JP2007530012A - ヒト腫瘍壊死因子−αに対するモノクローナル抗体の可変領域およびこれをコードする遺伝子 - Google Patents
ヒト腫瘍壊死因子−αに対するモノクローナル抗体の可変領域およびこれをコードする遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
本発明の目的は、ヒト腫瘍壊死因子−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域を提供ことである。ヒト腫瘍壊死因子−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域は、特定の相補性決定領域を有する重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域の少なくとも一つを含む。前記抗体可変領域をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクターおよび前記組換えベクターにより形質転換された細胞がさらに提供される。
Description
本発明は、ヒト腫瘍壊死因子−α(human tumor necrosis factor−α，hTNFα)に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域、これをコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターにより形質転換された細胞に関する。
ヒト腫瘍壊死因子−α(以下、「ｈＴＮＦα」と略称する)は、３つの１７ｋＤａサブユニットタンパク質からなる三量体(Ｔｒｉｍｅｒ)である(Eck MJ et al., JBC 267：2119−2112,1992；Smith RA et al., JBC 262：6951−6954, 1987)。ｈＴＮＦαは、マクロファージと単核細胞とから分泌される炎症性サイトカイン(ｃｙｔｏｋｉｎｅ)であって、細胞壊死やアポトーシスのような多様な細胞性反応において信号伝達者として作用する(Beyaert R et al., FEBS Lett. 340, 9−16, 1994)。
ｈＴＮＦαは、軟骨および骨の分解(Saklatvala, Nature 322： 547−549, 1986)や好中球およびリンパ球の接着増加(Pober et al., K.Immunol. 138： 3319, 1987)のように組織の破壊を誘発する前−炎症性反応をもたらす。また、ｈＴＮＦαは、感染性疾患と腫瘍に対する防衛機構においても重要な役割を果たすと知られている(Fiers W, FEBS Lett.285,199−212,1991)。
ｈＴＮＦαは、軟骨および骨の分解(Saklatvala, Nature 322： 547−549, 1986)や好中球およびリンパ球の接着増加(Pober et al., K.Immunol. 138： 3319, 1987)のように組織の破壊を誘発する前−炎症性反応をもたらす。また、ｈＴＮＦαは、感染性疾患と腫瘍に対する防衛機構においても重要な役割を果たすと知られている(Fiers W, FEBS Lett.285,199−212,1991)。
ｈＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、細菌感染、癌および退行性疾患に関与する。このような疾患の中で、ｈＴＮＦαは、関節リウマチおよびクローン病(Crohn's disease)の特定の生理学的な治療のための有用な標的タンパク質と見なされている。
一方、関節リウマチを治療するための目的で、ｈＴＮＦα抑制剤を用いるのが提示されている。初期段階の関節リウマチから得た滑膜細胞内でｈＴＮＦαが過剰発現され(Buchan G et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 449−455, 1988)、前記滑膜細胞を抗−ｈＴＮＦαモノクローナル抗体で処理すると、関節リウマチの病変に関連するサイトカインが減少したことが報告されている(Butler DM et al., Eur. Cytokine Netw. 6, 225−230, 1995)。
また、コラーゲン誘導マウス関節炎モデルにおいて、抗−ｈＴＮＦα抗体または組換え水溶性ｈＴＮＦα受容体が炎症および関節破壊を抑制することが発見された(Wpiquet PF et al., Immunology 77, 510−514, 1992； Wooley PH et al., J.Immunol.151, 6602−6607, 1993；Williams RO et al.,Immunology 84,433−439,1995)。さらに、ｈＴＮＦαを過剰発現する形質転換マウスで炎症性関節炎が誘導されるのが観察された(Keffer J et al., EMBO J .10, 4025−4031,1991)。
このような結果は、ｈＴＮＦαが関節リウマチにおいて炎症性サイトカインを調節する直接的あるいは間接的な調節者として重要な役割を果たしていることを示している。従って、関節リウマチの治療のために、ｈＴＮＦαに対して高い選択性および反応性を有するモノクローナル抗体の開発が要求されている。
従って、本発明の目的は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域(variable region)を提供することである。
本発明の他の目的は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域をコードする遺伝子；前記遺伝子を含む組換えベクター;および前記組換えベクターにより形質転換された細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域をコードする遺伝子；前記遺伝子を含む組換えベクター;および前記組換えベクターにより形質転換された細胞を提供することである。
