JP2008039918A - 顕微鏡光学系および顕微鏡観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、広視野観察と高倍率観察とを切り替えて行うことを可能とする。
【解決手段】観察対象Ｂからの光を集光する対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光された光を検出装置１０に結像させる結像レンズ９と、これら対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱可能に設けられた正パワーを有する補助光学系１１とを備える顕微鏡光学系１を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡光学系および顕微鏡観察方法に関し、特に、実験小動物等の体内を生きたまま観察するための顕微鏡光学系および観察方法に関するものである。

従来、対物レンズの視野中心を拡大することにより、対物レンズを交換することなく低倍での広い視野と、高倍での高解像の観察とを可能とする顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００２−３１７５８号公報

実験小動物等の体内を生きたまま観察するためには、実験小動物等をなるべく傷つけないように小さく切開し、できるだけ細径の対物レンズを挿入することが必要である。
しかしながら、対物レンズを細径にすると、視野が狭くなるため、単に、特許文献１のように拡大光学系を対物レンズの後段に挿入しても、広視野の観察を行うことはできないという不都合がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、広視野観察と高倍率観察とを切り替えて行うことができる顕微鏡光学系および観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、観察対象からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された光を検出装置に結像させる結像レンズと、これら対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられた正パワーを有する補助光学系とを備える顕微鏡光学系を提供する。
本発明によれば、対物レンズと結像レンズとの間の光路に補助光学系を挿入して広視野観察を行い、補助光学系を離脱させて拡大観察を行うことが可能となる。補助光学系は正パワーを有しているので、対物レンズの作動距離が変化するが、作動距離の調節を行うことにより、細径の対物レンズを用いても、その対物レンズを切り替えることなく広視野観察と拡大観察とを切り替えて行うことが可能となる。

上記発明においては、前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱される平行平板を備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱されるガリレオ型のアフォーカル光学系を備えることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱されるケプラー型のアフォーカル光学系を備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記補助光学系とともに対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱される逆ガリレオ型のアフォーカル光学系を備えることとしてもよい。
このようにすることで、像側の瞳位置を動かさないように設計することができる。

また、上記発明においては、前記補助光学系の挿脱により反転する像を補正する反転補正手段を備えることとしてもよい。
反転補正手段の作動により、補助光学系を挿脱しても像が反転することが防止され、像が反転することにより注目部位を見失う等の不都合の発生を防止することができる。

また、上記発明においては、前記補助光学系の挿脱による作動距離の変化を補正する作動距離補正手段を備えることとしてもよい。
作動距離補正手段の作動により、補助光学系の挿脱による作動距離の変化を自動的に補正することができ、ピントの合った鮮明な広視野観察画像および拡大観察画像を取得することができる。

また、上記発明においては、取得される画像上において像の中心位置を示す中心位置表示手段が、前記補助光学系に設けられていることとしてもよい。
このようにすることで、中心位置表示手段の作動により、像の中心位置を画像上において表示することができる。したがって、補助光学系が光路に挿入されることにより、広視野観察が行われる際に、中心位置表示手段により像の中心位置を表示することで、注目部位を画像中心に容易に配置することができる。

また、上記発明においては、対物レンズと試料との間に液体を供給する注液手段を備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズと試料とを近接させた拡大観察を行う際に、対物レンズと試料との間に液体を介在させて観察を行うことができる。

また、上記発明においては、対物レンズを含む光学系を光軸方向に移動可能に支持する移動機構を備え、該移動機構が、前記補助光学系の挿脱による作動距離の変化量に一致する距離に前記光学系の移動範囲を制限するストッパを備えることとしてもよい。
このようにすることで、補助光学系の挿脱により作動距離が変化したときに、移動機構の作動により、対物レンズを含む光学系を光軸方向に移動させることで、作動距離の変化を補正することができる。この場合に、移動機構による光学系の移動範囲がストッパにより制限されているので、ストッパにより停止されるまで光学系を移動させるだけで、広視野観察および拡大観察のいずれにおいても、簡易に作動距離の変化の補正を行うことができる。

また、上記発明においては、前記補助光学系が以下の条件式を満足するように配置されていることとしてもよい。
０．０１０８（ｍｍ）≦［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］≦６７５（ｍｍ）
ここで、［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］はＦ_ＯＢ′とＦ_ＳＵＢとの間の距離、Ｆ_ＯＢ′は、対物レンズの像側焦点Ｆ_ＳＵＢは、補助光学系の物体側焦点である。
このようにすることで、試料としての実験動物の種類に応じて異なる作動距離に対応して、補助光学系の挿脱により広視野観察と拡大観察とを行うことができる。

