JP2008048682A - バシラス属細菌、及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】双翅目害虫、特にイエカに対して強力な毒性を持つ、新規な殺虫剤を提供する。
【解決手段】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、及びそれの有する特定のアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質と、それをコードする遺伝子。該細菌は、双翅目害虫、特にイエカに対して強力な毒性を有し、特定のアミノ酸配列からなる殺虫タンパク質を含む封入体を有する。従って、該細菌及びその封入体は、双翅目害虫用、特にイエカ用の殺虫剤として有用である。
【選択図】なし
【解決手段】受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、及びそれの有する特定のアミノ酸配列を有する殺虫タンパク質と、それをコードする遺伝子。該細菌は、双翅目害虫、特にイエカに対して強力な毒性を有し、特定のアミノ酸配列からなる殺虫タンパク質を含む封入体を有する。従って、該細菌及びその封入体は、双翅目害虫用、特にイエカ用の殺虫剤として有用である。
【選択図】なし
Description
本発明は、新規バシラス属細菌及びその封入体、並びにそれらを利用した双翅目害虫の防除方法等に関する。
細菌バシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis・以後ＢＴと略称する）はグラム陽性の桿菌で胞子形成期に殺虫タンパク質を含む封入体を形成する。この封入体を摂食した害虫は腸管破裂等ののち死に至ることが知られている。ＢＴの殺虫活性スペクトルは鱗翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目及びトビゲラ目に及ぶことが知られている。しかし、その殺虫作用は化学合成殺虫剤とは異なり、それぞれの昆虫に特異的であり、動物や植物に対して毒性を示さない。従って、ＢＴを用いた害虫防除剤は化学合成殺虫剤に代わりうる安全性の高い有効な害虫防除剤として期待されている（非特許文献１：Glare and O’Callaghan, Bacillus thuringiensis:Biology, Ecology and Safety. Chichester: John Wiley & Sons (2000)）。双翅目昆虫の中では、蚊やブヨなどの衛生害虫及びユスリカやチョウバエ等の不快害虫に対してＢＴが用いられている。蚊の中でも、イエカは西ナイル熱ウイルスのベクターとして西ナイル熱の伝染に深く関与していることから、この防除が強く求められる。双翅目昆虫の駆除用として一般に使用されているＢＴの菌株はバシラス・チューリンゲンシス・セロバー・イスラエレンシス(B.thuringiensis serovar israelensis、以後イスラエレンシスと略称する)である。イスラエレンシスは殺虫タンパクとしてCry4A, Cry4B, Cry10A, Cry11A, Cyt1A, Cyt2Bを持っており、その遺伝子は１つのプラスミドに保持されていることが知られている(非特許文献２：C. Berry et al. Appl. Environ. Microbiol. 68:5082-5095 (2002))。
しかし、イスラエレンシスは、最初に単離されてからかなりの年月が経過しているため、これに対する抵抗性を獲得した系統の双翅目害虫の出現が懸念される。そこで、双翅目害虫、特にイエカに対してイスラエレンシスを超える毒性を持つ、新規な細菌の開発が求められている。
Glare及びO’Callaghan著、「バシラス・チューリンゲンシス：バイオロジー，エコロジー アンド セイフティ（Bacillus thuringiensis:Biology, Ecology and Safety）」、（米国）、チチェスター（Chichester）、ジョン ウィレイ アンド サンズ（John Wiley & Sons）、2000年 C. Berryら、アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Applied and environmental microbiology）、68巻、p5082-5095、2002年
しかし、イスラエレンシスは、最初に単離されてからかなりの年月が経過しているため、これに対する抵抗性を獲得した系統の双翅目害虫の出現が懸念される。そこで、双翅目害虫、特にイエカに対してイスラエレンシスを超える毒性を持つ、新規な細菌の開発が求められている。
Glare及びO’Callaghan著、「バシラス・チューリンゲンシス：バイオロジー，エコロジー アンド セイフティ（Bacillus thuringiensis:Biology, Ecology and Safety）」、（米国）、チチェスター（Chichester）、ジョン ウィレイ アンド サンズ（John Wiley & Sons）、2000年 C. Berryら、アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Applied and environmental microbiology）、68巻、p5082-5095、2002年
上記事情に鑑み、本発明は、双翅目害虫、特にイエカに対して強力な毒性を持つ、新規な細菌を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討したところ、屋久島の川水中から単離された新規なバシラス属細菌Ｂ２８２が、双翅目害虫、特にチカイエカ等のイエカに対してイスラエレンシスを超える強力な毒性を有し、該細菌及びその細菌中に含まれる封入体が双翅目害虫の殺虫剤として有用であることを見出し、以下の発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌。
［２］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌の封入体。
［３］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を含む組成物。
［４］双翅目害虫用殺虫剤である、［３］記載の組成物。
［５］双翅目害虫がイエカである、［４］記載の組成物。
［６］双翅目害虫の幼虫の生息環境中に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を適用することを含む、双翅目害虫の防除方法。
［７］双翅目害虫がイエカである、［６］記載の方法。
［８］以下（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド又はその部分ペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［９］［８］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［１０］［９］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１１］［１０］記載の発現ベクターを含む形質転換体。
［１２］［８］記載のポリペプチドに対する抗体。
［１３］［１２］記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌。
［２］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌の封入体。
［３］受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を含む組成物。
［４］双翅目害虫用殺虫剤である、［３］記載の組成物。
