KR20060136364A - 소형 펩티드에 의한 제약 단백질 제제의 안정화 - Google Patents

소형 펩티드에 의한 제약 단백질 제제의 안정화 Download PDF

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KR20060136364A
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백스터 인터내셔널 인코포레이티드
박스터 헬쓰케어 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 이용하여 안정화된 안정한 제약 단백질 제제에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 에리트로포이에틴, 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 그들의 혼합물로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하는 안정한 제약 제제에 관한 것이다. 펩티드 안정화제에 부가하여, 제제는 계면활성제를 함유할 수 있다.
펩티드 안정화제, 제약 단백질 제제, 에리트로포이에틴, 계면활성제

Description

소형 펩티드에 의한 제약 단백질 제제의 안정화{STABILIZATION OF PHARMACEUTICAL PROTEIN FORMULATIONS WITH SMALL PEPTIDES}
본 발명은 생물학적 활성 단백질 및 펩티드 안정화제를 포함하는 안정한 제약 제제에 관한 것이다. 발명은 추가로 에리트로포이에틴, 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 또는 그들의 혼합물인 안정화제를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 본 발명의 안정한 제약 제제는 트윈(Tween)® 80과 같은 계면활성제를 함유할 수 있다.
유전자 재조합 기술의 발전에 따라, 수많은 단백질이 치료 용도를 위해 이용가능하게 되었다. 예로써, 질환을 치료하는데 현재 사용되고 있는 단백질은 에리트로포이에틴, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 헤모글로빈, 인슐린, 인터페론 알파, 베타, 및 감마, 혈관 내피 성장 인자, 인터류킨 2, 및 많은 다른 것들을 포함한다. 그러나, 단백질은 생리적 불안정성 (예를 들어, 변성, 응집체의 형성 등) 및 가수분해, 산화, 및 탈아미드화와 같은, 화학적 불안정성의 결과 생물학적 활성을 상실할 수 있다. 단백질의 안정성은 추가로 pH, 온도, 장성, 및 동결-해동 주기의 수와 같은 인자에 의해 영향을 받는다.
안정성을 보장하기 위하여, 치료용 단백질 제제는 일반적으로 별도로 포장된 수용성 희석제에 사용 직전에 용해되는 동결건조된 단백질이나, 안정성을 향상시키기 위한 첨가제를 함유하는 단백질 용액으로 공급된다. 예를 들어, 단백질 용액을 제제화하는데 유용한 유리 아미노산 (예를 들어, 류신, 트립토판, 세린, 아르기닌 및 히스티딘)과 같은 첨가제가 예를 들어 AU 722300; US 5,691,312; US 6,120,761과 같은 특허에 제안되어 있다. 시장에서 현재 이용가능한 일부 단백질 제제는 안정화제로서 단백질을 함유한다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴이 단백질 용액에서 화학적 및 물리적 변화를 억제하는데 사용된다. 그러나, 이들 단백질의 첨가는 바이러스 오염을 제거하기 위한 복잡한 과정을 포함한다. 동결건조는 안정성을 보장하기 위하여 사용되는 또 하나의 방법이지만; 이 과정은 제조 비용을 증가시키고, 동결건조된 단백질이 사용 직전에 용해되어야만 하므로, 부적절한 투여의 증가된 위험을 포함한다. 미국특허 제5,705,482호는 펩티드 Leu-His-Leu로 안정화된 인간 성장 호르몬 (hGH)의 제약 용액을 개시하고 있다.
치료제로 널리 사용되는 단백질 중 하나는 에리트로포이에틴이다. 에리트로포이에틴은 적혈구의 형성을 자극하는 34-39 kDa 당단백질 호르몬이다. 그것은 신장에서 생산되고, 일단 생산되면, 그것은 그것이 추후 적혈구로 성숙하는 전적혈구모세포로의 원시 전구 세포의 전환을 자극하는 골수로 순환한다. 정상적인 건강한 상태에서는, 에리트로포이에틴은 혈장 중에 매우 낮은 농도로, 즉 약 0.01 내지 0.03 U/㎖로 존재하지만, 저산소증이 일어날 때, 즉 수송 중인 산소 수준이 감소될 때, 신장은 더 많은 에리트로포이에틴을 생산한다. 저산소증은 예를 들어, 대량의 혈액 유실, 방사선에 의한 적혈구의 파괴, 또는 높은 고도에 대한 노출의 결과일 수 있다. 또한, 적혈구는 신체에서 산소 수송을 담당하므로 다양한 형태의 빈혈이 저산소증을 유발한다. 정상 상태에서, 증가된 수준의 에리트로포이에틴은 새로운 적혈구의 생산을 자극하여 산소 수준을 증가시키고 저산소 상태를 감소시키거나 제거한다.
정상적으로 일어나는 저산소증의 이 보정과는 반대로, 만성 신부전 ("CRF") 환자는 에리트로포이에틴의 생산이 제한되거나 일어나지 않고 결과적으로, 충분한 적혈구를 생산하지 못한다. 적혈구의 정상적 수명은 약 120 일이므로, 그러한 환자는 시간에 따라 점점 더 빈혈이 된다. 재조합 에리트로포이에틴의 개발 전에는, 만성 신부전 환자는 최소 수준의 적혈구를 유지하기 위하여 정기적인 수혈을 받아야만 했다.
환자를 치료하는데 현재 사용되는 몇몇 형태의 에리트로포이에틴이 있다 - 에리트로포이에틴 알파, 베타, 오메가 및 델타. 에리트로포이에틴 오메가는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포로 형질전환된 인간 게놈 에리트로포이에틴 DNA의 ApaⅠ 단편으로부터 발현되는 재조합 단백질이다. 에리트로포이에틴 오메가 및 그의 발현은 예를 들어 미국특허 제5,688,679호에 기재되어 있다. 더욱이, EPO 오메가에 있는 탄수화물 잔기의 구조와 조성은 예를 들어, 문헌 ([Nimtz et al., Eur. J. Biochem., 213: 39, 1993] 및 [Tsuda et al., Eur. J. Biochem., 188: 405, 1990])에 기재되어 있다. EPO 오메가는 약 35 kDa의 평균 분자량을 갖고 상이한 타입과 양의 글리코실화의 지표인, 여러 이소폼 (예를 들어, 등전 집중에 의해, 넓은 컷 분획에서 약 6-8 이소폼 및 피크 분획에서 6 이소폼)을 포함한다. EPO 오메가는 당단백질의 몰 당 1 몰 미만의 0-결합된 올리고당 함량을 갖고 아미노산 잔기 Asn-24, Asn-38, 및 Asn-83에 세 N-글리코실화 위치와 아미노산 잔기 Ser-126에 하나의 O-글리코실화 위치를 갖는다. 더욱이, 문헌 [Sytkowski et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176 (2): 698-704, 1991)에 보고되어 있는 바와 같이, 뇨 인간 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 알파 또는 베타와 달리, EPO 오메가는 비록 완전하지는 않을지라도, 실질적인, N-탈글리코실화에 이르게 하는 상태에 가해진 후에조차 실질적으로 모든 그의 생체 내 생물학적 활성을 보유한다.