また、本発明は上記いずれかの顕微鏡光学系を用いた観察方法であって、対物レンズと結像レンズとの間に補助光学系を挿入して広視野観察を行うステップと、該広視野観察において、試料の観察位置に像の中心位置を合わせるステップと、補助光学系を対物レンズと結像レンズとの間から離脱させるステップと、前記補助光学系の離脱による作動距離の変化量だけ前記顕微鏡光学系と試料とを相対的に移動させるステップと、拡大観察を行うステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。

また、本発明は上記いずれかの顕微鏡光学系を用いた観察方法であって、対物レンズと結像レンズとの間に補助光学系を挿入して広視野観察を行うステップと、該広視野観察において、試料の観察位置に像の中心位置を合わせるステップと、補助光学系を対物レンズと結像レンズとの間から離脱させるステップと、前記補助光学系の離脱による作動距離の変化量だけ前記顕微鏡光学系と試料とを相対的に移動させるステップと、対物レンズと試料との間に液体を供給するステップと、拡大観察を行うステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。

上記発明においては、前記対物レンズが、試料からの光を集光して略平行光にする第１群と、略平行光にされた光を集光して中間像を結像させる第２群と、中間像を結像した光を集光して略平行光に変換する第３群とを備えることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの先端の径寸法を細径化することができ、実験小動物等の試料を低侵襲で生きたままの状態で容易に観察することができる。

本発明によれば、対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、広視野観察と高倍率観察とを切り替えて行うことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡光学系１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡光学系１は、図１に示される顕微鏡装置２に備えられる。
顕微鏡装置２は、試料Ａである実験小動物を搭載するステージ３と、本実施形態に係る顕微鏡光学系１と、該顕微鏡光学系１をステージ３に対して上下方向に移動させる移動機構４とを備えている。移動機構４は、ステージ３から鉛直方向に延びる支柱５と、支柱５に対して上下方向に移動可能に設けられたスライダ６とを備えている。スライダ６はハンドル７の操作により、ステージ３に対して上下方向に移動させられるようになっている。スライダ６には顕微鏡光学系１が取り付けられている。

本実施形態に係る顕微鏡光学系１は、試料Ａである実験小動物に設けられた切開部から体内に挿入される細径先端部８ａを備え、臓器等の観察対象部位Ｂからの光を集光する対物レンズ８と、対物レンズ８により集光された光を集光して結像させる結像レンズ９と、該結像レンズ９による結像位置に撮像面１０ａを配置したＣＣＤ等の撮像素子１０と、前記対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱可能に設けられた補助光学系１１とを備えている。撮像素子１０には撮像素子ドライバ１２を介してモニタ等の表示装置１３（以下、モニタ１３とも言う。）が接続されている。

対物レンズ８は、第１群Ｇ_１と、第２群Ｇ_２と、第３群Ｇ_３とを備えている。特に、図２に示される拡大観察時において、第１群Ｇ_１は、試料Ａの観察対象部位Ｂ上の一点からの光を集光して略平行光にするようになっている。第２群Ｇ_２は、略平行光にされた光を集光して中間像を結像させるようになっている。第３群Ｇ_３は、中間像を結像した光を集光して略平行光に変換するようになっている。これにより、光束径を細く保持しつつ伝播することができ、細径先端部８ａの外径寸法を小さく抑えることができる。対物レンズ８は顕微鏡光学系１の最下端に鉛直方向に光軸を向けて配置されている。

本実施形態においては、前記補助光学系１１は、所定の正パワーを有するレンズである。このため、補助光学系１１が対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入された場合と、補助光学系１１が光路から離脱させられた場合とを比較すると、図１および図２に示されるように、結像関係が変化するようになっている。図においては、光束をその軸上マージナル光線により示している。

図１に示されるように、補助光学系１１が挿入された状態では、作動距離が大きくなり、図３に示されるように、対物レンズ８の先端から作動距離ＷＤ_１だけ離れた位置に合焦されるようになっている。一方、図２に示されるように、補助光学系１１が離脱された状態では、作動距離が小さくなり、対物レンズ８の先端から作動距離ＷＤ_２だけ離れた位置に合焦されるようになっている。したがって、補助光学系１１の挿脱による作動距離の変化量Ｚ_ＷＤ＝ＷＤ_１−ＷＤ_２だけ、スライダ６を上下方向に移動させて顕微鏡光学系１をその光軸方向に移動させることにより、それぞれの結像状態において合焦を図ることができる。

そして、このように異なる結像状態の下では、観察画像の倍率が変化する。図１に示されるように作動距離ＷＤ_１の大きな結像状態では倍率が低く視野が広い広視野観察を行うことができる。一方、図２に示されるように、作動距離ＷＤ_２の小さい結像状態では倍率が高く視野が狭い拡大観察を行うことができるようになっている。

