JP2007536198A - タンパク質沈殿物の処理方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遠心力の使用によりタンパク質沈殿物を洗浄する及び濃縮する方法に関する。前記タンパク質は、インシュリン、インスリンアナログまたはインシュリン誘導体またはGLP-1またはGLP-2及びそのアナログおよび誘導体(例えば、 アシル化タンパク質)であってもよい。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
本発明は、遠心力の使用によりタンパク質沈殿物を洗浄する及び濃縮する方法に関する。
薬学的用途のタンパク質は、現在は組換え製造技術によって現在作出されている;この技術には、所望のタンパク質を発現する及び自由選択で分泌する能力を有する挿入されたDNAを具備する、形質転換された細胞株または微生物の大規模な発酵が含まれる。直接的に発現される産物は、最終生産物(ultimate product)であってもよく又は前駆体(precursor)であってもよく、これは更なるインビトロ工程によって最終産物(final product)へと転換される。係るインビトロ工程は、前記前駆体が最終産物において望まれないペプチド配列を具備している融合産物である場合、酵素的または化学的な切断である。また、前記インビトロ転換は、1以上の化学的な転換を備えてもよい;これは例えば、アシル化工程であり、ここでアシル基が前記タンパク質分子の1以上のポジションに導入されて、前記タンパク質の変更された生物学的行動が導入される(例えば、より遅延性の作用様式)。
前記タンパク質が直接的発現される産物であるか又はイントロ工程によって更に転換されるかどうかにかかわらず、前記産物は、前記生産方法に由来する全ての不純物および副産物を除去するための複数の精製および濃縮工程(例えば、沈殿、遠心分離、濾過、結晶化、およびクロマトグラフィー処置)に供試される。
伝統的に、タンパク質沈殿物または結晶懸濁物の濃縮、洗浄、および溶剤交換は、沈殿、遠心分離、単離、および再懸濁の反復工程によって実施される、又は適切な微細構造を有する幾つかの結晶に関して、フィルターでの濾過および洗浄によって実施される。沈殿物の洗浄および分離に関する方法は、米国特許第4,436,631; 6,180,394; 4,350,283; 3,825,175; 4,798,579 および 4,670,002号に開示されている。
米国特許第6,180,394号は、流動床におけるクロマトグラフィー精製に関する方法を開示している。産物は、樹脂に結合され、そして適切な溶液で洗浄される。それから、前記産物は、別の溶剤で溶出される。前記プロセス(process)は、沈殿を促進する遠心力場(centrifugal force field)で操作される。
米国特許第4,350,283号および米国特許第4,670,002号の双方は、遠心力場におけるサイズに依存して、粒子を分離する方法を開示している。重いフラクションは分離チャンバーの内側に蓄積する、他方で軽いフラクションは分離チャンバーの他端で流体と共に放出(discharged)される。
タンパク質沈殿物の分離のためにここで使用される方法は、かなり多数の反復工程の使用を通常必要とし(例えば、沈殿物の洗浄および再懸濁)、労働集約的(labor intensive)であり、洗浄および溶剤交換に多量の溶剤容量を必要とする。また、これらの方法は粒子凝集を誘発し、粒子特性の変化および溶剤および溶質(solutes)の望まれない封入(inclusion)を生じる。さらにまた、フィルター、遠心分離などを空にする(emptying)の際の、開放系における沈殿物の手動操作によって、産物の汚染のリスクが増加するだろう。最終的に、収量損失のリスクが、各付加的な工程に関して増加し、全プロセスの経済性が低下する。
以上のように、当該技術において、タンパク質の精製および濃縮の大規模操作に関して、より効率的で、労働集約性が低いプロセスの必要性が存在する。
本発明は、タンパク質沈殿物を洗浄する及び自由選択(optionally)で濃縮するための方法に関し、該方法は以下を備える:
a)第1溶剤中のタンパク質沈殿物の懸濁物(suspension)を、回転チャンバーに供給し、同時に流動ゾーン(a fluidized zone)を樹立する間に沈殿なく溶剤を放出することと;
b)第2溶剤を前記回転チャンバーに導入し、同時に溶剤を沈殿することなく放出することと(それによって、流動ゾーンを維持している間、前記第1溶剤が前記第2溶剤によって部分的に又は完全に交換される);および
c)前記タンパク質を収集すること。
a)第1溶剤中のタンパク質沈殿物の懸濁物(suspension)を、回転チャンバーに供給し、同時に流動ゾーン(a fluidized zone)を樹立する間に沈殿なく溶剤を放出することと;
b)第2溶剤を前記回転チャンバーに導入し、同時に溶剤を沈殿することなく放出することと(それによって、流動ゾーンを維持している間、前記第1溶剤が前記第2溶剤によって部分的に又は完全に交換される);および
c)前記タンパク質を収集すること。
本発明のプロセスの効率に関して、工程a)で樹立される前記流動ゾーンが工程b)において維持されることが重要である。
前記流動ゾーンは、前記回転チャンバーの供給率および回転速度を調整することによって樹立される(当該技術における専門家に明らかなように)。
