JP2008070125A - 液体クロマトグラフにおける試料注入方法及び液体クロマトグラフ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、サンプルループへの試料の注入と溶離展開を抑制した分離カラム側への試料の排出とを繰り返すことにより、一分析あたりの試料量がサンプルループの容量を越える場合であっても分析を実施可能とするものである。
【選択図】図1
Description
このサンプルループ方式は、所定容量のチューブ(サンプルループ)を溶離液の流路に装脱着可能に配置し、脱着状態で該サンプルループに試料を注入し、流路切替バルブの操作によりサンプルループを溶離液流路中に装着することにより試料溶液を分離カラムに導入するものである。
このため、分離カラムに導入される試料量はサンプルループの容量に依存し、導入試料量を変更するためには、通常、その容量に合致したサンプルループに交換する必要がある。
また、本発明が解決すべき他の課題は、グラジエント溶離法において試料の注入量に依存してグラジエントの遅れが生じるのを防止することである。
一分析あたり注入しようとする試料溶液の試料量が前記サンプルループの容量を越える場合、
前記流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間に装着した状態で、前記注入工程で前記サンプルループに注入した試料溶液を前記送液手段により分離カラム側に排出する排出工程と、
を前記分離カラム中へ試料展開を抑制する条件下で必要回数繰り返すことにより、前記一分析あたり注入しようとする試料溶液を分割して注入することを特徴とする。
また、前記方法において、前記送液ポンプから前記切替バルブへの送液流路間に、前記流路切替バルブに向かう溶離液の流れを廃液流路側に切り替え可能なドレインバルブを備え、2回目以降の注入工程においては前記送液ポンプを停止すると共に前記ドレインバルブを廃液流路側に切り替えることが好適である。
また、前記方法において、排出工程は直前の注入工程で前記サンプルループに注入した試料溶液を、送液量がループ容量の1〜2.5倍に制御された前記送液手段により分離カラム側に排出する工程であることが好適である。
また、前記方法において、前記送液手段がグラジエント溶離システムを含むことが好適である。
また、本発明にかかる液体クロマトグラフにおいて、制御手段は、
流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間に装着した状態で、前記注入モードで前記サンプルループに注入した試料溶液を前記送液手段により分離カラム側に排出する排出モードと、
を、前記分離カラム中へ試料展開を抑制する条件下で必要回数繰り返すことにより、試料溶液を分割して分離カラムへ排出することを特徴とする。
本発明で使用できる分離カラムについて特に制限はない。排出工程の送液条件を制御することにより、吸着・分配型充填剤、イオン交換型充填剤、ゲル浸透型充填剤などを適宜使用することが可能である。たとえば、タンパク質の吸着分離に使用される疎水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤カラムを用いてグラジエント溶離法により分析する場合が特に好適な例となる。
本発明で用いられるサンプルループの容量は、特に制限はないが、当該クロマトグラフで処理に供される試料量の最小値前後であることが好適である。
また、流路切替バルブは、通常、周知の六方バルブが用いられる。
本発明において使用する送液手段について、特に制限はないが送液の流量制御及び送液停止/再起動が正確に制御できるものが好ましい。送液停止が確実にできないと、注入工程の2回目以降の繰り返し操作中に、排出工程で排出された試料が分離カラム内に押し出されてしまい、結果としてクロマトグラムのピーク波形が崩れたり、同じ試料成分に由来するピークが複数溶出されたりすることになる。この事態を避けるため、送液流路中に溶離液の流れを廃液流路に切り替えるドレインバルブを設け、送液手段を停止すると共にこのドレインバルブを開けて分離カラム側への送液を遮断する操作を加えるのが好ましい。分離カラムの流動抵抗が低い場合、送液ポンプ停止時でもサイフォンの原理で送液ポンプからカラム方向へ自然と溶離液が流れることがあることによる。