前記の目的を達成するため、本発明は、配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域;および配列番号１２、１３および１4のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域の少なくとも一つを含む、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域を提供する。
また、本発明は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードし、前記重鎖の可変領域が配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む核酸分子を提供する。
さらに、本発明は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域をコードし、前記軽鎖の可変領域が配列番号１２、１３および１4のアミノ酸配列を含む核酸分子を提供する。
本発明によるｈＴＮＦαに対するモノクローナル抗体の抗体可変領域をコードする遺伝子は高い結合力でｈＴＮＦαを特異的に認識できるキメラまたはヒト化抗体を製造するのに有用である。
本発明は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域およびこれをコードする遺伝子を含む。
ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体を製造するために、マウスを組換えｈＴＮＦα(Biosource PHC3011、ベルギー)で免疫させた。前記免疫化されたマウスから分離した脾臓細胞を骨髄腫細胞(Sp2/0−Ag14,ATCC CRL1581)と融合(ｆｕｓｉｏｎ）させてハイブリドーマ細胞（hybridoma cells）のプール（ｐｏｏｌ）を製造した。このようなハイブリドーマ細胞を連続的にクローニングと選別過程に適用させて多数のモノクローナル抗体を得た。こうして得られたモノクローナル抗体のうちｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体を以後の分析のために選別した。その結果、ｈＴＮＦαに特異的に結合し、ｈＴＮＦαに対して高い結合親和力を示すモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株(ＴＳＫ１１)を得た。
モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ分子を合成するために、前記ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１から抽出した全ＲＮＡを用いて、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。鋳型として前記合成したｃＤＮＡ分子を用いてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、配列番号：５の塩基配列を含み、重鎖の可変領域をコードする約４７０ｂｐのｃＤＮＡ分子および配列番号６の塩基配列を含む軽鎖の可変領域をコードする約４５０ｂｐのｃＤＮＡ分子を得た。
前記重鎖および軽鎖の可変領域の相補性決定領域(complementarity determining regions，CDRs)を分析した結果、重鎖の可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列における３１−３５(配列番号：９)、５０−６６(配列番号：１０)、および９９−１０６(配列番号１１)のアミノ酸位置で３つのＣＤＲｓを有することが確認された。同様に、軽鎖の可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列における２4−３５(配列番号１２)、５１−５７(配列番号：１３)、および９０−９８(配列番号１4)のアミノ酸位置で３つのＣＤＲｓを有することが観察された。
従って、本発明の一つ実施様態によるｃＤＮＡ分子は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖の配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む可変領域をコードする。好ましくは、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ分子、より好ましくは、配列番号５の塩基配列を有するｃＤＮＡ遺伝子を提供する。
また、本発明のまた一つの実施様態によるｃＤＮＡ分子は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖の配列番号：１２、１３および１4のアミノ酸配列を含む可変領域をコードする。本発明は、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ分子、より好ましくは、配列番号６の塩基配列を有するｃＤＮＡ遺伝子を提供する。
前記の軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域をコードする上述したｃＤＮＡ分子はそれぞれ組換えベクターを製造するために通常用いられるベクターに挿入し得る。発明の好ましい一つの実施様態においては、重鎖の可変領域を含む組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｈｖまたは軽鎖の可変領域を含む組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｌｖを製造するために配列番号５または６の塩基配列を含むｃＤＮＡ分子をｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ(インビトロジェン社、アメリカ)に挿入する。