［５］双翅目害虫がイエカである、［４］記載の組成物。
［６］双翅目害虫の幼虫の生息環境中に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を適用することを含む、双翅目害虫の防除方法。
［７］双翅目害虫がイエカである、［６］記載の方法。
［８］以下（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド又はその部分ペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［９］［８］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［１０］［９］記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１１］［１０］記載の発現ベクターを含む形質転換体。
［１２］［８］記載のポリペプチドに対する抗体。
［１３］［１２］記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
本発明のバシラス細菌及びその封入体は、双翅目害虫、特にイエカに対して強力な毒性を有しているので、双翅目害虫用の殺虫剤として有用である。
（１．細菌、封入体及びその用途）
本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌（以下、Ｂ２８２と呼ぶ場合がある）を提供する。受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている（受領日：平成１８年７月５日）。
本発明は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌（以下、Ｂ２８２と呼ぶ場合がある）を提供する。受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている（受領日：平成１８年７月５日）。
本発明の細菌は、菌中に、双翅目昆虫に対して強力な毒性を有する封入体（インクルージョン）を有しており、該細菌自体が双翅目昆虫に対して強力な毒性を有する。双翅目昆虫の幼虫の生息環境中に本発明の細菌を適用すると、該幼虫が死滅し、双翅目昆虫の繁殖が抑制される。双翅目昆虫としては、双翅目害虫（蚊やブヨなどの衛生害虫、ユスリカやチョウバエ等の不快害虫等）を挙げることが出来る。蚊としては、チカイエカ等のイエカ、ハマダラカ、ネッタイシマカ等のシマカを挙げることが出来る。本発明の細菌は、双翅目昆虫の中でも蚊に対して強力な毒性を有しており、特にチカイエカ等のイエカに対しては、イスラエレンシスと比較して顕著に強力な毒性を有している。
本発明の細菌は、屋久島の川水中から分離されたものであり、通常の培養条件下では、以下の様な表現形質を有している：
（１）グラム陽性桿菌であり、液体培養した場合、ほとんどが５連鎖菌以上になる。
（２）運動性は陰性である。
（３）楕円形の胞子形成が起こる。芽胞位置は偏在している。
（４）細胞内封入体は不定形であり、サイズは芽胞と同程度である。
（５）集落形態はバシラス・チューリンゲンシス（ＢＴ）に典型的な大集落であり、表面はくすんでいる。
（６）好気性である。
（７）下記表１に示すような炭水化物代謝能を有する。
（１）グラム陽性桿菌であり、液体培養した場合、ほとんどが５連鎖菌以上になる。
（２）運動性は陰性である。
（３）楕円形の胞子形成が起こる。芽胞位置は偏在している。
（４）細胞内封入体は不定形であり、サイズは芽胞と同程度である。
（５）集落形態はバシラス・チューリンゲンシス（ＢＴ）に典型的な大集落であり、表面はくすんでいる。
（６）好気性である。
（７）下記表１に示すような炭水化物代謝能を有する。
本発明の細菌は、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する。このヌクレオチド配列に基づく分子系統学的解析から、本発明の細菌は、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)細菌、又はバシラス・チューリンゲンシス細菌の一種であると考えられる（実施例２．３．参照）。
本発明の細菌は、バシラス属細菌全般の培養に用いられる自体公知の方法により培養することができる。例えば、本発明の細菌は、肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇを水１リットルに溶解した肉エキス寒天培地（pH7.6）上において、好気性条件下で約２８℃にて培養することができる。
また、本発明は、上記本発明の細菌の封入体（インクルージョン又はクリスタルともいう）を提供する。封入体は殺虫性タンパク質の結晶であり、双翅目昆虫に対して強力な毒性を有する。双翅目昆虫の幼虫の生息環境中に本発明の封入体を適用すると、該幼虫が死滅し、双翅目昆虫の繁殖が抑制される。本発明の封入体は、双翅目昆虫の中でも蚊に対して強力な毒性を有しており、特にチカイエカ等のイエカに対しては、イスラエレンシスと比較して顕著に強力な毒性を有している。例えば、２４時間インキュベーション時のＬＣ５０で比較した場合、本発明の封入体のチカイエカ（幼虫）に対する殺虫活性は、イスラエレンシスの封入体の該殺虫活性と比較して、通常２倍以上、好ましくは３倍以上（例えば約４倍）強力である。
本発明の封入体は、本発明の細菌から自体公知の方法により採集することができる。例えば、本発明の細菌を上述の培養条件で５日間程培養後、細菌を回収し、硫酸デキストラン−ポリエチレングリコール系による二相分離法（N. S. Goodman, J. Bact., 94: 485 (1967)）に付すことにより、本発明の封入体を得ることが出来る。
本発明の細菌及びその封入体は、双翅目昆虫、特にチカイエカ等のイエカに対して強力な毒性を有するので、双翅目害虫（例、イエカ）用の殺虫剤として有用である。本発明の殺虫剤は、双翅目害虫の殺虫のための有効量の本発明の細菌又はその封入体を、水や適切な公知の配合剤と混合することにより製造することができる。本発明の殺虫剤中の有効成分の含有量は、特に限定されないが、有効成分が本発明の細菌である場合、通常、１ｎｇ（湿重量）／ｍｌ〜５０μｇ（湿重量）／ｍｌ程度、有効成分が本発明の封入体である場合、通常、０．１ｎｇ（タンパク質量）／ｍｌ〜５μｇ（タンパク質量）／ｍｌ程度である。
また、本発明は、双翅目害虫の幼虫の生息環境中に、本発明の細菌又はその封入体を適用することを含む、双翅目害虫（例、イエカ）の防除方法を提供する。双翅目害虫の幼虫の生息環境中に、本発明の細菌又はその封入体を適用（散布、混入）すると、該幼虫が本発明の細菌又はその封入体と接触し、或いは該成分を摂取する結果、該幼虫が死滅するので、双翅目害虫の繁殖を抑制することができる。双翅目害虫の幼虫の生息環境は、防除対象である双翅目害虫の種類に応じて適宜選択することができる。双翅目害虫の幼虫の生息環境としては、特に限定されないが、水生環境（川、湖、沼、海、ドブ等）、土壌等を挙げることが出来る。ここで、「双翅目害虫の幼虫の生息環境」とは、双翅目害虫の幼虫が生息可能な環境をいい、双翅目害虫の幼虫が実際に生息していることを要しない。即ち、本発明の方法には、以下が包含される：
（１）双翅目害虫の幼虫が実際に生息している環境中に、本発明の細菌又はその封入体を適用することにより、該幼虫を殺虫し、双翅目害虫の繁殖を抑制すること；及び
（２）双翅目害虫の幼虫は生息していないが、将来的に該幼虫が発生するおそれがある環境中に、予め本発明の細菌又はその封入体を適用し、双翅目害虫の繁殖を予防すること。
（１）双翅目害虫の幼虫が実際に生息している環境中に、本発明の細菌又はその封入体を適用することにより、該幼虫を殺虫し、双翅目害虫の繁殖を抑制すること；及び