本発明の方法の一態様において、前記タンパク質の前記第1溶剤への供給および前記第2溶剤の前記回転チャンバーへの供給は、前記回転チャンバーの外側周辺ゾーンでの入口を介してなされる、それに反して、前記回転チャンバー溶剤の放出は内側周辺ゾーンでの出口でなされる。
工程a)における前記タンパク質沈殿物の懸濁物の供給の間、遠心力が懸濁された粒子を前記回転チャンバーの外側周辺ゾーンに向かって移動させる。前記懸濁物の供給が同率(same rate)で前記溶剤を連続的に放出させている条件下で継続される場合、前記第1溶剤におけるタンパク質沈殿物の濃度は連続的に増加する;というのも、溶剤のみが前記系から放出され、粒子は放出されないからである。工程a)は、懸濁されたタンパク質粒子の所望の濃度が回転チャンバー中で得られるまで、特定の回転速度および供給率の組み合わせで継続される。濃度の度合(degree)に関する明らかな上限は、懸濁されたタンパク質粒子が出口に見出される際に到達される。
更なる態様において、工程a)における供給は、前記第2溶剤を工程b)に導入する前に終了される。本態様において、前記プロセスは、バッチ処理として行われる。そして、同じ入口および出口は、それぞれ、前記第1および第2溶剤の供給に及び前記回転チャンバーからの溶剤の放出に使用し得る。
工程b)における前記第2溶剤の前記回転チャンバーへの供給は、前記第1溶剤と同じ入口を通して都合よく生じえる。しかしながら、前記第2溶剤は、前記回転チャンバーの周辺端(peripheral end)に配置される別の入口を通して導入されえる。
工程b)における前記第2溶剤の供給の間、溶剤は、出口(この出口は前記第1溶剤に対する出口と同じであっても、同じでなくてもよい)を通して、同率で退去する。
前記装置の連続性の作業は、前記第1溶剤の前記第2溶剤での交換(例えば、1つの緩衝剤の別の緩衝剤での交換または特定の緩衝剤の水での若しくは別の適切な溶剤での交換)を生じる。
前記流動ゾーンにおけるタンパク質沈殿物の濃度は、供給率および遠心力によってコントロールされる。前記タンパク質沈殿物の濃度は、前記第1溶剤におけるタンパク質の濃度と比較して、少なくとも約2の係数(factor)で、好ましくは少なくとも約3の係数で、および、より好ましくは少なくとも約5の係数で増加されえる。本発明の典型的な態様において、前記タンパク質の濃度は、前記第1溶剤中の濃度と比較して、50〜400%に増加されえる。
前記第1および前記第2溶剤は、典型的には異なる密度を有する。前記第2溶剤の密度が前記第1溶剤の密度と異なる場合、前記密度は、別個の工程(discrete steps)において漸進的に変化されえる又は連続的なグラジエントの手段で変化されえる。
前記第2溶剤の密度が前記第1溶剤の密度よりも高い場合、溶剤の交換は容易である。しかしながら、前記第1溶剤と比べて同じ又は実質的に同じ密度を又はより低い密度を有する第2溶剤の使用も、可能である。そのケースにおいて、溶剤での反復性の洗浄または減少した密度を有する溶剤での洗浄は、1つの側での供給と他の側での前記洗浄緩衝剤または前記溶剤との間の密度バリエーションによって生じる、混合および乱流の効果を低下させるために、有利である。或いは、溶剤グラジエントを使用しえる。
なお更なる態様において、前記第1溶剤は、同じ又は実質的に同じ粘性を有する或いはより高い又はより低い粘性を有する第2溶剤で置換される。
前記第2溶剤の粘性が前記第1溶剤の粘性と異なる場合、それは別々の工程において漸進的に変化されえる又はそれは連続的なグラジエントの手段で変化されえる。
工程c)における前記タンパク質の収集(Collection)は、任意の便利な手段で実施でき;例えば、マニュアル収集;流速を調整すること;流れ方向(flow direction)を調整すること;回転速度を調整すること,ガスを前記系に導入すること又は前記タンパク質を適切な溶剤に溶解すること;又はその任意の組み合わせである。
一態様において、工程a);b)およびc)はその順番で連続的(consecutively in that order)に実行される、しかしながら、工程a);b)およびc)は、連続的なプロセスにおいて同時(simultaneously)に実行されてもよい。更なる態様において、工程a)およびb)は同時に実行(carried out)される、なお更なる態様において、工程b)およびc)は同時に実行される。
工程a);b)およびc)が同時に実行される場合、前記第1溶剤を、前記チャンバーの内側周辺ゾーンで、前記チャンバーのセンター(center)に導入しえる或いは前記チャンバーのセンター付近に導入しえる;他方で上清は、前記チャンバーの内側周辺ゾーンで離れた(separate)出口から退去する。本態様において、前記第2溶剤は、外側周辺端での遠心力場に対して向流的(counter currently)に前記チャンバーに導入される、そして洗浄された沈殿物は、離れた出口を通して前記チャンバーの内側および外側端の間のゾーンに退去(withdrawn)する。
供給率および回転速度は、前記プロセスの個々の工程の操作の間に変化してもよい。このように、それらが増加または減少して、流動床(fluidized bed)が樹立される又は維持される或いは産物が前記回転チャンバーから放出される。さらにまた、 前記プロセスの個々の工程a),b)およびc)において前記供給率および回転速度は、同じであっても異なっていてもよい。