さらに、このような組換えベクターは、適当な宿主、例えば、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆのような微生物内に導入できる。例えば、大腸菌ＴＯＰ１０ＦをｐＴＳＫ１１−ＨｖまたはｐＴＳＫ１１−Ｌｖで形質転換させて、大腸菌TOP10F/pTSK11−Hvまたは大腸菌TOP10F/ pTSK11−Lvと命名された大腸菌形質転換体を取得し、これらを特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１４ＢＰおよびＫＣＴＣ１０５１５ＢＰとして韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)(住所：韓国大田廣域市儒城区魚隱洞５２、〒３０５−３３３)に２００３年８月２６日付で寄託した。
さらに、このような組換えベクターは、適当な宿主、例えば、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆのような微生物内に導入できる。例えば、大腸菌ＴＯＰ１０ＦをｐＴＳＫ１１−ＨｖまたはｐＴＳＫ１１−Ｌｖで形質転換させて、大腸菌TOP10F/pTSK11−Hvまたは大腸菌TOP10F/ pTSK11−Lvと命名された大腸菌形質転換体を取得し、これらを特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１４ＢＰおよびＫＣＴＣ１０５１５ＢＰとして韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)(住所：韓国大田廣域市儒城区魚隱洞５２、〒３０５−３３３)に２００３年８月２６日付で寄託した。
前記組換えベクターは従来の方法(J. Sambrook et al., molecular cloning, Vol. １,１.２５−１.２８)を用いて前記形質転換体から回収できる。例えば、前記形質転換体を溶液１(５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ)で処理して細胞膜を弱化させた後、溶液２(０.２Ｎ ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ)で処理して細胞膜を完全に破壊し、露出されたタンパク質および染色体を変性させる。その後、前記組換えベクターを除いた細胞成分を溶液３(５Ｍ酢酸カリウムおよび酢酸)で処理して凝集させ、これから得た溶液を遠心分離して組換えベクターを含む上澄液を分離し、前記組換えベクターはエタノール沈殿によって前記上澄液から回収できる。
本発明の抗体可変領域は、配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域;および配列番号１２、１３および１４のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域の少なくとも一つを含み得る。好ましくは、前記抗体可変領域は、配列番号：７のアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域の少なくとも一つを含む。
ｈＴＮＦαに対するヒト化モノクローナル抗体は、ヒト抗体遺伝子を配列番号９〜１１のＣＤＲｓを含む重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ分子または配列番号１２〜１4のＣＤＲｓを含む軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡ分子と融合させることによって製造できる。
上述したように、本発明の抗体可変領域は、ｈＴＮＦαに特異的に結合するため、ｈＴＮＦαを中和・不活性化させるのに効果的に利用できる。
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
実施例１：ｈＴＮＦαを利用したマウスの免疫化
リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline, PBS)１５０μｌに溶解された組換えｈＴＮＦα(Biosource PHC3011、ベルギー)３０μｇを１５０μｌの完全フロインドアジュバント(complete Freund’s adjuvant、Sigma F5881、アメリカ)と混合して乳化させた後、この混合液３００μｌを６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。２週間後、３０μｇのｈＴＮＦαと１５０μｌの不完全フロインドアジュバント(incomplete Freund’s adjuvant、Sigma F5506、アメリカ)とを含む乳化混合液３００μｌを前記マウスの腹腔内に注射した。第２回目の注射から２週間後、１５０μｌのＰＢＳに溶解された３０μｇの組換えｈＴＮＦαを前記マウスの静脈内（ｉ.ｖ.）に注射した。第３回目の注射から１０日後、ＰＢＳに溶解させた３０μｇの組換えｈＴＮＦαを前記マウスの静脈内に注射した。
リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline, PBS)１５０μｌに溶解された組換えｈＴＮＦα(Biosource PHC3011、ベルギー)３０μｇを１５０μｌの完全フロインドアジュバント(complete Freund’s adjuvant、Sigma F5881、アメリカ)と混合して乳化させた後、この混合液３００μｌを６週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。２週間後、３０μｇのｈＴＮＦαと１５０μｌの不完全フロインドアジュバント(incomplete Freund’s adjuvant、Sigma F5506、アメリカ)とを含む乳化混合液３００μｌを前記マウスの腹腔内に注射した。第２回目の注射から２週間後、１５０μｌのＰＢＳに溶解された３０μｇの組換えｈＴＮＦαを前記マウスの静脈内（ｉ.ｖ.）に注射した。第３回目の注射から１０日後、ＰＢＳに溶解させた３０μｇの組換えｈＴＮＦαを前記マウスの静脈内に注射した。