（２）双翅目害虫の幼虫は生息していないが、将来的に該幼虫が発生するおそれがある環境中に、予め本発明の細菌又はその封入体を適用し、双翅目害虫の繁殖を予防すること。
本発明の方法において、本発明の細菌又はその封入体の用量は、双翅目害虫を防除し得る限り特に限定されず、対象となる双翅目害虫や生息環境の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば水生環境に本発明の細菌を適用する場合、通常、該環境中の濃度が１ｎｇ（湿重量）／ｍｌ〜１０μｇ（湿重量）／ｍｌ程度となるように該細菌が適用される。また、例えば、水生環境に本発明の封入体を適用する場合、通常、環境中の濃度が１ｎｇ（タンパク質量）／ｍｌ〜１μｇ（タンパク質量）／ｍｌ程度となるように、該封入体が適用される。
（２．新規殺虫性ポリペプチド及びその関連発明）
本発明は、本発明の細菌に由来する新規殺虫性ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。本発明のポリペプチドは、例えば、双翅目害虫の殺虫、本発明の抗体の作製などに有用であり得る。
本発明は、本発明の細菌に由来する新規殺虫性ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。本発明のポリペプチドは、例えば、双翅目害虫の殺虫、本発明の抗体の作製などに有用であり得る。
一実施形態では、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されると所定のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列同一性の程度は、例えば約９５％、好ましくは約９６％、より好ましくは約９７％、さらにより好ましくは約９８％、最も好ましくは約９９％又は約９９．５％以上であり得る。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。
別の実施形態では、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換、付加、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列であり得る。置換、付加、欠失および／または挿入されるアミノ酸の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個、最も好ましくは１〜約１０個、１〜約５個あるいは１または２個であり得る。
本発明のポリペプチドは、双翅目害虫（例、イエカ）に対する殺虫活性を有し得る。本発明のポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである場合、殺虫活性の程度は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば約０．１〜約５倍、好ましくは約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。
本発明の部分ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ペプチドであり得る。本発明の部分ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも約８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらにより好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは２０個以上の連続したアミノ酸からなるペプチドであり得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドあるいはその部分ヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチドあるいはその部分ヌクレオチドは、例えば、本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドの作製に有用であり得る。
一実施形態では、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチド配列同一性の程度は、例えば約９５％、好ましくは約９６％、より好ましくは約９７％、さらにより好ましくは約９８％、最も好ましくは約９９％又は９９．５％以上であり得る。ヌクレオチド配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、ヌクレオチド配列同一性（％）は、上述したアミノ酸配列同一性（％）と同様の方法により決定できる。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列において１以上のヌクレオチドが置換、付加、欠失および／または挿入されたヌクレオチド配列であり得る。置換、付加、欠失および／または挿入されるヌクレオチドの数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約３００個、好ましくは１〜約１５０個、より好ましくは１〜約１００個、さらにより好ましくは１〜約５０個、最も好ましくは１〜約３０個、１〜約２０個、１〜約１０個または１〜約５個であり得る。
さらに別の実施形態では、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列の相補配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、上記殺虫活性を有するポリペプチドをコードし得る。本発明のポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである場合、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの殺虫活性の程度は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと定量的に同等であり得るが、許容し得る範囲（例えば約０．１〜約５倍、好ましくは約０．５〜約２倍）で異なっていてもよい。
本発明の部分ヌクレオチドは、本発明の部分ペプチドをコードするヌクレオチドであり得る。詳細には、本発明の部分ヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの部分ヌクレオチドであり得る。
本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、本発明の細菌からＤＮＡを抽出した後、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりクローニングできる。また、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、上記の通りクローニングしたポリヌクレオチドに変異を導入することにより作製できる。変異導入法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法（gapped duplex）法、ランダムに点突然変異を導入する方法（例えば、亜硝酸若しくは亜硫酸での処理）、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスマッチプライマー法などの方法が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドについても自体公知の方法により作製できる。例えば、上記のように作製した本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適切な宿主細胞に導入して形質転換体を得た後、形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドを産生させ、次いで回収すればよい。本発明はまた、このような組換えベクター、及び当該ベクターが導入された形質転換体をも提供する。
