができる。具体的には、タンパク質を１〜２０倍量の水に均一に分散させた後、２０〜８０℃に加温し、１〜１０ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの強アルカリ、１〜１０ｍｏｌ／ｌの塩酸、硫酸などの強酸、ペプシン、トリプシン、サーモライシンなどのタンパク質分解酵素、またはそれらの併用で加水分解した後、ｐＨを調整し、不溶物を除去することによって得られる。

次に、このようにして得られた加水分解タンパクをＮ−アシル化誘導体にするが、Ｎ−アシル化反応もＳｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ法などの公知の方法で行うことができる。すなわち、例えば、本出願人取得の特許第１６５７３４８号の公報に記載されているように、脂肪酸のハロゲン変性誘導体を加水分解タンパクのＮ末端アミノ基に対して求核反応させることによって加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体が得られる。より具体的には、ｐＨを９〜１１に調整した加水分解タンパクを含む水溶液を４０〜６０℃に加温し、攪拌しながら脂肪酸クロライドを滴下して１５分〜６時間反応させることによって加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体が得られる。

加水分解タンパクのＮ−アシル化反応に用いる脂肪酸としては、炭素数が８〜１８個の直鎖もしくは分岐鎖を有する飽和または不飽和の脂肪酸であり、具体的には、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸などが好ましい。

これは、Ｎ−アシル化反応に用いる脂肪酸の炭素数が上記より大きくなると、加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩が水溶性を保つことができなくなるからであり、また、脂肪酸の炭素数が上記より小さい場合は、エラスターゼ阻害作用が低下するためである。

上記一般式（１）において、Ｍは一価もしくは二価の金属原子（ただし、二価の金属原子の場合は１／２当量）、ＮＨ_４または有機アミン化合物のオニウムであり、上記一価の金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属が挙げられ、二価の金属原子としては、例えば、カルシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属、マグネシウムなどが挙げられる。ただし、二価の金属原子を用いる場合は、１金属原子が２分子のアシル化ペプチドと中和塩を形成するので、上記一般式（１）におけるＭとしては、その１／２当量を使用する。ＮＨ_４はアンモニアに由来するものであり、また、オニウムを形成しうる有機アミン化合物としては、例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミンなどのアルキルアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールなどのアルカノールアミン、リシン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、グアニジンなどが挙げられる。そして、上記Ｎ−アシル化誘導体の塩の好適な具体例としては、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、トリエタノールアミン塩、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩などが挙げられる。

本発明の一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤のエラスターゼ阻害作用は、日本皮膚科学会大阪地方会発行の「皮膚」、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、ｐ．７９３〜７９７に記載されている酵素活性測定方法に準じてエラスターゼ活性を測定することによって確認することができる。すなわち、基質にＮ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリドを用い、エラスターゼによる基質の加水分解によって生じるｐ−ニトロアニリンの生成量を波長４１０ｎｍの吸光度で測定し、単位時間あたりの吸光度変化量でエラスターゼ活性を求める方法で確認することができる。つまり、エラスターゼによって基質中のｐ−ニトロアニリド部分が加水分解されてｐ−ニトロアニリンが生成し、その生成に伴なって吸光度が変化するので、それによってエラスターゼの活性を求める方法である。

本発明の一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤は、その使用量に応じてエラスターゼの活性を阻害する作用を発揮するので、その使用量は、特に限定されるものではないが、通常、エラスターゼ１μｇに対して０．０１ｍｇ以上、特に０．１ｍｇ以上が好ましい。つまり、本発明のエラスターゼ阻害剤の使用量が上記より少ない場合は、エラスターゼの活性に対する阻害作用が充分に発揮されなくなるおそれがある。また、本発明のエラスターゼ阻害剤は、その使用量を多くしすぎても、使用量の増加に伴なうエラスターゼ活性の阻害作用の増加がほとんど認められなくなることから、多くても、エラスターゼ１μｇに対して１００ｍｇ以下、特に１．５ｍｇ以下が好ましい。本発明の一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤は、通常、該エラスターゼ阻害剤を構成する一般式（１）で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩の水溶液として流通にのせられるが、上記の使用量は、その純分、つまり、エラスターゼ阻害剤自身の量として表したものである。

