JP2008225096A - 顕微鏡装置および顕微鏡観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、広視野観察と高倍率観察とを切り替えて行うことを可能とする。
【解決手段】該対物レンズ８により集光された光を検出装置１０に結像させる結像レンズ９と、正パワーを有する補助光学系１１と、該補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱可能にする補助光学系挿脱装置１１ａと、補助光学系１１の挿脱に伴って生じる対物レンズ８の作動距離の変動に応じて、対物レンズ８と観察対象Ｂとの距離を変化させる作動距離補正装置６と、該作動距離補正装置６と補助光学系挿脱装置１１ａとを連動させる連動装置７とを備える顕微鏡装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡装置および顕微鏡観察方法に関し、特に、実験小動物等の体内を生きたまま観察するための顕微鏡装置および顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、対物レンズの視野中心を拡大することにより、対物レンズを交換することなく低倍での広い視野と、高倍での高解像の観察とを可能とする顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００２−３１７５８号公報

実験小動物等の体内を生きたまま観察するためには、実験小動物等をなるべく傷つけないように小さく切開し、できるだけ細径の対物レンズを挿入することが必要である。
しかしながら、対物レンズを細径にすると、視野が狭くなるため、単に、特許文献１のように拡大光学系を対物レンズの後段に挿入しても、広視野の観察を行うことはできないという不都合がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、低倍率の広視野観察と高倍率の拡大観察とを切り替えて行うことができる顕微鏡装置および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、該対物レンズにより集光された光を検出装置に結像させる結像レンズと、正パワーを有する補助光学系と、該補助光学系を前記対物レンズと前記結像レンズとの間の光路に挿脱可能にする補助光学系挿脱装置と、前記補助光学系の挿脱に伴って生じる前記対物レンズの作動距離の変動に応じて、前記対物レンズと前記観察対象との距離を変化させる作動距離補正装置と、該作動距離補正装置と前記補助光学系挿脱装置とを連動させる連動装置とを備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、補助光学系挿脱装置の作動により、対物レンズと結像レンズとの間の光路に補助光学系を挿入して広視野観察を行い、補助光学系を離脱させて拡大観察を行うことが可能となる。補助光学系は正パワーを有しており、その挿脱によって結像関係が変化するので、細径の対物レンズを用いても、その対物レンズを切り替えることなく広視野観察と拡大観察とを切り替えて行うことが可能となる。この場合において、補助光学系の挿脱に伴って対物レンズの作動距離が変化する。しかし、連動装置の作動により、作動距離補正装置と補助光学系挿脱装置とが連動させられるので、操作を個別に行う煩雑さを解消して、簡易に顕微鏡観察を行うことができる。

上記発明においては、複数の照明装置を有し、前記連動装置が、前記作動距離補正装置および前記補助光学系挿脱装置の作動に連動させて、前記複数の照明装置を選択的に切り替えることにしてもよい。
このようにすることで、広視野観察および拡大観察のそれぞれに適合する照明装置を採用し、広視野観察および拡大観察を適正に行うことができる。この場合においても、操作を個別に行う煩雑さを解消して、簡易に適正な顕微鏡観察を行うことができる。

また、上記発明においては、複数の検出装置を有し、前記連動装置が、前記作動距離補正装置および前記補助光学系挿脱装置の作動に連動させて、前記複数の検出装置を選択的に切り替えることとしてもよい。
このようにすることで、広視野観察および拡大観察のそれぞれに適合する検出装置を採用し、広視野観察および拡大観察を適正に行うことができる。この場合においても、操作を個別に行う煩雑さを解消して、簡易に適正な顕微鏡観察を行うことができる。

また、本発明は、対物レンズを介して実験小動物等の試料を明視野で広視野観察を行う広視野観察ステップと、該広視野観察ステップと同一の対物レンズを使用して試料の拡大蛍光観察を行う拡大観察ステップとを備える顕微鏡観察方法を提供する。
本発明によれば、対物レンズを切り替えることなく、広視野観察に適した明視野での試料の広視野観察ステップと、拡大観察に適した蛍光による試料の拡大観察ステップとを切り替えて、試料の全体像の観察と、特定の微小な観察部位に特化した観察とを簡易に行うことが可能となる。