発現ベクターとしては、任意の宿主細胞中で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができる。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするDNA、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成され得る。
細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、AAGGなど）を含むものである。例えば宿主が大腸菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示される。ターミネーター領域、複製可能単位については、自体公知のものを用いることができる。
本発明の形質転換体は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞（例えば、大腸菌、バシラス属菌、放線菌等の細菌、酵母などの真核生物細胞）が例示される。
本発明のポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類）を含んでいてもよい。
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpHおよび培養時間は、本発明のポリペプチドが大量に生産されるように適宜選択される。例えば、宿主が細菌である場合、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、pHが５〜８である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地等が例示される。かかる場合、培養は、例えば、通気、撹拌しながら、約３０〜４０℃にて約５〜３０時間行うことができる。宿主がバシラス属菌の場合、例えば、通気、撹拌をしながら、約２５〜４０℃にて約１５〜１００時間行うことができる。
本発明のポリペプチドは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。
単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
また、タグ（例えば、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ）などを付加したポリペプチドを形質転換体に産生させ、当該タグに親和性を有する物質（例えば、Ｎｉ２＋レジン、タグに特異的な抗体）を用いることにより、より簡便に、本発明のポリペプチドを単離、精製することもできる。
さらに、本発明のポリペプチドは、無細胞系にて合成可能である。無細胞系による本発明のポリペプチドの合成では、例えば、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽からの抽出液などを使用できる。また、本発明のポリペプチドは、固相合成法、液相合成法等の自体公知の有機化学的方法によって作製できる。
或いは、本発明のポリペプチドは、上記本発明の封入体から、上述の単離、精製方法を用いて精製することもできる。
本発明の抗体の作製に用いられる抗原としては、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはそれらの部分ペプチドを用いることができる。部分ペプチドとしては、免疫原性を有する限り特に限定されないが、例えば、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも約８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらにより好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは２０個以上の連続したアミノ酸からなるペプチドであり得る。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。この抗体は、完全な抗体分子だけでなく、本発明のポリペプチドに対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるフラグメントであってもよく、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、minibody等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：新規バシラス属細菌の選抜
１９９６年７月１２日に、屋久島にて採取された川水より、以下の方法で新規バシラス属細菌Ｂ２８２を選抜した。
即ち、サンプル（川水）を６５℃で３０分間低温殺菌した。適度に希釈したサンプルを肉エキス寒天平板に塗布し、２８℃で５日間培養した。培養されたコロニーを光学顕微鏡で観察し、芽胞と封入体を形成しているコロニーを単離し、スラントに保存したものをＢＴライブラリーとした。ＢＴライブラリー中の各菌を２８℃で５日間、肉エキス寒天培地上で培養後、回収した。
菌体湿重量が２５０mg/mlになるように滅菌水で懸濁した菌体懸濁液を選抜用サンプルとして用いた。蒸留水３ｍｌとチカイエカ３齢幼虫５匹を入れた１２穴プレートに選抜用サンプルを５μｌ投与した。この結果、強い殺虫活性を示す菌株として、Ｂ２８２を選抜した。
１９９６年７月１２日に、屋久島にて採取された川水より、以下の方法で新規バシラス属細菌Ｂ２８２を選抜した。
即ち、サンプル（川水）を６５℃で３０分間低温殺菌した。適度に希釈したサンプルを肉エキス寒天平板に塗布し、２８℃で５日間培養した。培養されたコロニーを光学顕微鏡で観察し、芽胞と封入体を形成しているコロニーを単離し、スラントに保存したものをＢＴライブラリーとした。ＢＴライブラリー中の各菌を２８℃で５日間、肉エキス寒天培地上で培養後、回収した。
菌体湿重量が２５０mg/mlになるように滅菌水で懸濁した菌体懸濁液を選抜用サンプルとして用いた。蒸留水３ｍｌとチカイエカ３齢幼虫５匹を入れた１２穴プレートに選抜用サンプルを５μｌ投与した。この結果、強い殺虫活性を示す菌株として、Ｂ２８２を選抜した。
実施例２：新規バシラス属細菌の解析
２．１．表現形質の解析
実施例１により得られたＢ２８２の表現形質の解析を行った。炭水化物代謝能は、アピ50CHとアピ50CHB/CHE培地のキット(日本ビオメリュー株式会社)を使用し、マニュアルに従い濁度を調整した菌体懸濁液をそれぞれのウエルに接種することにより判定を行った。結果を以下に示す。
・細胞形態：
桿菌（液体培養した場合、ほとんど５連鎖菌以上になる）
運動性：陰性
胞子形成（楕円形：芽胞位置 偏在）
細胞内封入体：不定形 サイズは芽胞と同程度
集落形態：バシラス・チューリンゲンシス（ＢＴ）に典型的な大集落で、表面はくすんでいる。
グラム染色：陽性
・生理的性質：
好気性
炭水化物代謝能：下記表１に示す。
２．１．表現形質の解析
実施例１により得られたＢ２８２の表現形質の解析を行った。炭水化物代謝能は、アピ50CHとアピ50CHB/CHE培地のキット(日本ビオメリュー株式会社)を使用し、マニュアルに従い濁度を調整した菌体懸濁液をそれぞれのウエルに接種することにより判定を行った。結果を以下に示す。
・細胞形態：
桿菌（液体培養した場合、ほとんど５連鎖菌以上になる）
運動性：陰性
胞子形成（楕円形：芽胞位置 偏在）
細胞内封入体：不定形 サイズは芽胞と同程度
集落形態：バシラス・チューリンゲンシス（ＢＴ）に典型的な大集落で、表面はくすんでいる。
グラム染色：陽性
・生理的性質：
好気性
炭水化物代謝能：下記表１に示す。
２．２．芽胞及び封入体の観察
