MX2011000052A - Humanizacion de anticuerpos de conejos usando una estructura de anticuerpos universal. - Google Patents

Humanizacion de anticuerpos de conejos usando una estructura de anticuerpos universal.

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David Urech
Leonardo Borras
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Esbatech Alcon Biomed Res Unit
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Abstract

La presente invención se refiere a una estructura de aceptor de anticuerpos universal y a métodos para injertar anticuerpos no humanos, v.gr., anticuerpos de conejo, usando una estructura de aceptor de anticuerpos universal. Los anticuerpos generados por los métodos de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstica y terapéuticas.

Description

HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS DE CONEJOS USANDO UNA ESTRUCTURA DE ANTICUERPOS UNIVERSAL INFORMACIÓN RELACIONADA La presente solicitud reclama prioridad a la US 61/075,697 presenta el 25 de junio de 2008; además reclama prioridad a US 61/155,041 presentada el 24 de febrero de 2009 y a US61/155,105 del 24 de febrero de 2009.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales, sus conjugados y derivados son inmensamente importantes a nivel comercial como agentes terapéuticos y diagnóstico. Los anticuerpos no humanos producen una fuerte respuesta inmune en pacientes, siguiendo usualmente una inyección de una sola dosis baja (Schroff, 1985 Cáncer Res 45:879-85, Shawler, J Immunol 1985 135:1530-5; Dillman, Cáncer Biother 1994 9:17-28). Consecuentemente, se desarrollaron varios métodos para reducir la inmunogenicidad de murinos y otros anticuerpos de roedores asi como tecnologías para crear anticuerpos completamente humanos usando v.gr., ratones transgénicos o exposición de fagos. Se trataron anticuerpos quiméricos, que combinan regiones variables de roedores con regiones de constantes humanas (v.gr., Boulianne Nature 1984 312:643-6) problemas de inmunogenicidad considerablemente reducidos (v.gr., LoBuglio, Proc Nati Acad Sci 1989 86:4220-4; Clark, Immunol Today 2000 21:397-402). Los anticuerpos humanizados también fueron tratados, en los cuales la secuencia de roedores de la propia región variable se trató para estar tan cercana a una secuencia humana como sea posible mimbras conserva por lo menos CDR original, o en donde los CDR forman el anticuerpo de roedor en donde se injerta en la estructura de un anticuerpo humano (v.gr., Riechmann, Nature 1988 332:323-7; US5, 693, 61 ) . Los anticuerpos policlonales de ratones se utilizaron ampliamente para análisis biológicos tales como ELISA o análisis Western. Los anticuerpos de conejo policlonales algunas veces se favorecen sobre los anticuerpos de roedores policlonales debido a que usualmente tienen afinidad bastante superior. Además, el conejo con frecuencia puede producir buenas respuestas de anticuerpos a antigenos que son pobremente inmunogénicos en ratones y/o que no originan buenos aglutinantes cuando se usan en la exhibición de fagos. Debido a estas ventajas bien conocidas de anticuerpos de conejos, puede ser ideal para ser usada en el descubrimiento y desarrollo de anticuerpos terapéuticos. La razón de que esto no sea realizado comúnmente principalmente se debe a las confrontaciones técnicas en la generación de anticuerpos de conejos monoclonales . Dado que los tumores similares a mieloma son desconocidos en conejos, la tecnología de hibridoma convencional para generar anticuerpos monoclonales no se aplica a anticuerpos de conejo. El trabajo previo para proveer pares de líneas celulares por fusión para células que expresan anticuerpos de conejos se ha realizado por Knight y colaboradores (Spieker-Polet y otros, PNAS 1995, 92:9348-52) y la línea celular en par de fusión mejorada se ha descrito por Pytela y otros, en 2005 (véase v.gr., Patente de E.U.A. No. 7429487). Sin embargo, esta tecnología no se difunde ampliamente debido a que el conocimiento correspondiente se controla básicamente por un solo grupo de búsqueda. Los métodos alternativos para la generación de anticuerpos monoclonales que implica la clonación de anticuerpos de células que expresan anticuerpos seleccionados vía RT-PCR se describen en la literatura pero nunca se ha reportado exitosamente para anticuerpos de conej o .
Los anticuerpos de conejo, se espera que los anticuerpos como los de ratón producen fuertes respuestas inmunes si se usan para terapia humana, por lo tanto, los anticuerpos de conejos necesitan humanizarse antes de que se puedan usar clínicamente. Sin embargo, los métodos que se usan para crear anticuerpos de roedores humanizados no pueden extrapolarse fácilmente para anticuerpos de conejos debido a las diferencias estructurales entre conejos y ratones y, respectivamente, entre anticuerpos de conejos y humanos. Por ejemplo, la cadena ligera CDR3 (CDRL3) con frecuencia es más grande que los CDRL3 previamente conocidos de anticuerpos humanos o ratones.
Hay pocos enfoques de humanización de anticuerpo de ratones descritos en la técnica anterior que, sin embargo, no hay enfoque de injerto clásica en la cual los CDR de un donador no humano se trasplantan en un anticuerpo aceptor humano. WO 04/016740 describe una estrategia de "reparación" es remodelar los residuos accesibles con solventes del marco no humano de manera que se vuelven más parecidos a los seres humanos. Las técnicas de humanización similares para anticuerpos de conejos como se describió en WO 04/016740 se conocen en la materia. Tanto WO 08/144757 y WO05/016950 describe métodos para humanizar un anticuerpo monoclonal de conejos que implica la comparación de secuencias de aminoácido de un anticuerpo de conejo madre a las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo humano similar. Subsiguientemente, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de conejo madre se altera de manera que sus regiones de estructura son más similares en secuencia a las regiones de estructura equivalentes del anticuerpo humano similar. Con el fin de obtener buenas capacidades de unión, los esfuerzos de desarrollo laborioso necesitan estar hechos para cada inmunoaglutinante individualmente .
Un problema potencial de los enfoques descritos antes es que no se usa una estructura humana, pero la estructura de conejo se trata de manera que se ve más humana. Dicho enfoque tiene el riesgo de que las extensiones de aminoácidos que se entierran en el núcleo de la proteina aún puede comprender epitopes de células T inmunogénicas .
A la fecha, los solicitante son han identificado un anticuerpo de conejo, que fue humanizado aplicando enfoques de injerto del estado de la técnica. Esto puede explicarse por el hecho de que los CDR de conejo pueden ser muy diferentes de CDR humanos o de roedores. Como se conoce en la materia, muchas cadenas de VH de conejo tienen cisteinas en pares extra en relación con las contrapartes de murinos y seres humanos. Además, el puente de disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, hay un puente de cis21-cys79 asi como un puente ínter CDR S-S formado entre el último residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Además, los pares de residuos de cisteína con frecuencia se encuentran en CDR-L3. Además, muchos CDR de anticuerpos anticonejo no pertenecen a cualquier estructura canónica previamente conocida. En particular, CDR-L3 con frecuencia es mayor que CDR-L3 de una contraparte de humano o murino .
Por lo tanto, el injerto de anticuerpos de CDR no humanos en una estructura humana es una tarea de ingeniería de proteínas mayor. La transferencia de bucles de unión de antígenos de una estructura evolucionada naturalmente a una estructura humana seleccionada artificialmente diferente deberá llevarse a cabo de manera que las conformaciones de bucle nativas se retienen para unión de antigeno. Con frecuencia la afinidad de unión de antigeno se reduce en gran parte o se elimina después del injerto del bucle. El uso de estructuras humanas seleccionadas cuidadosamente al injertar los bucles de unión de antigeno aumenta al máximo la probabilidad de retener la afinidad de unión en la molécula humanizada (Roguzka y otros 1996) . Aunque los diferentes experimentos de injerto disponibles en la literatura proveen una guia para el injerto de CDR, no es posible generalizar un patón. Los problemas típicos consisten de perder la especificidad, estabilidad o producibilidad después del injerto de bucles de CDR.
