JP2007537988A - 低分子ペプチドを含む薬学的タンパク質処方物の安定化 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｇｉｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、こられの誘導体およびこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を使用して滅菌された安定な薬学的タンパク質処方物に関する。さらに、本発明はエリスロポエチン、およびジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ならびにこれらの混合物から選択されるペプチド安定剤を含有する安定な薬学的処方物に関する。ペプチド安定剤に加えて、上記処方物は、界面活性剤を含み得る。

Description

（発明の分野）
本発明は、生物学的に活性なタンパク質およびペプチド安定剤を含有する安定な薬学的処方物に関する。本発明はさらに、エリスロポエチンおよび安定剤を含有する薬学的処方物に関し、この安定剤は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはこれらの混合物である。本発明の安定な薬学的処方物は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）を含み得る。

（発明の背景）
遺伝子組換え技術の発展に伴い、多くのタンパク質の治療的使用が可能になった。一例として、現在、疾患を処置するために使用されるタンパク質としては、エリスロポエチン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ヘモグロビン、インスリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ、血管内皮細胞増殖因子、インターロイキン２、ならびに多くの他のタンパク質が挙げられる。しかし、タンパク質は、物理学的不安定性（例えば、変性、凝集体の形成など）、および化学的不安定性（例えば、加水分解、酸化、および脱アミノ反応）の結果として、生物学的活性を損失し得る。タンパク質の安定性はさらに、ｐＨ、温度、張度、および多くの凍結と融解の繰り返しのような要因に影響される。

安定性を確実にするために、治療用タンパク質処方物は、概して、使用する直前に別個に包装された水溶性希釈剤に溶解されるべき凍結乾燥タンパク質としてか、または安定性を改善するための添加剤を含むタンパク質溶液としてかのいずれかで供給される。例えば、添加剤（例えば、タンパク質溶液を処方するのに有用な遊離したアミノ酸（ロイシン、トリプトファン、セリン、アルギニンおよびヒスチジン）は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３のような特許中に提唱される。現在、利用可能ないくつかのタンパク質処方物は、安定剤としてタンパク質を含む。例えば、ヒト血清アルブミンまたは精製されたゼラチンが、タンパク質溶液中の化学的変化および物理学的変化を抑制するために使用される。しかし、これらのタンパク質の添加は、ウイルス汚染を除去するための複雑なプロセスを含む。凍結乾燥は、安定性を確実にする別の方法である（しかし、その凍結乾燥されたタンパク質が、その使用の直前に溶解される必要がある場合、このプロセスは、製造費用を増加させ、そして不適切な投与に関する増加した危険を含む）。特許文献４は、ペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕによって安定化されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の薬学的溶液を開示する。

治療剤として広く使用されるタンパク質の１つは、エリスロポエチンである。エリスロポエチンは、赤血球の形成を刺激する、３４〜３９ｋＤａの糖タンパク質ホルモンである。エリスロポエチンは、腎臓で産生され、そして一旦産生されると、それは、骨髄に流れ、そこで、初期の前駆細胞の前赤芽球（その後、成熟して赤血球になる）への変換を刺激する。通常の健康な状態において、エリスロポエチンは、血漿中に非常に低い濃度（すなわち、約０．０１Ｕ／ｍｌ〜０．０３Ｕ／ｍｌ）で存在するが、低酸素血症（すなわち、輸送における酸素のレベルが、減少される）が起こる場合には、腎臓は、エリスロポエチンを、より産生する。低酸素血症は、例えば、大量の血液の喪失、放射線による赤血球の破壊、または高地への曝露の結果である。さらに、貧血の種々の形態は、低酸素血症を引き起こす。なぜなら赤血球は、体内の酸素輸送に関与するからである。正常な状態において、エリスロポエチンの増加したレベルは、新しい赤血球の産生を刺激し、これにより、酸素のレベルを上昇させ、そして低酸素状態を、軽減するか、または解消する。

通常起こるこの低酸素血症の是正とは対照的に、慢性腎不全（「ＣＲＦ」）を有する患者は、エリスロポエチンの産生が制限されるか、またはその産生が無く、従って、その患者は、十分な赤血球を産生しない。赤血球の通常の寿命は、１２０日であるので、このような患者は、時間と共に、ますます貧血になる。組換えエリスロポエチンの開発以前には、慢性腎不全を有する患者は、多くの場合、赤血球の最低限のレベルを維持するために、定期的な輸血を受けなければならなかった。

患者を処置するために現在使用されるエリスロポエチンのいくつかの形態（エリスロポエチンα、エリスロポエチンβ、エリスロポエチンω、およびエリスロポエチンδ）が、存在する。エリスロポエチンωは、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞中に形質転換されたヒトゲノムのエリスロポエチンＤＮＡのＡｐａｌフラグメントから発現された組換えタンパク質である。エリスロポエチンωおよびその発現は、例えば、特許文献５に開示される。さらに、ＥＰＯω中の炭化水素残基の、構造および組成は、例えば、非特許文献１および非特許文献２に開示された。ＥＰＯωは、約３５ｋＤａの平均分子量を有し、そして複数のアイソフォーム（例えば、等電点電気泳動による、広範なカット（ｃｕｔ）画分中の約６〜８つのアイソフォーム、およびピーク画分中の６つのアイソフォーム）からなり、このことは、異なる型および量のグリコシル化（特に、異なる量のシアリル化）を示す。ＥＰＯωは、糖タンパク質の１モルあたり、１モル未満のＯ−結合型オリゴ糖含量を有し、そしてアミノ酸残基Ａｓｎ−２４、Ａｓｎ−３８、およびＡｓｎ−８３における３つのＮ−グリコシル化部位、ならびにアミノ酸残基Ｓｅｒ−１２６におけるＯ−グリコシル化部位を有する。さらに、尿中のヒトエリスロポエチン、またはエリスロポエチンαもしくはエリスロポエチンβとは異なり、ＥＰＯωは、非特許文献３に報告されるように、完全なＮ−脱グリコシル化でなくても実質的なＮ−脱グリコシル化をもたらす条件に供された後であっても、そのインビボにおける生物学的活性の実質的に全てを保持する。