分離株Ｂ２８２を普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）で２７℃、５日間培養した。培養後生育してきたコロニーを位相差顕微鏡下で観察した。結果を図１に示す。
楕円形の胞子形成が認められた。芽胞位置は偏在していた。細胞内封入体は不定形であり、そのサイズは芽胞と同程度だった。
分離株Ｂ２８２を普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）で２７℃、５日間培養した。培養後生育してきたコロニーを位相差顕微鏡下で観察した。結果を図１に示す。
楕円形の胞子形成が認められた。芽胞位置は偏在していた。細胞内封入体は不定形であり、そのサイズは芽胞と同程度だった。
２．３．16S rRNA遺伝子の塩基配列解析
Ｂ２８２を３時間本培養し、QIAGEN Genomic-tip（キアゲン）を用いて、製造者によるプロトコールに従い、Ｂ２８２からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。
16S rRNA遺伝子のほぼ全領域をカバーできるプライマーセットを用い、以下の条件で、該遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
・プライマーセット：
27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号８）
1492r：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’（配列番号９）
・反応液組成（50μl中）： Premix Taq(EX Taq Version) 25μl、プライマー 0.5 μM、ゲノムDNA 10ng
・反応条件: 予熱 ９４℃ ３分、３０サイクル（熱変性 ９４℃ ３０秒、アニーリング ６０℃ ３０秒、伸長 ７２℃ ６０秒）、冷却 ４℃
増幅産物のヌクレオチド配列を、自動ＤＮＡシーケンサー（Model 373S、Perkin-Elmer）で、Big Dye terminator(Applied Biosystems)を用いて決定し、得られたヌクレオチド配列に基づき、データベース(GenBank、EMBL、DDBJ)を使用したホモロジー検索を行った。ClustalWでマルチプルアライメントを行い、近隣結合法により系統樹を作成した。
得られたヌクレオチド配列を配列番号７に示す。また、系統樹を図２に示す。
このヌクレオチド配列に基づく解析から、Ｂ２８２は、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)細菌、又はバシラス・チューリンゲンシス細菌の一種である、新種のバチルス属細菌と判断された。
Ｂ２８２を３時間本培養し、QIAGEN Genomic-tip（キアゲン）を用いて、製造者によるプロトコールに従い、Ｂ２８２からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。
16S rRNA遺伝子のほぼ全領域をカバーできるプライマーセットを用い、以下の条件で、該遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
・プライマーセット：
27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号８）
1492r：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’（配列番号９）
・反応液組成（50μl中）： Premix Taq(EX Taq Version) 25μl、プライマー 0.5 μM、ゲノムDNA 10ng
・反応条件: 予熱 ９４℃ ３分、３０サイクル（熱変性 ９４℃ ３０秒、アニーリング ６０℃ ３０秒、伸長 ７２℃ ６０秒）、冷却 ４℃
増幅産物のヌクレオチド配列を、自動ＤＮＡシーケンサー（Model 373S、Perkin-Elmer）で、Big Dye terminator(Applied Biosystems)を用いて決定し、得られたヌクレオチド配列に基づき、データベース(GenBank、EMBL、DDBJ)を使用したホモロジー検索を行った。ClustalWでマルチプルアライメントを行い、近隣結合法により系統樹を作成した。
得られたヌクレオチド配列を配列番号７に示す。また、系統樹を図２に示す。
このヌクレオチド配列に基づく解析から、Ｂ２８２は、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)細菌、又はバシラス・チューリンゲンシス細菌の一種である、新種のバチルス属細菌と判断された。
２．４．Ｂ２８２の双翅目昆虫に対する殺虫活性の評価
Ｂ２８２を、普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）上で、２８℃、５日間培養し、集菌した。その菌体重量を測定し、濃度が２５０mg/mlになるように蒸留水により調製した菌体懸濁液をサンプルとし、殺虫活性評価をおこなった。即ち、チカイエカ幼虫２０匹を５ｍｌの脱イオン水の入った６穴プレートに入れた。各種濃度に希釈したＢ２８２を各穴に投与した。２５℃、２４時間のインキュベーション後、各穴中の幼虫の生存数を測定し、プロビット法(Finney, Probit Analysis, 2nd edn. London: Cambridge University Press.(1952))にてＬＣ５０を計算した。
その結果、Ｂ２８２のチカイエカに対する強力な殺虫活性が観察され、そのＬＣ５０は１８．４ng（湿重量）/mlだった。
Ｂ２８２を、普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）上で、２８℃、５日間培養し、集菌した。その菌体重量を測定し、濃度が２５０mg/mlになるように蒸留水により調製した菌体懸濁液をサンプルとし、殺虫活性評価をおこなった。即ち、チカイエカ幼虫２０匹を５ｍｌの脱イオン水の入った６穴プレートに入れた。各種濃度に希釈したＢ２８２を各穴に投与した。２５℃、２４時間のインキュベーション後、各穴中の幼虫の生存数を測定し、プロビット法(Finney, Probit Analysis, 2nd edn. London: Cambridge University Press.(1952))にてＬＣ５０を計算した。
その結果、Ｂ２８２のチカイエカに対する強力な殺虫活性が観察され、そのＬＣ５０は１８．４ng（湿重量）/mlだった。
２．５．Ｂ２８２の封入体の精製
菌体からの封入体（結晶性毒素タンパク）の精製は、硫酸デキストラン−ポリエチレングリコール系による二相分離法（N. S. Goodman, J. Bact., 94: 485 (1967)）により行った。
即ち、Ｂ２８２を、普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）上で、２８℃で、５日間培養し、集菌した。菌体を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、遠心分離により該菌体を再度回収した（洗浄操作）。洗浄操作は計３回行った。遠心分離した菌体２〜４ｇを３３ｍｌの蒸留水に懸濁し、懸濁液を超音波処理した。該懸濁液を下層液（２０％(w/v)硫酸デキストラン500（シグマ）３４ｍｌ、２０％(w/v)ポリエチレングリコール6000（和光）２３ｍｌ、３Ｍ 食塩 １０ｍｌ）に添加した後、この混合液に上層液（硫酸デキストラン500 ０．１５ｇ、ポリエチレングリコール6000 ３５．１５ｇ、食塩 ８．７５ｇ、蒸留水500ml）を１００ｍｌ添加し、５分間混合後、混合液を４０分静置した。上層を除去し、新しい上層液を１００ｍｌ添加し、混合／静置／上層の除去の操作を５回繰り返すことにより、封入体を精製した。下層を回収し、硫安沈殿を行い、遠心分離により沈殿物（封入体）を回収した。封入体を４回蒸留水で洗浄し、回収された封入体を蒸留水で懸濁し、使用するまで−２０℃で保存した。