上記発明においては、試料に対物レンズを挿入した状態で、作動距離を切り替えて、前記広視野観察ステップと前記拡大観察ステップとを行うこととしてもよい。
このようにすることで、広視野観察において特定した注目部位を画像の中心に設定したままの状態で、倍率を切り替えて拡大観察することができる。

また、上記発明においては、前記広視野観察ステップが、乾燥系における観察ステップであり、前記拡大観察ステップが、液浸系における観察ステップであることとしてもよい。
このようにすることで、作動距離が大きくなる広視野観察ステップにおいては対物レンズの先端と試料とを離間させた乾燥系における観察ステップが行われ、作動距離が小さくなる拡大観察ステップでは、対物レンズの先端を試料に近接させ、両者間に液体を注入した液浸系の観察ステップが行われる。これにより、簡易に広視野観察と拡大観察とを行うことができる。

本発明によれば、対物レンズを切り替えることなく、細径の対物レンズを使用した実験小動物等の生きたままの観察において、低倍率の広視野観察と高倍率の拡大観察とを切り替えて行うことができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置１について、図１〜図３を参照して以下に説明する。ここで、図１および図３（ａ）は低倍広視野観察時の状態を示し、図２および図３（ｂ）は高倍観察時の状態を示している。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、試料Ａである実験小動物を搭載するステージ２と、顕微鏡光学系３と、該顕微鏡光学系３をステージ２に対して上下方向に移動させる移動機構４とを備えている。

移動機構４は、ステージ２から鉛直方向に延びる支柱５と、支柱５に沿って上下方向に移動可能に設けられたスライダ６とを備えている。スライダ６はハンドル（連動装置）７の操作により、ステージ２に対して上下方向に移動させられるようになっている。スライダ６には顕微鏡光学系３が取り付けられている。

本実施形態に係る顕微鏡光学系３は、試料Ａである実験小動物に設けられた切開部から体内に挿入される細径先端部８ａを備え、臓器等の観察対象部位Ｂからの光を集光する対物レンズ８と、対物レンズ８により集光された光を集光して結像させる結像レンズ９と、該結像レンズ９による結像位置に撮像面１０ａを配置したＣＣＤ等の撮像素子１０と、前記対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱可能に設けられた補助光学系１１とを備えている。

対物レンズ８は、図３（ｂ）に示されるように、試料Ａの観察対象部位Ｂ上の一点からの光を集光して略平行光にする第１群Ｇ_１と、略平行光にされた光を集光して中間像を結像させる２群Ｇ_２と、中間像面に位置し、視野絞りとして機能する開口Ａ_１と、中間像を結像した光を集光して略平行光に変換する第３群Ｇ_３と、第３群Ｇ_３の後方に位置し、開口絞りとして機能する開口Ａ_２とを備えている。これにより、光束径を細く保持しつつ伝播することができ、細径先端部８ａの外径寸法を小さく抑えることができる。対物レンズ８は顕微鏡光学系３の最下端に鉛直方向に光軸を向けて配置されている。

本実施形態においては、前記補助光学系１１は、所定の正パワーを有するレンズである。このため、図３（ａ）に示されるような、補助光学系１１が対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入された場合と、図３（ｂ）に示されるような、補助光学系１１が光路から離脱させられた場合とを比較すると、結像関係が変化するようになっている。

以下に、この結像関係の変化によって達成される低倍広視野観察について詳細に説明する。
図３において、ＯＨ_１およびＯＨ_２は物体側合焦面上における観察可能な最大物体高さ（すなわち視野半径）、ＩＨ_１およびＩＨ_２は撮像素子１０の撮像面１０ａにおける最大像高さをそれぞれ示している。また、物体側合焦面上の視野中心（軸上物点）から発して顕微鏡光学系３に入射するマージナル光線を実線で、物体側合焦面上の視野最周辺上の一点（最軸外物点）から発して顕微鏡光学系３に入射する主光線を破線で、それぞれ示す。