市販のＥＰＯ処方物は概して、良好な耐容性を示し、そして安定であるが、極端な条件下では、このような処方物は、不安定であり得、そして活性の損失を受ける。これらの活性の損失は、微量の重金属、大気中の酸素などによって保存用に使用されるアンプル表面の触媒効果によるＥＰＯの分解、そしてまた、血管壁へのＥＰＯ分子の沈着（ＥＰＯの部分的な変性もまた起こる）に起因し得る。各投薬単位中に僅か数マイクログラムしか存在しないという事実を考慮すると、短い保存時間でも、吸着による損失はかなりのものであり得る。さらに、活性の損失は、外部因子（例えば、熱および光）によって促進され得るか、またはヒト血液産物（例えば、アルブミン）を含まない処方物中、もしくは保存料（例えば、ベンジルアルコール）を含む複数回用量の処方物中で促進され得る。
豪州特許第７２２３００号明細書 米国特許第５，６９１，３１２号明細書 米国特許第６，１２０，７６１号明細書 米国特許第５，７０５，４８２号明細書 米国特許第５，６８８，６７９号明細書 Ｎｉｍｔｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３：３９ Ｔｓｕｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９０，１８８：４０５ Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９１，１７６（２）：６９８−７０４

従って、所望のタンパク質を凍結乾燥することも安定剤としてヒトのタンパク質を使用することも必要とせずに改善された安定性を示す薬学的タンパク質処方物が、望ましい。

（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、安定な薬学的タンパク質処方物に関し、この処方物は、生物学的に活性なタンパク質、ならびにＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体およびこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を含有し、そしてこの処方物は、ヒト血清アルブミンを含まない。

別の実施形態において、本発明は、安定なタンパク質処方物に関し、この処方物は、エリスロポエチン、ならびにジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、およびにこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を含有し、この処方物は、ヒト血清アルブミンを含まない。

さらに別の実施形態において、提供されるものは、エリスロポエチン、ならびにＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体およびこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤、ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する安定な薬学的組成物であり、そしてこの組成物は、ヒト血清アルブミンを含まない。

他の対象および特徴は、以下において、部分的に明らかであり、そして部分的に示される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、安定な薬学的タンパク質処方物を提供し、このような処方物の安定化は、低分子ペプチドを利用することによって達成される。本明細書中に記載される薬学的タンパク質処方物は、安全な調製物であり、この調製物は、外来性のタンパク質を含まない。本明細書中に記載される処方物において安定剤として使用される低分子ペプチドは、従来の安定剤より安価であり、そしてその製造プロセスの間に掛かる費用もまた、凍結乾燥生成物について掛かる費用よりも安い。さらに、低分子ペプチドの使用によって、その薬学的タンパク質処方物は、ウイルス汚染を含み得るヒト血清アルブミン、または他のヒトのタンパク質もしくは動物のタンパク質（例えば、ゼラチン）の添加を回避する。

本明細書中に記載される組成物中への取り込みに関するタンパク質は、ヒト被験体において治療的価値を有する任意のタンパク質であり得る。従って、このようなタンパク質としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、因子ＶＩＩ、因子ＩＸ、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、トロンボポエチン、ヘパリン、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγ、インターロイキン２、濾胞刺激因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ならびに骨形成ファミリータンパク質（ＢＭＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＭＰは、広範なトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−βスーパーファミリー）中の新規な因子である。それらは、鉱質除去された骨の抽出物における生物学的活性を特徴付ける以前の記述（Ｕｒｉｓｔ Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６５）１５０：８９３−９９）に従い、Ｗｏｚｎｅｙ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４２：１５２８−３４によって、遺伝子クローニング技術を使用して、最初に同定された。これらの因子は、正常な骨芽細胞が分化する際にその骨芽細胞によって発現され、インビトロにおける、骨芽細胞分化および骨小結節（ｂｏｎｅ ｎｏｂｕｌｅ）形成、ならびにインビボにおける骨形成を刺激することが示されている（Ｈａｒｒｉｓ Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ（１９９４）９：８５５−６３）。この後者の特性は、骨量の減少を生じる疾患に対する治療剤としての潜在的な有用性を示唆する。骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｅｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）としては、哺乳動物の、骨形成タンパク質−１（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）（ＯＰ−１、ＢＭＰ−７およびショウジョウバエホモログ６０Ａとしても公知である）、骨形成タンパク質−２（ＯＰ−２、ＢＭＰ−８としても公知である）、骨形成タンパク質−３（ＯＰ−３、ＢＭＰ−８Ｂとしても公知である）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡおよびショウジョウバエホモログＤＰＰとしても公知である）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２Ｂとしても公知である）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびそのマウスホモログＶｇｒ−１、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ２としても公知である）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１としても公知である）、ＧＤＦ−（ＣＤＭＰ−２としても公知である）、ならびにＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３またはＢＭＰ−１２としても公知である）が挙げられる。

上で指定されたタンパク質の全ては、当該分野において周知であり、そしてそれらの組換え構築物は、当業者の認識の範囲内である。さらに、当業者は、さらなるタンパク質が本発明によって配合され得ることを容易に決定し得る。

１つの実施形態において、上記タンパク質は、エリスロポエチン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、濾胞刺激ホルモン、インスリン様成長因子、神経成長因子、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、および腫瘍壊死因子からなる群より選択される。別の実施形態において、そのタンパク質は、ＢＭＰ−７である。ＢＭＰ−７タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第５，１４１，９０５号に記載され、そしてＢＭＰ−７タンパク質を産生するための方法は、例えば、米国特許第５，３６６，８７５号に記載される。