注入工程では、流路切替バルブの設定により試料溶液リザーバ、サンプルループ、試料注入ポンプが連結され、注入ポンプの駆動によりサンプルループ中に試料溶液を取り込む。
この際、二回目以降の試料注入時には分離カラムへの溶離液の供給を停止することが好ましい。
排出工程において、試料溶液を分離カラム側に排出するとき、分離カラム中へ試料展開を抑制する条件下で行う必要がある。その条件の具体的手段としては、排出する際に、試料が分離カラム内部に展開されない程度に溶出力の低い溶離液を使用することが好ましい。溶離液の溶出力の程度は試料が分離カラム内部に展開されない程度であればよく、使用する分離カラムの特性によって異なる。
なお、本発明は、必ずしもグラジエント溶離法に限定されるものではなく、イソクラティック溶離法にも適用可能な技術である。
また、本発明をグラジエント溶離クロマトグラフに適用した場合には、さまざまな量の試料を過大な容量のサンプルループに注入するとき試料の注入量に依存してグラジエントの遅れが生じる問題は、本発明において、小さいサンプルループを用いてサンプルループのうち溶離液が占める変動部分を縮小することにより、効果的に軽減することができる。
図1には本発明の一実施形態にかかる液体クロマトグラフの構成図が示されている。同図において、液体クロマトグラフ10は、試料溶液の所望成分を分離する分離手段12と、前記分離手段12に所定量の試料溶液を供給する試料注入手段14と、前記分離手段に溶離液を送液する送液手段16と、を備える。
そして、前記分離手段12は分離カラム18、試料成分検出用の紫外吸光検出器20、グラジエントモニター用の電気伝導度検出器22およびフラクションコレクタ24を有し、分離カラム18で分離された所望成分を紫外吸光検出器20で検出し、フラクションコレクタ24で採取する。
本実施形態において、溶離液リザーバ34aには溶出力の低い溶離液Saが貯蔵され、リザーバ34bには溶出力の高い溶離液Sbが貯蔵されており、それぞれ前記送液ポンプ38a,38bで適量送出され、ミキサー42で溶出力が均質化されるように構成されている。
本実施形態にかかる液体クロマトグラフにおいて、図1は試料注入モードを示しており、制御手段46は流路切替バルブ28、シリンジポンプ32に指示を与え、送液流路43から脱着状態にあるサンプルループ26に試料液を注入する。なお、初回注入時には送液ポンプ38aが定常状態で作動しており、溶離液Saが分離カラム18に定常流で流れているが、二回目以降の注入時には、制御手段46は送液ポンプ38を停止し、ドレインバルブ40に指示を与えて送液ポンプ38の吐出路を廃液リザーバ44に接続し、分離カラム18に余剰の溶離液を供給しないようにしている。
この結果、溶離液リザーバ34aからの低溶出力溶離液がサンプルループ26内の試料液を押し出し、分離カラム18側に排出する。
図3において、まず液体クロマトグラフの安定化が図られ、この間は図1の状態でドレインバルブ40をミキサー42側に切り替え、適当な溶離液がポンプ38の定常動作により分離カラム18に供給され、分離カラム18、その他の機器の物理的(圧力等)、化学的安定化が図られる。
Sv/Lvの演算を行い、小数が出た場合には切り上げて試料注入回数Nとする。例えばサンプル量が9mL、ループ容量が2mLであればN=5とする。
次に、制御手段46はN回にわたり、注入工程(図1)、排出工程(図2)を繰り返す。この際、最初の注入工程のみ前記安定化処理と平行して行なわれるため、適当な溶離液を定常流速、圧力で分離カラム18に供給しながら行うが、2回目以降の注入工程では前回分離カラム18に供給した試料液の分析開始前展開を防止するため、前述したように送液ポンプ38は停止し、ドレインバルブ40を廃液リザーバ側に切り替え、過剰な溶離液が分離カラム18に供給されないよう制御する。
そして、N回目の注入工程においては、必要試料液の残存量のみ、即ち前記例においては1mLのみを注入することとする。この際、サンプルループ26の空容量部分は溶離液Saが注入されているが、わずか1mLのみであり、従来技術のような弊害を生じる事はない。
溶離液Sa:0.1mol/Lリン酸緩衝液+1.8mol/L硫酸アンモニウム(pH7.0)
溶離液Sb:0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)
グラジエント条件:1分間B0%(A100%)固定+5分間直線的にB100%(A0%)まで+3分間B100%固定+B0%にステップ
送液流量:5.0mL/min