상업적으로 입수가능한 EPO 제제는, 일반적으로 잘 견뎌지고 안정하지만, 극도의 조건 하에서, 그러한 제제는 불안정하고 활성 상실을 겪을 수 있다. 이들 활성 상실은 미량의 중금속, 대기 산소 등으로 인한 저장을 위해 사용되는 앰풀 표면의 촉매 효과에 의한 EPO의 파괴, 및 또한 용기 벽 상의 EPO 분자의 침적에 기인할 수 있고, 가능하게는 그의 부분적인 변성도 일어난다. 단지 소수의 미생물만이 각각의 용량 단위에 존재한다는 사실을 고려하면, 흡착으로 인한 상실은, 짧은 저장 시간 후에조차, 상당할 수 있다. 더욱이, 활성 상실은 열과 빛과 같은 외부 인자에 의해, 또는 알부민과 같은 인간 혈액 산물을 함유하지 않는 제제에서, 또는 벤질 알콜과 같은 보존제를 함유하는 다중-용량 제제에서 가속화될 수 있다.
따라서, 목적 단백질을 동결건조하거나 안정화제로 인간 단백질을 사용할 필요가 없이 향상된 안정성을 나타내는, 제약 단백질 제제가 바람직하다.
발명의 요약
일 실시양태에서, 본 발명은 제제가 생물학적 활성 단백질 및 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하며, 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 단백질 제제에 관한 것이다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴, 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하며, 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 단백질 제제에 관한 것이다.
다른 또 하나의 실시양태에서 에리트로포이에틴, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제, 및 트윈® 80을 포함하는며, 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 조성물이 제공된다.
다른 목적 및 특징은 일부 명백하고 일부 이하에서 지적될 것이다.
도 1은 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 8 주의 인큐베이션 후 단독 (B002) 또는 HSA (B001) 또는 트윈® 80 (B003)의 존재 하에 25 ℃에서 4 주 및 40 ℃에서 4 주간의 인큐베이션 후 EPO 회수(%)를 도시한다.
도 2는 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 8 주의 인큐베이션 후 펩티드 안정화제 (B004-B0012)의 존재 하에 25 ℃에서 4 주 및 40 ℃에서 4 주간의 인큐베이션 후 EPO 회수(%)를 도시한다.
도 3은 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 8 주의 인큐베이션 후 펩티드 안정화제 및 트윈® 80 (B013-B021)의 존재 하에 25 ℃에서 4 주 및 40 ℃에서 4 주간의 인큐베이션 후 EPO 회수(%)를 도시한다.
본 발명은 안정한 제약 단백질 제제로서, 그러한 제제의 안정화가 소형 펩티드를 사용함으로써 달성되는 제제이다. 여기에 기재된 제약 단백질 제제는 외래 단백질을 함유하지 않는 안전한 제제이다. 여기에 기재된 제제에서 안정화제로 사용되는 소형 펩티드는 통상적인 안정화제 보다 더 저렴하고, 제조 과정 중 발생하는 비용도 동결건조 제품에 대한 것 보다 더 낮다. 더욱이, 소형 펩티드를 사용함으로써, 제약 단백질 제제는 바이러스 오염물을 함유할 수 있는, 인간 혈청 알부민이나 젤라틴과 같은 다른 인간 또는 동물 단백질의 첨가를 방지한다.
여기에 기재된 조성물로 도입하기 위한 단백질은 인간 대상에서 치료적 가치를 갖는 어느 단백질일 수도 있다. 따라서, 그러한 단백질은, 제한 없이, 에리트로포이에틴 (EPO), 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 트롬보포이에틴, 헤파린, 인터페론 알파, 베타 및 감마, 인터류킨 2, 난포 자극 인자, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 신경 성장 인자 (NGF), 종양 괴사 인자 (TNF), 및 골 형태형성 족 단백질 (BMPs)을 포함한다. BMPs는 확장된 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β 거대족)의 신규 인자이다. 그들은 탈미네랄화된 뼈의 추출물에서 생물학적 활성을 특성분석한 앞선 기재 (문헌 [Urist M. Science (1965) 150: 893-99)]에 이어서, 유전자 클로닝 기술을 이용하여, 문헌 [Wozney J. et al. Science (1988) 242: 1528-34]에 의해 처음 동정되었다. 이들 인자는 정상 골아세포에 의해 그들이 분화할 때 발현되고, 생체 내에서 골 형성 뿐만 아니라 시험관 내에서 골아세포 분화 및 골 결절 형성을 자극하는 것으로 나타나 있다 (문헌 [Harris S. et al. J. Bone Miner Res (1994) 9: 855-63]). 이 후자의 성질은 골 유실로 귀결되는 질환에서 치료제로서 잠재적 유용성을 암시한다. 골 형태형성 단백질 (BMPs)은 포유류 골형성 단백질-1 (OP-1, BMP-7, 및 드로소필라 동족체 60A로도 알려져 있음), 골형성 단백질-2 (OP-2, BMP-8으로도 알려져 있음), 골형성 단백질-3 (OP-3, BMP-8B로도 알려져 있음), BMP-2 (BMP-2A, 및 드로소필라 동족체 DPP로도 알려져 있음), BMP-3, BMP-4 (BMP-2B로도 알려져 있음), BMP-5, BMP-6 및 그의 쥐 동족체 Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF-3 (Vgr2로도 알려져 있음), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (CDMP-1로도 알려져 있음), GDF-6 (CDMP-2로도 알려져 있음), 및 GDF-7 (CDMP-3 또는 BMP-12로도 알려져 있음)을 포함한다.
위 특정된 모든 단백질은 당업계에 잘 알려져 있고, 그들의 재조합적 제작은 당연히 당업자의 지식 내에 있다. 더욱이, 당업자는 어느 부가적인 단백질이 본 발명에 따라 제제화될 수 있는지 쉽게 결정할 수 있다.
일 실시양태에서, 단백질은 에리트로포이에틴, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터류킨 2, 난포 자극 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자, 신경 성장 인자, BMP-2, BMP-4, BMP-7, 및 종양 괴사 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 하나의 실시양태에서, 단백질은 BMP-7이다. BMP-7 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 예를 들어, 미국특허 제5,141,905호에 기재되어 있고, BMP-7 단백질의 제조방법은 예를 들어, 미국특허 제5,366,875호에 기재되어 있다.