菌体からの封入体（結晶性毒素タンパク）の精製は、硫酸デキストラン−ポリエチレングリコール系による二相分離法（N. S. Goodman, J. Bact., 94: 485 (1967)）により行った。
即ち、Ｂ２８２を、普通寒天培地（肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、寒天２０ｇ、水１リットル、ｐＨ７．６）上で、２８℃で、５日間培養し、集菌した。菌体を１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、遠心分離により該菌体を再度回収した（洗浄操作）。洗浄操作は計３回行った。遠心分離した菌体２〜４ｇを３３ｍｌの蒸留水に懸濁し、懸濁液を超音波処理した。該懸濁液を下層液（２０％(w/v)硫酸デキストラン500（シグマ）３４ｍｌ、２０％(w/v)ポリエチレングリコール6000（和光）２３ｍｌ、３Ｍ 食塩 １０ｍｌ）に添加した後、この混合液に上層液（硫酸デキストラン500 ０．１５ｇ、ポリエチレングリコール6000 ３５．１５ｇ、食塩 ８．７５ｇ、蒸留水500ml）を１００ｍｌ添加し、５分間混合後、混合液を４０分静置した。上層を除去し、新しい上層液を１００ｍｌ添加し、混合／静置／上層の除去の操作を５回繰り返すことにより、封入体を精製した。下層を回収し、硫安沈殿を行い、遠心分離により沈殿物（封入体）を回収した。封入体を４回蒸留水で洗浄し、回収された封入体を蒸留水で懸濁し、使用するまで−２０℃で保存した。
２．６．Ｂ２８２の封入体の双翅目昆虫に対する殺虫活性の評価
チカイエカ(Culex pipiens molestus)、ハマダラカ(Anopheles stephensi)、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)の２齢幼虫に対する殺虫活性を、Ｂ２８２及びイスラエレンシス株に由来する封入体について決定した。
即ち、各上記幼虫２０匹を５ｍｌの脱イオン水の入った６穴プレートに入れた。各種タンパク質濃度に希釈した精製封入体を各穴に投与した。２５℃、２４時間のインキュベーション後、各穴中の幼虫の生存数を測定し、プロビット法(Finney, Probit Analysis, 2nd edn. London: Cambridge University Press.(1952))にてＬＣ５０を計算した。
結果を表２に示す。
チカイエカ(Culex pipiens molestus)、ハマダラカ(Anopheles stephensi)、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)の２齢幼虫に対する殺虫活性を、Ｂ２８２及びイスラエレンシス株に由来する封入体について決定した。
即ち、各上記幼虫２０匹を５ｍｌの脱イオン水の入った６穴プレートに入れた。各種タンパク質濃度に希釈した精製封入体を各穴に投与した。２５℃、２４時間のインキュベーション後、各穴中の幼虫の生存数を測定し、プロビット法(Finney, Probit Analysis, 2nd edn. London: Cambridge University Press.(1952))にてＬＣ５０を計算した。
結果を表２に示す。
試験をした全ての双翅目昆虫に対して、Ｂ２８２の封入体はイスラエレンシスの封入体を上回る殺虫活性を示した。特に、Ｂ２８２の封入体のチカイエカに対する殺虫活性は極めて強力であり、イスラエレンシスの封入体のそれの４倍であった（ＬＣ５０の比較）。
実施例３：新規殺虫タンパク質の解析
３．１．Ｂ２８２の封入体中に含まれるタンパク質組成の検討
Ｂ２８２の封入体中に含まれるタンパク質組成を明らかにするため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。対照としてイスラエレンシスを用いた。
即ち、上記２．５．に記載の方法により、Ｂ２８２及びイスラエレンシスより封入体を精製し、それをLaemmli法(U. K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970))により、１０％分離ゲルと４％濃縮ゲルを用いて還元条件下（βメルカプトエタノール）電気泳動に付した。分子量はSDS-PAGE分子量スタンダード（バイオ・ラッド）と比較することにより決定した。染色にはクイック-CBB(和光純薬工業(株))を用いた。
３．１．Ｂ２８２の封入体中に含まれるタンパク質組成の検討
Ｂ２８２の封入体中に含まれるタンパク質組成を明らかにするため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。対照としてイスラエレンシスを用いた。
即ち、上記２．５．に記載の方法により、Ｂ２８２及びイスラエレンシスより封入体を精製し、それをLaemmli法(U. K. Laemmli, Nature 227:680-685 (1970))により、１０％分離ゲルと４％濃縮ゲルを用いて還元条件下（βメルカプトエタノール）電気泳動に付した。分子量はSDS-PAGE分子量スタンダード（バイオ・ラッド）と比較することにより決定した。染色にはクイック-CBB(和光純薬工業(株))を用いた。
結果を図３に示す。
Ｂ２８２は封入体中にイスラエレンシスの殺虫タンパク質であるCry11A（68 kDa）、Cyt1A(28 kDa)に相当する大きさのタンパク質を有していたが、Cry4A(125 kDa)、Cry4B(135 kDa)に相当する大きさのタンパク質は有していなかった。また、Ｂ２８２の封入体はイスラエレンシスの封入体が有していない約75 kDaのタンパク質を有していた。以上より、Ｂ２８２の封入体は、イスラエレンシスの封入体とは異なる組成のタンパク質を有していることが示された。
Ｂ２８２は封入体中にイスラエレンシスの殺虫タンパク質であるCry11A（68 kDa）、Cyt1A(28 kDa)に相当する大きさのタンパク質を有していたが、Cry4A(125 kDa)、Cry4B(135 kDa)に相当する大きさのタンパク質は有していなかった。また、Ｂ２８２の封入体はイスラエレンシスの封入体が有していない約75 kDaのタンパク質を有していた。以上より、Ｂ２８２の封入体は、イスラエレンシスの封入体とは異なる組成のタンパク質を有していることが示された。
３．２．Ｂ２８２のプラスミド組成の検討
QIAGEN Plasmid Kit（QIAGEN）を用いて、Ｂ２８２及びイスラエレンシスから全プラスミドを抽出・精製し、0.7%アガロース電気泳動に付した。
結果を図４に示す。
Ｂ２８２が保持している構成プラスミドの組成はイスラエレンシスのものとは大きく異なることが示された。
QIAGEN Plasmid Kit（QIAGEN）を用いて、Ｂ２８２及びイスラエレンシスから全プラスミドを抽出・精製し、0.7%アガロース電気泳動に付した。
結果を図４に示す。
Ｂ２８２が保持している構成プラスミドの組成はイスラエレンシスのものとは大きく異なることが示された。
３．３．Ｂ２８２の殺虫タンパク質遺伝子に関する検討（ＰＣＲ法による）
イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子をＢ２８２が保持しているかどうか検討するため、各遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ及び電気泳動の条件は以下の通りである。
