JP2008046052A - 液体試料中のアルブミンを測定するための液状試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】尿などの液体試料中の微量アルブミンを特異的かつ簡便に、免疫学的測定法に匹敵するほどの感度で、そして、免疫学的測定法では測定できない変性アルブミン（免疫非応答性アルブミン）も含めて高感度に測定することのできる液状試薬を提供する。
【解決手段】液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬であって、化学式１で示される化学構造を有する指示薬と、ｐＨを１．０〜３．０に調整したクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、非イオン性界面活性剤と、を含ませた。

【選択図】なし

Description

本発明は、液体試料中のアルブミンを高感度かつ特異的に測定するための液状試薬に関する。

生体試料中の蛋白質を測定することは、病理学的診断において重要である。たとえば、肝臓機能が低下した場合には、血清アルブミンの量が減少する。一方、腎炎、ネフローゼ症候群、結石、腫瘍等の腎・尿路疾患の場合には、尿中の蛋白質の量が増加する。また、近年では、生活習慣病である糖尿病、肥満、高血圧、あるいは動脈硬化に起因する心筋梗塞や脳梗塞等の危険性のある患者においても、尿中のアルブミンの量が増加することが指摘されている。生活習慣病を改善する方法として、各種降圧剤を投与して効果があった場合は、尿中アルブミンが減少する。従って、尿中に微量に排泄されるアルブミンを高感度に、特異的に、簡便に、安価に測定することは、上記疾患の早期診断と治療方針の適切化、治療効果の判定のために、また、重篤な生活習慣病に進行させないための各個人の予防意識を向上させる動機付けに、重要な指標となっている。

高感度に尿中アルブミンを測定する目的のために、各種測定方法が開発されてきた。特に、近年、心筋梗塞や脳梗塞の発症リスクが高いメタボリックシンドローム（中心肥満症候群）の概念が提唱され、上記の糖尿病性腎症の尿中アルブミンの診断基準以下でもメタボリックシンドロームを発症していることが報告されており、さらに高感度な測定法が要求されている。

米国糖尿病学会は、糖尿病性腎症である微量アルブミン尿の診断基準は、２０mg／L（２ｍｇ／ｄＬ）以上、２００ｍｇ／Ｌ以下であると提唱している。この診断基準付近を正確に測定するために、測定法として２０ｍｇ／L（２ｍｇ／ｄＬ）以下が精度良く測定できる方法が要望される。その方法の最小検出感度は１〜５ｍｇ／Ｌ（０．１〜０．５ｍｇ／ｄＬ）まで測定できる必要がある。

アルブミンを含む尿中蛋白質のスクリーニング検査として、試験紙法が汎用されている。試験紙法では、主に蛋白質誤差法が用いられている。この方法は、ｐＨ指示薬として、たとえばテトラブロムフェノールブルー（ＴＢＰＢ）が用いられており、アルブミンの等電点付近でアルブミンのアミノ基があたかも塩基性を示し、ｐＨ指示薬であるＴＢＰＢを発色させる。試験紙法にするためには、ＴＢＰＢと緩衝剤を濾紙などに含浸乾燥させて、プラスチックフィルム片に貼付して尿蛋白測定用試験紙を作製し、スクリーニング用として広く用いられている。上記ｐＨ指示薬を用いた蛋白誤差法による試験紙法の最小検出感度は、１５０ｍｇ／Ｌ（１５ｍｇ／ｄＬ）で、感度的には不十分であった。

近年、蛋白誤差法を改良して尿中アルブミンを高感度に測定できる試験紙法が開発された。ｐＨ指示薬として、ビス（３’，３’’−ジヨード−４’，４’’−ジヒドロキシ−５’，５’’−ジニトロフェニル）−３，４，５，６−テトラブロモスルホフタレインを用いた試験紙法で、検出感度は１０ｍｇ／Ｌである。ＴＢＰＢ法よりも、約１０倍近く高感度化されているが、まだ感度が低い課題があった。

さらに、尿中アルブミンを高感度に測定できる蛋白結合法（疎水結合）を用いた試験紙法が開発された。アルブミン結合色素として、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨード−フルオレセイン二ナトリウム塩（慣用名：アシッドレッド９４、ローズベンガル）を用いた試験紙法で、検出感度は同様に１０ｍｇ／Ｌである。（特許文献１）