Consecuentemente, hay una necesidad urgente para métodos mejorados para humanizar confiable y rápidamente anticuerpos de conejo para usarse como agentes terapéuticos y de diagnostico. Además, existe una necesidad de estructuras aceptoras humanas para humanizar confiablemente anticuerpos de conejo, proveyendo anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos funcionales con propiedades biofísicas similares a fármacos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado sorprendentemente que una estructura de anticuerpo humana altamente soluble y estable identificada por un análisis de Control de Calidad (QC) (como se describe en WO 0148017 y en Auf de Maur y otros (2001), FEBS Lett 508, p. 407-412) es particularmente adecuado para acomodar CDR de otra especia animal que no es de ser humano, por ejemplo, CDR de conejo. Consecuentemente, en un primer aspecto, la invención provee las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano particular (el asi llamado, anticuerpo "FW 1.4") que es especialmente adecuado como aceptor universal para CDR de una variedad de anticuerpos, en particular de anticuerpos de conejo, o de diferentes especificidades de unión, independientemente de si está presente o un puente de disulfuro de CDR. Además, la presente invención provee dos secuencias mutantes de la estructura de anticuerpos humanos particulares, a saber rFW1.4 y rFWl . (V2) , ambas siendo estructuras particularmente adecuadas como estructuras de aceptores universales parea el injerto de CDR de conejo. En otro aspecto, la invención provee un motivo de residuos de estructuras que vuelve adecuada la estructura humana para acomodar CDR de otras especies de animales que no son seres humanos, en particular CDR de conejo.
Los inmunoaglutinantes humanizados generados por el injerto de CDR de conejo en estas estructuras de cadena ligera y pesada variable altamente compatible y retienen confiablemente la orientación espacial de los anticuerpos de conejo de los cuales se derivan los CDR donadores. Por lo tanto, las posiciones no estructuralmente relevantes del inmunoaglut inante donador necesita introducirse en la I estructura aceptora. Debido a estas ventajas, la humanización de alto paso de anticuerpos de conejo sin ninguna o poca optimización de las capacidades de unión pueden lograrse.
Consecuentemente, en otro aspecto, la invención provee métodos para injertar CDR de conejo y otros CDR no humanos, en las secuencias de estructura de anticuerpo humano de cadena ligera y/o cadena pesada soluble y estable descritas en la presente, generando asi anticuerpos humanizados con propiedades biofísicas superiores. En particular, los inmunoaglutinantes generados por los métodos de la invención exhiben propiedades funcionales superiores tales como solubilidad y estabilidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe la definición de CDR Hl usada en la presente para injertar sitios de unión de antigeno de anticuerpos monoclonales de conejo en las estructuras de anticuerpos humanos altamente solubles y estables.
La Figura 2 muestra esquemáticamente una célula B 1 marcada con un anticuerpo fluorescente 2 que interactúa con una célula de expresión de blanco 3 teñida con un colorante intracelular 4. El blanco de elección: 5; BCR: 6.
Las Figuras 3A-3C: proceso de selección de FACS de células B de conejo que se unen al blanco soluble ESBA903. Figura 3A: linfocitos que se restringen de acuerdo con la dispersión hacia adelante y lateral. Figura 3B: entre ellos, se seleccionan células IgG+ IgM- (probablemente células dB de memoria) (compuerta roja) . Figura 3C: Células con tinción doble con ESBA903 -PE y ESBA903-PerCP (compuerta verde) se separa que codifiquen IgG de alta afinidad contra ESBA903. Las células que muestran la fluorescencia más brillante (compuerta rosa) se almacenan en palcas de 96 pozos.
Figura 4. Perlas revestidas con anticuerpos de anti-TNFalfa (marcadas con PE) se unen a células CHO transíectadas con TNFalfa (panel superior) . Las perlas de control revestidas con anticuepors anti-CD19 (marcadas con APC) no se unan a célula sCHo transíectadas con TNFalfa (panel medio) . Las perlas revestidas con anticuerpos anti-TNFalfa (marcadas con PE) no se unan a células CHO de tipo silvestre (wt) (panel inferior) . Las gráficas de puntos en la parte izquierda muestran dispersiones hacia adelante y laterales, que indican el tamaño respectivo y la granularidad de los eventos. Las población de perlas solas (~3 um) se restringen en P2. Las células CHO eventualmente se unen a perlas (~30 um) se restringen en Pl . Las gráficas de puntos en la parte media muestran los eventos Pl (células CHO) con respecto a su tinción de PE o APC. Por lo tanto, si las células interactúan con perlas anti-TNFalfa, serán mostradas en la compuerta P3, y si interactúan con las perlas anti-CD19 aparecerán en la compuerta P4. En el lado derecho, las estadísticas para cada muestra se detallan.
Figura 5. Perlas revestidas con anti-TNFalfa-PE y perlas revestidas con anti-CD19-AOc se mezclaron junto con células CHO transfectadas con TNFalfa. Las células CHO fueron restringidas (Pl) y entre las células que se unen a perlas revestidas con anti-TNFalfaPe o perlas revestidas con anti-CD19-APC se mostraron en las compuertas P3 y P4, respectivamente. Las perlas no unidas son visibles en la compuerta P2.
Figura 6. Un análisis de secuencias de anticuerpos de conejo extraídas de la base de datos de Kabat confirma que CDR3 de la cadena pesada variable normalmente es tres aminoácidos más larga que su contraparte de murinos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos serán definidos de la siguiente manera. Las definiciones adicionales se exhiben a través de la descripción detallada.
El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión de antigeno. El término "polipéptido de unión de antigeno" y "inmunoaglutinante" se usan simultáneamente en la presente. Un "anticuerpo" se refiera a una proteina, opcionalmente glicosilada, que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión de antigeno de los mismos. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviado en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región de constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR) , interpuestas con regiones que son regiones llamadas de estructura (FR), más conservadas. Cada VH y VL se compone de tres CDr y cuatro FR, dispuestos de terminaciones amino a terminaciones carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3, FR . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos que median la unión de inmunoglobulina a tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (v.gr., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico .
El término "porción de unión a antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que tienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (v.gr., TNF) . Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL. VH, CL y CH1; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste de VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios FL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un solo dominio o fragmento de dAb (Ward y otros, (18989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) o (vii) una combinación de dos o más CDR aislados que opcionalmente se unen por un entrelazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, par de regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena única Fv (scFv); véase v.gr., Bird y otros (1988) Science 242:423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85.5879-5883). Dichos anticuerpos de una sola cadena también se pretende que sean abarcados dentro del término "porción de unión a antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se tamizan para utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antigenos se pueden producir por técnicas de ADN recombinantes , o por división enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser de un isotipo diferente, por ejemplo un anticuerpo IgG (v.gr., un subtipo IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4), IgAl, IgA2, IgD, IgE o IgM.