実施例２：抗−ｈＴＮＦα抗体を生産するマウスの脾臓細胞の融合
実施例１で免疫化されたマウスを炭酸カリウムで窒息させた後、脾臓を摘出した。摘出したマウスの脾臓から脾臓細胞を得た後、非分泌性の骨髄腫細胞であるＳｐ２／０（ATCC CRL1581）と１０：１の比率で混合した。細胞融合のために、予め３７℃に加温した５０％ポリエチレングリコール(Polyethylene glycol 1500, Roche 783641)１ｍｌを前記細胞混合物に添加した。２０%ウシ胎仔血清（FBS, JRH, 12−10678P)、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Gentamicin, Gibco−BRL, 15750−060)、１×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ，５６４９９−１０Ｌ）および１×ＨＡＴ補充剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（０.１ｍＭソジウムヒポキサンチン［Sodium hypoxanthine］、０.４μＭアミノプテリン［Aminopterin］、１６μＭチミジン［thymidin］；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、３１０６２−０３７）を含む成長培地で融合細胞を希釈した後、１.１×１０５細胞／ウェルの濃度で９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、４６９９４９、デンマーク）に分株した。前記融合細胞を５％二酸化炭素が供給される３７℃培養器(humid ified CO2 incubator)で２−３週間培養した。
実施例１で免疫化されたマウスを炭酸カリウムで窒息させた後、脾臓を摘出した。摘出したマウスの脾臓から脾臓細胞を得た後、非分泌性の骨髄腫細胞であるＳｐ２／０（ATCC CRL1581）と１０：１の比率で混合した。細胞融合のために、予め３７℃に加温した５０％ポリエチレングリコール(Polyethylene glycol 1500, Roche 783641)１ｍｌを前記細胞混合物に添加した。２０%ウシ胎仔血清（FBS, JRH, 12−10678P)、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン(Gentamicin, Gibco−BRL, 15750−060)、１×ＤＭＥＭ（ＪＲＨ，５６４９９−１０Ｌ）および１×ＨＡＴ補充剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（０.１ｍＭソジウムヒポキサンチン［Sodium hypoxanthine］、０.４μＭアミノプテリン［Aminopterin］、１６μＭチミジン［thymidin］；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、３１０６２−０３７）を含む成長培地で融合細胞を希釈した後、１.１×１０５細胞／ウェルの濃度で９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、４６９９４９、デンマーク）に分株した。前記融合細胞を５％二酸化炭素が供給される３７℃培養器(humid ified CO2 incubator)で２−３週間培養した。
実施例３：抗−ｈＴＮＦα抗体を生産する細胞株の検索およびクローニング
一旦融合細胞がコロニーを形成すると、その上澄液を取って抗体生産を確認するためにＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡ分析のために、ウェルに１μｇ／ｍｌのｈＴＮＦαを添加し、４℃で一晩中反応させてコーティングした後、０.５％カゼイン−ＰＢＳ溶液２００μｌを各ウェルに添加して３７℃で１時間反応させた。その後、細胞上澄液１００μｌを各ウェルに添加して３７℃で２時間反応させた。その後、１：１０００の比率で希釈した１００μｌの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Goat anti−mouses IgG−HRP、Bio−rad、170−6516)を各ウェルに添加し、３７℃で１.５時間反応させた。最後に、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質溶液(Horseradish peroxidase substrate solution,Bio−rad, 172−1064)を１００μｌずつ添加して３７℃で３分間放置し、発色反応を誘導した。４１０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機（ダイナテック社、アメリカ）で測定した。