다른 또 하나의 실시양태에서, 단백질은 에리트로포이에틴이다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 EPO는 포유류, 특히 인간 EPO의 것과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖고 자연 발생 EPO와 유전자 재조합에 의해 수득된 EPO를 포함한다. 유전자 재조합으로부터의 EPO는 자연 발생 EPO의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 EPO, 또는 하나 이상의 아미노산이 결실되거나, 하나 이상의 아미노산이 치환되거나, 하나 이상의 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 갖지만, 상기 생물학적 활성을 보유하는 EPO를 포함한다. 본 발명에서 EPO는 어느 방법, 예를 들어, 인간 뇨로부터의 추출 후, 다양한 방식으로의, 분리 및 정제를 포함하는 방법; 및 예를 들어, E. 콜라이, 효모, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포에서의 제조 후, 다양한 방식으로의 추출, 분리 및 정제를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시양태에서, EPO는 CHO 세포에서 생산된 재조합 EPO이다. 이들 세포에서의 EPO의 생산을 위해, 예를 들어, 미국특허 제4,703,008호를 참조하라. 또 하나의 실시양태에서, EPO는 BHK 세포에서 제조된 재조합 EPO이다. BHK 세포에서 EPO의 생산은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,688,679호를 참조하라. 다른 또 하나의 실시양태에서, 에리트로포이에틴은 에리트로포이에틴 오메가 (EPO 오메가의 설명에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제5,688,679호 및 WO 02/14356을 참조하라)이다.
여기에 기재된 조성물 중 생물학적 활성 단백질의 양은 목적하는 결과를 달성하기 위하여 단위 용량 당 치료 유효량의 단백질을 전달하는데 필요한 양이다. 따라서, 그 양은 단백질과, 치료되는 질환의 타입, 환자의 나이, 질환의 중증도, 다른 이상의 존재 등과 같은, 수많은 다른 인자에 기초하여 변화할 수 있다. 당업자는 조성물에 포함될 단백질의 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있다.
일 실시양태에서, 생물학적 활성 단백질이 에리트로포이에틴일 때, 제약 제제 중 EPO의 양은 약 500 IU/㎖ 내지 약 100,000 IU/㎖이다. 또 하나의 실시양태에서, EPO의 농도는 약 1,000 IU/㎖ 내지 약 50,000 IU/㎖이고, 다른 또 하나의 실시양태에서, 그것은 약 2,000 IU/㎖ 내지 약 20,000 IU/㎖이다. 바람직한 실시양태에서, 여기에 개시된 제약 제제 중 EPO의 농도는 약 10,000 IU/㎖이다. 소아 적응증을 위해, EPO는 약 1,000 IU/㎖의 농도로 제제화될 수 있다.
환자 치료를 위해, EPO 오메가는 처음에는 헤모글로빈 수준을 증가시키기 위하여 더 높은 용량으로, 나중에는 용량이 지속 및 연속 요법을 위해 조정되는, 유지 기간을 위해 적당한 더 작은 용량으로 투여될 수 있다. EPO 오메가는 매주 1 내지 3회 약 5 IU/㎏ 내지 약 150 IU/㎏의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 다른 실시에서, EPO 오메가는 주 당 2회, 약 25 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 또는 약 25 IU/㎏ 내지 약 35 IU/㎏의 용량으로 투여된다. 다른 또 하나의 실시에서, EPO 오메가는 주 당 1회 약 50 IU/kg 내지 약 150 IU/kg, 또는 약 75 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏의 용량으로 투여된다.
여기에 기재된 조성물에 사용되는 펩티드 안정화제는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 그들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 예시적 펩티드는 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물을 포함하지만; 다른 펩티드 역시 사용될 수 있다.
단백질 제제에서 사용하기 위한 펩티드는 그들이 상업적으로 입수가능하면, 상업적 공급자로부터 구입될 수 있거나, 합성될 수 있다. 펩티드의 고상 화학 합성의 원리는 당업계에 잘 알려져 있고 당업계의 일반적인 교재에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [H. Dugas and C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY, (1981) Springer-Verlag, New York, pgs. 54-92]를 참조하라. 예를 들어, 펩티드는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 430A 펩티드 합성기 (어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티 캘리포니아로부터 상업적으로 입수가능) 및 어플라이드 바이오시스템즈에 의해 공급되는 합성 사이클을 이용하는 고상 방법에 의해 합성될 수 있다.
더욱이, 여기에 기재된 제제에 사용되는 소형 펩티드를 설계함에 있어서, 보존적 아미노산 치환이 적용될 수 있다. 본 발명의 펩티드에서 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초할 수 있다. 본 펩티드 내에 침묵하는 변화를 일으키는 보존적 아미노산 변화를 만들기 위해 다양한 상기 특성을 갖는 예시적 치환 등은 자연 발생 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 아미노산은 아래 네 그룹으로 나뉠 수 있다: (1) 산성 아미노산; (2) 염기성 아미노산; (3) 중성 극성 아미노산; 및 (4) 중성 비-극성 아미노산. 이들 다양한 그룹 내의 대표적 아미노산은 (1) 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 (생리적 pH에서 음으로 하전되는) 아미노산; (2) 아르기닌, 히스티딘, 및 리신과 같은 염기성 (생리적 pH에서 양성으로 하전되는) 아미노산; (3) 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민과 같은 중성 극성 아미노산; 및 (4) 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌과 같은 중성 비-극성 아미노산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 장점을 가질 것으로 예상되지 않는 변화 또한 이들이 기능적 서열의 생산으로 귀결하면 유용할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환의 원리를 이용함으로써, Gly-Ala은 예를 들어, Ser-Leu, Thr-Leu, Thr-Ile 등으로 대체될 수 있다. 당업자는 보존적 아미노산 치환을 갖는 펩티드의 서열을 쉽게 결정할 수 있다.
발명의 소형 펩티드에 사용하기 위한 아미노산 잔기의 예는 D-아미노산 및 비-단백질형성 아미노산 뿐만 아니라 단백질형성 L-아미노산 (즉, 정상적으로 단백질로 도입되는 20 아미노산)과 같은 자연 발생 아미노산 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 비-단백질형성 아미노산은 일반적으로 단백질형성 아미노산의 대사물 또는 유사체이다. 자연 발생 비-단백질형성 아미노산의 비-제한적 예는 오르니틴, 타우린, 하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 노르류신, β-알라닌, 감마 아미노부티르산, 셀레노시스테인, 포스포세린, 피로글루탐산, 및 피로리신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 아미노산은 또한 비-자연 발생 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 비-자연 발생 아미노산은 아미노산 유도체 및 유사체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 아미노산 유도체의 비-제한적 예는 셀레노메티오닌, 텔루로-메티오닌 및 p-아미노페닐알라닌, 불화 아미노산 (예를 들어 불화 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌), 니트로페닐알라닌, 니트로벤족사디아졸릴-L-리신, 데옥시메틸아르기닌, 및 사이클로헥실알라닌을 포함한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 특성인 것으로 당업계에 알려져 있는 성질을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함하고, 그 예는 예를 들어, 트립토판 "유사체" b-셀레놀로[3,2-b]피롤릴알라닌 및 프롤린 "유사체" 티아프롤린 (1,3-티아졸리딘-4-카르복실산)을 포함한다. 부가적인 아미노산 유도체는 아미노산 염, 아실화된 아미노산, 및 알파-케토 아미노산을 포함한다.