図３（ｂ）に示されるように、補助光学系１１を離脱させた状態では作動距離が短くなり、対物レンズ８の先端から作動距離ＷＤ_２だけ離れた面が物体側合焦面となり、視野半径ＯＨ_２は顕微鏡光学系３によって最大像高さＩＨ_２に拡大投影される。この時、軸外物点から顕微鏡光学系３に入射する主光線は、光軸と平行である。これは、補助光学系１１を離脱させた場合の顕微鏡光学系３が、物体側にテレセントリックであることを意味する。
この場合の視野直径は、細径先端部８ａの直径を超えることはない。すなわち、光学系が物体側にテレセントリックである限り、その視野は光学系の直径に制限される。

次に、図３（ａ）に示されるように、補助光学系１１が挿入された状態では作動距離が大きくなり、対物レンズ８の先端から作動距離WD_１だけ離れた面が物体側合焦面となり、これと共に、図３（ｂ）の場合とは逆に、開口Ａ_１が開口絞りに、開口Ａ₂が視野絞りになる。この結果、物体側合焦面と第１群Ｇ_１との間に投影された開口Ａ_１の像Ａ_１′が、顕微鏡光学系３の入射瞳になる。この時、軸外物点から顕微鏡光学系３に入射する主光線は、傾きを持つ。これは、補助光学系１１が挿入された場合の顕微鏡光学系３が、物体側に非テレセントリックであることを意味する。

この場合の最軸外物点から顕微鏡光学系３に入射する主光線の傾きをθ_P１とすると、視野半径ＯＨ_１は、結像レンズ９、撮像素子１０、および補助光学系１１において主光線のケラレがない限り、下記式で表される。
ＯＨ_１＝ＯＥＰ_１・ｔａｎθ_P１ …（１）
ここで、ＯＥＰ_１は物体面から入射瞳Ａ_１′までの距離であり、補助光学系１１のパワーと配置により、任意に設定することが設計上可能である。

また、前記主光線の傾きθ_P１は、下記式で表される。
θ_P１=θ_M２ …（２−１）
ここで、θ_M２は図３（ｂ）に示される、高倍観察時において軸上物点から顕微鏡光学系３に入射するマージナル光線の傾きである。

なお、上記式（２−１）は低倍広視野観察および高倍観察の両方において対物レンズ８を乾燥系として用いる場合の関係であるが、高倍観察において対物レンズを液浸系として用いる場合は、液浸媒質の屈折率を考慮した下記式で表される。
ｓｉｎθ_P１=ｎ_Ｌ・ｓｉｎθ_M２Ｌ=ＮＡ_２Ｌ
∴θ_Ｐ１=ｓｉｎ^−１（ｎ_Ｌ・ｓｉｎθ_Ｍ２Ｌ）＝ｓｉｎ^−１ ＮＡ_2L …（２−２）
ここで、ｎ_Lは液浸媒質の屈折率、θ_M2Lは液浸系による高倍観察時における軸上物点から顕微鏡光学系３に入射するマージナル光線の傾き、NA_2Lは液浸系による高倍観察時における顕微鏡光学系３の物体側開口数である。

以上が、補助光学系１１の挿入に伴う結像関係の変化である。
この変化を利用した低倍広視野観察によって、対物レンズの直径に制限されることなく広い視野を観察することが可能になる。
例えば、対物レンズ８として
ＮＡ_２Ｌ＝０．５
のものを用い、
ＯＥＰ_１＝５（ｍｍ）
として低倍広視野観察を行う場合を考える。この場合の視野半径ＯＨ_１は、上記式（１）および式（２−２）より
θ_Ｐ１＝ｓｉｎ^−１０．５＝３０°
ＯＨ_１＝ＯＥＰ_１・ｔａｎθ_Ｐ１＝５・ｔａｎ３０°＝２．８９（ｍｍ)
となる。すなわち、直径５．７８ｍｍの視野が観察可能になる。

ここで、用いる対物レンズの直径がどれだけ小さくても、また、高倍観察時においてどれだけ倍率が高く視野が狭くても、上記ＮＡ_２ＬおよびＯＥＰ_１の条件さえ満たされれば、同様の大きさの視野が観察可能である。
さらに、対物レンズとしてよりＮＡ_２Ｌの大きいものを用いる、あるいはＯＥＰ_１としてより大きな距離を設定することにより、より広い視野が得られることは言うまでもない。