・プライマー： イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子(cry4A、 cry4B、 cry10A、 cry11A、 cyt1A、 cyt2B)を特異的に増幅するプライマー( J. E. Ibarra et al. Appl. Environ. Microbiol. 69:5269-5274 (2003))を用いた。
・反応液組成（50μl中）： Premix Taq(EX Taq Version)（タカラバイオ） 25μl、プライマー 0.5 μM、鋳型プラスミド（前述のＢ２８２又はイスラエレンシス由来） 10ng
・反応条件： 予熱 ９４℃ ３分、３０サイクル（熱変性 ９４℃ ３０秒、アニーリング ６０℃ ３０秒、伸長 ７２℃ ６０秒）、冷却 ４℃
・3%アガロース電気泳動
結果を図５に示す。
Ｂ２８２由来のプラスミドを鋳型とした場合、cry11A、cyt1A、cyt2Bを特異的に増幅するプライマーでは増幅産物が得られたが、cry4A、cry4B、cry10A用のプライマーでは増幅産物が得られなかった。
イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子をＢ２８２が保持しているかどうか検討するため、各遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ及び電気泳動の条件は以下の通りである。
・プライマー： イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子(cry4A、 cry4B、 cry10A、 cry11A、 cyt1A、 cyt2B)を特異的に増幅するプライマー( J. E. Ibarra et al. Appl. Environ. Microbiol. 69:5269-5274 (2003))を用いた。
・反応液組成（50μl中）： Premix Taq(EX Taq Version)（タカラバイオ） 25μl、プライマー 0.5 μM、鋳型プラスミド（前述のＢ２８２又はイスラエレンシス由来） 10ng
・反応条件： 予熱 ９４℃ ３分、３０サイクル（熱変性 ９４℃ ３０秒、アニーリング ６０℃ ３０秒、伸長 ７２℃ ６０秒）、冷却 ４℃
・3%アガロース電気泳動
結果を図５に示す。
Ｂ２８２由来のプラスミドを鋳型とした場合、cry11A、cyt1A、cyt2Bを特異的に増幅するプライマーでは増幅産物が得られたが、cry4A、cry4B、cry10A用のプライマーでは増幅産物が得られなかった。
３．４．Ｂ２８２の殺虫タンパク遺伝子に関する検討（サザンブロッテング法による）
イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子をＢ２８２が保持しているかどうか検討し、プラスミドの構造を解析するため、各遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてサザンブロッテングを行った。
即ち、Ｂ２８２及びイスラエレンシスに由来する全プラスミドを、制限酵素APaL I又はNco Iで処理し、０．７％アガロース電気泳動で分離した。分離されたプラスミドＤＮＡを、０．４Ｍ ＮａＯＨ 転写バッファーを用いてHybond-N+ ナイロンメンブランに転写した。上記３．３．のＰＣＲ産物をプローブとして使用した。プローブ標識、ハイブリダイゼーション及び検出はECL Labelling and Detection System（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）の試薬及び方法を用いて行った。
結果を図６に示す。
cry4A、cry4B、cry10AのＰＣＲ産物をプローブとした場合、B282からバンドは検出されなかった。一方、cry11A、cyt1A、cyt2BのＰＣＲ産物をプローブとした場合、B282からバンドが検出された。しかし、検出されたバンドの大きさはイスラエレンシスのものとは大きく異なっていた。
イスラエレンシスが保持している殺虫タンパクの遺伝子をＢ２８２が保持しているかどうか検討し、プラスミドの構造を解析するため、各遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてサザンブロッテングを行った。
即ち、Ｂ２８２及びイスラエレンシスに由来する全プラスミドを、制限酵素APaL I又はNco Iで処理し、０．７％アガロース電気泳動で分離した。分離されたプラスミドＤＮＡを、０．４Ｍ ＮａＯＨ 転写バッファーを用いてHybond-N+ ナイロンメンブランに転写した。上記３．３．のＰＣＲ産物をプローブとして使用した。プローブ標識、ハイブリダイゼーション及び検出はECL Labelling and Detection System（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）の試薬及び方法を用いて行った。
結果を図６に示す。
cry4A、cry4B、cry10AのＰＣＲ産物をプローブとした場合、B282からバンドは検出されなかった。一方、cry11A、cyt1A、cyt2BのＰＣＲ産物をプローブとした場合、B282からバンドが検出された。しかし、検出されたバンドの大きさはイスラエレンシスのものとは大きく異なっていた。
以上より、イスラエレンシスが１つのプラスミドpBtoxis中に６種の殺虫タンパク質遺伝子(cry4A、cry4B、cry10A、cry11A、cyt1A、cyt2B)を保持しているのに対して、Ｂ２８２は、イスラエレンシスのcry11A、cyt1A、cyt2B様の殺虫タンパク質遺伝子を保持していること、該遺伝子をコードするＢ２８２プラスミドの構造がイスラエレンシスとは大きく異なることが示唆された。
３．５．Ｂ２８２由来cry11A、cyt1A又はcyt2B様殺虫タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列の解析
QIAGEN Plasmid Kit（QIAGEN）を用いてＢ２８２の全プラスミドを抽出・精製した。該プラスミドを鋳型とし、PCRにより各遺伝子を増幅し、増幅産物のヌクレオチド配列を決定した。使用したプライマーは以下の通りである。
cry11A様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-ATGGAAGATAGTTCTTTAGAT-3’（配列番号１０）
5’-CTACTTTAGTAACGGATT-3’（配列番号１１）
cyt1A様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-CCTCAATCAACAGCAAGGGTTATT-3’（配列番号１２）
5’-TGCAAACAGGACATTGTATGTGTAATT-3’（配列番号１３）
cyt2B様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-ATTACAAATTGCAAATGGTATTCC-3’（配列番号１４）
5’-TTTCAACATCCACAGTAATTTCAAATGC-3’（配列番号１５）
PCRの反応液組成、反応条件及び塩基配列決定法に関しては16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列解析に準じた。
QIAGEN Plasmid Kit（QIAGEN）を用いてＢ２８２の全プラスミドを抽出・精製した。該プラスミドを鋳型とし、PCRにより各遺伝子を増幅し、増幅産物のヌクレオチド配列を決定した。使用したプライマーは以下の通りである。
cry11A様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-ATGGAAGATAGTTCTTTAGAT-3’（配列番号１０）
5’-CTACTTTAGTAACGGATT-3’（配列番号１１）