また、本実施形態においては、補助光学系１１に中心位置表示手段１４が備えられている。中心位置表示手段１４は、例えば、結像位置近傍に配置され、光軸において交差する十字線からなるマーカである。したがって、補助光学系１１が光路に挿入されたときには、図１に示されるように、モニタ１３における表示画像中に中心位置表示手段１４が十字線として表示され、画像の中心位置に配置される観察対象部位Ｂを簡単に特定することができるようになっている（以下、十字線１４とも言う。）。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡光学系１を備える顕微鏡装置２を用いた観察方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡光学系１を備えた顕微鏡装置２を用いて試料Ａである実験小動物の体内を生きたままの状態で観察するには、例えば、ステージ３に搭載された試料Ａの腹部を切開して、対物レンズ８の細径先端部８ａを切開部に挿入する。このとき、切開部から空気を送り込んで腹腔を膨らませた状態とする。

次いで、補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入し、図示しない光源を作動させて、腹腔内を照明する。これにより、光源からの照明光の観察対象部位Ｂの表面における反射光が対物レンズ８により集光され、補助光学系１１および結像レンズ９を介して撮像素子１０に入射される。撮像素子１０から出力された画像情報は撮像素子ドライバ１２を介してモニタ１３に表示される。観察者は、モニタ１３の表示を見ながら、ハンドル７を操作してスライダ６を上下方向に移動させ、合焦位置を見つける。

これにより、顕微鏡光学系１の焦点位置が臓器等の観察対象部位Ｂの表面に一致すると、該観察対象部位Ｂの像が撮像素子１０の撮像面１０ａに結像され、図１に示されるように、観察対象部位Ｂの広視野観察画像がモニタ１３に表示されるようになる。このとき、十字線１４がモニタ１３上に同時に表示されているので、観察者はステージ３を操作して試料Ａを水平方向に移動させることにより、観察対象部位Ｂの内の拡大観察を行いたい領域がモニタ１３の中心位置に配されるように調節する。

そして、拡大観察を行いたい領域がモニタ１３の中心位置に配置された後に、補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路から離脱させる。これにより、結像関係が変化するためモニタ１３上の画像はピントがずれたものとなる。そこで、観察者は、ハンドル７を操作して、スライダ６を下降させることにより、対物レンズ８の先端を臓器等の観察対象部位Ｂの表面に近接させていく。

これにより、その移動の途中において、顕微鏡光学系１の焦点位置が観察対象部位Ｂの表面に一致する。その結果、図２に示されるように、観察対象部位Ｂの像が撮像素子１０の撮像面１０ａに結像され、観察対象部位Ｂの拡大観察画像がモニタ１３に表示されるようになる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡光学系１によれば、正パワーを有する補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱するだけで、結像関係を切り替えて、倍率の異なる２種類の観察方法、すなわち、広視野観察と拡大観察とを行うことができる。この場合において、本実施形態によれば、対物レンズ８を交換することなく倍率を変更するので、試料Ａである実験小動物の切開部に対物レンズ８の細径先端部８ａを挿入したままの状態で、観察方法を切り替えることができる。したがって、広視野観察において特定した注目部位をモニタ１３上の画像中心に設定したままの状態で倍率を切り替えて拡大観察することができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡光学系１によれば、結像関係を変更することで倍率を切り替えるものであるため、従来のように対物レンズ８の後段に拡大光学系を挿脱する方法のものと比較して、対物レンズ８を細径化しても、拡大観察における高倍率と、広視野観察における広い視野とを確保することができる。したがって、試料Ａに設ける切開部を小さくすることができ、低侵襲で試料Ａにかかる負担を軽減し、試料Ａの健全な状態を維持しながら生きたままの観察を行うことができるという利点がある。

なお、本実施形態において、補助光学系１１の挿脱位置は、以下の関係式（１）を満足するように設定されることが好ましい。
０．０１０８（ｍｍ）≦［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］≦６７５（ｍｍ） （１）
ここで、［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］はＦ_ＯＢ′とＦ_ＳＵＢとの間の距離、
Ｆ_ＯＢ′は、対物レンズの像側焦点、
Ｆ_ＳＵＢは、補助光学系の物体側焦点
である。

この関係式（１）について、図３および図４を参照して説明する。
図４は、広視野観察時における対物レンズ周辺部における光線の詳細を示す図である。図４中、符号ＯＢは対物レンズ８、符号ＳＵＢは補助光学系１１を示している。ここでの対物レンズ８は、拡大観察時においては物体面が物体側焦点に一致する、いわゆる無限遠型対物レンズとして作用し、広視野観察時においては物体面が物体側焦点よりも遠くに位置する、いわゆる有限遠型対物レンズとして作用するものである。