カラム:Toyoscreen Phenyl−650M(東ソー製)
試料液:0.5mg/mLリゾチーム溶液
検出波長:280nm
温度:室温(20〜25℃)
12 分離手段
14 試料注入手段
16 送液手段
18 分離カラム
26 サンプルループ
28 流路切替バルブ
38 送液ポンプ
40 ドレインバルブ
43 送液流路
46 制御手段
Claims (8)
- 液体クロマトグラフィー用の分離カラムを有する分離手段と、
溶離液を前記分離カラムに送液する送液流路および送液ポンプを有する送液手段と、
注入する試料溶液の所定量を保持するサンプルループ及びこのサンプルループを前記送液流路間に装脱着可能とする流路切替バルブを有する試料注入手段と、
を備えた液体クロマトグラフにおいて、
一分析あたり注入しようとする試料溶液の試料量が前記サンプルループの容量を越える場合、
前記流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間から脱着した状態で、前記試料量の一部を前記サンプルループに注入する注入工程と、
前記流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間に装着した状態で、前記注入工程で前記サンプルループに注入した試料溶液を前記送液手段により分離カラム側に排出する排出工程と、
を前記分離カラム中への試料展開を抑制する条件下で必要回数繰り返すことにより、前記一分析あたり注入しようとする試料溶液を分割して注入することを特徴とする液体クロマトグラフにおける試料注入方法。 - 請求項1記載の方法において、前記必要回数は、前記サンプルループの容量に対する前記一分析あたりの試料溶液の試料量の比の値を整数に切り上げた値であることを特徴とする試料注入方法。
- 請求項1又は2記載の方法において、前記送液ポンプから前記切替バルブへの送液流路間に、前記流路切替バルブに向かう溶離液の流れを廃液流路側に切り替え可能なドレインバルブを備え、2回目以降の注入工程においては前記送液ポンプを停止すると共に前記ドレインバルブを廃液流路側へ切り替えることを特徴とする試料注入方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法において、排出工程は、注入工程で前記サンプルループに注入した試料溶液を試料が分離カラム内部に展開されない程度に溶出力が低い溶離液を用いて前記送液手段により分離カラム側に排出する工程であることを特徴とする試料注入方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の方法において、排出工程は直前の注入工程で前記サンプルループに注入した試料溶液を、送液量がループ容量の1〜2.5倍に制御された前記送液手段により分離カラム側に排出することを特徴とする試料注入方法。
- 請求項5記載の方法において、流量が溶離展開する流量よりも小さくなるように制御されることを特徴とする試料注入方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の方法において、前記送液手段がグラジエント溶離システムを含むことを特徴とする試料注入方法。
- 液体クロマトグラフィー用の分離カラムを有する分離手段と、
溶離液を前記分離カラムに送液する送液流路および送液ポンプを有する送液手段と、
注入する試料溶液の所定量を保持するためのサンプルループ及びこのサンプルループを前記送液流路間に装脱着可能とする流路切替バルブを有する試料注入手段と、
前記送液ポンプ及び流路切替バルブを制御する制御手段と、
を備えた液体クロマトグラフにおいて、前記制御手段は、
前記流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間から脱着した状態で、前記試料量の一部を前記サンプルループに注入する注入モードと、
前記流路切替バルブ操作により前記サンプルループを前記送液流路間に装着した状態で、前記注入モードで前記サンプルループに注入した試料溶液を前記送液手段により分離カラム側に排出する排出モードと、
を、前記分離カラム中へ試料展開を抑制する条件下で必要回数繰り返すことにより、試料溶液を分割して分離カラムへ排出することを特徴とする液体クロマトグラフ。
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