プロセス温度は、適切な手段によってコントロールされてもよい;これには前記チャンバーの直接的な冷却、シールの冷却(ここで、ほとんどの熱が発生する)、および/または、供給および洗浄液の冷却が含まれえる。前記温度は、約マイナス5゜C〜約100゜Cの範囲内で調整されてもよい。
一態様において、プロセス 温度は、それぞれ、工程a);b)およびc)において独立にコントロールしえる。
ガスを使用することによってタンパク質沈殿物が前記回転チャンバーから除去される場合、前記ガスは、空気、蒸気、および不活性ガス、例えば、窒素、又はその任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。
一態様において、前記第1溶剤は、少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%v/vでの前記第2溶剤によって交換される。
遠心力場の使用によって、いくつかの精製工程(例えば、濃縮、洗浄、および溶剤交換)を、1つの機械中で非常に効率的な操作で大規模に結合することが可能であり、それゆえ時間および溶剤量が節約され、収量が増加する。さらにまた、前記プロセスは、閉鎖系で実施することができ、これにより産物汚染のリスクが低下し、濃縮を可能とし、そして自由選択で磨耗(attrition)に脆弱(fragile)または感受性(susceptible)であるタンパク質の沈殿物を洗浄することが可能となる。
本発明は、添付される図面で更に説明される。
略語および命名法。
洗浄:洗浄は特定のプロセスを意味する;該プロセスにおいて、タンパク質沈殿物が懸濁される溶剤は、別の溶剤によって、部分的に又は完全に交換される又は転置される。洗浄方法の目的は、前記第1溶剤に含有される塩を除去するため又は特定の緩衝剤を別の緩衝剤で置換するためであってもよい。
洗浄:洗浄は特定のプロセスを意味する;該プロセスにおいて、タンパク質沈殿物が懸濁される溶剤は、別の溶剤によって、部分的に又は完全に交換される又は転置される。洗浄方法の目的は、前記第1溶剤に含有される塩を除去するため又は特定の緩衝剤を別の緩衝剤で置換するためであってもよい。
タンパク質:発現タンパク質は、ペプチドおよびポリペプチドを含むことを意図している。
沈殿物:沈殿物は、タンパク質の結晶形態、無定形形態(amorphous form)、および凝集物、並びに任意の他の非溶解状態(non dissolved state)を含む任意の物理的な形態であってもよい。
流動ゾーン(Fluidized zone):粒子を前記チャンバー中で遠心力に対して、それらの沈降速度に相当する速度で、押されるときに流動化が発生する。
転置(Displacing):特定の溶剤の別の溶剤での置換(Replacement)は、対流性混合(convective mixing)を伴わないか又は非常に限定的に伴う。
水溶液(Aqueous solution):水溶液は、水および他の物質、例えば、塩、緩衝成分(buffering component)、添加物、および/または有機物成分を含有している溶液を意味する。
前記タンパク質は任意のタンパク質でよく、例えば、アプロチニン、組織因子経路インヒビターまたは他のプロテアーゼインヒビター、インシュリンまたはインシュリン前駆体、ヒトまたはウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織プラスミノゲンアクチベーター、トランスフォーミング成長因子αまたはβ、血小板由来成長因子、GRF(成長ホルモン放出因子)、免疫グロブリン、EPO、組織プラスミノゲン活性化因子、プロテインC、血液凝固因子、例えば、FVII、FVIII、FIV、および FXIII、exendin-3、exentidin-4、および酵素およびその機能的なアナログである。この前後関係において、「機能的なアナログ(functional analogue)」の用語は、未変性タンパク質と類似の機能を有するタンパク質を意味する。前記タンパク質は、前記未変性タンパク質と構造的に類似してもよい及び前記未変性タンパク質のCおよびN末端の何れか又は両方への1以上のアミノ酸の付加、前記未変性アミノ酸配列における1又は幾つか(a number of)の異なる部位での1以上のアミノ酸の置換、前記未変性タンパク質の何れか又は両方の端での又は前記アミノ酸配列における1又はいくつか(several)の部位での1以上のアミノ酸の欠失、又は前記未変性アミノ酸配列における1以上の部位での1以上のアミノ酸の付加によって前記未変性タンパク質から由来してもよい。そのうえ、前記タンパク質は、1以上のポジションでアシル化されてもよい〔WO 98/08871(これはGLP-1およびそのアナログのアシル化を開示している)およびWO98/08872(これはGLP-2およびそのアナログのアシル化を開示している)を参照されたい〕。アシル化GLP-1誘導体の例は、Lys26(Nε-テトラデカノイル)-GLP-1(7-37)であり、これはポジション26におけるLys残基のε-アミノ基がテトラデカノイル化(tetradecanoylated)されたGLP-1(7-37)である。