また、本発明のエラスターゼ阻害剤は、化粧料などに配合することができる。例えば、化粧水、乳液、クリーム、ジェルなどの形態の化粧料に本発明のエラスターゼ阻害剤を配合することができ、それによって、紫外線曝露による光老化性のシワやタルミの改善、肌のハリの改善などの効果を期待することができる。その際の配合量としては、エラスターゼ活性の阻害作用が発揮される量でさえあれば特に限定されることはないが、通常、本発明のエラスターゼ阻害剤を、その純分として（つまり、エラスターゼ阻害剤そのものとして）、化粧料中に０．００１〜１０質量％程度配合することが好ましい。つまり、エラスターゼ阻害剤の配合量が上記より少ない場合は、エラスターゼ活性の阻害作用が充分に発揮されず、また、エラスターゼ阻害剤の配合量が上記より多くなっても、その配合量の増加に伴なう阻害作用の増加が認められないからである。

つぎに、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は、それらの実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例に先立って、エラスターゼ阻害率を測定・算出するための試験法を示す。また、下記の実施例や比較例で用いる％は、いずれも質量％である。

ヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験
加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩やその原料である加水分解タンパクのヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害率を以下の方法で測定した。すなわち、活性測定用緩衝液として０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用い、活性測定用基質としては合成基質であるＮ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド（ペプチド研究所社製）を用い、あらかじめそれを１−メチル−２−ピロリドンに濃度が１２５ｍｍｏｌ／ｌとなるように溶解させておいた。そして、エラスターゼ酵素液としてはヒト好中球由来エラスターゼ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を上記活性測定用緩衝液で濃度が７０．０μｇ／ｍｌとなるように調製したものを用いた。

エラスターゼ活性は、上記活性測定用緩衝液を用いて、試験液中で、活性測定用基質が１．４μｍｏｌ／ｍｌ、エラスターゼ酵素液が濃度１３μｌ／ｍｌ、各測定試料濃度が０．００１、０．０１、０．１％になるように濃度を調整して、それらを混合し、３７℃で１５分間反応させて生じたｐ−ニトロアニリンの生成量を分光光度計（４１０ｎｍ）で測定し、単位時間当たりの吸光度変化としてエラスターゼの活性値を求めた。つまり、この方法は、エラスターゼの活性により活性測定用基質のＮ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリドのＡｌａとｐ−ニトロアニリドとの間が切断され、それによって生成するｐ−ニトロアニリンの生成量に伴なう吸光度の変化を分光光度計で測定し、それに基づいて、ｐ−ニトロアニリンの生成量とエラスターゼ活性値を求める方法である。このエラスターゼ活性の測定方法は、前記のように日本皮膚科学会大阪地方会発行の「皮膚」、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、ｐ．７９３〜７９７に記載されている方法に基づくものであり、試験液の全量は２．７ｍｌであるため、測定時の阻害剤のエラスターゼに対する濃度は、エラスターゼ１μｇ当たり０．０１１ｍｇ、０．１１ｍｇ、１．１ｍｇとなる。

そして、エラスターゼの純活性は、加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩やその原料である加水分解タンパクに代えて精製水を対照品（ブランク）として測定した。なお、本発明のエラスターゼ阻害剤を構成する一般式（Ｉ）で示される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩の生成にあたっては、副生成物として生成する塩化ナトリウムが系中に少量残存することがあるが、このヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験では、試験液中に塩化ナトリウムが残存していても、エラスターゼ活性に影響がないことを確認している。

エラスターゼ阻害率は、以下の計算式に基づいて算出した。なお、Ａは精製水（比較対照＝ブランク）のエラスターゼ活性値であり、Ｂは下記実施例１〜９および比較例１〜９のエラスターゼ活性値である。このエラスターゼ阻害率が高いほど、当然、エラスターゼ活性の阻害作用が高い。