また、図１における対物レンズ８が、第１群Ｇ_１、第２群Ｇ_２および第３群Ｇ_３の３つの群よりなるのに対して、図４における対物レンズ８は１枚のレンズのみよりなるものとして描かれているが、これは単に前記３つの群を１枚のレンズに置き換えたものであり、以下に論じる距離［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］ の好ましい値を求めるに際して、図４のような簡略化は何ら問題ない。

図４における光軸方向の座標は、物体から像に向かう方向を正とする。広視野観察時の物体面はＯＢＪ_ＭＡで示され、焦点Ｆ_ＯＢから距離Ｘ（＜０）に位置する。
広視野観察時の対物レンズ８による一次結像面はＩＭＧ_ＭＡ１で示され、焦点Ｆ_ＯＢ′から距離Ｘ′（＞０）に位置する。この一次結像面ＩＭＧ_ＭＡ１は、補助光学系の物体側焦点Ｆ_ＳＵＢ上に位置し、物体からの光線は補助光学系ＳＵＢによって平行光線になり、不図示の結像レンズによって結像する。

ここで、対物レンズ８の好ましい焦点距離の範囲を求める。対物レンズの焦点距離をｆ_ＯＢ、結像レンズの焦点距離をｆ_ＴＬ、光学倍率をβとすると、次式が成り立つ。
ｆ_ＯＢ＝ｆ_ＴＬ／β
生物の組織や細胞の観察に適した倍率は、β＝４〜１００である。ここで、焦点距離ｆ_ＴＬ＝１８０（ｍｍ）とすると、 焦点距離ｆ_ＯＢ＝４５〜１．８（ｍｍ）となる。

図３は、広視野観察時の作動距離ＷＤ_１と、拡大観察時の作動距離ＷＤ_２との関係を示す図である。ここで、拡大観察における課題のひとつは、観察対象が生きた動物の体内であるために、細胞レベルの構造を安定的に観察するためには、観察部位の動きを抑制する必要がある、という点にある。この動きを抑制するには、あらかじめ対物レンズ８の作動距離ＷＤ_２を小さく設計し、観察時には対物レンズ８の先端側端面を観察部位に押し当てるのが効果的である。具体的には、０．０１≦ＷＤ_２≦０．３（ｍｍ）の値が好ましい。

一方、広視野観察における課題のひとつは、種々の実験動物に対して、それらの体の大きさに適した作動距離をもって観察する必要がある、という点にある。具体的には、代表的な実験動物において、その腹腔内に気体を注入して膨らませ、内部の臓器を広視野観察する場合に、作動距離ＷＤ_１としては以下の値が好ましい。
ブタ：６０〜３００ｍｍ
イヌ：２０〜１００ｍｍ
ウサギ：１０〜５０ｍｍ
ラット：５〜２５ｍｍ
マウス：３〜１５ｍｍ

一方、前述のように、広視野観察時の作動距離ＷＤ_１、拡大観察時の作動距離ＷＤ_２、および作動距離の変化量Ｚ_ＷＤには、Ｚ_ＷＤ＝ＷＤ_１−ＷＤ_２の関係がある。さらに、上記作動距離ＷＤ_１，ＷＤ_２の好ましい値を比較すると、ＷＤ_１≧ＷＤ_２であると言える。したがって、以下においてはＺ_ＷＤ≒ＷＤ_１として説明する。

図４において、距離Ｘ，Ｘ’、および焦点距離ｆ_ＯＢの間には、ニュートンの公式により次の式が成り立つ。
Ｘ・Ｘ′＝−ｆ_ＯＢ ^２
また、次の式も成り立つ。
｜Ｘ｜＝Ｚ_ＷＤ≒ＷＤ_１

以上の２式より、
ＷＤ_１≒Ｚ_ＷＤ＝｜Ｘ｜＝｜−ｆ_ＯＢ ^２／Ｘ′｜＝｜ｆ_ＯＢ ^２／Ｘ′｜
∴Ｘ′≒ｆ_ＯＢ ^２／ＷＤ_１ （ただし、Ｘ′＞０の場合）
となる。
この式に、前記ｆ_ＯＢおよび ＷＤ_１の好ましい値を代入することにより、以下のようにＸ′の好ましい値の範囲が求まる。

すなわち、上記表におけるＸ′の最小値０．０１０８（ｍｍ）から最大値６７５（ｍｍ）までが、Ｘ′の好ましい範囲であり、またＸ′は前記［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］に他ならないから、
０．０１０８（ｍｍ）≦［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］≦６７５（ｍｍ）
が求められる。