インスリンアナログは、ヒトインスリン分子と比較して、Aおよび/またはBアミノ酸鎖の1以上の変異(mutations)、置換、欠失および/または付加を有しているインスリン分子である。前記インスリンアナログは好ましくは次のようなものである、つまり1以上の天然のアミノ酸残基のなかの好ましくは1、2、または3つが、別のコード可能な(codable)アミノ酸残基によって置換されているものである。従って、B鎖のポジション28は、天然のPro残基からAsp、Lys、またはIleのうちの1つに修飾されえる。別の態様において、ポジションB29でのLysはProに修飾される;また、ポジションA21でのAsnはAla, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr またはValに、特にGly, Ala, Ser, またはThrに及び好ましくはGlyに修飾しえる。さらにまた、ポジションB3でのAsnは、Lysに修飾しえる。インスリンアナログの更なる例は、des(B30)ヒトインスリン、PheB1を欠失したインスリンアナログ、A鎖および/またはB鎖がN末端拡張(N-terminal extension)を有するインスリンアナログ、並びにA鎖および/またはB鎖がC末端拡張を有するインスリンアナログである。たとえば、1または2つのArgを、ポジションB1に付加しえる。
前駆体の例は、アミノ酸配列 B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)を有するインスリン前駆体であり、ここで、A(1-21)はヒトインスリンのA鎖であり、B(1-29)はヒトインスリンのB鎖(ここでThr(B30)は欠落している)である。このインスリン前駆体は、ヒトインスリンに転換されてもよい;この転換はAla-Ala-Lysブリッジの酵素的な切断によって行われ;これはポジションB29中のアミノ酸残基をポジションA21中のアミノ酸残基と連結しており;Thrアミノ酸をB29アミノ酸残基へと酵素的にカップリングしている。他のインシュリン前駆体は、適切な酵素的または化学的な処理によって後に切断される、B鎖へのN末端拡張を具備してもよい(米国特許番号6521738, WO 97/22706, WO 97/00581および WO 00/04172を参照されたい)。
他のインシュリン中間体は、所望のインシュリン産物へと、例えば、アシル化またはペジレーション(pegylation)によって転換されうるものであり、遅延型(protracted)のインスリン分子を形成する。アシル化インスリンはEP792290Bに開示される、これはアシル化インスリンおよびアシル化インスリンアナログを開示している。アシル化インスリンの例は、ヒトインスリンまたはdesB30ヒトインスリンのB29ポジションにおいて又はB28がLysおよびB29がProで修飾されたヒトインスリンのポジションB28においてアシル化されているもの、例えば、NεB29-テトラデカノイルdes(B30)ヒトインスリン;NεB29-(リトコロイル-γ-Glu) des(B30)ヒトインスリン;NεB28-テトラデカノイル LysB28ProB29 ヒトインスリン;NεB29-テトラデカノイルAspB28 ヒトインスリン;NεB29-テトラデカノイル GlnB3 des(B30)ヒトインスリン)、NεB29-トリデカノイル ヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイル ヒトインスリン、NεB29-デカノイル ヒトインスリン、およびNεB29-ドデカノイル ヒトインスリンである。
前記第1および第2溶剤(これは同じ又は異なっていてもよい)は、問題のタンパク質(the protein in question)に依存的な任意の適切な溶剤であればよく、例えば、水、水溶液、有機溶剤、又はその任意の混合物である。前記溶剤が同じ場合、前記プロセスの効果は主に前記溶剤中での沈殿物の濃度を増加させることである;他方で前記溶剤が異なる場合、前記プロセスは前記沈殿物のアップ濃縮(up-concentration)および洗浄を可能にする。
たとえば、前記第1溶剤は、適切な塩を含有している水性の酢酸溶液(acetate solution)であってもよい;他方で前記第2溶剤は、同じ酢酸溶液であってもよいが、塩を含まない。また、前記第1溶剤は、特定のpH(one pH)を有する緩衝剤であってもよく;他方で前記第2溶剤は、別のpHおよび塩を自由選択で含有している異なる緩衝剤であってもよい。前記第1溶剤は、そのうえ水および有機溶剤の混合物であってもよく;他方で前記第2溶剤は、これらの構成成分の1つであってもよい(即ち、水または有機溶剤の何れか)。
本発明の一態様において、塩の成分は、有機または無機塩及びその混合物、好ましくはNaCl、KCl、NH4Cl、CaCl2、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はその混合物からなる群から選択される。