実施例１〔加水分解コラーゲンのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量５００の加水分解コラーゲンの３０％水溶液を３００ｇ用い、２０％水酸化ナトリウムでｐＨを８．８〜９．５に調整した後、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のラウリン酸クロライド４０ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間攪拌を続けて反応を完結させた。アシル化反応後、反応液を希塩酸でｐＨを約２に調整し、アシル化物を浮遊沈澱として未反応の加水分解コラーゲンと分離した。浮遊沈澱は水洗後、２０％水酸化ナトリウム水溶液で中和してｐＨを７に調整し、濃度を調整して加水分解コラーゲンのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の３５％水溶液を２５０ｇ得た。

実施例２〔加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量５００の魚鱗由来加水分解コラーゲンの３０％水溶液を２００ｇ用い、２０％水酸化ナトリウムでｐＨを８．８〜９．５に調整した後、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のイソステアリン酸クロライド３８ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間攪拌を続けて反応を完結させた。アシル化反応後、反応物のｐＨを希塩酸で約２に調整し、反応物と同量のイソブタノールを添加してアシル化物をイソブタノール層に移行させた。イソブタノール層は同量の水で水洗を繰り返し、未反応のペプチドを分離した。水洗後のイソブタノール層は、減圧濃縮によりイソブタノールを除去し、濃縮残渣を２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールでｐＨ７に調整し、水とエタノールを加えて濃度を調整し、加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩の２５％水溶液とエタノールとの質量比１：１の混合液を４３０ｇ得た。

実施例３〔加水分解コラーゲンのＮ−ウンデシノイル誘導体のカリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量８００の加水分解コラーゲンの３０％水溶液を３００ｇ用い、アシル化剤としてウンデシレン酸クロライドを２５ｇ、中和時のアルカリ剤として２０％水酸化カリウムを用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解コラーゲンのＮ−ウンデシノイル誘導体のカリウム塩の３５％水溶液を２１５ｇ得た。

実施例４〔加水分解コラーゲンのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量５００の魚鱗由来加水分解コラーゲンの３０％水溶液３００ｇを用い、アシル化剤としてヤシ油脂肪酸クロライドを４３ｇ、中和時のアルカリ剤として２０％水酸化カリウムを用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解コラーゲンのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩の３５％水溶液を２９０ｇ得た。

比較例１〔加水分解コラーゲン〕
実施例１の加水分解コラーゲンのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の原料である数平均分子量５００の加水分解コラーゲンを用いて、比較例１とした。

上記実施例１の加水分解コラーゲンのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩、実施例２の加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩、実施例３の加水分解コラーゲンのＮ−ウンデシノイル誘導体のカリウム塩、実施例４の加水分解コラーゲンのＮ−ココイル誘導体（ヤシ油脂肪酸縮合物）のカリウム塩および比較例１の加水分解コラーゲンを上記のヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験に供し、それらのエラスターゼ阻害率を求めた。各試料の構造を明確にするため、上記一般式（１）における各官能基などを表１に示す。

また、上記実施例１〜４、比較例１および比較対照品（精製水）のエラスターゼ阻害率を表２に示す。

表２に示す結果から明らかなように、比較例１の加水分解コラーゲンにはエラスターゼ阻害作用が見られなかったが、その加水分解コラーゲンをＮ−アシル化誘導体の塩にした実施例１の加水分解コラーゲンのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩、実施例２の加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール塩および実施例４の加水分解コラーゲンのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩は濃度が０．００１％という低濃度でも非常に高いエラスターゼ阻害作用を示した。また、実施例３の加水分解コラーゲンのＮ−ウンデシノイル誘導体のカリウム塩は濃度が０．００１％ではエラスターゼ阻害作用が充分でなかったものの、濃度が０．０１％以上になると高いエラスターゼ阻害作用を示し、比較例１とのエラスターゼ阻害作用との差が明らかであった。

実施例５〔加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量３５０の加水分解シルクの３０％水溶液を３００ｇ用い、アシル化剤としてラウリン酸クロライドを６５ｇ用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の２５％水溶液を４７０ｇ得た。

実施例６〔加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量３５０の加水分解シルクの３０％水溶液を２００ｇ用い、アシル化剤としてイソステアリン酸クロライドを５１ｇ、中和時のアルカリ剤として２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールを用いた以外は、実施例２と同様にして、加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩の２５％水溶液とエタノールとの質量比１：１の混合液を５４０ｇ得た。