일 실시양태에서, 펩티드 안정화제는 아미노산 염을 함유할 수 있다. 예로써, 그러한 염은 아미노산 하이드로클로라이드와 같은 무기산 또는 아미노 아세테이트와 같은 유기 산으로 제조될 수 있다. 예를 들어, L-히스티딘 하이드로클로라이드 또는 L-알라닌 하이드로클로라이드와 같은, 아미노산 하이드로클로라이드를 함유하는 펩티드가 사용될 수 있다. 아미노산 하이드로클로라이드는 상업적으로 입수가능하거나 그들은 당업계에 알려져 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, Gly-His.HCl.H2O, Gly-Ala.HCl.H2O, Ala.HCl.H2O-Gly, 및 Ala.HCl.H2O-Ala.HCl.H2O가 아미노산 염을 이용하는 펩티드 안정화제 예의 일부이다. 또 하나의 실시양태에서, 펩티드 안정화제는 아실화된 아미노산 및/또는 알파-케토 아미노산을 함유한다. 상기 예에 더하여, 수많은 상이한 펩티드가 상기 아미노산을 이용하여 창제될 수 있다. 제한이 아닌 예로써, 디펩티드는 L-아미노산 및 D-아미노산, L-아미노산 및 아미노산 염, D-아미노산 및 아미노산 유사체, L-아미노산 및 아실화된 아미노산, L-아미노산 및 알파-케토 아미노산, 아실화된 아미노산 및 알파-케토 아미노산, 두 아실화된 아미노산, 두 L-아미노산, 두 아미노산 염 등을 함유할 수 있다. 당업자는 디펩티드 뿐만 아니라, 발명의 다른 소형 펩티드를 위한 부가적인 아미노산 조합 또한 쉽게 인식할 수 있다.
제약 제제는 단일 종의 펩티드 (예를 들어 Gly-Gly) 또는 펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 예로써, 혼합물은 디펩티드와 디펩티드 (예를 들어 Gly-Gly, Gly-His), 디펩티드와 트리펩티드 (예를 들어 Ala-Ala과 Gly-Gly-Gly), 트리펩티드와 펜타펩티드, 두 디펩티드와 하나의 트리펩티드 등을 포함할 수 있다.
여기에 기재된 안정한 제약 조성물 중 펩티드 안정화제 또는 그들의 혼합물의 농도는 약 0.01 g/ℓ 내지 약 10 g/ℓ이다. 또 하나의 실시양태에서, 펩티드 안정화제의 농도는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ이다. 다른 또 하나의 실시양태에서, 펩티드 안정화제의 농도는 약 1 g/ℓ이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 안정한 제약 단백질 조성물은 계면활성제를 함유한다. 특정 이론에 구속되지 않으면서, 용액 중 계면활성제의 존재는 제제가 저장되는, 용기의 벽에 대한 EPO와 같은, 생물학적 활성 단백질의 부착을 감소시킨다. 여기에 기재된 제제에 사용되는 계면활성제의 양은 약 0.0005% w/v 내지 약 0.5% w/v 범위이다. 일 실시양태에서, 계면활성제, 특히 트윈® 80의 양은 0.03% w/v이다. 또 하나의 실시양태에서, 계면활성제는 비경구 투여를 위해 적당하다.
약제학적으로 허용가능한 어느 계면활성제도 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 그러한 계면활성제는 제한 없이, 비이온성 계면활성제 (예를 들어 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 알킬렌 글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 지방산 에스테르, 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 지방산 에테르, C16-C24 지방산, 지방산 모노-, 디- 또는 폴리-글리세리드, 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀, 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 지방 아민 옥사이드, 지방산 알칸올아미드, 알킬 셀룰로스, 카르복시알킬 셀룰로스, 폴리옥시알킬렌 피마자유 유도체), 음이온성 계면활성제 (예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트를 포함하는, 알킬 설페이트, 올레핀 설페이트, 에테르 설페이트, 모노글리세리드 설페이트, 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 올레핀 설포네이트, 알킬 설포석시네이트, 아릴 설포석시네이트), 양이온성 계면활성제 (예를 들어 스테아릴아민, 트리에탄올아민 올리에이트, 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는, 벤즈알코늄 염, 폴리옥시알킬렌 알킬아민, 알킬아민, 알칸올아민 지방산 에스테르, 4급 암모늄 지방산 에스테르, 디알킬 암모늄 염, 알킬 피리디늄 염), 양쪽성 계면활성제 (예를 들어 알킬 β-아미노프로피오네이트, 2-알킬이미다졸린 4급 암모늄 염) 및 쯔비터이온성 계면활성제를 포함한다. 발명의 조성물에 사용하기 위한 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트(트윈® 20), 폴리옥시에틸렌 (4) 소르비탄 모노라우레이트(트윈® 21), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트 (트윈® 40), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트 (트윈® 60), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트 (트윈® 65), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트 (트윈®) 80 또는 폴리소르베이트 80), 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올리에이트 (트윈® 85), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 모노올리에이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 슈크로스 지방산 에스테르, 소르비탄 라우레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 팔미테이트, 소르비탄 스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 세스퀴올리에이트, 소르비탄 트리올리에이트, 소르비탄 이소스테아레이트, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 미리스테이트, 나트륨 팔미테이트, 나트륨 스테아레이트, 나트륨 올리에이트, 노닐페놀 폴리에톡시에탄올, 트리부틸페녹시-폴리에톡시에탄올, 옥틸페녹시-폴리에톡시에탄올, 폴리옥시에틸렌 글리세롤 트리리시놀리에이트 또는 폴리옥실 35 피마자유 (크레모포어(Cremophor)® EL, 바스프(BASF) Corp.), 폴리옥시에틸렌 글리세롤 옥시스테아레이트 (크레모포어®RH40), 폴리에틸렌 글리콜 60 수소화 피마자유 (크레모포어® RH60), 폴록사머(Poloxamer)® 124, 폴록사머® 188, 폴록사머® 237, 폴록사머® 388, 폴록사머® 407 (바스프 와이안도트(BASF Wyandotte) Corp.), 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 사용되는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 (트윈® 20), 폴리옥시에틸렌 (4) 소르비탄 모노라우레이트 (트윈® 21), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트 (트윈® 40), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트 (트윈® 60), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트 (트윈® 65), 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트 (트윈® 80 또는 폴리소르베이트 80) 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올리에이트 (트윈® 85)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 트리-라우릴, 팔미틸, 스테아릴 또는 올레일 에스테르이다.