本明細書中に使用される、「緩衝剤(a buffer)」の用語は次の緩衝剤を含む任意の緩衝剤を含むことを意図するが、これらに限定されない、その緩衝剤とは:クエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アルキルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、3-エタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤、およびバルビツール酸緩衝剤、並びにその混合物である〔cf. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), or handbooks from Amersham Biosciences). Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), or handbooks from Amersham Biosciences〕。
本発明は、図面および例を参照して以下に更に詳細に記載される。
図1は、例に使用される遠心コンタクター(20)を説明する。これは2つの静的なシリンダー(8)からなり、各々は入口(1)および出口(2)を具備しており、これは回転チャンバー(3)にチューブ(13)および(14)を介して連結している。前記方法の連続的な操作において、更なるポート(5)および(6)が使用される。段階的な(stepwise)又はバッチの操作において、好ましくは1つの入口(1)および1つの出口(2)のみが使用される。
前記遠心コンタクター(The centrifugal contactor)は、固定されたローターシャフト(4)の周りを回転する。前記装置の回転速度は、1〜5000rpmであってもよいが、10,000または20,000rpmの高さであってもよい。G力(G forces )およびrpmは次の通りである:G力=rpm^2*r*(2π/60)^2*(1/g)、式中:rpm=回転/分、r=遠心半径(radius of the centrifuge)、およびg=重力定数(9.8 m/s^2)である。
図2は、本発明による方法の一般的な概要を記載している。図2において、(9)は、供給懸濁物(feed suspension)を含有している貯蔵容器(storage container)である。(10)は、タンパク質沈殿物を洗浄するために使用される緩衝剤を有する貯蔵容器である;また、(11)は、3ポート2ウェイバルブ(3-port 2-way valve)である。3ポート2ウェイバルブをスイッチング(switching)することによって、前記遠心コンタクター(3)を選択することができる。流れ方向は、6ポート2ウェイバルブ(12)のスイッチングによって決定することができる。廃棄物容器(15)に連結された流出液管(17)において、液体は伝導プローブ(16)(タイプConsort C-832)を通して通過する。濃縮および洗浄された産物は、出口(18)を通して収集され、容器(19)に収集される。
図3は、本発明の態様を記載しており、ここで工程a)、b)、およびc)は段階的に実施される;即ち、タンパク質粒子の充填(loading)、洗浄(washing)、および回収(recovery)が、前記回転チャンバー(3)において別々の工程で実施される。前記供給懸濁物は、前記第1溶剤中に懸濁されるタンパク質沈殿物であり、洗浄液(wash liquid)は前記第2溶剤である。供給母液(Feed mother liquor)は、タンパク質沈殿物がない又は実質的にない溶剤である。
工程a)(図3の1a)において、前記粒子は、ローターシャフト(4)から最も遠い前記回転チャンバー(3)の端(前記回転チャンバーの外側周辺端)の入口(1)から、前記回転チャンバー(3)へと供給される。前記第1溶剤の過剰分(供給母液)は、前記回転チャンバー(3)からローテーションシャフト(4)付近の出口(2)を通して放出される。タンパク質粒子は遠心力による外向き運動に力をうけ、液体は逆方向に供給されるので、懸濁された粒子の流動床は前記回転チャンバー中に作られる。従って、供給懸濁物の充填容量は、前記回転チャンバー(3)の容量に限定されない;また、1を超えるチャンバー容量を前記コンタクターに供給することができる;他方で同時間に前記流動ゾーン中の懸濁物におけるタンパク質粒子の濃度が増加し、そして枯渇した(depleted)第1溶剤(供給母液)が出口(2)を通じて放出される。供給懸濁物が前記チャンバー に所望の程度にまで充填された場合、供給懸濁物の供給は停止される。
工程b)(図3における1b) において、新しい新鮮な洗浄液体(第2溶剤)が前記チャンバーに入口(1)を通じて供給される。これによって前記第1溶剤は、洗浄液体(第2溶剤)で転置される〔前記回転チャンバー(3)中で粒子の流動ゾーンが維持される間〕。溶剤の過剰分(Excess)は、同時間に出口(2)を通じて放出される。
工程c)(図3における1c)において、洗浄され、濃縮された粒子は、この時点で新鮮な洗浄液体中に出口(2)を通して回収される(遠心力を低下させること又は洗浄流速を増加させることによって)。或いは、濃縮された粒子は、入口(1)を通して、洗浄流れ方向を逆転させることによって回収しえる。
図4は、連続的な操作での前記回転チャンバー(3)におけるタンパク質粒子の充填、洗浄、および回収を記載している。本発明の本態様の第1工程は、図3における工程1aと同一である。前記プロセスの次の工程において、供給懸濁物は、前記チャンバー(3)の中央(middle)に近いポート(6)を通して連続的に供給される;そして洗浄液体は、流動床の少なくともその部分〔ここで洗浄された産物懸濁物(product suspension)がポート(5)を通して回収される〕から供給母液を転置(displace)するために十分大きい流速で、入口(1)を通して流動床に連続的に供給される。更なる処理の間、残存している供給母液とおそらくは洗浄液体とは、出口(2)を通して連続的に廃棄される(discarded)。