El término "inmunoaglutinante" se refiere a una molécula que contiene todo o parte del sitio de unión de antígeno de un anticuerpo, v.gr., todo o parte del dominio de variable de cadena pesada y/o ligera, de manera que el inmunoaglutinante reconoce específicamente un antígeno blanco. Ejemplos no limitantes de inmunoaglutinantes incluyen moléculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFvs, asi como fragmentos de anticuerpos que comprenden dos fragmentos de Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento de Fab', que esencialmente es un Fab con parte de la región de gozne (véase FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) un fragmento de Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (v) un fragmento de Fv que consiste de los dominios de VL y vH de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de un solo dominio tal como un fragmento de Dab (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio de VH y VL, un Camelid (ver Hamers-Casterman, y otros, Nature 363:446-448 (1993) y Dumoulin, y otros, Protein Science 11 : 500-515 (2002)) o un anticuerpo Shark (v.gr., Ig-NARs Nanobodies® de tiburón; y (vii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un dominio de una sola variable y do dominios constantes. el término "anticuerpo de una sola cadena", "Fv de una sola cadena" o "scFv" se refiere a una molécula que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (o región; VH) y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo )o región; VL) conectado por un entrelazado . Dichas moléculas de scFv pueden tener las estructuras generales: N¾- VL-entrelazador- VH-COOH o NH2-VH-entrelazador-VL-COOH. Un estado adecuado de entrelazador de la técnica consiste de secuencias de aminoácidos de GGGGS repetidas o variantes del mismo. En una modalidad preferida de la presente invención, un entrelazador de (GGGGGS)4 de la secuencia de aminoácidos exhibida en SEC ID NO: 8 se usa, pero las variantes de 1-3 repeticiones también son posibles (Holliger y otros (19993), Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 90:6444-64448). Otros entrelazadores que se pueden usar para la presente invención se describen por Alfthan y otros (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi y otros (2001), Eur. J. Immunol. 31 :94-106, Hu et al. (1996), Cáncer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov y otros, (1999), J. Mol. Biol . 293:41-56 and Roovers y otros (2001), Cáncer Immunol.
Como se usa en la presente, el término "propiedad funcional" es una propiedad de un polipéptido (v.gr., un inmunoaglutinante ) para el cual es conveniente y/o ventajosa una mejora (v.gr., relativa a un polipéptido convencional) para alguien experto en la materia, v.gr., con el fin de mejorar las propiedades de manufactura o eficacia terapéutica del polipéptido. En una modalidad, la propiedad funcional es estabilidad (v.gr., estabilidad térmica). En otra modalidad, la propiedad funcional es solubilidad (v.gr., bajo condiciones celulares) . En aún otra modalidad, la propiedad funcional es el comportamiento de agregación. En aún otra modalidad, la propiedad funcional es la expresión de proteínas (v.gr., en una célula procariótica) . En aún otra modalidad, la propiedad funcional es el comportamiento de redobles siguiendo la solubilización del cuerpo de inclusión en un proceso de manufactura. En ciertas modalidades, la propiedad funcional no es una mejora en afinidad de unión de antigeno. En otra modalidad preferida, a la mejora de una o más propiedades funcionales no tiene efecto sustancial en la afinidad de unión del inmunoaglutinante .
El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que principalmente contribuyen a unión de antigeno. Una de las definiciones más comúnmente usadas para los seis CDR se proporcionó por Kabat E.A. y otros, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Como se usa en la presente, la definición de Kabat de CDR solo se aplican a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de variable de cadena ligera (CDR Ll, CDR L2, CDR L3, o Ll, L2, L3) , asi como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3) . CDR1 del dominio de variable de cadena pesada (CDR Hl o Hl) sin embargo, como se usa en la presente, se definen por las posiciones de residuo (numeración de Kabt) partiendo con la posición 26 y terminando antes de la posición 36. Esta definición básicamente es una fusión de CDR Hl como se definió de manera diferente por Kabat y Chotia (ver también Figura 1 para ilustración) .
El término "estructura de anticuerpo" como se usa en la presente se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o VH, que sirve como una plataforma para los bucles de unión de antigeno (CDR) de este dominio variable. En esencia es el dominio variable dentro de los CDR.
El término "epitope" o "determinante antigénica" se refiere a un sitio en un antigeno al cual se une específicamente un a inmunoglobulina o anticuerpo (v.gr, un sitio específico en la molécula de TNF) . Un epitope normalmente incluye por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación espacial única. Véase, por ejemplo, Epitope apping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) .
Los términos "unión específica", "unión selectiva", "se une selectivamente" y "se une específicamente," se refieren a la unión del anticuerpo a un epitope de un antígeno determinado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kj)) de aproximadamente menos de 10~7 M, como aproximadamente menos que cerca de 10~8 M, 10"9 M o el 10"10 M.
El término "KD" o "Kd" se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, los anticuerpos de la invención se unen a TNF con una constante de equilibrio de disociación (KD) menor a aproximadamente 10"7 M, tal como menor a aproximadamente 10~8M, 10"9 o 10"10M o aún inferior, por ejemplo, como se determina usando tecnología de resonancia de plasminógeno de superficie (SPr) en un instrumento BIACORE.
El término "molécula de ácido nucléico", como se usa en la presente se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácidos nucléicos puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra. Un ácido nucléico está "ligado operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucléicos. Por ejemplo, un promotor o mejorador está ligado operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácidos nucléicos capaz de transportar otro ácido nucléico al cual se ha ligado. En una modalidad, el vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el cual se pueden ligar los segmentos de ADN adicionales. En otra modalidad, el vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Los vectores descritos en la presente pueden ser capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (v.gr., vectores bacteriales que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) pueden estar integrados en el genoma de una célula huésped por introducción en la célula huésped por lo tanto se replican junto con el genoma huésped (v.gr., vectores de mamíferos no episomales) .
El término "célula huésped" se refiere a una célula en la cual el sector de expresión se ha introducido. Las células huésped incluyen células bacterianas, microbianas, de plantas o animales, preferiblemente, Escherichia coli, Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, CHO (Chínese Hámster Ovary lines) o células NSO.
El término "lagomorfos" se refiere a miembros del orden taxonómico Lagomorpha, que comprende las familias Leporidae (v.gr, liebres y conejos) y Ochotonidae (picas). En una modalidad más preferida, el lagomorfo es un conejo. El término "conejo" como se usa en la presente se refiere a un animal que pertenece a la familia de leporidae.
Como se usa en la presente, "identidad" se refiere a la secuencia que coincide entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucléicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas se ocupa por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada uno de dos polipéptidos se ocupa por una lisina) , entonces las moléculas respectivas son idénticas en dicha posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posición idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que necesita introducirse para alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente se hace una comparación cuando se alinean dos secuencias para dar identidad máxima. Dicha alineación se puede proveer usando, por ejemplo, el método del algoritmo de Needleman y Wunsh (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1979)) que se ha incorporado en el programa de GAP en el paquete de software GCG, usando cualquiera de una matriz de Blossum 62 o una matriz de PAM 250 y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6.
A menos que se definen de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen más adelante. En caso de conflicto, controlará la presente especificación, incluyendo definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos únicamente son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes .
Varios aspectos de la invención se describen en mayor detalle en las siguientes subsecciones . Se entiende que varias modalidades, preferencias y rangos pueden combinarse a voluntad. Además, dependiendo de la modalidad especifica, A. Honegger, and Pluckthun, J. Mol. Biol . 309:657-670). Alternativamente, se puede usar el sistema de numeración de Kabat como se describe más ablente en Kabat y otros (Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) . Las tablas de conversión de los dos sistemas de numeración diferentes usados para identificar posiciones de residuos de aminoácidos en regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos se proveen en A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
En un primer aspecto, la presente invención provee una estructura de aceptor universal para el injerto de CDR de otras especies animales, por ejemplo, de conejo. Se ha descrito previamente que los anticuerpos y derivados de anticuerpos que comprenden las estructuras humanas identificadas en la pantalla llamada "Control de Calidad" (WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta. Aunque la estructura de una sola cadena humana F 1.4 (una combinación de SEC ID NO: 1 (nombrado a43 en WO03/097697) y SEC ID NO: 2 (nombrada KI27 en O03/097697 ) ) se llevó a cabo claramente en el análisis de Control de Calidad, sorprendentemente se encontró que tiene una alta estabilidad termodinámica intrínseca y se puede producir bien, también en combi ancón con una variedad de diferentes CDR. La estabilidad de esta molécula puede atribuirse en su mayor parte a sus regiones de estructura. Además, se ha mostrado que FW1.4 es en esencia altamente compatible con los sitios de unión a antigeno de anticuerpos de conejo. Por lo tanto, FW1. representa una plataforma adecuada para construir fragmentos de anticuerpos de scFv humanizados estables del injerto de bucles de conejo. Por lo tanto, en un aspecto, la invención provee una estructura de aceptor de inmunoaglutinante, que comprende una secuencia de VH que tiene una identidad de por lo menos 90% con SEC ID No. 1 y/o una secuencia de VL que tiene una identidad de por lo menos 85% con SEC ID NO. 2, más preferiblemente comprendiendo la secuencia de FW1.4 (SEC ID No. 3) para el injerto de CDR de conejo, o una secuencia que tiene por lo menos 60%, más preferiblemente identidad de por lo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, a SEC ID NO: 3.