比較例２〔加水分解シルク〕
実施例５の加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の原料である数平均分子量３５０の加水分解シルクを用いて、比較例２とした。

比較例３〔加水分解シルクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩〕
数平均分子量３５０の加水分解シルクの３０％水溶液１００ｇを２０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．８〜９．５に調整し、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のアセチルクロライド５．８ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間撹拌を続けて反応を完結させた。反応液のｐＨを希塩酸で７に調整し、濃度を調整して加水分解シルクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩の２５％水溶液を１３０ｇ得た。

比較例４〔加水分解シルクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩〕
数平均分子量３５０の加水分解シルクの３０％水溶液１００ｇを２０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．８〜９．５に調整し、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のコハク酸クロライド１１．５ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間撹拌を続けて反応を完結させた。反応液のｐＨを希塩酸で７に調整し、濃度を調整して加水分解シルクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩の２５％水溶液を１５０ｇ得た。

上記実施例５の加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩、実施例６の加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩、比較例２の加水分解シルク、比較例３の加水分解シルクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩および比較例４の加水分解シルクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩を上記のヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験に供し、それらのエラスターゼ阻害率を調べた。各試料の構造を明確にするため、上記一般式（１）における各官能基などを表３に示す。

上記実施例５〜６、比較例２〜４および比較対照品（精製水）のエラスターゼ阻害率を表４に示す。

表４に示す結果から明らかなように、実施例５の加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩は、濃度が０．００１％という低濃度ではエラスターゼ阻害作用がやや低かったものの、濃度が０．０１％以上になるとエラスターゼ阻害率が９０％以上という高いエラスターゼ阻害作用を示し、実施例６の加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩は濃度が０．００１％という低濃度でも９８％のエラスターゼ阻害率を示し、高いエラスターゼ阻害作用を有していた。

これらに対して、比較例では、実施例５および６の原料である比較例２の加水分解シルクはエラスターゼ阻害作用が低く、また、それを短鎖の脂肪酸でアシル化した比較例３および４のアシル化誘導体の塩もエラスターゼ阻害作用が低かった。

実施例７〔加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量６００の加水分解カゼインの３０％水溶液を３００ｇ用い、アシル化剤としてヤシ油脂肪酸クロライドを３５ｇ、中和時のアルカリ剤として２０％水酸化カリウムを用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩の３５％水溶液を２１０ｇ得た。

比較例５〔加水分解カゼイン〕
実施例７の加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩の原料である数平均分子量６００の加水分解カゼインを用いて、比較例５とした。

上記実施例７の加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩および比較例５の加水分解カゼインを上記のヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験に供し、それらのエラスターゼ阻害率を調べた。各試料の上記一般式（１）における官能基などを表５に示す。

上記実施例７、比較例５および比較対照品（精製水）のエラスターゼ阻害率を表６に示す。

表６に示す結果から明らかなように、実施例７の加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩は、その原料である比較例５の加水分解カゼインに比べて、低濃度でも非常に高いエラスターゼ阻害作用を示した。

実施例８〔加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量７００の加水分解大豆タンパクの３０％水溶液を３００ｇ用い、アシル化剤としてヤシ油脂肪酸クロライドを３０ｇ、中和時のアルカリ剤として２０％水酸化カリウムを用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩の３５％水溶液を２００ｇ得た。

比較例６〔加水分解大豆タンパク〕
実施例８の加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩の原料である数平均分子量７００の加水分解大豆タンパクを用い、比較例６とした。

比較例７〔加水分解大豆タンパクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩〕
数平均分子量７００の加水分解大豆タンパクの３０％水溶液１００ｇを２０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．８〜９．５に調整し、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のアセチルクロライド４．５ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間撹拌を続けて反応を完結させた。反応液のｐＨを希塩酸で７に調整し、濃度を調整して加水分解大豆タンパクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩の２５％水溶液を１３０ｇ得た。