高感度かつ特異的に尿中微量アルブミンを測定する方法として、免疫比濁法や免疫ラテックス凝集法が一般に用いられている。これら免疫法は１ｍｇ／Ｌ（０．１ｍｇ／ｄＬ）まで測定できる高感度な方法であり、免疫反応であるためにアルブミンに特異性が高い方法である。しかし、アルブミン濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下で正常と判定された尿試料においても、電気泳動法や液体クロマトグラフィー法において、変性アルブミンやグロブリンが多数検出される例が存在するとの報告がある。免疫法で用いられる抗体は、人血清アルブミンの１つ分画を抗原にして作製されている。尿中に排泄されるアルブミンには変性アルブミン（立体構造が変化したもの、薬物やビリルビンが結合したもの、糖化やスルフォニル化したもの、側鎖が切断された低分子アルブミン等）が多く排泄されている。アルブミンの抗原認識部位（エピトープ）に各種化合物が結合したり、変性したアルブミン（免疫非応答性アルブミン）を本免疫法では測定することができないことが指摘されている（非特許文献１）。

国際公開ＷＯ２００４／０１５４２３号公報 Clinical Chemistry 50: 2286-2291, 2004. Characterization ofImmunochemically Nonreactive Urinary Albumin Tanya M. Osicka and Wayne D.Comper

尿中蛋白質のスクリーニング検査として多用されているＴＢＰＢを指示薬として用いた試験紙法の最小検出感度は１５ｍｇ／ｄＬで、米国糖尿病学会の微量アルブミン尿の診断基準である２０ｍｇ／Ｌ（２ｍｇ／ｄＬ）の低濃度付近のアルブミンを測定できない課題があった。当然、上記の診断基準を満足させるための最小検出感度：１〜５ｍｇ／Ｌ（０．１〜０．５ｍｇ／ｄＬ）付近では検出不可能か、又はその濃度差を定量的に識別できない。

非特許文献１に記載されているような、各種変性アルブミンを測定する方法として、液体クロマトグラフィー法や電気泳動法を用いて分離分析して測定する方法があるが、高価な特別な装置が必要であり、また操作が煩雑で実用向きではない。信頼性向上のために、各変性アルブミンに対する抗体を作製して混合抗体で免疫学的に測定することも考えられるが、さらに高コストになり、極めて現実性が無くなる。

そこで本発明は、尿などの液体試料中の微量アルブミンを特異的かつ簡便に、免疫学的測定法に匹敵するほどの感度で、そして、免疫法では測定できない変性アルブミン（免疫非応答性アルブミン）も含めて高感度に測定することのできる液状試薬を提供することを課題とする。

本発明は、下記化学式１または下記化学式２で示される化学構造を有する指示薬と、ｐＨを１．０〜３．０に調整したクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、非イオン性界面活性剤と、を含むことを特徴とする、液体試料中の微量アルブミンを特異的に測定するための液状試薬である。

本発明者らは鋭意研究の末、先述の特許文献１に記載のアルブミン高感度測定方法を改良し、さらに高感度に、さらにアルブミンに特異的である処方を見出し、本発明を完成させた。これにより、免疫学的測定法にも匹敵する感度を有しながら、より低濃度のアルブミンを特異的に測定できる。また、特許文献１に記載のアルブミン高感度測定方法は、蛋白質自体を染色することが原理であり、抗原認識部位の有無や性質にとらわれないために、本発明では免疫学的測定法では測定できない免疫非応答性アルブミンも測定することが可能となった。

また、本発明の液状試薬を用いる場合には、免疫非応答性アルブミンをも同時に測定するために、液体クロマトグラフィー法や電気泳動法を利用した高価で操作が煩雑な特別の装置が不要であり、本発明の液状試薬は指示薬として安価に入手可能な試薬を用いている。そのため、本発明の液状試薬は、安価かつ簡易にアルブミンを高感度で測定することができる。

本発明の液状試薬は、微量アルブミン測定用指示薬として、色素結合法で用いられるハロゲン化キサンテン系色素のうち、下記化学式３で示される化学構造を有するアシッドレッド９２（一般名：フロキシンＢ（Phloxine B））または下記化学式４で示されるアシッドレッド９４（一般名：ローズベンガル（Rose Bengal））を使用するものである。