次に、補助光学系１１の挿脱に伴って生じる作動距離の変化について説明する。
図３（ａ）に示されるように、補助光学系１１が挿入された状態では、作動距離はＷＤ_１である。
一方、図３（ｂ）に示されるように、補助光学系１１が離脱された状態では、作動距離が小さくなり、対物レンズ８の先端から作動距離ＷＤ_２だけ離れた位置に合焦されるようになっている。したがって、補助光学系１１の挿脱による作動距離の変化量Ｚ_ＷＤ＝ＷＤ_１−ＷＤ_２だけ、スライダ６を上下方向に移動させて顕微鏡光学系３をその光軸方向に移動させることにより、それぞれの結像状態において合焦を図ることができるようになっている。

本実施形態においては、ハンドル７が、支柱５に固定された支点７ａ回りに揺動させられるように設けられている。また、ハンドル７は、スライダ６および補助光学系１１のフレーム１１ａにそれぞれ、相対揺動可能に連結されている。ハンドル７には長孔７ｂ，７ｃが設けられ、スライダ６およびフレーム１１ａには長孔７ｂ，７ｃに挿入されるピン６ａ，１１ｂが設けられている。

これにより、ハンドル７の先端に外力を作用させると、ハンドル７が支点７ａ回りに揺動させられ、ハンドル７に設けられた長孔７ｂ，７ｃ内で、ピン６ａ，１１ｂを摺動させて、ハンドル７の揺動運動がスライダ６およびフレーム１１ａの並進運動に変換されるようになっている。その結果、スライダ６が上下動させられるとともに、補助光学系１１が光軸に交差する方向に進退させられて、光路に挿脱されるようになっている。すなわち、ハンドル７の操作により、スライダ６の上下動および補助光学系１１の光路への挿脱を連動させることができるようになっている。

支柱５には、スライダ６の移動端においてスライダ６に突き当たるストッパ１２ａ，１２ｂが設けられている。ストッパ１２ａ，１２ｂにより制限されたスライダ６の移動距離は、上述した作動距離の変化量Ｚ_ＷＤに設定されている。
図１中、符号１３は、ステージ２を上下動させるハンドルである。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いた顕微鏡観察方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて試料Ａである実験小動物の体内を生きたままの状態で観察するには、例えば、ステージ２に搭載された試料Ａの腹部を切開して、対物レンズ８の細径先端部８ａを切開部に挿入する。このとき、切開部から空気を送り込んで腹腔を膨らませた状態とする。

次いで、ハンドル７の操作により、補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿入し、図示しない光源を作動させて、腹腔内を照明する。このとき、補助光学系１１の挿入に連動してスライダ６が上方に移動させられ、上側のストッパ１２ａに突き当たることで、顕微鏡光学系３が上昇位置に配置される。

この状態で、ハンドル１３を調節してステージ２を上下動させ、対物レンズ８を合焦位置に配置する。広視野観察においては、対物レンズ８の作動距離が大きくなるので、スライダ６が上昇位置に配置させられることで、対物レンズ８の先端と試料Ａとが離間させられて作動距離ＷＤ_１が確保される。したがって、広視野観察においては、対物レンズ８の先端と試料Ａとの間に空間が形成される乾燥系の観察方法となる。

これにより、光源からの照明光の観察対象部位Ｂの表面における反射光が対物レンズ８により集光され、補助光学系１１および結像レンズ９を介して撮像素子１０に入射される。
顕微鏡光学系３の物体側合焦面が臓器等の観察対象部位Ｂの表面に一致すると、該観察対象部位Ｂの像が撮像素子１０の撮像面１０ａに結像され、観察対象部位Ｂの明視野による広視野観察画像を得ることができる。

次に、ハンドル７を操作して、補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路から離脱させる。このとき、補助光学系１１の離脱に連動してスライダ６が下降させられ、下側のストッパ１２ｂに突き当たることで、顕微鏡光学系３が下降位置に配置され、対物レンズ８の先端が臓器等の観察対象部位Ｂの表面に近接させられる。