임의로, 여기에 기재된 안정한 제약 단백질 제제는 보존제, 완충제, 등장화제, 및 제약 조성물을 제제화하는데 사용되는 기타 통상적인 성분을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 조성물에서 유용한 보존제는 조성물이 안정하도록 예를 들어, 에리트로포이에틴과 적합한 그들 보존제이다. 사용을 위해 착상되는 특정 보존제는 벤질 알콜, 파라벤, 페놀, 페놀 유도체, 벤즈알코늄 클로라이드 및 그들의 혼합물을 포함한다. 사용되는 특정 보존제에 따라, 보존제의 양은 변할 수 있다. 예를 들어, 벤질 알콜은 0.6-2.0%의 양으로, 바람직하게는 약 1%의 양으로 사용된다. 이 농도에서, 벤질 알콜은 에리트로포이에틴의 안정성에 부당하게 영향을 미치지 않으면서 보존 및 국소 마취 효능을 제공한다.
또 하나의 실시양태에서, 완충제는 조성물의 pH를 목적하는 범위 내에서 유지하는데 사용된다. 바람직한 물질은 다양한 염, 산성 또는 염기성 형태의 아래 음이온을 포함한다: 시트레이트, 포스페이트, 타르트레이트, 석시네이트, 아디페이트, 말리에이트, 락테이트, 아세테이트, 바이카보네이트, 피루베이트 및 카보네이트. 사용될 수 있는 이들 완충제의 대표적 염은, 염과 양이 주사용 조성물에서 생리적으로 적합한 한, 나트륨 및 칼륨 형태이다. 이들 완충제의 혼합물 또한 사용될 수 있다. 이들 물질 중, 시트레이트와 포스페이트 완충제가 바람직하다. 제약 조성물에서 유용한 완충제의 양은 거의 사용되는 특정 완충제와 용액의 pH에 의존한다. 예를 들어, 시트레이트는 pH 7에서 보다 pH 6에서 보다 효율적인 완충제여서 pH 7 보다 pH 6에 있는 용액에서 더 적은 시트레이트가 사용될 수 있다. 용액의 바람직한 pH 범위는 약 5-8이고, 약 6-7.5가 보다 바람직하고, 약 7의 pH가 가장 바람직하다. 이들 pH 값에 걸쳐, 완충제의 양은 일반적으로 약 1 mM 내지 약 30 mM 범위일 것이다. 시트레이트 완충제의 양은 약 1 mM 내지 약 20 mM 범위일 수 있다. 동일한 보존제, 완충제, 및 등장화제가 에리트로포이에틴 이외외 단백질을 위해 사용될 수 있지만; pH나 첨가제의 농도를 조정하는 것이 필요할 수 있다. 이들 변형은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액이 등장성이고 주사를 위해 보다 적합하도록 하기 위해 등장성 조정제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 물질은 염화나트륨, 글리세롤, 만니톨, 슈크로스, 솔비톨 및 그들의 혼합물을 포함한다. 가장 바람직한 물질은 염화나트륨이다. 용액을 등장성으로 하기 위해 필요한 등장성 조정제의 양은 특정 물질에 따라 변화하지만 일반적으로 약 0.1-10%의 범위 내에 속한다.
일 실시양태에서, 제약 단백질 제제는 펩티드 안정화제나 두 개 이상의 안정화제의 혼합물을 멸균 인산염 완충화된 염수 (PBS) 용액에 첨가함으로써 제조된다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 pH 7.2이다. 계면활성제, 예를 들어 트윈® 80이 사용되면, 그것은 펩티드 안정화제와 함께 첨가된다. 이것에 이어서, 용액은 잘 혼합되고, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어, EPO가 용액에 첨가된다. 임의로, 완충제나 보존제와 같은 부가적인 물질이 사용되면, 그들은 단백질 첨가 전이나 단백질 첨가 후에 첨가될 수 있다.
안정한 제약 단백질 제제는 밀봉된, 멸균 플라스틱 또는 유리 용기에 함유될 수 있다. 용액 제제는 앰풀, 바이알 또는 일회용 주사기, 또는 주사용 백이나 병과 같은 다중 제형 중에 처방된 용량으로 공급될 수 있다. 일 실시양태에서, 안정한 제약 단백질 제제는 적어도 24 개월 동안 냉장 조건에서 저장될 수 있다.
본 발명의 안정한 단백질 제제는 일반적으로 비경구 경로, 예를 들어, 주사 (근육내, 복강내, 피하 또는 정맥내)에 의해 투여되지만; 제제는 또한 경피, 경점막 또는 경비와 같은, 기타 경로에 의해 투여될 수 있다.
여기에 기재된 안정한 제약 단백질 제제는 제제 중에 있는 단백질이 적응증으로 하는 어느 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 제한이 아닌 예로써, 제제 중의 단백질이 에리트로포이에틴일 때, 제제는 적혈구 (RBC) 증식의 자극이 원해지는 어느 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, EPO는 빈혈이 내생적 에리트로포이에틴 결핍과 관련되어 있는 빈혈, 악성 질환의 빈혈, 악성 질환의 화학요법/방사선 치료로부터 초래되는 빈혈, 또는 만성 질환의 빈혈을 치료하는데 사용될 수 있다. 만성 질환의 빈혈은 류마티스성 관절염, 간염, AIDS (특히 AZT로 치료되는 환자에서), 미숙아의 빈혈, 신부전과 관련된 빈혈, 지중해성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 및 수술과 관련된 빈혈 (예를 들어, 골수 이식을 수행한 환자에서 조혈을 증가시키기 위하여)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
또 하나의 예에서, 단백질이 BMP-7과 같은 BMP 족 구성원일 때, 그것은 골 형성을 증진시킬 필요를 특징으로 하는, 적혈구과다증의 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 이상은, 예를 들어, 골 성장을 자극하고 골 수복을 서두르는 것이 바람직한 골절을 포함한다. 여기에 기재된 바와 같이 제제화된 BMP 단백질로 치료될 수 있는 기타 골 결함 이상은 제한 없이 골 분절 결손, 치주 질환, 전이성 골 질환, 골용해성 골 질환 및 모세관 결손이나 손상의 치유나 재생과 같은, 결합 조직 수복이 유익한 이상을 포함한다. 골 성장에 대한 필요를 특징으로 하는 다른 이상은 원발성 및 이차성 부갑상선기능항진증 및 골다공증 (나이-관련 골다공증, 폐경-후 호르몬 상태와 관련된 골다공증, 불용 골다공증, 당뇨-관련 골다공증, 및 글루코코르티코이드-관련 골다공증 포함)을 포함한다. 대안으로, 여기에 제제화된 바와 같은 BMP 족 구성원은 정상 또는 이상 세포나 조직의 대사, 증식 및/또는 분화를 변조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 당업자에게 명백해질 것이다. 여기에 제공된 설명과 예시는 다른 당업자가 발명, 그의 원리 및 그의 실제 적용을 알도록 하고자 하는 것이다. 당업자는 발명을 특정 용도의 요건에 가장 잘 맞도록, 그의 수많은 형태로 적합화하고 적용할 수 있다. 따라서, 나타내어진 바와 같은 본 발명의 구체적 실시양태는 본 발명을 망라하거나 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물과 특허출원은 각각의 개별적인 간행물이나 특허출원이 참조에 의해 도입되는 것으로 구체적이고도 개별적으로 표시된 것 처럼 참조에 의해 여기에 도입된다.