一旦融合細胞がコロニーを形成すると、その上澄液を取って抗体生産を確認するためにＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡ分析のために、ウェルに１μｇ／ｍｌのｈＴＮＦαを添加し、４℃で一晩中反応させてコーティングした後、０.５％カゼイン−ＰＢＳ溶液２００μｌを各ウェルに添加して３７℃で１時間反応させた。その後、細胞上澄液１００μｌを各ウェルに添加して３７℃で２時間反応させた。その後、１：１０００の比率で希釈した１００μｌの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Goat anti−mouses IgG−HRP、Bio−rad、170−6516)を各ウェルに添加し、３７℃で１.５時間反応させた。最後に、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質溶液(Horseradish peroxidase substrate solution,Bio−rad, 172−1064)を１００μｌずつ添加して３７℃で３分間放置し、発色反応を誘導した。４１０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機（ダイナテック社、アメリカ）で測定した。
実施例４：抗−ｈＴＮＦα抗体を生産する細胞株の選別
実施例３でクローニングされた細胞株のうち、ｈＴＮＦα免疫化マウスから得た陽性対照群血清よりも高い吸光度を示した９つのＩｇＧ−生産細胞株を得た。これらの細胞株のうち、最高の吸光度を示したＴＳＫ１１を以後の分析のための細胞株として最終選抜した。
実施例３でクローニングされた細胞株のうち、ｈＴＮＦα免疫化マウスから得た陽性対照群血清よりも高い吸光度を示した９つのＩｇＧ−生産細胞株を得た。これらの細胞株のうち、最高の吸光度を示したＴＳＫ１１を以後の分析のための細胞株として最終選抜した。
実施例５：ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１から得たモノクローナル抗体のアイソタイプ
ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１から生産されたモノクローナル抗体のアイソタイプ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）は、下記のようにＥＬＩＳＡ分析で決定した。マウスモノ抗体アイディーキットＨＲＰ溶液(Mouse MonoAb ID kit HRP solution, Zymed, 90−6550)１００μｌを１００μｇ／ｍｌのＴＳＫ１１抗体で予めコーティングされたウェルに添加した後、前記ウェルプレートを３７℃で３分間維持して発色反応を誘導した。各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機（ダイナテックサ社、アメリカ）を用いて４１０ｎｍ波長で測定した。その結果、ＴＳＫ１１抗体がＩｇＧ１−タイプ重鎖とカッパタイプ軽鎖とを含むことを確認した。
ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１から生産されたモノクローナル抗体のアイソタイプ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）は、下記のようにＥＬＩＳＡ分析で決定した。マウスモノ抗体アイディーキットＨＲＰ溶液(Mouse MonoAb ID kit HRP solution, Zymed, 90−6550)１００μｌを１００μｇ／ｍｌのＴＳＫ１１抗体で予めコーティングされたウェルに添加した後、前記ウェルプレートを３７℃で３分間維持して発色反応を誘導した。各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機（ダイナテックサ社、アメリカ）を用いて４１０ｎｍ波長で測定した。その結果、ＴＳＫ１１抗体がＩｇＧ１−タイプ重鎖とカッパタイプ軽鎖とを含むことを確認した。
実施例６：ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１由来モノクローナル抗体の生体内の結合親和力
ｈＴＮＦαに対するＴＳＫ１１抗体の生体内の結合親和力はＥＬＩＳＡ分析によって次のように測定した。まず、各ウェルを４μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ組換えｈＴＮＦαでコーティングした。次いで、マイクロチューブ（ＡＸＹＧＥＮ社、アメリカ）内で組換えｈＴＮＦαを５×１０−９Ｍ〜１×１０−１０Ｍの範囲の濃度になるよう、０.０２％ウシ血清アルブミンが添加されたＰＢＳ溶液で希釈した。このようにして得られた多様な濃度のｈＴＮＦα希釈液をＴＳＫ１１抗体３０ｎｇと混合して３７℃で２時間反応させた。前記混合液を組換えｈＴＮＦαでコーティングされた各ウェルに分散し、３７℃で２時間反応させた。その後、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質溶液(Bio−rad，172−1064)を１００μｌずつ添加し、３７℃で３分間発色反応を誘導した。各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機(ダイナテック社、アメリカ)を用いて４１０ｎｍ波長で測定した。
見かけ上の親和力は、競争的ＥＬＩＳＡのスキャッチャード・プロット分析(Scatchard plot analysis)に従って最大結合の５０%を抑制するのに要求される抗原濃度の逆数(reciprocal)を計算することで決めた(Friguet B. et al., J. of Immunological Method７7, 305−319, 1985)。その結果、ｈＴＮＦαに対するＴＳＫ１１抗体の親和力は１.９５×１０−９Ｍ（Ｋｄ）であった。