拡大観察においては、対物レンズ８の作動距離が小さくなるので、スライダ６が下降させられることで、対物レンズ８の先端と試料Ａとが近接させられて作動距離ＷＤ_２が達成される。このとき、対物レンズ８の先端と試料Ａとの間には体液等で満たされるので、拡大観察は液浸系の観察方法となる。

これにより、顕微鏡光学系３の物体側合焦面が観察対象部位Ｂの表面に一致すると、観察対象部位Ｂの像が撮像素子１０の撮像面１０ａに結像され、観察対象部位Ｂの拡大観察画像を得ることができる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、正パワーを有する補助光学系１１を対物レンズ８と結像レンズ９との間の光路に挿脱するだけで、結像関係を切り替えて、倍率の異なる２種類の観察方法、すなわち、広視野観察と拡大観察とを行うことができる。この場合において、本実施形態によれば、対物レンズ８を交換することなく倍率を変更するので、試料Ａである実験小動物の切開部に対物レンズ８の細径先端部８ａを挿入したままの状態で、観察方法を切り替えることができる。したがって、広視野観察において特定した注目部位を画像中心に設定したままの状態で倍率を切り替えて拡大観察することができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、結像関係を変更することで倍率を切り替えるものであるため、従来のように対物レンズ８の後段に拡大光学系を挿脱する方法のものと比較して、対物レンズ８を細径化しても、拡大観察における高倍率と、広視野観察における広い視野とを確保することができる。したがって、試料Ａに設ける切開部を小さくすることができ、低侵襲で試料Ａにかかる負担を軽減し、試料Ａをより自然に近い状態に維持しながら生きたままの観察を行うことができるという利点がある。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、ハンドル７を操作するだけで、スライダ６と補助光学系１１のフレームとを連動させて、観察方法の切り替えと、それぞれに適合する作動距離の達成を同時に行うことができる。したがって、観察方法の切替操作の煩雑さを解消して操作性を向上することができるという利点がある。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置２０について、図４を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略することにする。

図４（ａ）は、本実施形態に係る広視野観察時における顕微鏡装置２０の一部を示す部分的な正面図であり、（ｂ）は、拡大観察時における同正面図であり、（ｃ）は広視野観察時における同側面図である。なお、ハンドル７は図示を省略している。

本実施形態に係る顕微鏡装置２０は、異なる２つの照明装置２１，２２を備える点およびハンドル７の操作によるスライダ６および補助光学系１１の移動に連動させて、照明装置２１，２２を切り替える点において、第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と相違している。
２つの照明装置２１，２２は、図４（ａ），（ｂ）に示されるように、共用の光源ユニット２３と２つのフィルタユニット２４，２５とにより構成されている。２つのフィルタユニット２４，２５は、図４（ｃ）に示されるように、補助光学系１１のフレーム１１ａに、該補助光学系１１の移動方向に隣接して固定され、補助光学系１１の光路への挿脱とともに切り替えられるようになっている。

光源ユニット２３は、紫外光を含む白色光を発生する水銀灯２６および集光レンズ２７により構成されている。
第１のフィルタユニット２４は、水銀灯２６から発せられる白色光の内の紫外光を遮断するＵＶカットフィルタ２８と、ビームスプリッタ２９とを備えている。

水銀灯２６から発せられた白色光の内、ＵＶカットフィルタ２８により遮断された紫外光以外の光の一部がビームスプリッタ２９により反射され、対物レンズ８を介して試料Ａに照射されるようになっている。一方、試料Ａにおいて反射した反射光は対物レンズ８により集光された後、その一部がビームスプリッタ２９を透過して結像レンズ９により集光され、撮像素子１０により撮影されるようになっている。第１のフィルタユニット２４は、補助光学系１１と光軸方向に直列に配置されており、補助光学系１１が光路に挿入されるときに同時に光路に挿入されるようになっている。