약어 및 정의
발명의 이해를 용이하게 하기 위하여, 많은 용어가 아래에 정의된다:
"BMP"는 골 형태형성 단백질의 약어이다.
"CDMP"는 모세관-유래 형태형성 단백질의 약어이다.
"DPP"는 데카펜타플레직(decapentaplegic) 단백질을 나타낸다.
"GDF"는 성장 및 분화 인자의 약어이다.
"OP"는 골형성 단백질의 약어이다.
"Vgr"은 식물성 (단백질) 관련의 약어이다.
"RH"는 상대적 습도의 약어이다.
"HSA"는 인간 혈청 알부민의 약어이다.
"AUC"는 곡선 하 면적의 약어이다.
여기에 사용된, 용어 "아미노산"은 그의 최광의로 사용되고, 자연 발생 아미노산도 아미노산 유사체 및 유도체를 포함하는, 비-자연 발생 아미노산도 포함한다. 후자는 아미노산 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 당업자는, 이 넓은 정의에 비추어, 아미노산에 대한 여기에서의 언급이 예를 들어, 자연 발생 단백질형성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 유사체 및 유도체와 같은 화학적으로 변형된 아미노산; 자연 발생 비-단백질형성 아미노산, 및 아미노산의 특성인 것으로 당업계에 알려져 있는 성질을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함하는 것을 이해할 것이다.
여기에 사용된, "생물학적 활성 단백질"은 관심있는 천연 형태의 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 단백질의 능력을 말한다.
"조성물"과 "제제"는 여기에서 상호교환가능하게 사용된다.
여기에 사용된, "펩티드"는 적어도 하나의 펩티드 결합에 의해 연결된 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 화합물을 의미한다. "디펩티드"는 하나의 펩티드 결합에 의해 연결된 두 아미노산으로 구성된 펩티드를 의미하고, "트리펩티드"는 펩티드 결합들에 의해 연결된 세 아미노산으로 구성된 펩티드를 의미하는 등이다. 본 발명의 목적을 위한 "소형 펩티드"는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 및 펜타펩티드를 포함한다.
용어 "안정한" 및 "안정화된"은 발명의 제약 조성물이 여기에 기재된 바와 같은 어느 펩티드 안정화제도 포함하지 않는, 동일한 조성물에 대해 증가된 저장 안정성을 가짐을 의미한다. 본 발명에 의해 제공되는 안정화는 2-8 ℃에서 액체 형태에서 증가된 저장 안정성, 재구성 없는 투여의 용이성, 및 제제를 예비충전된, 즉시 사용형 주사기나 제제가 정균제와 적합성이면 다중용량 제제로서 제공하는 능력을 허용한다. 바람직하게는, 발명의 안정한 조성물은 냉장 조건 (약 2 내지 약 8 ℃)에서 적어도 6 개월, 12 개월, 18 개월, 24 개월, 30 개월, 36 개월, 또는 초과로 저장될 수 있다.
어구 "치료적으로 유효한"은 대체 요법과 전형적으로 관련된 부정적인 부작용을 방지하면서, 치료에 걸쳐 질환 중증도 및 발병 빈도에서 개량의 목적을 달성할, 생물학적 활성 단백질의 양을 가리키고자 하는 것이다.
"IU" 또는 "국제 단위"는 약물 또는 자연 발생 물질의 특정화된 생물학적 효과의 양의 표준화된 측정이다. 특히, 에리트로포이에틴에 대한 IU는 에리트로포이에틴의 세계보건기구 국제 참조 제제를 이용하여 표준화된 생체 내 활동성-저산소성 다혈구증 마우스 어세이로부터의 단위 측정을 말한다. 주어진 물질에 대해 1 IU를 제공하는데 요구되는 물질의 양은 물질의 출처, 상태, 질, 순도, 및/또는 타입에 따라 변화할 것이다. IU와 방사성면역 어세이에 의해 결정되는 것과 같은 다른 단위 간의 관계는 추가로 문헌 [Storring et al., Brit. J. Haematol., 100: 79, 1998]을 참조로 하여 이해될 것이다.
아래 실시예는 발명을 예시하지만, 예시된대로 발명의 다양한 측면을 제한하는 것으로 취급되어서는 안된다.
실시예 1
본 연구는 안정화제로서 1) 소형 펩티드 또는 2) 소형 펩티드 및 트윈® 80을 함유하는 PBS 용액 중 에리트로포이에틴 오메가의 안정성을 평가하기 위하여 설계되었다. 안정성은 안정화제가 사용되지 않을 때나 안정화제로서 인간 혈청 알부민 (HSA)이나 트윈® 80이 단독으로 사용될 때의 EPO 오메가의 안정성과 비교하여 평가되었다. 아래 소형 펩티드가 연구에 사용되었다: Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly- Tyr, Gly-Phe, Gly-His.HCl.H20, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly 및 Ala-Ala. 모든 펩티드와 트윈® 80은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다.
아래 수록된 프로토콜을 에리트로포이에틴 오메가를 함유하는 제약 제제의 저장 안정성을 측정하는데 사용되는 용액을 제조하는데 적용하였다:
PBS 용액을 제조하기 위하여, 유리 병에
- 주사용수 (WFI)를 대략 800 g까지 가하고;
- 8.18 g의 NaCl과 1.56 g의 NaH2PO4.2H2O를 가하고;
- 총 제제화된 용액 질량, 1006 g까지 교반하면서 WFI를 가하고;
- 최소 15 분간 신속하게 교반하고 (모든 염은 혼합을 끝내기 전에 용해되어야 한다);
- 질소를 용액에 도입하고; 2 분간 버블링하고;
- 용액의 pH를 결정하고 10 M NaOH로 7.20 (범위 7.10 내지 7.30)으로 조정하고;
- 용액을 멸균 용기로 멸균 0.22 ㎛ 막 필터를 통해 여과하고;
- 여과된 용액을 사용하여 에리트로포이에틴의 제제화된 용액을 제조한다.