cyt1A様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-CCTCAATCAACAGCAAGGGTTATT-3’（配列番号１２）
5’-TGCAAACAGGACATTGTATGTGTAATT-3’（配列番号１３）
cyt2B様遺伝子のためのプライマーセット：
5’-ATTACAAATTGCAAATGGTATTCC-3’（配列番号１４）
5’-TTTCAACATCCACAGTAATTTCAAATGC-3’（配列番号１５）
PCRの反応液組成、反応条件及び塩基配列決定法に関しては16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列解析に準じた。
cry11A様遺伝子、cyt1A様遺伝子及びcyt2B様遺伝子のＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列を配列番号１、３及び５に、該ヌクレオチド配列から導き出された推定アミノ酸配列を配列番号２、４及び６にそれぞれ示す。また、各ヌクレオチド配列とイスラエレンシス由来の配列との比較を表３〜５に示す。
Ｂ２８２のcry11A様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcry11A遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで99.3%、アミノ酸配列レベルで99.0%のホモロジーを有していた。
Ｂ２８２のcyt1A様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcyt1A遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで98.6%、アミノ酸配列レベルで95.7%のホモロジーを有していた。
Ｂ２８２のcyt2B様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcyt2B遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで99.7%、アミノ酸配列レベルで99.0%のホモロジーを有していた。
Ｂ２８２のcry11A様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcry11A遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで99.3%、アミノ酸配列レベルで99.0%のホモロジーを有していた。
Ｂ２８２のcyt1A様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcyt1A遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで98.6%、アミノ酸配列レベルで95.7%のホモロジーを有していた。
Ｂ２８２のcyt2B様遺伝子の増幅断片は、イスラエレンシスのcyt2B遺伝子と、ヌクレオチド配列レベルで99.7%、アミノ酸配列レベルで99.0%のホモロジーを有していた。
表３において、（１）はＢ２８２プラスミドを鋳型として用い、cry11A特異的プライマーで増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、（２）はイスラエレンシスcry11Aの対応するヌクレオチド配列を、それぞれ示す。
表４において、（１）はＢ２８２プラスミドを鋳型として用い、cyt1A特異的プライマーで増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、（２）はイスラエレンシスcyt1Aの対応するヌクレオチド配列を、それぞれ示す。
表５において、（１）はＢ２８２プラスミドを鋳型として用い、cyt2B特異的プライマーで増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、（２）はイスラエレンシスcyt2Bの対応するヌクレオチド配列を、それぞれ示す。なお、表５中のＢ２８２由来のヌクレオチド配列は、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の相補鎖の配列に該当する。
表４において、（１）はＢ２８２プラスミドを鋳型として用い、cyt1A特異的プライマーで増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、（２）はイスラエレンシスcyt1Aの対応するヌクレオチド配列を、それぞれ示す。
表５において、（１）はＢ２８２プラスミドを鋳型として用い、cyt2B特異的プライマーで増幅されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、（２）はイスラエレンシスcyt2Bの対応するヌクレオチド配列を、それぞれ示す。なお、表５中のＢ２８２由来のヌクレオチド配列は、配列番号５で表されるヌクレオチド配列の相補鎖の配列に該当する。
本発明のバシラス属細菌及びその封入体は、双翅目昆虫、特にイエカに対して強力な毒性を有しているので、双翅目昆虫用の殺虫剤として有用である。
配列番号８：16S rRNA遺伝子のためのプライマー
配列番号９：16S rRNA遺伝子のためのプライマー
配列番号１０：cry11Aのためのプライマー
配列番号１１：cry11Aのためのプライマー
配列番号１２：cyt1Aのためのプライマー
配列番号１３：cyt1Aのためのプライマー
配列番号１４：cyt2Bのためのプライマー
配列番号１５：cyt2Bのためのプライマー
配列番号９：16S rRNA遺伝子のためのプライマー
配列番号１０：cry11Aのためのプライマー
配列番号１１：cry11Aのためのプライマー
配列番号１２：cyt1Aのためのプライマー
配列番号１３：cyt1Aのためのプライマー
配列番号１４：cyt2Bのためのプライマー
配列番号１５：cyt2Bのためのプライマー
Claims (13)
- 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌。
- 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌の封入体。
- 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を含む組成物。
- 双翅目害虫用殺虫剤である、請求項３記載の組成物。
- 双翅目害虫がイエカである、請求項４記載の組成物。
- 双翅目害虫の幼虫の生息環境中に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９４９で表されるバシラス属細菌又はその封入体を適用することを含む、双翅目害虫の防除方法。
- 双翅目害虫がイエカである、請求項６記載の方法。
- 以下（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド又はその部分ペプチド：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - 請求項８記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項９記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１０記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 請求項８記載のポリペプチドに対する抗体。
- 請求項１２記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
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