また、本実施形態においては、観察者がハンドル７を操作することによりスライダ６を上下方向に作動距離ＷＤの変化量Ｚ_ＷＤ分だけ移動させて２つの観察方法における合焦を図ることとしたが、上述したように、挿脱する補助光学系１１によって作動距離ＷＤの変化量Ｚ_ＷＤは予め定まっているので、図５および図６に示されるように、スライダ６上に、顕微鏡光学系１を上下に移動させる第２のスライダ１５を設け、スライダ６上における第２のスライダ１５の移動範囲を作動距離ＷＤの変化量Ｚ_ＷＤに一致する範囲に制限するストッパ１６を設けておくこととしてもよい。図中、符号１７は、第２のスライダ１５を上下方向に移動させるためのハンドルである。また、符号１８は、補助光学系１１を挿脱するための取手である。

このように構成することで、補助光学系１１の挿脱により観察方法を切り替えた際に、第２のスライダ１５をストッパ１６に突き当たる位置まで移動させるだけで、作動距離ＷＤの変化を簡単に補正することができ、広視野観察で特定した注目部位のピントの合った鮮明な拡大画像を迅速にモニタ１３に表示させることができる。

さらに、図７および図８に示されるように、第２のスライダ１５上を上下方向に移動可能な第３のスライダ１９を設け、対物レンズ８および補助光学系１１を第２のスライダ１５に支持させ、結像レンズ９および撮像素子１０を第３のスライダ１９に支持させることとしてもよい。この場合、上記と同様に、第２のスライダ１５に対する第３のスライダ１９の移動範囲を制限するストッパ２０を設けておくことが好ましい。
図中、符号２１は、第３のスライダ１９を上下方向に移動させるためのハンドルである。

補助光学系１１の挿脱により結像状態が変化し、同時に、像側の瞳位置が変動する。像側の瞳位置が変動すると、撮像素子１０への入射角度が変動するので、これを防止することが好ましい。第３のスライダ１９の作動により、像側の瞳位置の変動を防止することができ、それによって、観察方法の切替えによる画像の明るさの変動あるいは画像上における明るさのムラの発生、特に画像周辺部における明るさの減少を防止することができる。

（実施例）
次に、本実施形態に係る顕微鏡光学系１の実施例について、図９〜図１２および表２、表３を参照して以下に説明する。図において、符号ＴＬは結像レンズ９、符号ＩＭＧは撮像素子１０の撮像面１０ａ、符号ＯＢＪは物体面、ＯＢ_Ｉは対物レンズ８の第１群Ｇ_１、ＯＢ_ＩＩは対物レンズ８の第２群Ｇ_２、ＯＢ_ＩＩＩは対物レンズ８の第３群Ｇ_３をそれぞれ示している。

表２は、本実施形態における拡大観察時、すなわち、補助光学系１１を離脱させた状態の顕微鏡光学系１のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２０倍である。また、このときの物体面視野直径をφ０．２、像面視野直径をφ４とした場合の近軸追跡結果を図９および図１０に示す。図９は顕微鏡光学系１全体の近軸追跡結果、図１０は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。図中、ＯＢＪ_ＭＩは拡大観察時の物体面を示す。

また、表３は、本実施形態における広視野観察時、すなわち補助光学系１１を挿入した状態の顕微鏡光学系１のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２倍である。仮に像面視野直径が上記拡大観察時と同様にφ４とすれば、物体面視野直径はφ２となり、上記拡大観察時の１０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

さらに、像面視野直径をφ２０とした場合の近軸追跡結果を図１１および図１２に示す。図１１は顕微鏡光学系１全体の近軸追跡結果、図１２は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。図中、ＯＢＪ_ＭＡは広視野観察時の物体面を示す。

ここで図１０と図１２を比較すれば明らかなように、図１０の拡大観察時の物体側光線は、マージナル光線の傾きが大きく（すなわち開口数（ＮＡ）が大きく）かつ主光線が光軸と平行（すなわちテレセントリック）であるのに対して、図１２の広視野観察時の物体側光線は、マージナル光線の傾きが小さく（すなわちＮＡが小さく）かつ主光線が光軸に対して傾いている（すなわち非テレセントリック）。

これは、拡大観察時よりも広視野観察時の方が収差やビネッティングが生じにくく、より大きな像面視野においても、周辺まで明るさが均一でかつ鮮明な像を得られることを意味する。図１１および図１２は、広視野観察時における光学系のこの性質に基づいて、像面視野直径をφ２０としたものである。この場合の物体面視野直径はφ１０であり、上記拡大観察時の５０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡光学系３０について、図１３および図１４を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡光学系１および顕微鏡装置２と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡光学系３０は、補助光学系３１において第１の実施形態と相違している。本実施形態において、補助光学系３１は、図１３および図１４に示されるように、正パワーを有するレンズ３１ａ（補助光学系）と一対に構成された平行平板３１ｂを備えている。