PBS pH 7.2 - 펩티드 (1.25 g/ℓ)의 저장 용액을 제조하기 위하여, PBS pH 7.2 (50 ㎖)와 펩티드 (62.5 ㎎)를 배합하라.
PBS pH 7.2 - 트윈® 80 (0.375 g/ℓ)의 저장 용액을 제조하기 위하여, PBS pH 7.2 (1000 ㎖)와 트윈® 80 (0.375 g)을 배합하라.
PBS pH 7.2 - 펩티드 (1.25 g/ℓ) - 트윈® 80 (0.375 g/ℓ)의 저장 용액을 제조하기 위하여, 50 ㎖의 PBS pH 7.2 - 트윈® 80 (0.375 g/ℓ) 저장 용액에 펩티드 (62.5 ㎎)를 가하라.
PBS pH 7.2 중 EPO (50,000 IU/㎖)의 저장 용액을 제조하기 위하여, PBS pH 7.2 (75. 3 ㎖)와 14.7 ㎖의 EPO 농축 용액 (306,OOO IU/㎖)을 배합하라.
PBS pH 7.2 중 EPO 10,000 IU/㎖의 용액을 제조하기 위하여, 16 ㎖의 PBS pH 7.2와 4 ㎖의 저장 EPO (50,000 IU/㎖)를 혼합하라.
PBS pH 7.2 - HSA 2.5 ㎎/ℓ 중 EPO 10,000 IU/㎖의 용액을 제조하기 위하여, 16 ㎖의 PBS pH 7.2, 4 ㎖의 저장 EPO (50,000 IU/㎖)와 250 ㎕의 HSA (20% w/v)를 혼합하라.
PBS pH 7.2 - 트윈® 80 (0.3 g/ℓ) 중 EPO 10,000 IU/㎖의 용액을 제조하기 위하여, 16 ㎖의 PBS pH 7.2 - 트윈® 80 저장 용액과 4 ㎖의 저장 EPO (50,000 IU/㎖)를 혼합하라.
PBS pH 7.2 - 펩티드 (1.0 g/ℓ) 중 EPO 10,000 IU/㎖의 용액을 제조하기 위하여, 16 ㎖의 PBS pH 7.2 - 펩티드 저장 용액과 4 ㎖의 저장 EPO (50,000 IU/㎖)를 혼합하라.
PBS pH 7.2 - 트윈® 80 (0.3 g/ℓ) - 펩티드 (1.0 g/ℓ) 중 EPO 10,000 IU/㎖의 용액을 제조하기 위하여, 16 ㎖의 PBS pH 7.2 - 트윈® 80 - 펩티드 저장 용액과 4 ㎖의 저장 EPO (50,000 IU/㎖)를 혼합하라.
균질화를 보장하기 위하여 모든 용액을 잘 혼합하고 멸균 용기로 멸균 0.22 ㎛ 막 필터를 통해 여과한다.
표 1은 본 연구에 사용된 EPO 샘플을 설명한다.
샘플 EPO IU/㎖ 계면활성제 계면활성제 농도 ㎎/㎖ 펩티드 펩티드 농도 ㎎/㎖
B001 10,000 부재 n/a 알부민 2.5
B002 10,000 부재 n/a 부재 n/a
B003 10,000 트윈® 80 0.3 부재 n/a
B004 10,000 부재 n/a Gly-Gly 1
B005 10,000 부재 n/a Gly-Gly-Gly 1
B006 10,000 부재 n/a Gly-Tyr 1
B007 10,000 부재 n/a Gly-Phe 1
B008 10,000 부재 n/a Gly-His 1
B009 10,000 부재 n/a Gly-Asp 1
B010 10,000 부재 n/a Gly-Ala 1
B011 10,000 부재 n/a Ala-Gly 1
B012 10,000 부재 n/a Ala-Ala 1
B013 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Gly 1
B014 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Gly-Gly 1
B015 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Tyr 1
B016 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Phe 1
B017 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-His 1
B018 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Asp 1
B019 10,000 트윈® 80 0.3 Gly-Ala 1
B020 10,000 트윈® 80 0.3 Ala-Gly 1
B021 10,000 트윈® 80 0.3 Ala-Ala 1
샘플을 처음에는 25 ℃/60% RH에서 유지시키고, 1, 2, 4, 6, 8 및 10 주에 분석하였다. 4 주의 저장 후, 2 셋트의 샘플을 40 ℃/60% RH로 옮기고 6 및 8 주에 분석하였다. 이것은 어느 잠재적인 안정화제 효과를 증폭하기 위하여 용액에 더 큰 정도로 압력을 가하기 위하여 수행하였다. 25 ℃/60% RH에서의 연구는 10 주 후 중단하였다.
용액을 워터스(WATERS) 오븐과 워터스® 듀얼 λ 흡광도 검출기가 장착된 분리 모듈 워터스® 얼라이언스(ALLIANCE) 2690을 이용하는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석하였다. 시스템을 워터스® C4-300 Å-5 ㎛ 델타-팩(DELTA-PACK) 칼럼에 연결시켰다. 샘플을 23G× 11/4" 멸균 켄달(KENDALL) 모노젝트 바늘이 장착된 멸균 1.0 ㎖ 켄달 모노젝트 주사기를 이용하여 HPLC 바이알로 옮겼다. 단백질 함량을 280 ㎚에서의 피크 AUC로 측정하였다.
곡선 하 면적 (AUC)을 기록하고 초기 기간의 반응에 기초하여 단백질의 회수를 계산하는데 사용하였다. 회수를 관심있는 기간과 초기 기간의 반응 사이의 비율로서 계산하였다.
회수AUC (%) = 100 × CAUCt/CAUC0, 여기에서
회수AUC는 AUC에 기초한 회수이고,
CAUCt는 피크의 AUC로서 표현된 관심있는 기간의 에리트로포이에틴 함량이며,
CAUC0은 피크의 AUC로서 표현된 초기 기간의 에리트로포이에틴 함량이다.