Además, se ha encontrado que FW1. puede optimizarse sustituyendo varias posiciones de residuos en la cadena pesada de F1.4 y/o sustituyendo la posición 1 en la cadena liguera de FW1.4. Por lo tanto, se ha encontrado sorprendentemente que la conformación de bucles de una gran variedad de CDR de conejo en VH puede mantenerse completamente, en gran parte independiente de la secuencia de la estructura de donador. Dichos residuos en la cadena pesada asi como en la posición 1 en la cadena ligera de FW1.4 se conservaron en anticuerpos de conejo. El residuo consensual de las posiciones en la cadena pesada asi como en una posición en la cadena ligera se dedujo del repertorio de conejo y se introdujo en la secuencia de la estructura de aceptor humano.
Como resultado, la estructura modificada 1.4 (de aquí en adelante denominada como rFW1.4) es compatible virtualmente con cualquier CDR de conejo. Además, rFW1.4 que contiene diferentes CDR de conejo se expresa y produce bien contrario a las cadena solas de tipo silvestre de conejo y aun retiene casi completamente la afinidad de los anticuerpos de conejo donadores originales.
Por lo tanto, la presente invención provee la estructura de cadena pesada variable de SEC ID NO. 1, además comprendiendo uno o más residuos de aminoácidos que generalmente soportan la conformación de CDR derivados de un inmunoaglutinante de conejo. En particular, los residuos están presentes en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H y 108H (numeración AHo) . Se probó que estas posiciones afectan la conformación de CDR y por lo tanto se contemplan para mutación para adaptar CDR donador. Preferiblemente, dichos uno o más residuos se seleccionan del grupo que consiste de: Treonina (T) en la posición 24, Valina (V) en la posición 25, Glicina o Alanina (G o A) en la posición 56, Lisina (K) en la posición 82, Treonina (T) en la posición 84, Valina (V) en la posición 89 y Arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) . Preferiblemente, por lo menos tres, más preferiblemente, cuatro, cinco, seis y más preferiblemente los siete residuos están presentes. Sorprendentemente, se ah encontrado que la presencia de los residuos mencionados mejor a la estabilidad del inmunoaglutinante .
En una modalidad preferida, la invención provee una estructura de aceptor de inmunoaglutinante que comprende un VH que tiene una identidad de por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y todavía más preferiblemente 100% a SEC ID No. 4, siempre y cuando estén presentes por lo menos uno, más preferiblemente por lo menos tres, más preferiblemente cuatro, cinco, seis y todavía más preferiblemente siete residuos del grupo que consiste de treonina (T) en la posición 24, valían (V) en la posición 25, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, treonina (T) en la posición 84, lisina (K) en la posición 82, valían (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) . En una modalidad preferida, la estructura de aceptor de inmunoaglutinante es una estructura de aceptor de inmunoaglutinante para CDR de conejo.
En una modalidad preferida, dicha estructura de cadena pesada variable es o comprende SEC ID No. 4 o SEC ID NO. 6. Ambas estructuras de cadena pesada variable por ejemplo, pueden combinarse con cualquier estructura de cadena ligera adecuada.
Consecuentemente, la presente invención provee una estructura de aceptor de inmunoaglutinante que comprende (i) una estructura de cadena pesada variable que tiene por una identidad de por lo menos 70%, preferiblemente identidad de por lo menos 75%, 805, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, a SEC Id No. 4; y/o (ii) una estructura de cadena ligera variable que tiene identidad de por lo menos 70%, preferiblemente identidad de por o menos 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos identidad del 95%, a SEC ID NO. 2.
En una modalidad bastante más preferida, la estructura de cadena pesada variable comprende treonina (T) en la posición 24, glicina (G) en la posición 56, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) .
En una modalidad preferida, la cadena ligera variable comprende Treonina (TI en la posición 87 (numeración AHo) .
En una modalidad preferida, dicha estructura de aceptor de inmunoaglutianante comprende (i) una estructura de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 4 y SEC ID No. 6; y/o (ii) una estructura de cadena ligera variable de SEC ID No. 2 o SEC ID No. 9.
En una modalidad preferida, la estructura de cadena pesada variable se liga a una estructura de cadena ligera variable via un entrelazador . El entrelazador puede ser cualquier entrelazador adecuado, por ejemplo, un entrelazador que comprende de la 4 repeticiones de la secuencia GGGGS, preferiblemente un péptido de (GGGGS ) 4 (SEC ID No. 8), o un entrelazado como se describe en Alfthan y otros (1995) Protein Eng. 8:725-731.
En otra modalidad preferida, la estructura de aceptor inmunoaglutinante es una secuencia que tiene identidad de por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, a SEC ID No. 5, mientras que la secuencia, preferiblemente, no es SEC ID No. 3. Más preferiblemente, la estructura de aceptor de inmunoaglutinante comprende o es SEC ID No. 5.
En otra modalidad preferida, la estructura de aceptor inmunoaglutinante es una secuencia que tiene identidad de por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95%, a SEC ID NO. 7, mientras que la secuencia, preferiblemente, no es SEC ID No. 3. Más preferiblemente, la estructura de aceptor de inmunoaglutinante comprende o es SEC ID No. 7.
Además, se ha encontrado sorprendentemente que la presencia del motivo de aminoácidos descrito antes vuelve una estructura, preferiblemente una estructura humana, particularmente adecuada para el acomodo de CDR de otras especies de animales no humanos, en particular CDR de conejo. Dicho motivo no tiene impacto negativo en la estabilidad de un inmunoaglutinante. Los CDR se presentan en una conformación similar a su orientación espacial nativa en el inmunoaglutinante de conejo; por lo tanto, las posiciones no estructuralmente relevantes necesitan ser injertadas en la estructura del aceptor. Consecuentemente, la estructura de aceptores de inmunoaglutinante humano o humanizado comprende por lo menos tres aminoácidos, preferiblemente cuatro, cinco, seis y más preferiblemente siete aminoácidos del grupo que consiste de Treonina (T) en la posición 24, Valina (V) en la posición 25, Alanina (A) o Glicina (G) en la posición 56, Lisina (K) en la posición 82, Treonina (T) en la posición 84, Valina (V) en la posición 89 y Arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) .
Las estructuras de aceptor de inmunoaglutinante como se describe en la presente pueden comprender sustitución que aumenta la solubilidad en la estructura de cadena pesada, preferiblemente en las posiciones 12, 103 y 144 (numeración AHo) . Preferiblemente un aminoácido hidrofóbico se sustituye por un aminoácido más hidrofilico. Los aminoácidos hidrofilicos por ejemplo son, Arginina (R) , Asparagina (N) , Ácido aspártico (D) , Glutamina (Q) , Glicina G) , Histidina (H) , Lisina (K) , Serina (S) y Treonina (T) .Más preferiblemente, la estructura de cadena pesada comprende (a) Serina (S) en la posición 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición 103 y/o (c) Seriba (S) o Treonina (T) en la posición 144.