ｈＴＮＦαに対するＴＳＫ１１抗体の生体内の結合親和力はＥＬＩＳＡ分析によって次のように測定した。まず、各ウェルを４μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ組換えｈＴＮＦαでコーティングした。次いで、マイクロチューブ（ＡＸＹＧＥＮ社、アメリカ）内で組換えｈＴＮＦαを５×１０−９Ｍ〜１×１０−１０Ｍの範囲の濃度になるよう、０.０２％ウシ血清アルブミンが添加されたＰＢＳ溶液で希釈した。このようにして得られた多様な濃度のｈＴＮＦα希釈液をＴＳＫ１１抗体３０ｎｇと混合して３７℃で２時間反応させた。前記混合液を組換えｈＴＮＦαでコーティングされた各ウェルに分散し、３７℃で２時間反応させた。その後、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質溶液(Bio−rad，172−1064)を１００μｌずつ添加し、３７℃で３分間発色反応を誘導した。各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡ読取機(ダイナテック社、アメリカ)を用いて４１０ｎｍ波長で測定した。
見かけ上の親和力は、競争的ＥＬＩＳＡのスキャッチャード・プロット分析(Scatchard plot analysis)に従って最大結合の５０%を抑制するのに要求される抗原濃度の逆数(reciprocal)を計算することで決めた(Friguet B. et al., J. of Immunological Method７7, 305−319, 1985)。その結果、ｈＴＮＦαに対するＴＳＫ１１抗体の親和力は１.９５×１０−９Ｍ（Ｋｄ）であった。
実施例７：ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１からＲＮＡの分離およびｃＤＮＡ合成
１×１０８個のハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１の細胞からＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ、アメリカ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、これをThermotranscript Kit（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、アメリカ）を利用したｃＤＮＡ合成に用いた。鋳型としてのＲＮＡ５μｇと０.５ｎｇのオリゴｄ（Ｔ）とを滅菌蒸留水で希釈して最終体積を１０μｌに合わせた。前記混合物を６５℃で５分間放置してＲＮＡを変性(denaturation)させ、常温に冷却してプライマーアニーリング(primer annealing)を誘導した。ｃＤＮＡ合成のためのＲＴ−ＰＣＲ反応溶液は、逆転写酵素(reverse transcriptase、１unit/μl)１μｌ、０.１Ｍ ＤＴＴ２.５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ２.５μｌとＲＮＡ分解酵素抑制剤(RNase inhibitor,１unit/μl)１μｌを混合し、滅菌蒸留水で最終体積を２５μｌで合わせて製造した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を５０℃で１時間行い、９５℃で５分間加熱して反応を中止させた。
１×１０８個のハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１の細胞からＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ、アメリカ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、これをThermotranscript Kit（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、アメリカ）を利用したｃＤＮＡ合成に用いた。鋳型としてのＲＮＡ５μｇと０.５ｎｇのオリゴｄ（Ｔ）とを滅菌蒸留水で希釈して最終体積を１０μｌに合わせた。前記混合物を６５℃で５分間放置してＲＮＡを変性(denaturation)させ、常温に冷却してプライマーアニーリング(primer annealing)を誘導した。ｃＤＮＡ合成のためのＲＴ−ＰＣＲ反応溶液は、逆転写酵素(reverse transcriptase、１unit/μl)１μｌ、０.１Ｍ ＤＴＴ２.５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ２.５μｌとＲＮＡ分解酵素抑制剤(RNase inhibitor,１unit/μl)１μｌを混合し、滅菌蒸留水で最終体積を２５μｌで合わせて製造した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を５０℃で１時間行い、９５℃で５分間加熱して反応を中止させた。
鋳型として合成されたｃＤＮＡ２μｇと重鎖の増幅のためのプライマー対(配列番号１および２)または軽鎖の増幅のための他のプライマー対(配列番号３および４)を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液はAmpliTaq Gold polymerase (パーキンエルマー社、アメリカ、５ｕｎｉｔ／μｌ)０.５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ１μｌおよび２５ｍＭ ＭｇＣｌ２５μｌを混合し、滅菌蒸留水で最終体積を５０μｌに合わせた。ＰＣＲは次の条件下で行った：９５℃で５分間の初期変性後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分の反応を３０回行い、７２℃で１０分の最終延長。
増幅されたＤＮＡを１.５％アガロースゲル電気泳動させ、このゲルを０.５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド(ethidium bromide)溶液１００ｍｌで２０分間染色した。その結果、１００ｂｐ標準ＤＮＡ梯子（ライフテクノロジー、アメリカ）を基準に、重鎖の場合は約４７０ｂｐに該当する位置から、軽鎖の場合は約４５０ＢＰに該当する位置で、２つの増幅されたＤＮＡ産物が検出された。