さらに別の実施形態において、上記タンパク質は、エリスロポエチンである。本発明の組成物に使用するためのＥＰＯは、哺乳動物のＥＰＯ、特に、ヒトＥＰＯと実質的に同等の生物学的活性を有し、そしてそれとしては、天然に存在するＥＰＯおよび遺伝子組換えによって得られるＥＰＯが挙げられる。遺伝子組換えから得られるＥＰＯとしては、天然に存在するＥＰＯのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するＥＰＯ、またはこのアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸が欠失されたアミノ酸配列、もしくは１つ以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、もしくは１つ以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するが、上述の生物学的活性を保持するＥＰＯが挙げられる。本発明のＥＰＯは、任意の方法（例えば、種々の様式で、ヒトの尿から抽出し、その後、分離および精製する工程を包含する方法、ならびに、種々の様式で、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞において産生し、その後、抽出、分離および精製する工程を含む方法）によって産生され得る。１つの実施形態において、ＥＰＯは、ＣＨＯ細胞中で産生される組換えＥＰＯである。これらの細胞中でのＥＰＯの産生については、例えば、米国特許第４，７０３，００８号を参照されたい。別の実施形態において、ＥＰＯは、ＢＨＫ細胞中で作製される組換えＥＰＯである。ＢＨＫ細胞中でのＥＰＯの産生は、当該分野において周知である。例えば、米国特許第５，６８８，６７９号を参照されたい。さらに別の実施形態において、そのエリスロポエチンは、エリスロポエチンωである（ＥＰＯωの記載については、例えば、米国特許第５，６８８，６７９号およびＷＯ ０２／１４３５６を参照のこと）。

本明細書中に記載される上記組成物中の生物学的に活性なタンパク質の量は、所望の結果を達成する単位用量あたりの、そのタンパク質の治療有効量を送達するのに必要とされる量である。従って、その量は、タンパク質および他の多くの因子（例えば、処置されるべき疾患の型、患者の年齢、疾患の重篤度、他の状態の存在など）に基づいて変化し得る。当業者は、その組成物中に含まれるべきそのタンパク質の適切な量を容易に決定し得る。

１つの実施形態において、上記生物学的に活性なタンパク質がエリスロポエチンである場合、薬学的処方物におけるそのＥＰＯの濃度は、約５００ＩＵ／ｍｌと約１００，０００ＩＵ／ｍｌとの間である。別の実施形態において、そのＥＰＯの濃度は、約１，０００ＩＵ／ｍｌと約５０，０００ＩＵ／ｍｌとの間であり、そしてさらに別の実施形態において、そのＥＰＯの濃度は、約２，０００ＩＵ／ｍｌと約２０，０００ＩＵ／ｍｌとの間である。好ましい実施形態において、本明細書中に開示される薬学的処方物中のそのＥＰＯの濃度は、約１０，０００ＩＵ／ｍｌである。小児への適用に関して、ＥＰＯは、約１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で処方され得る。

患者の処置に関して、ＥＰＯωは最初に、ヘモグロビンレベルを上昇させるためにより高い用量で投与され得、そしてその後、維持期間に適切なより低い用量で投与され得、用量は、長期的かつ継続的な治療に応じて調整される。ＥＰＯωは、週に３回、約５ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇの用量、または週に１〜２回、約１０ＩＵ／ｋｇ〜約７５ＩＵ／ｋｇの用量で患者に投与され得る。別の実施において、ＥＰＯωは、約２５ＩＵ／ｋｇ〜約６０ＩＵ／ｋｇの用量、または約２５ＩＵ／ｋｇ〜約３５ＩＵ／ｋｇの用量で、週に２回投与される。さらに別の実施において、ＥＰＯωは、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇの用量、または約７５ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇの用量で、週に１回投与される。

本明細書中に記載される組成物において使用されるべきペプチド安定剤としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、およびこれらの混合物が挙げられる。本発明の例示的なペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体およびこれらの混合物が挙げられるが、他のペプチドも使用され得る。

上記タンパク質処方物において使用するペプチドは、商業的な供給業者から購入され得る。ペプチドの固相化学合成の原理は、当該分野で周知であり、そして当該領域の一般的な文書中に見出され得る。例えば、Ｈ．ＤｕｇａｓおよびＣ．Ｐｅｎｎｅｙ，ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，（１９８１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５４−９２ページを参照のこと。例えば、ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販される）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給される合成サイクルを利用する固相方法論によって合成され得る。

さらに、本明細書中に記載される処方物中に使用されるべき低分子ペプチドの設計において、保存的アミノ酸置換が、適用され得る。本発明のペプチドにおけるアミノ酸置換は、そのアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づき得る。本発明のペプチド内で静的な変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）を生じる保存的アミノ酸変化を形成するなどのために、種々の前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換基は、天然に存在するアミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択され得る。アミノ酸は、以下の４つの群に分けられ得る：（１）酸性アミノ酸；（２）塩基性アミノ酸；（３）中性の極性アミノ酸；および（４）中性の非極性アミノ酸。これらの種々の群内の代表的なアミノ酸としては、（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸のような酸性（生理学的ｐＨにおいて負に帯電する）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン、およびリジンのような塩基性（生理学的ｐＨにおいて正に帯電する）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンのような中性の極性アミノ酸；ならびに（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンのような中性の非極性アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。有利であることが予想できない変化はまた、その変化が、機能的配列の産生を生じる場合に有用であり得ることに注意すべきである。例えば、保存的アミノ酸置換の原理を使用することによって、Ｇｌｙ−Ａｌａは、例えば、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ−Ｉｌｅなどに置き換えられ得る。当業者は容易に、保存的アミノ酸置換を含むペプチドの配列を決定し得る。

本発明の低分子ペプチドにおける使用のためのアミノ酸残基の例は、タンパク質新生（ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｃ）のＬ−アミノ酸（すなわち、タンパク質に通常含まれる２０のアミノ酸）、ならびにＤ−アミノ酸および非タンパク質新生のアミノ酸のような、天然に存在するアミノ酸のいずれかから選択され得る。非タンパク質新生のアミノ酸は概して、タンパク質新生のアミノ酸の、代謝産物および類似物である。天然に存在する非タンパク質新生のアミノ酸の例としては、オルニチン、タウリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ノルロイシン、β−アラニン、γアミノ酪酸、セレノシステイン、ホスホセリン、ピログルタミン酸、およびピロリジンが挙げられるが、これらに限定されない。そのアミノ酸はまた、天然に存在しないアミノ酸から選択され得る。天然に存在しないアミノ酸としては、アミノ酸誘導体およびアミノ酸類似物が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸誘導体の例としては、セレノメチオニン、テルロメチオニン（ｔｅｌｌｕｒｏ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）およびｐ−アミノフェニルアラニン、フッ素化アミノ酸（例えば、フッ素化トリプトファン、フッ素化チロシンおよびフッ素化フェニルアラニン）、ニトロフェニルアラニン、ニトロベンズオキサジアゾリル−Ｌ−リジン、デオキシメチルアルギニン、ならびにシクロヘキシルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸類似物としては、アミノ酸の特徴であるとして当該分野で公知の特性を有する化学合成された化合物が挙げられ、それらの例としては、例えば、トリプトファンの「類似物」である、ｂ−セレノロ［３，２−ｂ］ピロリルアラニン、およびプロリンの「類似物」であるチアプロリン（ｔｈｉａｐｒｏｌｉｎｅ）（１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸）が挙げられる。さらなるアミノ酸誘導体としては、アミノ酸塩、アシル化アミノ酸、およびα−ケトアミノ酸が挙げられる。