Además, los aminoácidos mejoradores de estabilidad pueden estar presentes en una o más posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la estructura de cadena ligera variable (numeración AHo) . Más preferiblemente, la estructura de cadena ligera variable comprende ácido glutámico (E) en la posición 1, valina (V) en la posición 3, leucina (L) en la posición 4, Serina (S) en la posición 10; Arginina (R) en la posición 47, Serina (S) en la psoicón 57, fenilalanina (F) en la psoción 91 y/o Valina (v) en la posición 103.
Dado que la glutamina (Q) es propensa a desaminación, en otra modalidad preferida, VH comprende en la posición 141 una glicina (G) . Esta sustitución puede mejorar el almacenamiento a largo plazo de la proteina.
Por ejemplo, las estructuras de aceptor descritas en la presente se pueden usar para generar un anticuerpo humano o humanizado que retiene las propiedades de unión del anticuerpo no humano del cual se derivan los CDR no humanos. Consecuentemente, en una modalidad preferida la invención abarca una estructura de aceptor inmunoaglutinante como se describe en la presente, comprendiendo además CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un inmunoaglutinante donador, preferiblemente de un inmunoaglutinante de mamíferos, más preferiblemente de un inmunoaglutinante de lagomorfo y más preferiblemente de un conejo. Por lo tanto, en una modalidad, la invención provee un inmunoaglutinante específico a un antígeno deseado que comprende (i) CDR de cadena ligera variable de un lagomorfo; y (ii) una estructura de cadena pesada variable humana que tiene identidad de por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 55%, 605, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 85% y más preferiblemente 100% a SEC ID No. 4.
En una modalidad preferida, existe la condición de que por lo menos un aminoácido del grupo que consiste de treonina T) en la posición 24, valina (V) en la posición 25, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, treonina (T) en la posición 84, lisina (K) en la posición 82, valina (V en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) está presente en la secuencia de estructura de cadena pesada variable humana.
Preferiblemente, el lagomorfo es un conejo. Más preferiblemente, el inmunoaglutinante comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y cDR3 de cadena ligera, del inmunoalgutinante de donador.
Como se sabe en la materia, las cadenas de VH de conejo tienen cisteinas de pares extra relativos a contrapartes de murinos y humanas. Además, el puente de disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, también es un puente de cys21-cys79 asi como un puente interCDR S-S formado entre el último residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Además, los pares de residuos de cisteina de CDR-L3 se encuentran con frecuencia. Además, muchos CDR de anticuerpos de conejo no pertenecen a cualquier estructura canónica previamente conocida. En particular CDR-L3 con frecuencia es bastante mayor a CDR-L3 de una contraparte humana o de murinos.
Como se estableció antes, el injerto de CDR no humanos en las estructuras descritas en la presente da una molécula en donde los CDR se exhiben en una conformación apropiada. Si se requiere, la afinidad del inmunoaglutinante puede mejorarse por el injerto de antigeno que interactúa con los residuos de estructura del inmunoaglutinante donador no humano. Estas posiciones pueden ser por ejemplo, identificadas por (i) identificación de la secuencia progenitora de la linea germinal respectiva o, alternativamente, usando las secuencia consensúales en el caso de secuencias de estructura altamente homologa; (ii) generar una alineación de secuencia de secuencias de dominio variable donadoras con la secuencia progenitora de la línea germinal o secuencia consensual del paso (i) ; y (iii) identificar residuos diferentes.
Los residuos diferentes en la superficie de la molécula en donde en muchos casos se mutan durante los procesos de generación de afinidad in vivo, presumiblemente para generar afinidad al antígeno.
En otro aspecto, la presente invención provee un inmunoaglutinante que comprende la estructura de aceptor inmunoglutinante descrita en la presente. Dicho inmunoaglutinante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo scFv, una inmunoaglobulina de longitud completa, un fragmento de FAb, un Dab o un Nanocuerpo.
En una modalidad preferida, el inmunoaglutinante se unen a una o más moléculas, por ejemplo, un agente terapéutico tal como un agente citotoxico, una citoquina, una quimioquina, un factor de crecimiento u otra molécula de señalamiento, un agente de formación de imágenes, o una segunda proteina tal como un activador transcripcional y un dominio de unión de ADN .
El inmunoaglutinante como se describe en la presente puede ser por ejemplo usada en aplicaciones de diagnóstico, aplicación terapéutica, validación blanco o terapia de genes.
La invención provee además un ácido nucléico aislado que codifica la estructura de aceptor de inmunoaglutinante descrita en la presente o el inmunoaglutinante como se describe en la presente.
En otra modalidad, se provee un vector que comprende el ácido nucléico descrito en la presente.
El ácido nucléico o el vector como se describe en la presente puede usarse, por ejemplo, en terapia de genes.
La invención además abarca una célula huésped que comprende el vector y/o el ácido nucléico descrito en la presente .
Además, se provee una composición que comprende la estructura de acepto de inmunoaglutinante como se describe en la presente, el inmunoaglutinante, como se describe en la presente, el ácido nucléico asilado como se describe en la presente o el vector como se describe en la presente.
Las secuencias descritas en la presente son las siguientes (residuos X son sitios de inserción de CDR) : SEC ID NO: 1: estructura de cadena pesada variable de FW1.4 (a43) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n_i_50 WVRQAPGKGLEWVS (X) n=1-5o RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (X) n=1-50 GQGTLVTVSS SEC ID NO. 2: estructura de cadena ligera variable de FW1.4 (KI27) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=i-50 WYQQKPGKAPKLLI Y (X) n-i-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-so FGQGTKLTVLG SEC ID NO. 3: estructura de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC ( (X)n-i-50 Q PGKAPKLLIY (X) n=i-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=1.50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n-i-5o WVRQAPGKGLEWVS (X)n-i-50 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAK(X)n=i-5o WGQGTLVTVSS SEC ID NO. 4: estructura de cadena pesada variable de FW1.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X)n=i-5o RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTA VYYCAR (X n_i_50 WGQGTLV TVSS SEC ID NO. 5: estructura de rFW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X)n=i-50 WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=i- 50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X) n_i_50 WVRQAPG GLEWVG (X) n-i-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR (X) n=i-5o WGQGTLVTVSS SEC ID NO. 6: estructura de cadena pesada variable de rFW1.4(V2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n=i-50 WVRQAPGKGLE VG (X) n=i-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTA VYYCAR(X)n=i-50 WGQGTLVTVSS SEC ID NO. 7: estructura de rFW1.4(V2) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X) n=i-50 YQQKPG APKLLIY (X) n=1. 50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n=i-50 FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n~i-so WVRQAPGKGLEWVG (X) n-i-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLREDTAVYYCAR (X) n=i-50 WGQGTLVTVSS SEC ID NO. 8: entrelazador GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEC ID NO. 9: estructura de cadena ligera variable sustituida de FW1.4 EIVMTQSPSTLSASVGDRVI ITCPOn=i-5o WYQQKPGKAPKLLIY (X) n=i-5o GVPSRFSGSGSGTEFTL ISSLQPDDFATYYC (X) n=i-50 FGQGTKLTVLG En otro aspecto, la invención provee métodos para la humanización de anticuerpos no humanos por injerto de CDR de anticuerpos donadores no humanos en estructuras de anticuerpos estables y solubles. En una modalidad particularmente preferida, el tallo de CDR de anticuerpos de conejo y las estructuras son las descritas antes.