比較例８〔加水分解大豆タンパクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩〕
数平均分子量７００の加水分解大豆タンパクの３０％水溶液を１００ｇを２０％水酸化ナトリウムでｐＨ８．８〜９．５に調整し、液温を５０℃に保ち、溶液を攪拌しながらＮ末端アミノ基のモル濃度に対して１当量のコハク酸クロライド８．７ｇを２時間かけて滴下し、その後さらに１時間撹拌を続けて反応を完結させた。反応液のｐＨを希塩酸で７に調整し、濃度を調整して加水分解大豆タンパクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩の２５％水溶液を１３５ｇ得た。

上記実施例８の加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体（ヤシ油脂肪酸縮合物）のカリウム塩、比較例６の加水分解大豆タンパク、比較例７の加水分解大豆タンパクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩および比較例８の加水分解大豆タンパクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩を上記のヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験に供し、それらのエラスターゼ阻害率を調べた。各試料の構造を明確にするため、上記一般式（１）における各官能基などを表７に示す。

上記実施例８、比較例６〜８および比較対照品（精製水）のエラスターゼ阻害率を表８に示す。

表８に示す結果から明らかなように、実施例８の加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体のカリウム塩は、濃度が０．００１％という低濃度から高いエラスターゼ阻害作用を示したが、その原料である比較例６の加水分解大豆タンパクは、濃度が０．０１％になってもエラスターゼ阻害率が３５％と低く、エラスターゼ阻害作用が低かった。

また、加水分解大豆タンパクを短鎖の脂肪酸でＮ−アシル化した比較例７の加水分解大豆タンパクのＮ−アセチル誘導体のナトリウム塩および比較例８の加水分解大豆タンパクのＮ−サクシニル誘導体のナトリウム塩のエラスターゼ阻害作用は、それらの原料である加水分解大豆タンパクと大差はなく、短鎖の脂肪酸でのＮ−アシル化誘導体の塩ではエラスターゼ阻害作用が付与されないことが明らかであった。

実施例９〔加水分解エンドウ豆タンパクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩〕
加水分解タンパクとしての数平均分子量５００の加水分解エンドウ豆タンパクの２５％水溶液を２５０ｇ用い、アシル化剤としてラウリン酸クロライドを２８ｇ用いた以外は、実施例１と同様にして、加水分解エンドウ豆タンパクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の３５％水溶液を１８０ｇ得た。

比較例９〔加水分解エンドウ豆タンパク〕
実施例９の加水分解エンドウ豆タンパクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩の原料である数平均分子量５００の加水分解エンドウ豆タンパクを用いて、比較例９とした。

上記実施例９の加水分解エンドウ豆タンパクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩および比較例９の加水分解エンドウ豆タンパクを上記のヒト好中球由来エラスターゼ活性阻害試験に供し、それらのエラスターゼ阻害率を調べた。各試料の上記一般式（１）における官能基などを表９に示す。

上記実施例９、比較例９および比較対照品（精製水）のエラスターゼ阻害率を表１０に示す。

表１０に示す結果から明らかなように、実施例９の加水分解エンドウ豆タンパクのＮ−ラウロイル誘導体のナトリウム塩は、濃度が０．００１％という低濃度から非常に高いエラスターゼ阻害作用を示したが、その原料である比較例９の加水分解エンドウ豆タンパクは、高濃度でこそエラスターゼ阻害作用を示すものの、低濃度ではエラスターゼ阻害作用が低かった。

以上の実施例および比較例の結果から、加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩は、アシル基のアルキル部分の炭素数が８以上であれば、アルキル鎖が飽和、不飽和にかかわらず、また、直鎖、分岐鎖にかかわらず、原料である加水分解タンパクに比べて、エラスターゼ阻害作用が高くなることが明らかであった。

すなわち、原料の加水分解タンパクでは、加水分解大豆タンパクと加水分解エンドウ豆タンパクが、濃度が０．１％になるとやや高いエラスターゼ阻害作用を示したが、その他の加水分解タンパクは、濃度が０．０１％以下ではエラスターゼ阻害作用がほとんどないと言える。これに対して、本発明のエラスターゼ阻害剤を構成する加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩は、その原料である加水分解タンパクに比べて高いエラスターゼ阻害作用を示した。