第２のフィルタユニット２５は、水銀灯２６から発せられる白色光の内の励起光を抽出する励起フィルタ３０と、該励起フィルタ３０により抽出された励起光を反射し、試料Ａから入射してくる蛍光を透過させるダイクロイックミラー３１と、該ダイクロイックミラー３１を透過する励起光を遮断するバリアフィルタ３２とを備えている。第２のフィルタユニット２５は、補助光学系１１および第１のフィルタユニット２４が光路から離脱させられるときに、第１のフィルタユニット２４に代えて光路に挿入されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置２０の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置２０を用いて試料Ａの広視野観察を行うには、ハンドル７を操作して、補助光学系１１および第１のフィルタユニット２４を光路に挿入するとともに、スライダ６を上方に移動させて、試料Ａと対物レンズ８との間隔を大きく確保する。第１のフィルタユニット２４が光路上に挿入配置されることにより、照明装置２１が構成される。そして、ハンドル１３を操作してステージ２を昇降させ、試料Ａの観察対象部位Ｂを対物レンズ８の物体側合焦面に一致させる。

この状態で、光源ユニット２３から第１のフィルタユニット２４に白色光が入射されると、ＵＶカットフィルタ２８により紫外光を除去された残りの白色光がビームスプリッタ２９により反射され、補助光学系１１および対物レンズ８を介して試料Ａに照射される。そして、試料Ａからの反射光が対物レンズ８により集光され、補助光学系１１およびビームスプリッタ２９を透過して結像レンズ９により集光され、撮像素子１０により撮影される。これにより、白色光による明視野の広視野観察を行うことができる。対物レンズ８と試料Ａとの間には空間が形成されているので、広視野観察は乾燥系の観察方法となる。

一方、本実施形態に係る顕微鏡装置２０を用いて試料Ａの拡大観察を行うには、ハンドル７を操作して、補助光学系１１および第１のフィルタユニット２４を光路から離脱させ、代わりに第２のフィルタユニット２５を光路上に挿入配置する。第２のフィルタユニット２５が光路上に挿入配置されることにより、照明装置２２が構成される。このとき、ハンドル７の操作によるフィルタユニット２４，２５の挿脱に連動してスライダ６が下降させられるので、対物レンズ８の先端が試料Ａに近接させられる。これにより、短い作動距離が達成されて、試料Ａの観察対象部位Ｂが対物レンズ８の物体側合焦面に一致させられる。

この状態で、光源ユニット２３から第２のフィルタユニット２５に白色光が入射されると、励起フィルタ３０により抽出された励起光が、ダイクロイックミラー３１により反射され、対物レンズ８を介して試料Ａに照射される。試料Ａにおいては、励起光が照射されることにより、試料Ａ内に含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ８によって集光され、ダイクロイックミラー３１およびバリアフィルタを透過して、結像レンズ９により集光され、撮像素子１０により撮影される。これにより、蛍光による拡大観察を行うことができる。対物レンズ８の先端は試料Ａに密着するほど近接させられているので、両者間には体液等の液体が介在させられる。したがって蛍光拡大観察は液浸系の観察方法となる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡装置２０によれば、ハンドル７を操作するだけで、２つの観察方法を切り替えるとともに、それに適合する作動距離を達成し、かつ、照明装置２１，２２をも各観察方法に適合したものに切り替えることができる。したがって、さらに操作性を向上することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、同軸落射方式の明視野観察用白色光照明と蛍光照明とを切り替えることとしたが、これに代えて、図５および図６に示されるように、広視野観察時には対物レンズ８の外部からの白色光による直接照明、拡大観察時には同軸落射蛍光照明にそれぞれ切り替えることにしてもよい。
図５（ａ）は、広視野観察時における顕微鏡装置２０′の一部を示す部分的な平面図、（ｂ）は同正面図、（ｃ）は拡大観察時における同平面図、（ｄ）は同正面図、（ｅ）は広視野観察時における同側面図である。なお、ハンドル７は図示を省略している。
図６（ａ）は、広視野観察時のファイババンドル３３による直接照明、（ｂ）は拡大観察時の同軸落射蛍光照明をそれぞれ示す部分的な正面図である。