本発明の方法は、従来のバッチ濾過または遠心分離工程において大規模に処置することがより困難であろう、粘着性の沈殿物および結晶を処理するために特に有用である。
以下の例では乾燥インスリン結晶をモデルとして用いた。しかしながら、本方法は、当業者に明白であるので、広範な様々なタンパク質に対して適切である。乾燥インスリン結晶は、82.7% w/wインシュリンを含有していた。実験に関する供給懸濁物(feed suspension)を、乾燥インスリン結晶を第1溶剤に懸濁することによって調製した。
例1、2、および3における「第1溶剤(first solvent)」は、以下の水溶液を含有している:
500 mM リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)
10 mM 酢酸ナトリウム(NaH3CCOO)
13 mM 塩化ナトリウム(NaCl)
3.7 mM 塩酸(HCl)
pH 4.8 〜 4.9に調整
伝導率:28.5 mS/cm
密度:1076.2 g/l
500 mM リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)
10 mM 酢酸ナトリウム(NaH3CCOO)
13 mM 塩化ナトリウム(NaCl)
3.7 mM 塩酸(HCl)
pH 4.8 〜 4.9に調整
伝導率:28.5 mS/cm
密度:1076.2 g/l
例に使用される別の緩衝剤は、「第2溶剤(second solvent)」であり、以下の水溶液を含有している:
10 mM 酢酸ナトリウム (NaH3CCOO)
13 mM 塩化ナトリウム(NaCl)
3.7 mM 塩酸(HCl)
pH 4.8 〜 4.99に調整
伝導率:2.4 mS/cm
密度:998.2 g/l
10 mM 酢酸ナトリウム (NaH3CCOO)
13 mM 塩化ナトリウム(NaCl)
3.7 mM 塩酸(HCl)
pH 4.8 〜 4.99に調整
伝導率:2.4 mS/cm
密度:998.2 g/l
溶剤密度を、DMA-48 密度メーター(Anton-Paar GmbH, Graz, Austria)で決定した。第1溶剤の密度は1076.2 g/lであると決定された、第2溶剤の密度は998.2 g/lであると決定された、第1溶剤における乾燥インスリン結晶の 100 g/l懸濁物は、1428 g/lの密度を有することが決定された。pHおよび伝導率を、C-832 pH/C/Tメーター(Consort,Turnhout,Belgium)で決定した。インシュリン濃度を、UV吸光度を用いて遡及的(retrospectively)に測定した。
以下の非限定的な例により、本発明を説明する。例1、2、および3の全ては、供給物としてインスリン結晶懸濁物を使用する。例4は、本発明のインスリン沈殿懸濁物への適用を記載する。
使用した設備は、65 mlのチャンバー容量(1 チャンバー容量) および104 mlのデッド系容量(dead system volume)(1.6 チャンバー容量)を有する、遠心コンタクター(centrifugal contactor)である。2つのチャンバーのうち1つのみが、本発明の洗浄方法の実施に使用された。
[例1]
インスリン結晶懸濁物の濃度
結晶懸濁物を、遠心コンタクター中で請求される方法で処理した(図1に示される)。
インスリン結晶懸濁物の濃度
結晶懸濁物を、遠心コンタクター中で請求される方法で処理した(図1に示される)。
溶剤は、上部(top)および底部(bottom)で回転チャンバー中に入り、これら双方は定位(static)の入口および出口(1)および(2)へと、回転シール(rotating seal)を介して連結され、前記装置の回転部分(rotating part)と連結される。回転チャンバーは、直径2.5 cmであり、約 65 mlの容量を有している。前記チャンバーは、入口(1)の底部でのスクリーンを除いて、内部物(internals)(例えば、ディスクスタック、バッフル、またはディストリビューター) を含んでいない。回転速度は、0および2500rpmの間であった。
本例に使用される供給材料は、第2溶剤における24 g/lインスリン結晶懸濁物であり、これは乾燥インスリン結晶を本溶剤に添加することによって調製された。その正確なインスリン濃度は、前記固体を溶解し、分光光度法を用いて総タンパク質含有量を決定することによって決定された。
遠心コンタクターを、実際の実験の開始前にインシュリンがフリーの緩衝液で充填した。前記コンタクターを、次に1500 rpmで操作し、そしてトータルで919.4 gのインスリン結晶懸濁物を前記コンタクターに35.8 g/minの速度で注入した。この充填段階の終了時に、供給ポンプを、同じ流速で同じ流れ方向で緩衝剤にスイッチした。約 1.5分後、前記コンタクターの回転速度を即座(instantaneously)に200 rpmに下げ、流れ方向を逆転させた。前記緩衝液を、この時点で入口2を介して前記コンタクターへと供給する。この工程の産物のいくつかのフラクションを収集した;これらのフラクションの最も濃縮されたものは、76.8 g/l インシュリンの濃度を有していた。