연구 개시 전에, 펩티드 안정화제와 에리트로포이에틴 오메가로부터 나오는 잠재적인 분해 산물 간의 방해의 부재를 조사하였다. 이것은 소형 펩티드 및/또는 트윈® 80이 EPO에 대한 AUC와 회수 %의 적당한 계산에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위해 설계된 또 하나의 실험 대조였다. 이 문제를 해결하기 위하여, 소형 펩티드를 함유하고 에리트로포이에틴 오메가를 함유하지 않는 용액을 주입 전에 25 ℃/60% RH에서 4 주 및 40 ℃/60% RH에서 4 주간 유지시켰다. 크로마토그램의 분석은 아무 신호도 에리트로포이에틴 오메가 신호 (20.6 분) 근처에서 나타나지 않음을 보여주어, 펩티드 및/또는 트윈® 80이 EPO에 대한 AUC 및 회수 %의 계산에 영향을 미치지 않음을 가리켰다.
표 2 (아래 참조)는 25 ℃/60% RH에서 1, 2, 4, 6, 8 및 10 주 및 40 ℃/60% RH에서 6 및 8 주에 소형 펩티드 (B004-B012) 또는 소형 펩티드 및 트윈® 80 (B013-B021)으로 안정화될 때 EPO의 % 회수를 보여준다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, EPO 단독 (B002) 또는 트윈® (B003)을 함유하는 대조 용액을 제외하고는, 10 주간 25 ℃/60% RH에서 저장된 시험 샘플에서 거의 아무런 분해도 기록되지 않았다. 동일한 조건에서, HSA를 갖는 EPO 샘플 (B001)에서 단백질 분해가 기록되지 않았다. HSA를 함유하지 않는 대조 용액 (B002 및 B003)의 경우, 약간의 감소가 시간에 따라 기록되었다. 더욱이, 40 ℃/60% RH에서의 EPO 안정성이 동일한 조건에서 유지된 HSA를 함유하지 않는 대조 샘플에서 보다 펩티드 또는 펩티드 및 트윈® 안정화제를 함유하는 샘플에서 더 우수하였다. 또한, 예상되는 바와 같이, EPO 용액은 40 ℃에서 보다 25 ℃에서 더 우수한 저장 안정성을 나타내었다. 동일한 결과를 도 1, 2 및 3에서의 그래프 표현으로서 알 수 있다.
EPO의 % 회수 ＠ 25 ℃/60% RH EPO의 % 회수 ＠ 40 ℃/60% RH
샘플 w0 w1 w2 w4 w6 w8 w10 w6 w8
B001 100 100 100 101 100 101 101 97 95
B002 100 100 99 99 97 97 96 90 88
B003 100 99 98 97 94 93 93 82 74
B004 100 100 99 100 99 100 98 97 97
B005 100 99 99 100 98 99 98 95 95
B006 100 100 100 100 100 99 99 97 96
B007 100 100 99 99 100 100 99 98 97
B008 100 99 99 100 99 87* 99 98 98
B009 100 100 100 100 100 99 99 97 97
B010 100 99 100 100 99 99 98 97 97
B011 100 99 99 100 99 99 98 97 97
B012 100 99 100 101 99 100 98 99 97
B013 100 99 99 99 99 98 98 96 94
B014 100 99 99 99 98 98 98 94 89
B015 100 99 99 100 99 99 100 95 92
B016 100 99 99 100 99 99 98 96 94
B017 100 99 99 100 99 100 99 98 97
B018 100 98 99 99 98 99 98 95 93
B019 100 99 99 99 99 99 98 95 93
B020 100 98 99 98 98 99 98 95 92
B021 100 98 99 99 98 99 98 95 91
* 25 ℃/60% RH에서 8 주의 저장 후, 87%의 회수가 B008에 대해 확인되었다. 경향 결과를 벗어나는 이것은 이후 기간이나 40 ℃/60% RH에서 확인되지 않았고, 장비 문제 (전력 공급 실패)에 기인하였다.
모든 상기 과정이 사용되는 단백질, 연구의 길이 등에 따라, 특정 연구를 위해 변형될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 변형은 부당한 실험 없이 당업자에 의해 설계될 수 있다.

Claims (36)

  1. 치료 유효량의 생물학적 활성 단백질 및 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하며, 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 활성 단백질이 에리트로포이에틴, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터류킨 2, 난포 자극 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자, 신경 성장 인자, BMP-2, BMP-4, BMP-7, 및 종양 괴사 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 활성 단백질이 재조합 기원의 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 생물학적 활성 단백질이 에리트로포이에틴인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 오메가인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물 중 에리트로포이에틴 오메가의 농도가 약 500 IU/㎖ 내지 약 100,000 IU/㎖인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 에리트로포이에틴 오메가의 농도가 약 2,000 IU/㎖ 내지 약 20,000 IU/㎖인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 유도체가 Gly-Gly의 염, Gly-Gly-Gly의 염, Gly-Tyr의 염, Gly-Phe의 염, Gly-His의 염, Gly-Asp의 염, Gly-Ala의 염, Ala-Gly의 염, 및 Ala-Ala의 염을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물 중 펩티드 안정화제의 농도가 약 0.01 g/ℓ 내지 약 10 g/ℓ인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 펩티드 안정화제의 농도가 약 0.5 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 또는 그들의 혼합물인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 조성물 중 계면활성제의 농도가 약 0.0005% w/v 내지약 0.5% w/v인 조성물.
  16. 에리트로포이에틴, 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하며, 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 펩티드 안정화제가 디펩티드인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 펩티드 안정화제가 트리펩티드인 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 펩티드 안정화제가 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 유도체가 Gly-Gly의 염, Gly-Gly-Gly의 염, Gly-Tyr의 염, Gly-Phe의 염, Gly-His의 염, Gly-Asp의 염, Gly-Ala의 염, Ala-Gly의 염, 및 Ala-Ala의 염을 포함하는 것인 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 조성물 중 펩티드 안정화제의 농도가 약 0.01 g/ℓ 내지 약 10 g/ℓ인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 펩티드 안정화제의 농도가 약 0.5 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ인 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민인 조성물.
  24. 제16항에 있어서, 에리트로포리에틴이 재조합 에리트로포이에틴인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 재조합 에리트로포이에틴이 BHK 세포에서 생산되는 것인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 재조합 에리트로포이에틴이 CHO 세포에서 생산되는 것인 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 재조합 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 오메가인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조성물 중 에리트로포이에틴 오메가의 농도가 약 500 IU/㎖ 내지 약 100,000 IU/㎖인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 에리트로포이에틴 오메가의 농도가 약 2,000 IU/㎖ 내지 약 20,000 IU/㎖인 조성물.
  30. 제16항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터이온성 계면활성제, 또는 그들의 혼합물인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르인 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 상기 조성물 중 계면활성제의 농도가 약 0.0005% w/v 내지 약 0.5% w/v인 조성물.
  34. 에리트로포이에틴, 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 및 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Tyr, Gly-Phe, Gly-His, Gly-Asp, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, 그의 유도체 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 안정화제를 포함하며, 혈청 알부민을 함유하지 않는 안정한 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 오메가인 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민인 조성물.
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