Un método general para injertar CDR en estructuras de aceptores humanos se ha descrito por Winter en la Patente de E.U.A. No. 5,225,539 y por Queen y otros en WO 9007861 Al, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La estrategia general para injertar CDR de anticuerpos monoclonales de conejo en estructuras seleccionadas se refiere a la de Inter y otros y Queen y otros, pero diverge en ciertos aspectos clave. En particular, los métodos de la invención divergen de la metodología de Winter y Queen normal conocida en la materia en quelas estructuras de anticuerpos humanos como se describen en la presente son particularmente adecuados como aceptores universales para anticuerpos donadores humanos o no humanos. Por lo tanto, a diferencia del método general de Winter y Queen, la secuencia de estructura usada para los métodos de humanización de la invención no necesariamente es la secuencia de estructura que exhibe la secuencia mayo similarmente a la secuencia del anticuerpo o humano (v.gr., conejo) de la cal se derivan los CDR donadores. Además, el injerto de residuo de estructura de la secuencia donadora para soportar la conformación de CDR no se requiere. En la mayoría, los aminoácidos de unión de antigeno localizados en la estructura y otras mutaciones que ocurrieron durante la hipermutación somática se pueden introducir .
Los detalles particulares de los métodos de injerto para generar anticuerpos derivados de conejos humanizados con alta solubilidad y estabilidad se describen más adelante.
Consecuentemente, la invención provee un método para humanizar un inmunoaglutinante de donador de CDR de conejo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera. El método comprende los pasos de: (i) injertar en la cadena pesada por lo menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres CDR del grupo que consiste de secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en una estructura de aceptor de cadena ligera humana que tiene por lo menos identidad de 50%, preferiblemente de por lo menos 55%,. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95% a SEC ID NO. 1; y/o (ii) injertar en la cadena pesada por lo menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres CDR del grupo que consiste de secuencias de CDR1, cDR2, CDR3 en una estructura de aceptor de cadena ligera humana, la estructura de cadena ligera humana que tiene por lo menos identidad de 50%, preferiblemente de por lo menos 55%, . 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95% a SEC ID NO. 2.
En una modalidad preferida, la estructura aceptora de cadena variable comprende (i) una estructura de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoácidos de estucara seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 6 y (ii) una estructura de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoácidos de estructura de SEG ID NO: 2 o SEC ID NO: 9.
En una modalidad bastante más preferida, el método comprende el paso de (i) injertar las secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada en la cadena pesada y (ii) injertar las secuencias de CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera en la cadena ligera de un inmunoaglutinante que tiene identidad de por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95% con la SEC ID NO: 3, SEC ID NO. 5 o SEC ID NO. 7. Más preferiblemente, el inmunoaglutinante es o comprende SEC ID NO. 3, SEC ID NO. 5 o SEC ID NO. 7.
En otra modalidad, con el fin de mejorar la unión a antigeno, el método puede comprender además el paso de residuos de estructura de aceptor sustituyente por residuos del donador están implicados en la unión de antigeno.
En modalidades ilustrativas de los métodos de la invención, la secuencia de aminoácidos del antecuerpo de donador de CDR se identifica primero y las secuencias alineadas usando herramientas de alineación de secuencia convencional (v.gr., matrices de algoritmo de Needleman-Wunsch y Blossum) . La introducción de espacios y nomenclatura de posiciones de residuos puede realizarse usando un sistema de numeración de antecuerpo convencional. Por ejemplo, el sistema de numeración de AHo para dominios de variables de inmunoglobulina pueden usarse. El esquema de numeración de Kabat también puede aplicarse dado que es el estándar más ampliamente adoptado para la numeración de residuos en un anticuerpo. La numeración de Kabat por ejemplo puede asignarse usando el programa SUBIM. Este programa analiza las regiones variables de una secuencia de anticuerpos y números de la secuencia de acuerdo con el sistema establecido por Kabat y colaboradores (Deret y otros 1995) . La definición de la estructura y regiones de CDR generalmente se realizan siguiendo la definición de Kabat que se basa en la variabilidad de secuencia y es la más comúnmente usada. Sin embargo, para CDR-H1, la designación preferiblemente es la combinación de las definiciones de Kabat, los datos de contacto medios generados por el análisis de contactos entre el anticuerpo y antigeno de un subgrupo de estructuras complejas 3D (MacCallum y otros, 1996) y Chotia que se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales (ver también Figura 1). Las tablas de conversión para dos diferentes sistema de numeración usados para identificar posiciones de residuos de aminoácidos en regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos se proveen de A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. El sistema de numeración de Kabt se describe además en Kabat y otros (Kabt, E. A. , y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, IH publication No. 91-3242) . El sistema de numeración de AHo se describe además de Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol . 309:657-670).
Los dominios variables de los anticuerpos monoclonales de conejo pueden clasificarse por ejemplo en los subgrupos humanos correspondientes usando v.gr., una implementación de EXCEL de algoritmos de análisis de secuencia y métodos de clasificación basados en el análisis del repertorio de anticuerpos humanos (Knappik y otros, 2000, J Mol Biol Feb 11; 296 (l):57-86).
Las conformaciones de CDR pueden asignarse a las regiones de unión de antigeno de donador, las posiciones de residuos subsiguientes requeridas para tener diferente estructuras canónicas también pueden identificarse. Las estructuras canónicas de CDR para cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos de anticuerpos de conejos (Ll, L2, L3, Hl y H2) se determinan usando definición de Chothia (1989) .
En una modalidad preferida, los CDR se generan, identifican y aislan de acuerdo con el siguiente método: células B, preferiblemente células B de conejo, se incuban con (i) antigenos blanco (preferiblemente purificados) o (ii) con células que expresan el antigeno blanco en su superficie.
En caso (ii) las células que expresan el antigeno blanco pueden, v.gr., ser célula de mamíferos, preferiblemente células CHO o HEK293, células de levadura, preferiblemente esferoblastos de levadura, o células bacterianas que naturalmente expresan el blanco de elección o se transforman para expresar la proteína blanco en su superficie. Al expresarse, el antigeno blanco puede expresarse en la superficie célula ya sea integrada o unida a la membrana celular, las células pueden cultivarse como capas aisladas en cultivo celular o se pueden aislar de su ambiente natural, v.gr., un tejido, un órgano o un organismo.
Al proveer el antígeno blanco expresado en la superficie de las células, es decir, caso (ii) , se prefiere especialmente para proteínas de transmembrana, aún más preferiblemente para proteínas de expansión de múltiples membranas, tales como GPCR (receptores acoplados a proteína G) o canales de iones o cualquier otra proteína de la cual la conformación nativa es difícil de mantener por expresión y purificación recombinante . La inmunización tradicional con la proteína recombinante en estos casos es impredecible o imposible debido a la pérdida de conformación nativa es difícil de mantener por expresión recombinante y purificación. La inmunización tradicional con la proteína recombinante en estos casos es inadvertible o imposible debió a la pérdida de conformación nativa de proteínas/complejos de membrana integral durante el proceso de purificación o debido cantidades insuficientes de proteína pura. En una modalidad preferida de la invención, un mamífero, más preferiblemente un conejo, se inmuniza con ADN en lugar de proteína recombinante v.gr., por un protocolo de vacuna de ADN como se describe en WO/200 /087216. La vacuna de ADN induce una respuesta inmune rápida contra un antígeno nativo. Dado que no es necesaria la proteína recombinante, esa tecnología por un lado es muy costosa, por otro lado y de manera más importante, este método permite la expresión nativa de complejos de membrana integral y/o proteínas de membrana de expansión de membrana múltiple. Las células B pueden aislarse de dicho mamífero inmunizado, preferiblemente del conejo, o alternativa ser células B nativas.