[例2]
インスリン結晶懸濁物の単一段階洗浄
前記第1溶剤中に18.7 g/lインシュリンを含有している、トータルで922.4 gのインスリン結晶懸濁物を、例1で使用されたものと同じ遠心コンタクターへと37.1 g/minの速度で充填した。前記コンタクターを、1500 rpmで操作した。本充填工程後、回転チャンバーの内側の懸濁物を、第2溶剤を用いて、37.4 g/minの流速でトータルで48 min洗浄した。コンタクター流出液(contactor effluent)の伝導率を、洗浄工程の間にモニターした。この状況において、前記流出液の伝導率を使用して、前記系から廃棄される溶剤が決定される。無次元(dimensionless)の結果(伝導率に対して標準化される:第2溶剤の伝導率=0%、第1溶剤の伝導率は100%)が図5に示される。
インスリン結晶懸濁物の単一段階洗浄
前記第1溶剤中に18.7 g/lインシュリンを含有している、トータルで922.4 gのインスリン結晶懸濁物を、例1で使用されたものと同じ遠心コンタクターへと37.1 g/minの速度で充填した。前記コンタクターを、1500 rpmで操作した。本充填工程後、回転チャンバーの内側の懸濁物を、第2溶剤を用いて、37.4 g/minの流速でトータルで48 min洗浄した。コンタクター流出液(contactor effluent)の伝導率を、洗浄工程の間にモニターした。この状況において、前記流出液の伝導率を使用して、前記系から廃棄される溶剤が決定される。無次元(dimensionless)の結果(伝導率に対して標準化される:第2溶剤の伝導率=0%、第1溶剤の伝導率は100%)が図5に示される。
系のデッドボリューム(入口管などを含む総容積)は、1.6チャンバー容量と決定された。この図を用いて、特定の洗浄効率を達成するために必要な洗浄緩衝液の容量が図5のグラフから読取れる:
・50% 効率に対して、1.7チャンバー容量
・90% 効率に対して、5.6 チャンバー容量
・95% 効率に対して、13.0 チャンバー容量
・90% 効率に対して、5.6 チャンバー容量
・95% 効率に対して、13.0 チャンバー容量
洗浄工程の後、流れ方向を逆転し、前記コンタクターの回転速度を即座に200 rpmに下げた。これによって幾つかの産物フラクション数が生じ、そのうちで最も濃縮されたものはトータル質量(total mass)76 gおよび33 g/lのインスリン濃度を有していた。
[例3]
インスリン結晶懸濁物の2段階洗浄
インスリン結晶懸濁物の2段階洗浄
前記第1溶剤中に22.5 g/lインシュリンを含有している、トータルで980.8 gのインスリン結晶懸濁物を、例1で使用されたものと同じ遠心コンタクターへと39.9 g/minの速度で充填した。前記コンタクターを、1500 rpmで操作した。本充填工程後、回転チャンバーの内側の懸濁物を、36.8 g/minの流速で、2段階で洗浄した。第1工程において、トータル146.8 gの、50%第1溶剤および50%第2溶剤を含有している緩衝剤を使用した。第2工程において、トータル150.6 gの前記第2溶剤が使用された。
コンタクター流出液の伝導率を洗浄工程の間にモニターした;結果を、図6に示す;この図では、中間および低密度の緩衝液を用いた、高密度結晶懸濁物の洗浄の流出液伝導率曲線を示す。
例1でのように、標準化された伝導率は、流出液組成物に関する参照として使用される。2.4 mS/cmに相当する0%は純粋(pure)な第2溶剤に相当(corresponds)し、28.5 mS/cmに相当する100%は純粋な第1溶剤に相当する。
産物懸濁物の伝導率は次の事項を示す;その事項とは、トータルで3.9チャンバー容量の緩衝剤を用いる洗浄(系の1.6CV デッドボリュームに対して補正される)が、89%洗浄効率を生じたことである。例2において、この効率は、5.6カラム容量程度の後に達成された。
洗浄工程の後、流れ方向を逆転し、前記コンタクターの回転速度を即座に200 rpmに低下させた。これによって幾らか(a couple of)の産物フラクション数が生じ、そのうちで最も濃縮されたものはトータル質量83.6 gおよび57.9 g/lのインスリン濃度を有していた。
[例4]
インスリン沈殿懸濁物の濃度
インスリン沈殿懸濁物の濃度
本例に使用される供給材料は、約18% w/w エタノールおよび10 mM NaAcを含有しているpH5.2の緩衝剤中の1.9 g/lインスリン沈殿懸濁物であった。溶剤密度は、DMA-48 密度メーター(Anton-Paar GmbH, Graz, Austria)で、969.9 g/lであると決定された。その正確なインスリン濃度は、前記懸濁物のサンプルを遠心分離すること、上清を除去すること、前記沈殿物が最初に懸濁されるものに類似するがpH3.0である溶液に、前記固体を溶解すること、および分光光度法を用いて総タンパク質含有量を決定することによって測定された。
トータルで893.9 gの本インシュリン沈殿懸濁物を、例1で記載された遠心コンタクターへと5.73 g/minの速度で充填した。前記コンタクターを、500 rpmで操作した。本充填段階の後、前記チャンバーにおける懸濁物を、pH5.2緩衝剤を用いて、流速5.65 g/minで20min洗浄し、その後、流れ方向を逆転させ、前記コンタクターの回転速度を即座に200 rpmに減少させた。これによって幾つかの産物フラクション数が生じ、そのうちで最も濃縮されたものはトータル質量41.2 gおよび8.3 g/lのインスリン濃度を有していた。