本発明の液状試薬におけるアシッドレッド９２（上記化学式３）およびアシッドレッド９４（上記化学式４）の濃度は、測定対象である微量アルブミンの濃度によって変更可能であり、たとえば０．００５〜０．２ｍｍｏｌ／Lである。好ましくは、液状試薬に含有される指示薬の濃度は、０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Lとされる。

本発明の液状試薬はさらに、反応系のｐＨを１．０〜３．５の条件に調整することのできるクエン酸および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、非イオン性界面活性剤と、を含んでいる。

緩衝液としては、液状試薬に含有される指示薬がアシッドレッド９２（上記化学式３）である場合には、反応系のｐＨを２．５〜２．８とすることができるものを使用するのが好ましい。この場合、緩衝液としては、クエン酸緩衝液を使用するのが好ましい。

一方、液状試薬に含有される指示薬がアシッドレッド９４（上記化学式４）である場合には、緩衝液としては反応系のｐＨを２．２〜３．５とすることができるものを使用するのが好ましい。この場合、緩衝液としては、酢酸緩衝液を使用するのが好ましい。

液状試薬に含有される緩衝液の濃度は、たとえば０．０１〜０．５ｍｏｌ／Lとされ、好ましくは０．０５ｍｏｌ／Lとされる。

液状試薬に含有される非イオン性界面活性剤は、指示薬であるアシッドレッド９２およびアシッドレッド９４の溶解性を向上させるためのものである。非イオン性界面活性剤としては、指示薬とアルブミンとの反応性を阻害させないものを使用するのが好ましく、ポリオキシオクチルフェニルエーテルシリーズ（エトオキシル基が７〜７０）が好ましく使用され、一般名Triton X-100（Union Carbide Chemicals and Plastic Co.の登録商標）として市販されているポリオキシ（１０）オクチルフェニルエーテルを使用することで、よりアルブミンに対する特異性を上げることができる。液状試薬における非イオン性界面活性剤の濃度は、たとえば０．０１〜１．０％とされ、最適濃度は０．１〜０．５％である。

本発明による液状試薬は、基本的に、一液系の形態でも、二液系の形態でも、好ましく使用できる。二液系の形態の場合、指示薬（アシッドレッド９２又はアシッドレッド９４）と非イオン性界面活性剤が、別個の溶液（Ｒ１試薬およびＲ２試薬）として独立して存在させられる。液体試料にＲ１試薬を加え混合して吸光度（Ａ）を測定して、次にＲ２試薬を添加して混合して吸光度（Ｂ）を測定して、（Ｂ）−[（Ａ）×容量係数]より検体盲検を差し引いた測定値を得ることができる。

ここで、Ｒ１試薬は、非イオン性界面活性剤と、クエン酸緩衝液および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、を含んだものとされる。

一方、Ｒ２試薬は、指示薬（アシッドレッド９２又はアシッドレッド９４）と、クエン酸緩衝液および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、を含んだものとされる。

Ｒ１試薬における非イオン性界面活性剤および緩衝液の濃度は、Ｒ２試薬と混合したときの最終濃度が先に説明した濃度範囲となるように設定される。たとえば、非イオン性界面活性剤の最終濃度は０．０１〜１．０％とされ、指示薬の最終濃度は０．００５〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌとされ、緩衝液の最終濃度は０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌとされる。

二液系として調製した液状試薬は、非イオン界面活性剤及び緩衝液を含むＲ１試薬と指示薬及び緩衝液を含むＲ２試薬を、予め、混合して一液系として使用することができる。この場合には検体盲検は測定できないが、試薬盲検で代用することができる。

二液系として調製した液状試薬を二液系として使用する場合および一液系として使用する場合における測定方法の一例を示すと、表１の通りとなる。ここで、表１において、たとえば吸光度測定ＡはＲ１試薬２００μＬに尿試料３０μＬを添加して吸光度を測定する場合を示しており、吸光度測定Ｂは吸光度測定Ａに使用した尿試料とＲ１試薬との混合液にＲ２試薬１００μＬ添加して吸光度を測定する場合を示している。表１に関しては、吸光度測定Ｃ〜Ｉについても吸光度測定Ａ，Ｂと同様な見方をするものとする。ここで、表１の吸光度測定Ａは、Ｒ１試薬を検体盲検として使用する場合に相当している。なお、本測定方法は一例であって、自動分析装置の種類や測定対象の試料の種類によって、試料量やＲ１試薬、Ｒ２試薬の量は適宜変更して使用することができる。