また、比較例３〜４や比較例７〜８のように、炭素数が少ないアルキル鎖でアシル化した場合は、多少のエラスターゼ阻害作用が付与されるようになるものの、本発明のエラスターゼ阻害剤のように、炭素鎖の長いアルキル鎖でアシル化したものに比べると、エラスターゼ阻害作用が低かった。

本発明の加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤は、皮膚の弾力やはり、しわの改善を目的として化粧料に配合して利用できるが、以下に応用例として、本発明のエラスターゼ阻害剤を配合した各種化粧料処方を示す。なお、エラスターゼ阻害剤は実施例番号とエラスターゼ阻害剤を構成する加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩名で示す。また、配合量は質量％で示しており、配合成分が固形分でないものについては括弧内に有効成分濃度を示している。

応用例１〔化粧水〕
（配合成分） （％）
実施例２：加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の ０．２
２−アミノ−２−メチル−１、３−プロパンジオール塩（２５％）
実施例６：加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の ０．２
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩（２５％）
地黄抽出エキス水溶液（１０％）＊１ ２．５
ソルビトール ２．０
濃グリセリン １．０
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５
プロピレングリコール ２．５
防腐剤 適量
精製水 計１００とする

応用例２〔乳液〕
（配合成分） （％）
実施例５：加水分解シルクのＮ−ラウロイル誘導体の ０．５
ナトリウム塩（２０％）
実施例６：加水分解シルクのＮ−イソステアロイル誘導体の ０．２
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール塩（２５％）
カルボキシビニルポリマー ０．３
２−アミノ−２−メチル−１プロパノール ０．１１
ポリオキシエチレン（２５）セチルエーテル １．０
スクワラン ２．０
エタノール ５．０
プロピレングリコール ２．５
防腐剤 適量
精製水 計１００とする

応用例３〔クリーム〕
（配合成分） （％）
実施例７：加水分解カゼインのＮ−ココイル誘導体の ０．２
カリウム塩（２５％）
実施例８：加水分解大豆タンパクのＮ−ココイル誘導体の ０．２
カリウム塩（２５％）
地黄抽出エキス水溶液（１０％）＊１ ２．５
イソステアリン酸イソプロピル ５．５
親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
イソステアリン酸グリセリル ０．５
ホホバ油 ０．５
セタノール １．０
ジメチコン ０．２５
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビット（４０Ｅ．Ｏ．） １．７
ステアリン酸 １０．０
トリエタノールアミン １．０
防腐剤 適量
精製水 計１００とする

応用例４〔ジェル〕
（配合成分） （％）
実施例２：加水分解コラーゲンのＮ−イソステアロイル誘導体の ０．２
２−アミノ−２−メチル−１、３−プロパン
ジオール塩（２５％）
実施例３：加水分解コラーゲンのＮ−ウンデシノイル誘導体の ０．３
カリウム塩（３６％）
（アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウ ２．５
リンナトリウム）コポリマーを含むゲル状の乳化増粘剤＊２
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ０．３
ジメチコン ４．０
濃グリセリン ４０．０
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
プロピレングリコール ５．０
防腐剤 適量
精製水 計１００とする

上記応用例で使用した成分のうち＊印を付したものは下記の通りである。
＊１：（株）成和化成製ジオウエキス（商品名）
＊２：セピック社（フランス）製 シマルゲルＮＳ（商品名）

Claims (2)

1. 下記の一般式（１）
   

   

   〔式中、ＲＣＯは炭素数８〜１８の直鎖もしくは分岐鎖の飽和または不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ^１はタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖を示し、ｎは３〜１５で、Ｍは一価もしくは二価の金属原子（ただし、二価の金属原子の場合は１／２当量）、ＮＨ_４または有機アミン化合物のオニウムを示す〕で表される加水分解タンパクのＮ−アシル化誘導体の塩からなるエラスターゼ阻害剤。
2. 加水分解タンパクが、コラーゲン、シルク、カゼイン、大豆タンパクまたはエンドウ豆タンパクを加水分解したものである請求項１記載のエラスターゼ阻害剤。