実施例８：ｃＤＮＡクローニング
実施例７で増幅された４７０ｂｐの重鎖のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した後、QIAquick ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、アメリカ)を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ(インビトロジェン社、アメリカ)にサブクローニングした後、得られたベクターを用いてこれを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ(インビトロゼン、アメリカ)を形質転換させて形質転換体を得た (Cohen, S. N. et al, Proc.Nat. Acad. Sci.69, 2110, 1972)。このように製造された大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で一晩中培養した。プラスミドＤＮＡを培養された形質転換体から抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ(バイオラブ社、アメリカ)で切断して４７０ｂｐの重鎖ＤＮＡ断片を含むクローンＴＳＫ１１−Ｈｖを得た。
実施例７で増幅された４７０ｂｐの重鎖のＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した後、QIAquick ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、アメリカ)を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ(インビトロジェン社、アメリカ)にサブクローニングした後、得られたベクターを用いてこれを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ(インビトロゼン、アメリカ)を形質転換させて形質転換体を得た (Cohen, S. N. et al, Proc.Nat. Acad. Sci.69, 2110, 1972)。このように製造された大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で一晩中培養した。プラスミドＤＮＡを培養された形質転換体から抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ(バイオラブ社、アメリカ)で切断して４７０ｂｐの重鎖ＤＮＡ断片を含むクローンＴＳＫ１１−Ｈｖを得た。
実施例７で増幅された４５０ｂｐの軽鎖のＤＮＡ断片に対しても、上記と同一操作過程を行って、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ形質転換体を得た。前記大腸菌質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩中培養した。プラスミドＤＮＡを培養された形質転換体から抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ(バイオラブ社、アメリカ)で切断して４５０ｂｐの軽鎖のＤＮＡ断片を含むクローンＴＳＫ１１−Ｌｖを得た。
実施例９：ｃＤＮＡ塩基配列の分析
実施例８で得たクローンＴＳＫ１１−ＨｖおよびＴＳＫ１１−ＬｖをWizard plus SV Minipreps DNA Purification System (プロメガ、アメリカ)を用いて精製し、それらの塩基配列の分析を行った。
その結果、前記重鎖のＤＮＡ断片が配列番号：５の塩基配列と配列番号：７のアミノ酸配列とを含むことを確認した。クローンＴＳＫ１１−Ｈｖに属する３つの特異的クローン(TSK11Hv1、TSK11Hv2およびTSK11Hv3)を調査した結果、これらの塩基配列がすべて同一であった。クローンＴＳＫ１１Ｈｖから得たプラスミドベクターをｐＴＳＫ１１−Ｈｖと命名した。また、前記プラスミドベクターｐＴＳＫ１１−Ｈｖで形質転換された大腸菌を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＴＳＫ１１−Ｈｖと命名し、特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１４ＢＰとして韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)(住所：韓国大田廣域市儒城区魚隱洞５２、〒３０５−３３３)に２００３年８月２６日付で寄託した。
実施例８で得たクローンＴＳＫ１１−ＨｖおよびＴＳＫ１１−ＬｖをWizard plus SV Minipreps DNA Purification System (プロメガ、アメリカ)を用いて精製し、それらの塩基配列の分析を行った。
その結果、前記重鎖のＤＮＡ断片が配列番号：５の塩基配列と配列番号：７のアミノ酸配列とを含むことを確認した。クローンＴＳＫ１１−Ｈｖに属する３つの特異的クローン(TSK11Hv1、TSK11Hv2およびTSK11Hv3)を調査した結果、これらの塩基配列がすべて同一であった。クローンＴＳＫ１１Ｈｖから得たプラスミドベクターをｐＴＳＫ１１−Ｈｖと命名した。また、前記プラスミドベクターｐＴＳＫ１１−Ｈｖで形質転換された大腸菌を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＴＳＫ１１−Ｈｖと命名し、特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１４ＢＰとして韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)(住所：韓国大田廣域市儒城区魚隱洞５２、〒３０５−３３３)に２００３年８月２６日付で寄託した。