本発明の液状試薬は、尿、血液、髄液、唾液、涙液、胃液、およびアルブミン含有液（例えば、輸液、組織抽出液、蛋白精製液、食品等）などの液状試料中のアルブミン濃度を測定するために使用することができ、液体試料が尿検体である場合に特に有用である。

次に、本発明を、以下の実施例により説明する。なお、本発明は、下記の実施例に制限されない。また、以下の実施例における指示薬（アシッドレッド９２又はアシッドレッド９４）の濃度は、１００ｍｇ／ｄＬのアルブミンを測定できる濃度である、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌに設定した。その理由は、早期腎症や動脈血管の障害を検出するには、糖尿病性腎症の診断基準２ｍｇ／ｄＬが重要で、１００ｍｇ／ｄＬ以上は顕性腎症で重篤な状態になっているので、これ以上の濃度を測定するのは意味が無いからである。

本実施例では、指示薬としてアシッドレッド９２およびアシッドレッド９４を用いる場合において、緩衝液の種類の最適化を行なう前に、液状試薬における緩衝液のｐＨがアルブミンとの反応性に与える影響について検討した。

液状試薬に含有させる緩衝液としては酒石酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を用い、ｐＨは２．３〜３．５とし、アルブミンに対する反応性を確認した。アルブミンに対する反応性は、液体試料として、人血清アルブミン、α，β−グロブリン、およびγ−グロブリンの３種について、それぞれ２０ｍｇ／ｄＬ水溶液を用い、吸光度を測定することにより確認した。吸光度の測定結果については、アルブミンの吸光度を１００％としたときの各グロブリンの吸光度の相対値（％）として反応性を評価し、アシッドレッド９２については表２に、アシッドレッド９４については表３にそれぞれ示した。

表２に示すように、指示薬としてアシッドレッド９２を用いた場合には、ｐＨ２．５およびｐＨ２．８でアルブミンへの反応性が高く、グロブリンに対する反応性が低いことが分かった。

表３に示すように、指示薬としてアシッドレッド９４を用いる場合には、ｐＨ２．２からｐＨ３．５の範囲でアルブミンへの反応性が高く、グロブリンに対する反応性が低いことが分かった。

本実施例では、指示薬としてアシッドレッド９２およびアシッドレッド９４を用いる場合において、緩衝液の種類がアルブミンとの反応性に与える影響について検討した。

指示薬としてアシッドレッド９２を用いる場合には、緩衝液として、クエン酸、酒石酸、フタル酸、およびグリシンの各緩衝液を０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．８に調整したものを用いた。各緩衝液を用いた場合の反応性は、人血清アルブミン、α，β−グロブリン、およびγ−グロブリンの３種について、それぞれ２０ｍｇ／ｄＬ水溶液を用い、実施例１と同様にして吸光度を測定することにより確認した。吸光度の測定結果については、アルブミンの吸光度を１００％としたときの各グロブリンの吸光度の相対値（％）として反応性を評価し、表４に示した。

表４から分かるように、クエン酸（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐH２．８）が、最もアルブミンに対する吸光度が高く、かつグロブリンとの反応性が低く、アルブミンに特異的であった。

一方、指示薬としてアシッドレッド９４を用いる場合には、緩衝液として、クエン酸、酢酸、ギ酸、およびグリシンの各緩衝液を０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．８に調整したものを用いた。各緩衝液を用いた場合の反応性は、人血清アルブミン、α，β−グロブリン、およびγ−グロブリンの３種について、それぞれ２０ｍｇ／ｄＬ水溶液を用い、実施例１と同様にして吸光度を測定することにより確認した。吸光度の測定結果については、アルブミンの吸光度を１００％としたときの各グロブリンの吸光度の相対値（％）として反応性を評価し、表５に示した。