補助光学系３１のレンズ３１ａが対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入されたときには平行平板３１ｂは光路から離脱され、レンズ３１ａが対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路から離脱されたときにはレンズ３１ａの代わりに平行平板３１ｂが同じ位置に挿入されるようになっている。
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡光学系３０によれば、上述したような第３のスライダ１９を設けることなく、広視野観察と拡大観察との切替によっても、像側の瞳位置の変動を防止することができるという利点がある。

（実施例）
本実施形態に係る顕微鏡光学系３０の実施例について、図１５〜図１８および表４、表５を参照して以下に説明する。

表４は、本実施形態における拡大観察時、すなわち、３１ａを離脱させ、平行平板３１ｂを挿入した状態の顕微鏡光学系３０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２０倍である。物体面視野直径をφ０．２、像面視野直径をφ４とした場合の近軸追跡結果を図１５および図１６に示す。図１５は顕微鏡光学系３０全体の近軸追跡結果、図１６は、物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。

また、表５は、本実施形態における広視野観察時、すなわち、平行平板３１ｂを離脱させ、レンズ３１ａを挿入した状態の顕微鏡光学系３０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２倍である。仮に、像面視野直径を上記拡大観察時と同様にφ４とすれば、物体面視野直径はφ２となり、上記拡大観察時の１０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

さらに、像面視野直径をφ２０とした場合の近軸追跡結果を図１７および図１８に示す。図１７は顕微鏡光学系３０全体の近軸追跡結果、図１８は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。この場合の物体面視野直径はφ１０であり、上記拡大観察時の５０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡光学系４０について、図１９を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡光学系３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡光学系４０は、補助光学系４１において第２の実施形態と相違している。本実施形態において、補助光学系４１は、図１９に示されるように、第２の実施形態における平行平板３１ｂに代えて、物体側から順に正パワーのレンズ４２と負パワーのレンズ４３とを備えたガリレオ型のアフォーカル光学系４１ｂを備えている。

補助光学系４１のレンズ４１ａ（補助光学系）が対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入されたときにはアフォーカル光学系４１ｂは光路から離脱され、レンズ４１ａが対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路から離脱されたときにはレンズ４１ａの代わりに同じ位置にアフォーカル光学系４１ｂが挿入されるようになっている。
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡光学系４０によれば、第２の実施形態と同様に、第１の実施形態のような第３のスライダ１９を設けることなく、広視野観察と拡大観察との切替によっても、像側の瞳位置の変動を防止することができるという利点がある。

（実施例）
本実施形態に係る顕微鏡光学系４０の実施例について、図２０〜図２３および表６、表７を参照して以下に説明する。

表６は、本実施形態における拡大観察時、すなわち、補助光学系４１のレンズ４１ａを離脱させ、アフォーカル光学系４１ｂを挿入した状態の顕微鏡光学系４０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２０倍である。物体面視野直径をφ０．２、像面視野直径をφ４とした場合の近軸追跡結果を図２０および図２１に示す。図２０は顕微鏡光学系４０全体の近軸追跡結果、図２１は、物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。

また、表７は、本実施形態における広視野観察時、すなわち、アフォーカル光学系４１ｂを離脱させ、レンズ４１ａを挿入した状態の顕微鏡光学系４０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２倍である。仮に像面視野直径を上記拡大観察時と同様にφ４とすれば、物体面視野直径はφ４となり、上記拡大観察時の２０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

さらに、像面視野直径をφ１０とした場合の近軸追跡結果を図２２および図２３に示す。図２２は顕微鏡光学系４０全体の近軸追跡結果、図２３は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。この場合の物体面視野直径はφ１０であり、上記拡大観察時の５０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡光学系５０について、図２４を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡光学系３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡光学系５０は、補助光学系５１において第２の実施形態と相違している。本実施形態において、補助光学系５１は、図２４に示されるように、第２の実施形態における平行平板３１ｂに代えて、間隔をあけた２枚の正パワーのレンズ５２，５３を備えたケプラー型のアフォーカル光学系５１ｂを備えている。

補助光学系５１のレンズ５１ａが対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入されたときにはアフォーカル光学系５１ｂは光路から離脱され、レンズ５１ａが対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路から離脱されたときにはレンズ５１ａの代わりに同じ位置にアフォーカル光学系５１ｂが挿入されるようになっている。
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡光学系５０によれば、第２、第３の実施形態と同様に、第１の実施形態のような第３のスライダ１９を設けることなく、広視野観察と拡大観察との切替によっても、像側の瞳位置の変動を防止することができるという利点がある。

（実施例）
本実施形態に係る顕微鏡光学系５０の実施例について、図２５〜図２８および表８、表９を参照して以下に説明する。

表８は、本実施形態における拡大観察時、すなわち、補助光学系５１のレンズ５１ａを離脱させ、アフォーカル光学系５１ｂを挿入した状態の顕微鏡光学系５０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は２０倍である。物体面視野直径をφ０．２、像面視野直径をφ４とした場合の近軸追跡結果を図２５および図２６に示す。図２５は顕微鏡光学系５０全体の近軸追跡結果、図２６は、物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。