この場合、補助光学系１１のフレーム１１ａには、光源ユニット２３からの白色光の入射方向に並んでファイババンドル３３の端面と対物レンズ８とが配置され、補助光学系１１が対物レンズ８の光軸上に配置されたときに、第１のフィルタユニット２４′がファイババンドル３３の光軸上に配置されるようになっている。第１のフィルタユニット２４′は、ビームスプリッタ２９に代えてミラー２９′を備えている。

また、フレーム１１ａには、補助光学系１１が対物レンズ８の光軸上から離脱させられたときに代わりに同光軸上に配置される位置に第２のフィルタユニット２５が配置されている。図中、符号３４は、ファイババンドル３３の端面に照明光を集光するカップリングレンズである。
このようにすることで、広視野観察時における照明光のロスを低減して明るい照明を行うことができる。

次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置４０について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略することにする。

本実施形態に係る顕微鏡装置４０は、２つの検出装置４１，４２を備え、観察方法の切り替えに連動して検出装置４１，４２が切り替えられる点において第１の実施形態に係る顕微鏡装置１と相違している。
第１の検出装置４１は、図７に示されるように、フレーム１１ａに固定されたミラー４３および補助光学系１１と、折り返しミラー４４と、結像レンズ４５と、該結像レンズ４５により集光された反射光を撮影するＣＣＤのような固体撮像素子４６とを備えている。

広視野観察時に、フレーム１１ａが移動させられてミラー４３が光路上に配置されることにより、対物レンズ８により集光された試料Ａからの反射光が、固体撮像素子４６により撮影されるようになっている。広視野観察時の照明光源については図示を省略する。また、このとき、後述する第２の検出装置４２への光路はミラー４３により遮られるようになっている。

第２の検出装置４２は、レーザ光を発生するレーザ光源４７と、該レーザ光源４７からのレーザ光を略平行光にするコリメータレンズ４８と、略平行光にされたレーザ光を反射するダイクロイックミラー４９と、レーザ光を２次元的に走査するガルバノミラー５０と、該ガルバノミラー５０により走査されたレーザ光を集光する瞳リレーレンズ５１と、該瞳リレーレンズ５１により集光されたレーザ光を略平行光にする結像レンズ５２とを備えている。また、第２の検出装置４２は、対物レンズ８により集光され、結像レンズ５２、瞳リレーレンズ５１、ガルバノミラー５０を介して同一光路を戻り、ダイクロイックミラー４９を透過した試料からの蛍光を透過し、レーザ光を除去するバリアフィルタ５３と、該バリアフィルタ５３を透過した蛍光を集光させる集光レンズ５４と、集光された蛍光を通過させる共焦点ピンホール５５と、該共焦点ピンホール５５を通過した蛍光を検出する光検出器５６とを備えている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置４０を用いて広視野観察を行う場合には、図示しないハンドル７を操作して、ミラー４３を光軸上に配置することにより、第１の検出装置４１を選択する。これにより、ミラー４３により折り返された光路上に補助光学系１１が配置され、観察方法が広視野観察に切り替えられるとともに、図示しないスライダ６が上昇して作動距離が確保される。

このようにすることで、対物レンズ８により集光した試料Ａの観察対象部位Ｂからの反射光が、ミラー４３によって反射されて補助光学系１１により集光され、折り返しミラー４４および結像レンズ４５を介して固体撮像素子４６により撮影される。これにより、広視野観察画像を取得することができる。

一方、拡大観察を行う場合には、ハンドル７を操作して、ミラー４３および補助光学系１１を光路から離脱させる。これにより、第２の検出装置４２が選択される。このとき、スライダ６が連動して下降させられ、短い作動距離が達成され、観察方法が拡大観察に切り替えられる。

レーザ光源４７から出射されたレーザ光が、コリメータレンズ４８、ダイクロイックミラー４９およびガルバノミラー５０を介して２次元的に走査され、瞳リレーレンズ５１、結像レンズ５２を介して略平行光になった状態で対物レンズ８にそのまま入射される。試料Ａの観察対象部位Ｂにおいて発生した蛍光は、対物レンズ８により集光され、結像レンズ５２、瞳リレーレンズ５１、ガルバノミラー５０およびダイクロイックミラー４９を介して戻り、バリアフィルタ５３によりレーザ光を除去される。そして、レーザ光を除去された蛍光は、集光レンズ５４により集光され、共焦点ピンホール５５を通過したもののみが光検出器５６により検出される。各時刻におけるガルバノミラー５０によるレーザ光の走査位置と、光検出器５６により検出された蛍光強度情報とを逐次記録しておくことにより、観察対象部位Ｂの蛍光共焦点画像を取得することができる。