１つの実施形態において、上記ペプチド安定剤は、アミノ酸塩を含み得る。一例として、このような塩は、無機酸から作製されても（例えば、アミノ酸の塩酸塩）、有機酸から作製されても（例えば、アミノ酸の酢酸塩）よい。例えば、アミノ酸の塩酸塩を含むペプチド（例えば、Ｌ−塩酸ヒスチジンまたはＬ−塩酸アラニン）が、使用され得る。アミノ酸の塩酸塩は、市販されているか、またはそれらは、当該分野で公知であるように生成され得る。例えば、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏ、Ｇｌｙ−Ａｌａ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏ、Ａｌａ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏ−Ｇｌｙ、およびＡｌａ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏ−Ａｌａ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏは、いくつかの、アミノ酸塩を利用するペプチド安定剤の例である。別の実施形態において、ペプチド安定剤は、アシル化アミノ酸、および／またはα−ケトアミノ酸を含む。上述の例に加えて、多くの様々なペプチドが、上述のアミノ酸を使用して生成され得る。一例として、ジペプドは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸およびアミノ酸塩、Ｄ−アミノ酸およびアミノ酸類似物、Ｌ−アミノ酸およびアシル化アミノ酸、Ｌ−アミノ酸およびα−ケトアミノ酸、アシル化アミノ酸およびα−ケトアミノ酸、２つのアシル化アミノ酸、２つのＬ−アミノ酸、２つのアミノ酸塩を含み得る、などであるが、これらに限定されない。当業者は、ジペプチドだけではなく、本発明の他の低分子ペプチドに関するアミノ酸の組み合わせも容易に認識し得る。

上記薬学的処方物は、ペプチドの単一種（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）またはペプチドの混合物のいずれかを含み得る。一例として、混合物としては、ジペプチドおよびジペプチド（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）、ジペプチドおよびトリペプチド（例えば、Ａｌａ−ＡｌａおよびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、トリペプチドおよびペンタペプチド、２つのジペプチドおよび２つのトリペプチドなどが、挙げられ得る。

本明細書中に記載される安定な薬学的組成物中の、ペプチド安定剤の濃度またはペプチド安定剤の混合物の濃度は、約０．０１ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間である。別の実施形態において、そのペプチド安定剤の濃度は、約０．５ｇ／Ｌと約５ｇ／Ｌとの間である。さらに別の実施形態において、そのペプチド安定剤の濃度は、約１ｇ／Ｌである。

本発明の１つの実施形態において、上記安定な薬学的タンパク質組成物は、界面活性剤を含む。特定の理論に束縛されないが、溶液中の界面活性剤の存在は、生物学的に活性なタンパク質の吸着（例えば、上記処方物が保存される容器の壁へのＥＰＯの吸着）を減少させると考えられる。本明細書中に記載される処方物中に使用される界面活性剤の量は、約０．０００５％ ｗ／ｖ〜約０．５％ ｗ／ｖの範囲である。１つの実施形態において、界面活性剤、特に、Ｔｗｅｅｎ(登録商標）８０の量は、０．０３％ ｗ／ｖである。別の実施形態において、その界面活性剤は、非経口的投与に適切である。

薬学的に受容可能である任意の界面活性剤が、本発明の組成物中に含まれ得る。そのような界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン脂肪酸エーテル、Ｃ_１６〜Ｃ_２４脂肪酸、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、脂肪酸ポリグリセリド、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール、アルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、脂肪酸アミンの酸化物、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、ポリオキシアルキレンヒマシ油誘導体）、アニオン性界面活性剤（例えば、硫酸アルキル、硫酸オレフィン、硫酸エーテル、硫酸モノグリセリド、スルホン酸アルキル、スルホン酸アリール、スルホン酸オレフィン、スルホコハク酸アルキル、スルホコハク酸アリール（ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる））、カチオン性界面活性剤（例えば、ベンザルコニウム塩、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアミン、アルカノールアミン脂肪酸エステル、４級アンモニウム脂肪酸エステル、ジアルキルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩（ステアリルアミン、オレイン酸トリエタノールアミン、塩化ベンゼトニウムが挙げられる））、両性界面活性剤（例えば、β−アミノプロピオン酸アルキル、２−アルキルイミダゾリンの４級アンモニウム塩）、ならびに双性イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物おいて使用する非イオン性界面活性剤としては、モノラウリル酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、モノラウリル酸ポリオキシエチレン（４）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、もしくはポリソルベート８０）、またはトリオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシ４０、水素化ポリオキシエチレンヒマシ油１０、水素化ポリオキシエチレンヒマシ油５０および水素化ポリオキシエチレンヒマシ油６０、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０、スクロース脂肪酸エステル、ラウリル酸ソルビタン、オレイン酸ソルビタン、パルミチン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、イソステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステリン酸ポリオキシエチレン、ジステアリン酸ポリオキシエチレン、モノステアリン酸グリセリル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ノニルフェノールポリエトキシエタノール、トリブチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、トリリシノレイン酸（ｔｒｉｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）ポリオキシエチレングリセロールまたはポリオキシル３５ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）、オキシステアリン酸ポリオキシエチレングリセロール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ ４０）、水素化ポリエチレングリコール６０ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ ６０）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１２４、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１８８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）２３７、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）３８８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０７（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、使用される界面活性剤は、ポリオキシエチレンモノラウリルエステル、ポリオキシエチレントリラウリルエステル、ポリオキシエチレンパルミチルエステル、ポリオキシエチレンステアリルエステル、またはポリオキシエチレンオレイルエステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、モノラウリル酸ポリオキシエチレン（４）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、もしくはポリソルベート８０）、またはトリオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）である。