また、表９は、本実施形態における広視野観察時、すなわち、アフォーカル光学系５１ｂを離脱させ、レンズ５１ａを挿入した状態の顕微鏡光学系５０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は１倍である。仮に像面視野直径を上記拡大観察時と同様にφ４とすれば、物体面視野直径はφ２となり、上記拡大観察時の１０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

さらに、像面視野直径をφ２０とした場合の近軸追跡結果を図２７および図２８に示す。図２７は顕微鏡光学系５０全体の近軸追跡結果、図２８は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。この場合の物体面視野直径はφ１０であり、上記拡大観察時の５０倍の物体面視野を有する広視野観察が可能になる。

次に、本発明の第５の実施形態に係る顕微鏡光学系６０について、図２９を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡光学系３０と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡光学系６０は、補助光学系６１において第１の実施形態と相違している。
本実施形態において、補助光学系６１は、図２９に示されるように、正パワーを有する第１の実施形態と同様のレンズ６１ａと直列に、物体側から順に負パワーのレンズ６２と正パワーのレンズ６３とを配列した逆ガリレオ型のアフォーカル光学系６１ｂを備えている。
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡光学系６０によれば、第２〜第４の実施形態と同様に、第１の実施形態のような第３のスライダ１９を設けることなく、広視野観察と拡大観察との切替によっても、像側の瞳位置の変動を防止することができるという利点がある。

（実施例）
本実施形態に係る顕微鏡光学系６０の実施例について、図３０、図３１および表１０を参照して以下に説明する。

表１０は、本実施形態における広視野観察時、すなわち、補助光学系６１を挿入した状態の顕微鏡光学系６０のレンズデータの一例を薄肉レンズモデルによって示している。このときの倍率は１．２５倍である。仮に像面視野直径をφ４とすれば、物体面視野直径がφ３．２となる広視野観察が可能になる。
さらに、像面視野直径をφ２０とした場合の近軸追跡結果を図３０および図３１に示す。図３０は顕微鏡光学系６０全体の近軸追跡結果、図３１は物体面付近を拡大した近軸追跡結果を示している。この場合は物体面視野直径がφ１６となる広視野観察が可能になる。

なお、本実施形態における拡大観察時、すなわち、補助光学系６１を離脱させ状態の顕微鏡光学系６０のレンズデータおよびその近軸追跡結果は、第１の実施形態における実施例と同様であるので例示を省略する。
また、上記各実施形態における顕微鏡光学系においては、ＣＣＤ等の撮像素子１０により画像を取得する場合について説明したが、これに限定されるものではなく、ガルバノミラーにより走査する走査型顕微鏡に適用することとしてもよい。

また、上記各実施形態においては、補助光学系１１，３１，４１，５１，６１の挿脱により、結像関係が変化するので、モニタ１３に表示される画像が反転してしまう可能性がある。そこで、これを補正するために、イメージローテータ等の反転補正手段（図示略）を設けておくこととしてもよい。反転補正手段としては、画像処理により表示画像の反転を補正してもよく、撮像素子１０を回転させる等の機械的手法によって補正してもよい。また、走査型顕微鏡における場合には、ガルバノミラーによるスキャン方向を切り替える方法により取得画像の反転を防止することとしてもよい。

また、中心位置表示手段１４として、補助光学系にマーカを設けた場合について説明したが、これに限定されるものではなく、画像処理により、広視野観察時にモニタに表示する画像に十字線等を表示させるようにしてもよい。
また、対物レンズ８の先端と観察対象部位Ｂとの間に水やエマルジョンオイル等の液体を供給する注液手段（図示略）を備えることとしてもよい。この場合、広視野観察から拡大観察への切替時に、注液装置を作動させることにより、対物レンズ８の先端と観察対象部位Ｂとの間に液体を供給し、対物レンズ８を液浸状態として観察を行うことが好ましい。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡光学系を備える顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡光学系の拡大観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡光学系における作動距離の変化を説明する図である。 図１の顕微鏡光学系における補助光学系の挿入位置を説明するための近軸追跡図を示している。 図１の顕微鏡光学系の第１の変形例における広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図５の顕微鏡光学系の拡大観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡光学系の第２の変形例における広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図７の顕微鏡光学系の拡大観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡光学系の一実施例における拡大観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図９の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 図１の顕微鏡光学系の一実施例における広視野観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図１１の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡光学系を備える顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１３の顕微鏡光学系における作動距離の変化を説明する図である。 図１３の顕微鏡光学系の一実施例における拡大観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図１５の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 図１３の顕微鏡光学系の一実施例における広視野観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図１７の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡光学系を備える顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１９の顕微鏡光学系の一実施例における拡大観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図２０の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 図１９の顕微鏡光学系の一実施例における広視野観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図２２の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡光学系を備える顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図２４の顕微鏡光学系の一実施例における拡大観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図２５の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 図２４の顕微鏡光学系の一実施例における広視野観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図２５の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。 本発明の第５の実施形態に係る顕微鏡光学系を備える顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図２９の顕微鏡光学系の一実施例における広視野観察時の近軸追跡結果を示す図である。 図３０の近軸追跡結果の物体面近傍の拡大図である。