表４から分かるように、緩衝液としてクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．８）およびグリシン緩衝液を用いた場合に、グロブリンとの反応性が低く、アルブミンに特異的であった。これらの緩衝液のうち、酢酸緩衝液が最もアルブミンに対する吸光度が高く、この点からは、アシッドレッド９４を用いる場合の緩衝液としては、酢酸を用いるのが好ましいことが分かる。

本実施例では、指示薬としてアシッドレッド９２を用いる場合において、非イオン界面活性剤の種類が、アルブミンとの反応性に与える影響について検討した。

本実施例においては、液状試薬として、アシッドレッド９２（０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ）、クエン酸緩衝液（ｐＨ２．８、０．０５ｍｏｌ／Ｌ）、および非イオン界面活性剤（０．１％）を含むものを使用した。非イオン界面活性剤としては、アシッドレッド９２を溶解するために、また指示薬であるアシッドレッド９２とアルブミンの結合物の溶解性を確保するために必要で、アルブミンとアシッドレッド９２の反応性を阻害させない非イオン性界面活性剤である、一般名Triton X-100（Union Carbide Chemicals and Plastic Co.の登録商標）および一般名Brij35として市販されているポリオキシエチレンラウリルエーテルを使用した。

アルブミンとの反応性は、人血清アルブミン、α，β−グロブリン、およびγ−グロブリンの３種について、それぞれ２０ｍｇ／ｄＬ水溶液を用い、実施例１と同様にして吸光度を測定することにより確認した。吸光度の測定結果については、アルブミンの吸光度を１００％としたときの各グロブリンの吸光度の相対値（％）として反応性を評価し、表６に示した。

表６に示すように、非イオン界面活性剤として、一般名Triton X-100（Union Carbide Chemicals and Plastic Co.の登録商標）として市販されているポリオキシ（１０）オクチルフェニルエーテルを用いた場合には、一般名Brij35として市販されているポリオキシエチレンラウリルエーテルを用いた場合と比較して、アルブミンに対する反応性は同等であるが、グロブリンとの反応性が低くいことが分かった。

本実施例では、アシッドレッド９２またはアシッドレッド９４を用いた液状試薬の処方における自動分析装置での定量特性を、同時再現性として評価した。この評価においては、自動分析装置として、株式会社日立ハイテクノロジーズ製の自動分析装置７１７０を用いた。同時再現性は、アルブミン溶液として、アルブミン濃度が１０ｍｇ／ｄＬ、３０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬおよび１００ｍｇ／ｄＬになるように調製し、それぞれのアルブミン溶液を試料として、２０回の同時再現性から、変動係数として評価した。

（二液系の測定条件）
指示薬としてアシッドレッド９２を用いる定量法の場合、まず試料（アルブミン溶液）３０μＬと、０．１％TritonＸ-100を含むクエン酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．８）２００μＬとを混合し、この混合液を３７度にて５分間インキュベートした。先の自動分析装置を用いて、主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで試薬盲検を対照に吸光度を測定し、検体盲検とした。続いて、先の混合液と、アシッドレッド９２（０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含むクエン酸緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．８）１００μＬとを混合し、３７度にて５分間インキュベートし、試料発色液を調製した。この試料発色液について、同様に自動分析装置を用いて、主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍで試薬盲検を対照に吸光度を測定した。別途検定された１００ｍｇ／ｄＬアルブミン標準液についても同様の操作を行い、その標準液の吸光度で試料発色液の吸光度を除し、１００ｍｇ／ｄＬを乗じてアルブミン濃度を求めた。各濃度の試料溶液におけるアルブミン濃度の測定結果は、表７に示した。表７には、２０回測定の平均値と標準偏差および変動係数を同時に示した。

表７に示したように、上記処方の液体試料を用いた場合、各種濃度の試料溶液において変動係数が０．２〜０．８％と極めて良好であり、同時再現性に優れていることが分かった。また、表７に示した結果より、指示薬としてアシッドレッド９２を用いる場合の測定値は、１０〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲で原点を通る直線性を示すことが分かる。

本発明者らはさらに、データは示さないが、アシッドレッド９２でのアルブミンの最小検出感度について、１００mg／ｄＬのアルブミン標準液を精製水で段階希釈し、精製水の再現性の＋２標準偏差と最低のアルブミン濃度の再現性の−２標準偏差が交差しない濃度として求めた。その結果、アルブミンの最小検出感度は０．５ｍｇ／ｄＬ（５ｍｇ／Ｌ）であった。故に、アシッドレッド９２を用いた本発明の液体指示薬は、０．５〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲までアルブミン濃度を測定可能で、低濃度から高濃度まで広範囲に、精度良くアルブミン濃度を測定できることか分かった。