必要に応じて、本明細書中に記載される安定な薬学的タンパク質処方物は、保存料、緩衝剤、等張化剤、および薬学的組成物を処方するのに使用される他の従来の成分を含み得る。

１つの実施形態において、本発明の組成物において有用な保存料は、その組成物が安定であるように、例えば、エリスロポエチンに適合し得る保存料である。使用を企図される特定の保存料としては、ベンジルアルコール、パラベン、フェノール、フェノール誘導体、塩化ベンザルコニウムおよびこれらの混合物が挙げられる。利用される特定の保存料に依存して、その保存料の量は変化し得る。例えば、ベンジルアルコールは、０．６〜２．０％の量で使用され、好ましくは、約１％の量で使用される。この濃度において、ベンジルアルコールは、そのエリスロポエチンの安定性に過度に影響を及ぼすことなく、防腐能力および局所麻酔能力を提供する。

別の実施形態において、緩衝剤は、所望の範囲内で、上記組成物のｐＨを維持するために使用される。好ましい薬剤としては、以下のアニオンの、種々の塩、酸性形態、または塩基性形態が挙げられる：クエン酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、乳酸、酢酸、重炭酸、ピルビン酸、およびカルボン酸。使用され得るこれらの緩衝剤の代表的な塩は、その塩およびその量が、注入可能な組成物において生理学的に適合可能である限りは、ナトリウム形態およびカリウム形態である。これらの緩衝剤の混合物もまた、使用され得る。これらの薬剤のうち、クエン酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤が望ましい。上記薬学的組成物において有用な緩衝剤の量は、使用される特定の緩衝剤およびその溶液のｐＨに大きく依存する。例えば、クエン酸は、ｐＨ７よりｐＨ６においてより有効な緩衝剤であり、より少量のクエン酸は、ｐＨ７よりｐＨ６の溶液において使用され得る。上記溶液において好ましいｐＨの範囲は、約５〜８であり、より好ましくは約６〜７．５であり、そして約７のｐＨが、最も好ましい。これらのｐＨ値にわたって、緩衝剤の量は概して、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲である。クエン酸緩衝剤の量は、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲であり得る。同じ保存料、同じ緩衝剤、および同じ等張化剤が、エリスロポエチン以外のタンパク質に使用され得るが、その場合、添加剤のｐＨまたは添加剤の濃度を調整する必要がある。これらの改変は、通常の実験によって決定され得る。

本発明の組成物はさらに、上記溶液を等張性かつ注入により適合可能にするために、等張性調整剤を含む。好ましい薬剤としては、塩化ナトリウム、グリセロール、マンニトール、スクロース、ソルビトールおよびこれらの混合物が挙げられる。最も好ましい薬剤は、塩化ナトリウムである。上記溶液を等張性にするのに必要とされる等張性調整剤の量は、その特定の薬剤によって変化するが、概して、約０．１〜１０％の範囲内である。

１つの実施形態において、上記薬学的タンパク質処方物は、ペプチド安定剤または２つ以上の安定剤を、滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に添加することによって調製される。その溶液のｐＨは、好ましくは約ｐＨ７．２である。界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）が、使用される場合に、それは、上記ペプチド安定剤と一緒に添加され得る。その後、その溶液は、十分に混合され、そして生物学的に活性なタンパク質、例えば、ＥＰＯがその溶液に添加される。必要に応じて、添加剤（例えば、緩衝剤または保存料）が使用される場合、それらは、タンパク質の添加前またはタンパク質の添加後のいずれかに添加され得る。

上記安定な薬学的タンパク質処方物は、密封され、滅菌された、プラスチック容器またはガラス容器に収容され得る。その溶液調製物は、アンプル、バイアルまたは使い捨ての注射器において処方された用量、または複数回投与形態（例えば、注入用のバッグまたはボトル）で供給され得る。１つの実施形態において、その安定な薬学的タンパク質処方物は、少なくとも２４ヶ月、冷蔵状態にて保存され得る。

本発明の安定なタンパク質処方物は概して、非経口的経路、例えば、注射（筋肉内、腹腔内、皮下、または静脈内）で投与されるが、その処方物はまた、他の経路（例えば、経皮的、経粘膜的、または経鼻的）によって投与され得る。

本明細書中に記載される安定な薬学的タンパク質処方物は、その処方物中にあるタンパク質が指示される任意の状態を処置するために使用され得る。一例として、上記処方物中のタンパク質が、エリスロポエチンの場合、その処方物は、赤血球（ＲＢＣ）増殖の刺激が望まれる任意の状態を処置するために使用され得るが、これに限定されない。従って、ＥＰＯは、貧血を処置するために使用され得、貧血は、内因性のエリスロポエチン欠乏、悪性疾患に関する貧血、悪性疾患に対する化学療法／放射線治療から生じる貧血、または慢性疾患に関する貧血に関連する。慢性疾患に関する貧血としては、関節リウマチ、肝炎、ＡＩＤＳ（特に、ＡＺＴで処置される患者）に関連する貧血、未熟児貧血、腎不全に関連する貧血、サラセミアに関する貧血、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、および外科手術に関連する貧血（例えば、骨髄移植を受ける患者における赤血球新生を増加するため）が挙げられるが、これらに限定されない。

別の例において、タンパク質が、ＢＭＰファミリーメンバー（例えば、ＢＭＰ−７）である場合、多くの状態を処置するために使用され得、その状態は、骨形成を向上させる必要性によって特徴付けられる。これらの状態としては、例えば、骨折が挙げられ、骨折においては、骨の成長を刺激しかつ骨の修復を早めることが望まれる。本明細書中に記載されるような処方されたＢＭＰタンパク質によって処置され得る、他の骨の欠損状態としては、骨の部分的な欠損、歯周病、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、および結合組織の修復（例えば、欠損もしくは損傷した軟骨の、治癒または再生）が、有益である状態が挙げられるが、これらに限定されない。骨の成長の必要性によって特徴付けられる他の状態としては、原発性および続発性の、副甲状腺亢進症ならびに骨粗鬆症（加齢に関連した骨粗鬆症、閉経後のホルモン状態に関連した骨粗鬆症、廃用性骨粗鬆症、糖尿病性骨粗鬆症、および糖質コルチコイド性骨粗鬆症を含む）が挙げられる。あるいは、本明細書中で処方されるようなＢＭＰファミリーメンバーは、正常な細胞もしくは正常な組織、または異常な細胞もしくは異常な組織の、代謝、増殖および／または分化を調節するために使用され得る。