符号の説明

Ｂ 観察対象部位（観察対象）
Ｇ_１ 第１群
Ｇ_２ 第２群
Ｇ_３ 第３群
ＷＤ，ＷＤ_１，ＷＤ_２ 作動距離
Ｚ_ＷＤ 変化量
１，３０，４０，５０，６０ 顕微鏡光学系。
６ スライダ（作動距離補正手段）
８ 対物レンズ
９ 結像レンズ
１０ 検出装置
１１，６１ 補助光学系
１４ 十字線（中心位置表示手段）
１５ 第２のスライダ（移動機構）
１６ ストッパ
３１ａ，４１ａ，５１ａ レンズ（補助光学系）
３１ｂ 平行平板
４１ｂ，５１ｂ，６１ｂ アフォーカル光学系

Claims (14)

1. 観察対象からの光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された光を検出装置に結像させる結像レンズと、
   これら対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱可能に設けられた正パワーを有する補助光学系とを備える顕微鏡光学系。
2. 前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱される平行平板を備える請求項１に記載の顕微鏡光学系。
3. 前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱されるガリレオ型のアフォーカル光学系を備える請求項１に記載の顕微鏡光学系。
4. 前記補助光学系が対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱されるときに、前記補助光学系と切り替えて光路に挿脱されるケプラー型のアフォーカル光学系を備える請求項１に記載の顕微鏡光学系。
5. 前記補助光学系とともに対物レンズと結像レンズとの間の光路に挿脱される逆ガリレオ型のアフォーカル光学系を備える請求項１に記載の顕微鏡光学系。
6. 前記補助光学系の挿脱により反転する像を補正する反転補正手段を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
7. 前記補助光学系の挿脱による作動距離の変化を補正する作動距離補正手段を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
8. 取得される画像上において像の中心位置を示す中心位置表示手段が、前記補助光学系に設けられている請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
9. 対物レンズと試料との間に液体を供給する注液手段を備える請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
10. 対物レンズを含む光学系を光軸方向に移動可能に支持する移動機構を備え、
    該移動機構が、前記補助光学系の挿脱による作動距離の変化量に一致する距離に前記光学系の移動範囲を制限するストッパを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
11. 前記補助光学系が以下の条件式を満足するように配置されている請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡光学系。
    ０．０１０８（ｍｍ）≦［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］≦６７５（ｍｍ）
    ここで、［Ｆ_ＯＢ′−Ｆ_ＳＵＢ］はＦ_ＯＢ′とＦ_ＳＵＢとの間の距離、
    Ｆ_ＯＢ′は、対物レンズの像側焦点、
    Ｆ_ＳＵＢは、補助光学系の物体側焦点
    である。
12. 請求項１から請求項１１のいずれかに記載の顕微鏡光学系を用いた観察方法であって、
    対物レンズと結像レンズとの間に補助光学系を挿入して広視野観察を行うステップと、
    該広視野観察において、試料の観察位置に像の中心位置を合わせるステップと、
    補助光学系を対物レンズと結像レンズとの間から離脱させるステップと、
    前記補助光学系の離脱による作動距離の変化量だけ前記顕微鏡光学系と試料とを相対的に移動させるステップと、
    拡大観察を行うステップとを備える顕微鏡観察方法。
13. 請求項１から請求項１１のいずれかに記載の顕微鏡光学系を用いた観察方法であって、
    対物レンズと結像レンズとの間に補助光学系を挿入して広視野観察を行うステップと、
    該広視野観察において、試料の観察位置に像の中心位置を合わせるステップと、
    補助光学系を対物レンズと結像レンズとの間から離脱させるステップと、
    前記補助光学系の離脱による作動距離の変化量だけ前記顕微鏡光学系と試料とを相対的に移動させるステップと、
    対物レンズと試料との間に液体を供給するステップと、
    拡大観察を行うステップとを備える顕微鏡観察方法。
14. 前記対物レンズが、試料からの光を集光して略平行光にする第１群と、略平行光にされた光を集光して中間像を結像させる第２群と、中間像を結像した光を集光して略平行光に変換する第３群とを備える請求項１２または請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。

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