このように、本実施形態に係る顕微鏡装置４０によれば、ハンドル７を操作するだけで、広視野観察と拡大観察とを切り替えることができるとともに、各観察方法に適合した作動距離を確保することができ、かつ、各観察方法に適合した検出装置４１，４２に切り替えることができる。したがって、操作性をさらに改善することができるとともに、拡大観察時には、共焦点顕微鏡を構成して、微弱な蛍光を検出し鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡装置の拡大観察時の状態を模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡光学系における作動距離および視野半径の変化を説明する図であり、（ａ）広視野観察時、（ｂ）拡大観察時をそれぞれ示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置であって、（ａ）広視野観察時の部分的な正面図、（ｂ）拡大観察時の部分的な正面図、（ｃ）広視野観察時の部分的な側面図である。 図４の顕微鏡装置の変形例であって、（ａ）広視野観察時の平面図、（ｂ）広視野観察時の部分的な正面図、（ｃ）拡大観察時の平面図、（ｄ）拡大観察時の部分的な正面図、（ｅ）広視野観察時の側面図である。 図５の顕微鏡装置における照明の切り替えを説明する図であり、（ａ）広視野観察時の直接照明、（ｂ）拡大観察時の同軸落射照明をそれぞれ示す部分的な正面図である。 本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置であって、広視野観察時の状態を模式的に示す部分的な正面図である。

符号の説明

Ｂ 観察対象部位（観察対象）
ＯＨ_１，ＯＨ_２ 最大物体高さ（実視野半径）
ＷＤ_１，ＷＤ_２ 作動距離
１，２０，２０′，４０ 顕微鏡装置
６ スライダ（作動距離補正装置）
７ ハンドル（連動装置）
８ 対物レンズ
９，４５，５２ 結像レンズ
１０ 撮像素子（検出装置）
１１ 補助光学系
１１ａ フレーム（補助光学系挿脱装置）
２１，２２ 照明装置
４１，４２ 検出装置
４６ 固体撮像素子（検出装置）
５６ 光検出器（検出装置）

Claims (6)

1. 観察対象からの光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された光を検出装置に結像させる結像レンズと、
   正パワーを有する補助光学系と、
   該補助光学系を前記対物レンズと前記結像レンズとの間の光路に挿脱可能にする補助光学系挿脱装置と、
   前記補助光学系の挿脱に伴って生じる前記対物レンズの作動距離の変動に応じて、前記対物レンズと前記観察対象との距離を補正する作動距離補正装置と、
   該作動距離補正装置と前記補助光学系挿脱装置とを連動させる連動装置とを備える顕微鏡装置。
2. 複数の照明装置を有し、
   前記連動装置が、前記作動距離補正装置および前記補助光学系挿脱装置の作動に連動させて、前記複数の照明装置を選択的に切り替える請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 複数の検出装置を有し、
   前記連動装置が、前記作動距離補正装置および前記補助光学系挿脱装置の作動に連動させて、前記複数の検出装置を選択的に切り替える請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 対物レンズを介して実験小動物等の試料を明視野で広視野観察を行う広視野観察ステップと、
   該広視野観察ステップと同一の対物レンズを使用して試料の拡大蛍光観察を行う拡大観察ステップとを備える顕微鏡観察方法。
5. 試料に対物レンズを挿入した状態で、作動距離を切り替えて、前記広視野観察ステップと前記拡大観察ステップとを行う請求項４に記載の顕微鏡観察方法。
6. 前記広視野観察ステップが、乾燥系における観察ステップであり、
   前記拡大観察ステップが、液浸系における観察ステップである請求項４または請求項５に記載の顕微鏡観察方法。

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