Claims (27)
- タンパク質沈殿物を洗浄する及び自由選択で濃縮するための方法であって、
a)第1溶剤中の前記タンパク質沈殿物の懸濁物を、回転チャンバーに供給し、流動ゾーンを樹立する間に前記第1溶剤を同時に放出することと;
b)第2溶剤を前記チャンバーに導入し、同時に溶剤を放出し、それによって前記流動ゾーンを維持している間に前記第1溶剤を前記第2溶剤で部分的に又は完全に交換することと;および
c)前記タンパク質を収集することと;
を備える方法。 - 請求項1記載の方法であって、溶剤の供給は前記回転チャンバーの外側周辺ゾーンで生じ、溶剤の放出は前記回転チャンバーの内側周辺ゾーンで生じる方法。
- 請求項1記載の方法であって、工程a)における前記懸濁物の供給は、前記第2溶剤が工程b)に導入される前に終了される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記流動ゾーンにおけるタンパク質沈殿物の濃度は、供給率および遠心力によってコントロールされる方法。
- 請求項4記載の方法であって、前記タンパク質沈殿物の濃度が、前記供給懸濁物におけるタンパク質の濃度と比較して、少なくとも約2の係数で増加される方法。
- 請求項5記載の方法であって、前記タンパク質沈殿物の濃度が、前記供給懸濁物におけるタンパク質の濃度と比較して、少なくとも約3、好ましくは少なくとも約5の係数で増加される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、同じ又は実質的に同じ密度を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、高密度を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、低密度を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項8または9記載の方法であって、前記第2溶剤の密度が、別個の工程において又は連続的なグラジエントの手段で漸進的に変化させられる方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、同じ又は実質的に同じ或いは高い粘性を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、高粘性を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は、低粘性を有する第2溶剤で置換される方法。
- 請求項12または13記載の方法であって、前記第2溶剤の粘性が、別個の工程において又は連続的なグラジエントの手段で漸進的に変化される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤は水、水溶液、有機溶剤、又はその任意の混合物である方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1および第2溶剤は塩を含有している水溶性の緩衝剤(salt containing aqueous buffers)である方法。
- 請求項1記載の方法であって、工程c)におけるタンパク質は、以下の手段の1つで収集される方法:
マニュアル手段(manual means);流速を調整すること;流れ方向を調整すること;回転速度を調整すること,ガスを前記系に導入すること又は前記タンパク質を適切な溶剤に溶解すること;又はその任意の組み合わせ。 - 請求項1記載の方法であって、工程a);b)およびc)はその順番で連続的に実行される方法。
- 請求項1記載の方法であって、工程a);b)およびc)は同時に実行される方法。
- 請求項1記載の方法であって、工程a)およびb)は同時に実行される方法。
- 請求項1記載の方法であって、工程b)およびc)は同時に実行される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記タンパク質沈殿物は磨耗に脆弱または感受性である方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記回転チャンバー中のプロセス温度は、約マイナス5゜C〜約100゜Cの範囲内にコントロールしえる方法。
- 請求項23記載の方法であって、前記プロセス温度は、それぞれ工程a);b)およびc)において独立にコントロールしえる方法。
- 請求項17記載の方法であって、前記ガスが空気、蒸気、および不活性ガス、又はその任意の組み合わせからなる群から選択される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記第1溶剤が前記第2溶剤で、少なくとも75%、80%、85%、90%、または95% v/v交換される方法。
- 請求項1記載の方法であって、前記タンパク質が、インシュリン、インスリンアナログ、アシル化インスリン、GLP-1又はそのアナログ、アシル化GLP-1;GLP-2及びそのアナログ;およびアシル化GLP-2からなる群から選択される方法。
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