本発明の、他の特徴、他の目的、および他の利点は、当業者にとって明らかである。本明細書中に示される説明および例証は、当業者に本発明、その原理、およびその実際の適用を理解させることを意図する。当業者は、本発明を、実際の使用の要件について最適であり得るような多くの形態で、適応および適用し得る。従って、記載された本発明の特定の実施形態は、本発明の網羅することまたは限定することを意図しない。

本明細書中に引用された、全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参考として援用されることが特異的かつ個々に示されているかのように、本明細書中に参考として援用される。

（略語および定義）
本発明の理解を容易にするために、多くの用語は、以下に定義される：
「ＢＭＰ」は、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）についての略語である。

「ＣＤＭＰ」は、軟骨由来形態形成タンパク質についての略語である。

「ＤＰＰ」は、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｅｉｃ）タンパク質を意味する。

「ＧＤＦ」は、増殖因子および分化因子についての略語である。

「ＯＰ」は、骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）についての略語である。

「Ｖｇｒ」は、関連した成長現象（タンパク質）についての略語である。

「ＲＨ」は、相対湿度についての略語である。

「ＨＳＡ」は、ヒト血清アルブミンについての略語である。

「ＡＵＣ」は、曲線下面積の略語である。

本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で使用され、天然に存在するアミノ酸、ならびにアミノ酸類似物およびアミノ酸誘導体を含む天然に存在しないアミノ酸を包含する。その後者としては、アミノ酸部分を含む分子が挙げられる。この広い定義に照らして、当業者は、アミノ酸についての本明細書中の参照が、例えば、天然に存在するタンパク質新生のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、化学修飾されたアミノ酸（例えば、アミノ酸類似物およびアミノ酸誘導体）、天然に存在する非タンパク質新生のアミノ酸、ならびにアミノ酸に特徴的であるとして当該分野で公知の特性を有する化学合成された化合物を包含することを認識する。

本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性なタンパク質」とは、タンパク質が目的のタンパク質のネイティブな形態と実質的に同じ機能を果たす能力をいう。

「組成物」および「処方物」は、本明細書中で交換可能に使用される。

本明細書中で使用される場合、「ペプチド」は、少なくとも１つのペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸からなる化合物を意味する。「ジペプチド」は、ペプチド結合によって連結される２つのアミノ酸からなるペプチドを意味し、「トリペプチド」は、ペプチド結合などによって連結される３つのアミノ酸からなるペプチドを意味する。本発明の意図する「低分子ペプチド」は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドを包含する。

用語「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」および「安定化される（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）」とは、本発明の薬学的組成物が、同じ組成物に対して貯蔵安定性を増したことを意味し、その同じ組成物は、本明細書中に記載されるようないかなるペプチド安定剤も含有しない。本発明によって提供される安定化は、２℃〜８℃の液体形態における向上した貯蔵安定性、再構成を伴わない投与の容易化、そして前充填（ｐｒｅｆｉｌｌ）され、使用の準備のできた注射器中の処方物、またはその処方物が、細菌の発育を阻止する薬剤と適合可能である場合、多回投与（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）調製物を供給する性能を可能にする。好ましくは、本発明の安定な組成物は、冷蔵状態（約２℃と約８℃との間）で、少なくとも６ヶ月間、１２ヶ月間、１８ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、またはそれ以上にわたって保存され得る。

成句「治療有効（治療的に有効）（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」は、代替的な治療に典型的に関連する有害な副作用を回避しながら、処置にわたる疾患重篤度の改善および事故頻度の改善という目的を達成する、生物学的に活性なタンパク質の量を限定することが意図される。

「ＩＵ」または「国際単位」は、薬物または天然に存在する物質の、特定の生物学的効果の量の標準化された測定である。特に、エリスロポエチンに対するＩＵとは、エリスロポエチンの世界保健機構（ＷＨＯ）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎを使用して標準化されるインビボ脱低酸素赤血球増加マウスアッセイ（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘ−ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ａｓｓａｙ）からの単位測定をいう。所定の物質について１つのＩＵを与えるのに必要とされる物質の量は、供給源、状態、品質、純度、および／または物質の型と共に変化する。ＩＵとラジオイムノアッセイによって定義されるような他の単位との間の関係は、Ｓｔｏｒｒｉｎｇら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１００：７９，１９９８を参照することによって、さらに理解され得る。

以下の実施例は、本発明を例示するが、そのように例示された本発明の種々の局面を限定するものとして解釈されるべきではない。

（実施例１）
本研究を、１）低分子ペプチド、または２）低分子ペプチドおよび安定剤としてＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、を含むＰＢＳ溶液中のエリスロポエチンωの安定性を評価するために設計した。その安定性を、いずれの安定剤も使用しない場合か、または安定剤として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を単独で使用した場合の、ＥＰＯωの安定性と比較して評価した。以下の低分子ペプチドを、本研究において使用した：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ．ＨＣＩ．Ｈ_２Ｏ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−ＧｌｙおよびＡｌａ−Ａｌａ。全てのペプチドおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