また、前記軽鎖ＤＮＡ断片は、配列番号６の塩基配列と配列番号８のアミノ酸配列とを含むことを確認した。クローンＴＳＫ１１−Ｌｖに属する２つの特異的クローン(ＴＳＫ１１Ｌｖ１およびＴＳＫ１１Ｌｖ２)を調査した結果、これらの塩基配列がすべて同一であった。クローンＴＳＫ１１Ｌｖから得たプラスミドベクターをｐＴＳＫ１１−Ｌｖと命名した。また、前記プラスミドベクターｐＴＳＫ１１−Ｌｖで形質転換された大腸菌を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ／ｐＴＳＫ１１−Ｌｖと命名し、特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１５ＢＰとして韓国遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)(住所：韓国大田廣域市儒城区魚隱洞５２、〒３０５−３３３)に２００３年８月２６日付で寄託した。
ハイブリドーマ細胞株ＴＳＫ１１から得たモノクローナル抗体の可変領域に対するアミノ酸配列分析(Harris. L. et al., Protein Sci. 4, 306−310, 1995. ; Kabat. E.A.et al., Sequence of proteins of immunological interest. 5th Ed., 1991. ; Williams A.F.et al., Annu.Rev.Immunol. 6,381−406,1988)を行った結果、重鎖はＫａｂａｔが定義した１１つのグループ以外の他グループ(miscellaneous group)に属し、軽鎖はカッパ６−タイプサブグループに属することが判明した。
重鎖の抗原を認識するＣＤＲｓは３１−３５(配列番号９)、５０−６６(配列番号１０)および９９−１０６(配列番号１１)のアミノ酸の位置で発見され、軽鎖の抗原を認識するＣＤＲｓは２４−３５(配列番号１２)、５１−５７(配列番号１３)および９０−９８(配列番号１４)のアミノ酸の位置で発見された。
重鎖の抗原を認識するＣＤＲｓは３１−３５(配列番号９)、５０−６６(配列番号１０)および９９−１０６(配列番号１１)のアミノ酸の位置で発見され、軽鎖の抗原を認識するＣＤＲｓは２４−３５(配列番号１２)、５１−５７(配列番号１３)および９０−９８(配列番号１４)のアミノ酸の位置で発見された。
Claims (15)
- 配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域；および配列番号２、１３および１４のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域の少なくとも一つを含むヒト腫瘍壊死因子−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体可変領域。
- 前記重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体可変領域。
- 前記軽鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体可変領域。
- 前記重鎖の可変領域が配列番号５の塩基配列を含むｃＤＮＡ分子によってコードされることを特徴とする請求項１に記載の抗体可変領域。
- 前記軽鎖の可変領域が配列番号６の塩基配列を含むｃＤＮＡ分子によってコードされることを特徴とする請求項１に記載の抗体可変領域。
- ヒト腫瘍壊死因子−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードし、前記重鎖の可変領域が配列番号９、１０および１１のアミノ酸配列を含む核酸分子。
- 前記重鎖の可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸分子。
- 配列番号：５の塩基配列を含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸分子。
- ヒト腫瘍壊死因子−αに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域をコードし、前記軽鎖の可変領域が配列番号１２、１３および１４のアミノ酸配列を含む核酸分子。
- 前記軽鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸分子。
- 配列番号６の塩基配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸分子。
- 請求項６に記載の核酸分子を含む組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｈｖ。
- 請求項９に記載の核酸分子を含む組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｌｖ。
- 請求項１２に記載の組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｈｖで形質転換され、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１４ＢＰを有する、形質転換体大腸菌ＴＯＰ１０F/ｐＴＳＫ１１−Ｈｖ。
- 請求項１３に記載の組換えベクターｐＴＳＫ１１−Ｌｖで形質転換され、寄託番号ＫＣＴＣ１０５１５ＢＰを有する、形質転換体大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ/ｐＴＳＫ１１−Ｌｖ。
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