一方、指示薬としてアシッドレッド９４を用いる場合には、緩衝液として酢酸緩衝液を用いた以外はアシッドレッド９２と同様にして、アルブミン標準液を精製水で段階希釈して、アルブミン濃度を測定した。この条件でのアルブミン濃度の最小検出感度をアシッドレッド９２と同様にして求めたところ、アルブミン濃度の最小検出感度が０．１２５ｍｇ／ｄＬ（１．２５ｍｇ／Ｌ）であった。また、アシッドレッド９４を用いた本発明の液状試薬は、アルブミン濃度の測定結果における直線性がアシッドレッド９２の場合と同様に良好なものであった。故に、アシッドレッド９４を用いた本発明の液体指示薬は、０．１２５〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲までアルブミン濃度を測定可能で、低濃度から高濃度まで広範囲に、精度良くアルブミン濃度を測定できることか分かった。

以上より、本発明の液状試薬は、低濃度から高濃度までアルブミン濃度を測定する場合の変動係数で１％以下であり、極めて良好な再現性が得られ、臨床の現場で使用可能である。

本発明の液状試薬の最小検出感度は、０．１２５〜０．５ｍｇ／ｄＬであり、糖尿病性腎症の診断基準から要望される最小検出感度の０．１〜０．５ｍｇ／ｄＬをクリアしており、免疫法と同等の感度を有することが確認できた。

本発明は、生体試料などの液体試料中の微量アルブミンを色素結合法の原理を用いて、高感度に、アルブミンに特異的に、低コストで、簡便に測定でき、免疫学的測定法に匹敵する性能を有する液状試薬である。

Claims (14)

1. 液体試料中の微量アルブミンを測定するための液状試薬であって、
   下記化学式１または下記化学式２で示される化学構造を有する指示薬と、
   ｐＨを１．０〜３．５に調製したクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液のうちの少なくとも一方の緩衝液と、
   非イオン性界面活性剤と、
   を含むことを特徴とする、液体試料中の微量アルブミンを特異的に測定するための液状試薬。
   

   

   
2. 液状試薬に含有される指示薬の濃度が、０．００５〜０．２ｍｍｏｌ／Lである、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
3. 液状試薬に含有される指示薬の濃度が、０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／Lである、特許請求の範囲第２項に記載の液状試薬。
4. 液状試薬に含有される指示薬が、上記化学式１に記載したものであり、
   液状試薬のｐＨ条件が、２．５〜２．８である、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
5. 液状試薬に含有される緩衝液が、クエン酸緩衝液である、特許請求の範囲第４項に記載の液状試薬。
6. 液状試薬に含有される指示薬が、上記化学式２に記載したものであり、
   液状試薬のｐＨ条件が、２．２〜３．５である、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
7. 液状試薬に含有される緩衝液が、酢酸緩衝液である、特許請求の範囲第６項に記載の液状試薬。
8. 液状試薬に含有される緩衝液の濃度が、０．０１〜０．５ｍｏｌ／Lである、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
9. 液状試薬に含有される非イオン性界面活性剤が、ポリオキシオクチルフェニルエーテルシリーズ（エトオキシル基が７〜７０）である、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
10. 液状試薬に含有される非イオン性界面活性剤が、ポリオキシ（１０）オクチルフェニルエーテル（商品名：Triton
    X-100）である、特許請求の範囲第９項に記載の液状試薬。
11. 液状試薬に含有される非イオン性界面活性剤の濃度が、０．０１〜１．０％である、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
12. 指示薬と非イオン性界面活性剤が別個の溶液（Ｒ１試薬およびＲ２試薬）として独立して存在し、検体盲検を測定することができることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
13. 指示薬と非イオン性界面活性剤が同一の試薬として測定できることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。
14. 液体試料が、尿、血液、髄液、唾液、涙液、胃液、およびアルブミン含有液（たとえば輸液、組織抽出液、蛋白精製液、食品等）である、特許請求の範囲第１項に記載の液状試薬。