En un paso subsiguiente de las células B del método, preferiblemente células B de memoria, se aislan de órganos linfáticos del animal inmunizado (tal como bazo o nodos linfáticos), preferiblemente conejos inmunizados. Las células B se incuban en una mezcla con células que expresan el antígeno en su superficie o con antígeno soluble marcad por fluorescencia. Las células B que expresan anticuerpos específicos blanco en su superficie y consecuentemente se unen al antígeno blanco o al antígeno blanco expresado en la superficie celular se aislan. En una modalidad más preferida, las 'células B y/o las células blanco se tiñen para permitir el aislamiento vía citometría de flujo basadas en clasificación de complejos de células B/células blanco o células B/antígeno. La citometría de flujo normalmente mide la fluorescencia emitida por células solas cuando cruzan un haz de láser. Sin embargo, algunos investigadores han usado citometros para investigar interacciones de célula-célula, por ejemplo, adhesión mediada por cadherinas (Panorchan y otros, 2006, J. Cell Science, 119, 66-74; Leong et Hibma, 2005, J. Immunol. Methods, 302, 116-124) o integrinas (Gawaz y otros, 1991, J. Clin, Invest. 88, 1128-1134). Por lo tanto, en el caso (ii), las células que expresan el blanco de elección se tiñen con un colorante fluorescente intracelular (por ejemplo calceina) . Las células B se tiñen con anticuerpos fluorescentes que se unen a marcadores específicos de superficie celular. Por lo tanto, los "eventos" bicolores pueden seleccionarse, consistiendo de dos células B que se adhieren entre ellos a través de interacciones de receptor-blanco de células B (véase Figura 2) .
Como IgG generalmente tienen una afinidad superior como IgMs, preferiblemente, se seleccionan las células B positivas que expresan IgG pero no IgM en su superficie (que es característica para células B de memoria) . Un agonista que señala a través de un GPCR puede agregarse a la mezcla para inducir eflujo de Ca2+ mediado por GPCR de retículo endoplásmico . En caso de un anticuerpo presentado en una célula B podría bloquear funcionalmente el señalamiento de agonistas, el flujo de Ca2+ podría consecuentemente bloquearse por esta interacción de célula-célula. El eflujo de Ca2+ puede medirse cuantitativamente por citometría de flujo. Por lo tanto, únicamente los conglomerados de célula B/célula banco que muestran el incremento o disminución en flujo de Ca2+ pueden clasificarse.
El paso de selección es segundo por el cultivo de célula B bajo condiciones adecuadas de manera que los anticuerpos se secretan en el medio de cultivo. Los anticuerpos producidos son anticuerpos monoclonales . El cultivo puede implicar el uso de una linea de células auxiliares, tal como línea celular auxiliar de timoma (v.gr., EL4-B5, véase Zubler y otros, 1985, J. Immunol., 134(6); 3662-3668) . Preferiblemente, un paso de validación se lleva a cabo probando los anticuerpos generados para unión específica al blanco, v.gr., para excluir anticuerpos que se dirigen contra una proteína que se expresa en la superficie célula diferente a la proteína blanco. Por ejemplo, CELISA, es decir, un análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) modificado) , en donde el paso de revestimiento se lela a cabo con células completas, es adecuado para dicho fin. Dicho método permite la evaluación de selectividad y la capacidad de anticuerpos para competir con el ligando.
Los anticuerpos generados en el paso mencionado antes se analizan luego para identificar los CDR de los anticuerpos. Esto puede implica pasos tales como purificación de anticuerpos, produciendo su secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácidos nucléicos.
Finalmente, los CDR pueden injertarse también en estructuras aceptoras, v.gr., por síntesis de genes con el método de extensión oligo, preferiblemente en las estructuras aceptoras descritas antes. En una modalidad, el proceso reconocido en la materia de injerto de CDR pueden usarse para transferir CDR donadores en estructuras aceptoras. En la mayoría de los casos, los tres CDR de la cadena pesada se trasplantan del antecuerpo donador a una sola estructura aceptora y los tres CDR de la cadena ligera se trasplantan a una estructura aceptora diferente. Se espera que no siembre sea necesario trasplantar todos los CDR, como algunos CDR no pueden estar implicados en la unión a antígeno, y los CDR con diferentes secuencias (y la misma longitud) puede tener el mismo doblez (y por lo tanto el contacto del antígeno al contacto de la cadena principal puede retenerse a pesar de diferentes secuencias) . Además, los dominios solos (Ward y otros, 1989, Nature 341, págs.. 544-546) o aún CDR solos (R.-Taub y otros, 1990, J. Biol Chem 264, págs.. 259-265) pueden tener actividades de unión a antígeno solas. Sin embargo, siempre que todo o algunos de los CDR son trasplantados, la invención de injerto de CDR es trasplantar los mismos y cuando mucho el mismo sitio de unión de antígeno, de anticuerpos de animales a humanos (véase, v.gr., Patente de EUA 5,225,539 (Winter) ) .
En otra modalidad, los CDR del antecuerpo donador puede alterarse antes de o después de su incorporación en la estructura aceptor.
Alternativamente, la caracterización de los anticuerpos puede llevarse a cabo únicamente en su formato inmunoaglut inante final. Para este enfoque, las secuencias de CDR de anticuerpos expresados en células B clasificadas se recuperan por RT-PCR de las células B clasificadas cultivadas de las células B clasificadas solas directamente. Para dicho fin, la multiplicación de células B y/o el paso de validación descrito antes y/o el paso de análisis como se describió antes puede no ser necesario. La combinación de dos combinaciones de oligonucleótidos de traslapamiento parcial en el cual una combinación de oligonucleótidos se codifica para los CDR y una segunda combinación codifica las regiones de estructura de una plataforma de inmunoaglutinante adecuada que podría permitir generar un inmunoalgut inante humanizado en un procedimiento de PCR de un paso. Las secuenciación, clonación y producción de alto paso podría permitir llevar a cabo la selección de clonación con base en el desempeño de los inmuoaglutinantes humanizados purificados, en lugar de caracterizar IgG secretados en el sobrenadante de cultivo celular. En una modalidad preferida de los mismos, el inmunoaglutinante es scFv.
Sin embargo, el injerto de CDR puede dar como resultado afinidad dañada del inmunoaglutinante generado al antigeno debido a residuos de estructura que están en contacto con el antigeno. Dichas interacciones pueden ser un resultado de hipermutación somática. Por lo tanto, aún puede requerirse injertar dichos aminoácidos de la estructura donadora en la estructura del anticuerpo humanizado. Los residuos de aminoácidos de inmunoaglutinante no humano implicado en unión de antigenos puede identificarse por examen de secuencias y estructuras de región variable de anticuerpos monoclonales de conejo. Cada residuo en la estructura donadora de CDR que difiere de la linea germinal puede considerarse relevante. Si la linea germinal más cercana no puede establecerse, la secuencia puede compararse contra el consenso del subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. Los residuo de estructura raros se consideran como el resultado posible de hipermutución somática y por lo tanto juegan un papel en la unión .
Los anticuerpos de la invención además pueden optimizarse para mostrar propiedades funcionales mejoradas, v.gr., solubilidad y/o estabilidad mejorada. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se optimizan de acuerdo con la metodología de "consenso funcional" descrita en la Solicitud de PCT Serie No. PCT/EP2008/001958, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 12 de marzo de 1008, que se incorpora aquí por referencia.
Por ejemplo, los inmunoaglutinantes de la invención se pueden comparar con una base de datos de scFvs seleccionados por funcionalidad se usan para identificar posiciones de residuos de aminoácidos que son más o menos tolerantes de variabilidad que las posiciones correspondientes en inmunoaglutinante, indicando sí que dichas posiciones de residuos identificadas pueden ser adecuadas para tratar con el fin de mejorar la f ncionalidad tal como estabilidad y/o solubilidad.