以下に列挙したプロトコルを適用して、エリスロポエチンωを含む薬学的処方物の保存安定性を評価するために使用する溶液を調製した：
ＰＢＳ溶液を調製するために、ガラスボトル中に
−注射用水（ＷＦＩ）を約８００ｇまで加え；
−８．１８ｇのＮａＣｌ、および１．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏを加え；
−攪拌しながらＷＦＩを配合溶液の全質量が１００６ｇになるまで加え；
−最低限１５分間、素早く攪拌し（混合の終了前に、全ての塩を溶解させるべきである）；
−その溶液中に窒素を導入し；２分間泡立て；
−その溶液のｐＨを決定し、そして１０Ｍ ＮａＯＨで７．２０（７．１０〜７．３０の範囲）に調整し；
−その溶液を、滅菌した０．２２μｍの膜フィルターを通して、滅菌した容器中に濾過し；そして
−その濾過した溶液を使用して、エリスロポエチンの配合溶液を調製する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−ペプチド（１．２５ｇ／Ｌ）のストック溶液を作製するために、ＰＢＳ ｐＨ７．２（５０ｍｌ）とペプチド（６２．５ｍｇ）とを混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（０．３７５ｇ／Ｌ）のストック溶液を作製するために、ＰＢＳ ｐＨ７．２（１０００ｍｌ）とペプチド（０．３７５ｇ）とを混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−ペプチド（１．２５ｇ／Ｌ）−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（０．３７５ｇ／Ｌ）のストック溶液を作製するために、５０ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（０．３７５ｇ）ストック溶液にペプチド（６２．５ｍｇ）を添加する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２中のＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）のストック溶液を作製するために、ＰＢＳ ｐＨ７．２（７５．３ｍｌ）と１４．７ｍｌのＥＰＯ濃縮溶液（３０６，０００ＩＵ／ｍｌ）とを混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２中のＥＰＯ １０，０００ＩＵ／ｍｌの溶液を作製するために、ＰＢＳ ｐＨ７．２と４ｍｌのストックＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）を混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−ＨＳＡ ２．５ｍｇ／Ｌ中のＥＰＯ １０，０００ＩＵ／ｍｌの溶液を作製するために、１６ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．２、４ｍｌのストックＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）および２５０μｌ ＨＳＡ（２０％ ｗ／ｖ）を混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（０．３ｇ／Ｌ）中のＥＰＯ １０，０００ＩＵ／ｍｌの溶液を作製するために、１６ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０ストック溶液と４ｍｌのストックＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）とを混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−ペプチド（１．０ｇ／Ｌ）中のＥＰＯ １０，０００ＩＵ／ｍｌの溶液を作製するために、１６ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．２−ペプチドストック溶液と４ｍｌのストックＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）とを混合する。

ＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（０．３ｇ／Ｌ）−ペプチド（１．０ｇ／Ｌ）中のＥＰＯ １０，０００ＩＵ／ｍｌの溶液を作製するために、１６ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．２−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０−ペプチドストック溶液と４ｍｌのストックＥＰＯ（５０，０００ＩＵ／ｍｌ）とを混合する。

全ての溶液は、均一化を確保するために十分に混合され、そして滅菌した０．２２μｍの膜フィルターを通して、滅菌した容器中に濾過される。

表１は、本研究で使用したＥＰＯサンプルを記載する。

。

サンプルを最初に、２５℃／６０％ＲＨに維持し、そして１週目、２週目、４週目、６週目、８週目および１０週目に分析した。保存の４週間後、２組のサンプルを４０℃／６０％ＲＨに移し、そして６週目および８週目に分析した。これは、安定化効果のいくらかの可能性を拡大するために、その溶液に、より大きい程度に負荷をかけるために行われた。２５℃／６０％ＲＨにおける研究を、１０週間後に中断した。

溶液を、ＷＡＴＥＲＳオーブン、およびＷＡＴＥＲＳ（登録商標）Ｄｕａｌ λ吸光度検出器を備えるＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＡＬＬＩＡＮＣＥ ２６９０を使用する、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。そのシステムを、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）Ｃ４−３００Å−５μｍ ＤＥＬＴＡ−ＰＡＣＫカラムに接続した。サンプルを、２３Ｇ×１_１／４インチ滅菌ＫＥＮＤＡＬＬ Ｍｏｎｏｊｅｃｔ針を備える１．０ ｍｌ ＫＥＮＡＬＬ Ｍｏｎｏｊｅｃｔ注射器を使用してＨＰＬＣバイアル中に移した。そのタンパク質含量を２８０ｎｍにてピークＡＵＣとして測定した。

曲線下面積（ＡＵＣ）を記録し、そしてこれを使用して、初期の反応に基づきタンパク質の回収率を計算した。その回収率を、目的の期間における反応と初期の反応との間の比として計算した。

回収率_ＡＵＣ（％）＝１００×Ｃ_{ＡＵＣ ｔ}／Ｃ_{ＡＵＣ ０}
ここで、回収率_ＡＵＣはＡＵＣに基づく回収率であり、Ｃ_{ＡＵＣ ｔ}はピークのＡＵＣとして表される、目的の期間におけるエリスロポエチン含量であり、そしてＣ_{ＡＵＣ ０}はピークのＡＵＣとして表される、最初の期間におけるエリスロポエチン含量である。

本研究の開始前に、上記ペプチド安定剤に由来する潜在的な分解産物とエリスロポエチンωとの干渉が存在しないことを調査した。これは、低分子ペプチドおよび／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０が、ＥＰＯについての回収率％およびＡＵＣの適切な計算に影響を与え得るかどうかを判断するために設計された、別の実験コントロールである。この問題に取り組むために、低分子ペプチドを含むがエリスロポエチンωを含まない溶液を、注入の前に、２５℃／６０％ＲＨにて４週間および４０℃／６０％ＲＨにて４週間維持した。クロマトグラムの分析は、エリスロポエチンωシグナル（２０．６分）の近辺にシグナルがないことを示し、これは、ペプチドおよび／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０が、ＥＰＯについてのＡＵＣおよび回収率％の計算に影響しないことを示す。

表２（以下を参照のこと）は、低分子ペプチド（Ｂ００４〜Ｂ０１２）を用いて安定化した場合、または低分子ペプチドおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（Ｂ０１３〜Ｂ０２１）を用いて安定化した場合の、２５℃／６０％ＲＨにて１週間、２週間、４週間、６週間、８週間、および１０週間におけるＥＰＯの％回収率、ならびに４０℃／６０％ＲＨにて６週間および８週間におけるＥＰＯの％回収率を示す。この表から理解し得るように、ＥＰＯ単独（Ｂ００２）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）（Ｂ００３）を含むコントロール溶液を除いて、２５℃／６０％ＲＨにて１０週間保存したサンプルではほとんど分解していないことが記録された。同一条件において、ＨＳＡを含むＥＰＯサンプル（Ｂ００１）ではタンパク質が分解していないことが記録された。ＨＳＡを含まないコントロールサンプル（Ｂ００２およびＢ００３）に関して、時間と共にわずかな還元が記録された。さらに、４０℃／６０％ＲＨにおけるＥＰＯの安定性は、同一条件で維持したＨＳＡを含まないコントロールサンプルにおいてより、ペプチドを含むか、またはペプチドとＴｗｅｅｎ（登録商標）とを含むサンプルにおいて、より良好であった。さらに、そして予想通りに、ＥＰＯ溶液は、４０℃においてより２５℃において、より良好な保存安定性を示した。同様の結果を、図１、図２、および図３中の図解として理解され得る。

。

上述される全ての手順が、特定の研究のために改変され得、このことが、使用されるタンパク質、研究の期間などのような要因に依存することは、注目されるべきである。このような改変は、過度の実験を伴わずに、当業者によって設計され得る。

図１は、実施例１に記載されるように、インキュベーションの８週間後、何も加えず（Ｂ００２）、またはＨＳＡの存在下（Ｂ００１）でか、もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の存在下（Ｂ００３）での、２５℃にて４週間および４０℃にて４週間のインキュベーション後のＥＰＯ回収率（％）を示す。 図２は、実施例１に記載されるように、インキュベーションの８週間後、ペプチド安定剤の存在下（Ｂ００４〜Ｂ００１２）で、２５℃にて４週間および４０℃にて４週間におけるインキュベーション後のＥＰＯ回収率（％）を示す。 図３は、実施例１に記載されるように、インキュベーションの８週間後、ペプチド安定剤およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の存在下（Ｂ０１３〜Ｂ０２１）で、２５℃にて４週間ならびに４０℃にて４週間におけるインキュベーション後のＥＰＯ回収率（％）を示す。

Claims (36)

1. 安定な薬学的組成物であって、治療有効量の生物学的に活性なタンパク質、ならびにＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体およびこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を含有し、該組成物は血清アルブミンを含まない、組成物。
2. 前記生物学的に活性なタンパク質が、エリスロポエチン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、濾胞刺激ホルモン、インスリン様成長因子、神経成長因子、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、および腫瘍壊死因子からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記生物学的に活性なタンパク質が、組換え体由来である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記生物学的に活性なタンパク質が、エリスロポエチンである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記エリスロポエチンが、エリスロポエチンωである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記組成物中のエリスロポエチンωの濃度が、約５００ＩＵ／ｍｌと約１００，０００ＩＵ／ｍｌとの間である、請求項５に記載の組成物。
7. エリスロポエチンωの前記濃度が、約２，０００ＩＵ／ｍｌと約２０，０００ＩＵ／ｍｌとの間である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記誘導体が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙの塩、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの塩、Ｇｌｙ−Ｔｙｒの塩、Ｇｌｙ−Ｐｈｅの塩、Ｇｌｙ−Ｈｉｓの塩、Ｇｌｙ−Ａｓｐの塩、Ｇｌｙ−Ａｌａの塩、Ａｌａ−Ｇｌｙの塩、およびＡｌａ−Ａｌａの塩を含有する、請求項１に記載の組成物。
9. 前記血清アルブミンが、ヒト血清アルブミンである請求項１に記載の組成物。
10. 前記組成物中の前記ペプチド安定剤の濃度が、約０．０１ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間である、請求項１に記載の組成物。
11. 前記ペプチド安定剤の前記濃度が、約０．５ｇ／Ｌおよび約５ｇ／Ｌとの間である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記組成物が、さらに界面活性剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
13. 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、またはこれらの混合物である、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記界面活性剤が、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記組成物中の前記界面活性剤の濃度が、約０．０００５％ｗ／ｖと約０．５％ｗ／ｖとの間である、請求項１２に記載の組成物。
16. 安定な薬学的組成物であって、エリスロポエチン、ならびにジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、およびこられの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を含有し、そして該組成物は血清アルブミンを含まない、組成物。
17. 前記ペプチド安定剤が、ジペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記ペプチド安定剤が、トリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
19. 前記ペプチド安定剤が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体、およびこられの混合物からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
20. 前記誘導体が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙの塩、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの塩、Ｇｌｙ−Ｔｙｒの塩、Ｇｌｙ−Ｐｈｅの塩、Ｇｌｙ−Ｈｉｓの塩、Ｇｌｙ−Ａｓｐの塩、Ｇｌｙ−Ａｌａの塩、Ａｌａ−Ｇｌｙの塩、およびＡｌａ−Ａｌａの塩を含有する、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記組成物中の前記ペプチド安定剤の濃度が、約０．０１ｇ／Ｌと約１０ｇ／Ｌとの間である、請求項１６に記載の組成物。
22. 前記ペプチド安定剤の前記濃度が、約０．５ｇ／Ｌと約５ｇ／Ｌとの間である、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記血清アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１６に記載の組成物。
24. 前記エリスロポエチンが、組換えエリスロポエチンである、請求項１６に記載の組成物。
25. 前記組換えエリスロポエチンが、ＢＨＫ細胞中で産生される、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記組換えエリスロポエチンが、ＣＨＯ細胞中で産生される、請求項２４に記載の組成物。
27. 前記組換えエリスロポエチンが、エリスロポエチンωである、請求項２４に記載の組成物。
28. 前記組成物中のエリスロポエチンωの濃度が、約５００ＩＵ／ｍｌと約１００，０００ＩＵ／ｍｌとの間である、請求項２７に記載の組成物。
29. エリスロポエチンの前記濃度が、約２，０００ＩＵ／ｍｌと約２０，０００ＩＵ／ｍｌの間である、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記組成物が、さらに界面活性剤を含有する、請求項１６に記載の組成物。
31. 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、またはこれらの混合物である、請求項３０に記載の組成物。
32. 前記界面活性剤が、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項３１に記載の組成物。
33. 前記組成物中の前記界面活性剤の濃度が、約０．０００５％ｗ／ｖと約０．５％ｗ／ｖとの間である、請求項３０に記載の組成物。
34. 安定な薬学的組成物であって、エリスロポエチン、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ならびにＧｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ａｌａ、これらの誘導体およびこれらの混合物からなる群より選択されるペプチド安定剤を含有し、該組成物は血清アルブミンを含まない、組成物。
35. 前記エリスロポエチンが、エリスロポエチンωである、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記血清アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項３４に記載の組成物。

Images