Las posiciones de residuos de estructura ilustrativas para sustitución y sustituciones de estructura ilustrativa se describen en la Solicitud de PCT No. PCT/CH2008/000285, titulada "Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties", presentada el 25 de junio de 2008, y Solicitud de PCT No. PCT/CH2008/000284, titulada "Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies", presentada el 25 de junio de 2008. Por ejemplo, una o más de las sustituciones pueden introducirse en una posición de aminoácidos (numeración de AHo se referencia para cada una de las posiciones de aminoácidos listadas más adelante) en la región variable de cadena pesada de un inmunoaglutinante de la invención: (a) Q o E en la posición de aminoácidos 1; (b) Q o E en la posición de aminoácidos 6; (c) T, S o A en la posición de aminoácido 7, más preferiblemente T o A, aún más preferiblemente T; (d) A, T, P, V o D, más preferiblemente T, P, V o D, en la posición de aminoácido 10, (e) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 12, (f) V, R, Q, M o K, más preferiblemente V, R, Q o M en la posición de aminoácido 13; (g) R, M, E, Q o K, más preferiblemente R, M, E o Q, aún más preferiblemente R o E, en la posición de aminoácido 14; (h) L o V, más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 19; (i) R, T, K o N, más preferiblemente R, T o N, aún más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 20; (j) I, F, L o V, más preferiblemente I, F o L, aún más preferiblemente I o L, en la posición de aminoácido 21; (k) R o K, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 45; (1) ?, ?, V, A o R, más preferiblemente T, P, V o R, aún más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47; (m) K, Q, H o E, más preferiblemente K, H o E, aún más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 50; (n) o l, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 55; (o) K o R, más preferiblemente K, en la posición de aminoácido 77; (p) A, V, L o I, más preferiblemente A, L o I, aún más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 78; (q) E, R, T o A, más preferiblemente E, T o A, aún más preferiblemente E, en la posición de aminoácido 82; (r) T, S, I o L, más preferiblemente T, S o L, aún más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 86; (s) D, S, N o G, más preferiblemente D, N o G, aún más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 87; (t) A, V, L o F, más preferiblemente A, V o F, aún más preferiblemente V, en la posición de aminoácido 89; (u) F, S, H, D o Y, más preferiblemente F, S, H o D, en la posición de aminoácido 90; (v) D, Q o E, más preferiblemente D o Q, aún más preferiblemente D, en la posición de aminoácido 92; (w) G, N, T o S, más preferiblemente G, N o T, aún más preferiblemente G, en la posición de aminoácido 95; (x) , A, P, F o S, más preferiblemente , A, P o F, aún más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 98; (y) R, Q, V, I, M, F, o L, más preferiblemente R, Q, I, M, F o L, aún más preferiblemente Y, aún más preferiblemente L, en la posición de aminoácido 103; and (z) N, S o A, más preferiblemente N o S, aún más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 107.
Adicional o alternativamente, una o más de las siguientes sustituciones se pueden introducir en la región variable de cadena ligera de un inmunoaglutinante de la invención: (aa) Q, D, L, E, S, o I, más preferiblemente L, E, S o l, aún más preferiblemente L o E, en la posición de aminoácido 1; (bb) S, A, Y, I, P o T, más preferiblemente A, Y, I, P o T, aún más preferiblemente P o T en la posición de aminoácido 2; (ce) Q, V, T o I, más preferiblemente V, T o I, aún más preferiblemente V o T, en la posición de aminoácido 3; (dd) V, L, l o M, más preferiblemente V o L, en la posición de aminoácido 4; (ee) S, E o P, más preferiblemente S o E, aún más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 7; (ff) T o I, más preferiblemente I, en la posición de aminoácido 10; (gg) A o V, más preferiblemente A, en la posición de aminoácido 1 1; (hh) S o Y, más preferiblemente Y, en la posición de aminoácido 12; (ii) T, S o A, más preferiblemente T o S, aún más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 14; (jj) S o R, más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 18; (kk) T o R, más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 20; (11) R o Q, más preferiblemente Q, en la posición de aminoácido 24; (mm) H o Q, más preferiblemente H, en la posición de aminoácido 46; (nn) K, R o l, más preferiblemente R o l, aún más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 47; (oo) R, Q, K, E, T, o M, más preferiblemente Q, K, E, T o M, en la posición de aminoácido 50; (pp) K, T, S, N, Q o P, más preferiblemente T, S, N, Q o P, en la posición de aminoácido 53; (qq) I o M, más preferiblemente M, en la posición de aminoácido 56; (rr) H, S, F o Y, más preferiblemente H, S o F, en la posición de aminoácido 57; (ss) I, V o T, más preferiblemente V o T, R, aún más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 74; (tt) R, Q o K, más preferiblemente R o Q, aún más preferiblemente R, en la posición de aminoácido 82; (uu) L o F, más preferiblemente F, en la posición de aminoácido 91; (vv) G, D, T o A, más preferiblemente G, D o T, aún más preferiblemente T, en la posición de aminoácido 92; (xx) S o N, más preferiblemente N, en la posición de aminoácido 94; (yy) F, Y o S, más preferiblemente Y o S, aún más preferiblemente S, en la posición de aminoácido 101; y (zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, más preferiblemente H, E, L, A, T, V, S, G o I, aún más preferiblemente A o V, en la posición de aminoácido 103.
En otras modalidades, los inmunoaglutinantes de la invención comprenden una o más de las mutaciones de mejoramiento de estabilidad descritas en la Solicitud Provisional de E.U.A. Serie No. 61/075,692, titulada "Solubility Optimization of Immunobinders" , presentada el 25 de junio de 2008. En ciertas modalidades preferidas, el inmunoaglutinante comprende una mutación de mejoramiento de solubilidad en una posición de aminoácidos seleccionada del grupo de posiciones de aminoácidos de cadena pesada que consiste de 12, 103 y 144 (Convención de Numeración de AHo) . En una modalidad preferida, el inmunoaglutinante comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de: (a) Serina (S) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácidos de cadena pesada. En otra modalidad, el inmunoaglutinante comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 144. En otra modalidad, el inmunoaglutinante comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácidos de cadena pesada 144.
En ciertas modalidades preferidas, el inmunoaglutinante comprende mutaciones de incremento de estabilidad en un residuo de estructura de la estructura de aceptor de cadena ligera en por lo menos una de las posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la región variable de cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de AHo. En una modalidad preferida, la estructura del aceptor de cadena ligera comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste de (a) ácido glutámico (e) en la posición 1, (b) valina (V) en la posición 3, (c) leucina 8L) en la posición 4; (d) Serina (S) en la posición 10; (e) Arginina (R) en la posición 47; (e) Serina (S) en la posición 57; (f) fenilalanina (F) en la posición 91; y (g) Valina (V) en la posición 103.
Uno puede usar cualquiera de una variedad de métodos disponibles para producir un anticuerpo humanizado que comprende una mutación como se describió antes.
Consecuentemente, la presente invención provee un inmunoaglutinante humanizado de acuerdo con el método descrito en la presente.
En ciertas modalidades preferidas, el antigeno blanco de dicho inmunoaglutinante es VEGF o TNFa.
Los polipéptidos descritos en la presente invención o generados por un método de la presente invención, por ejemplo, se pueden sintetizar usando técnicas conocidas en la materia. Alternativamente, las moléculas de ácidos nucléicos que codifican las regiones variable deseadas se pueden sintetizar y los polipéptidos producidos por métodos recombinantes .
Por ejemplo, una vez que la secuencia de una región variable humanizada se ha deducido porque, la región de variable o un polipéptido que la comprende puede estar hecha de técnicas bien conocidas en la materia de biología molecular. Más específicamente, las técnicas de ADN recombinantes se pueden usar para producir un rango amplio de polipéptidos transformando una célula huésped con una secuencia de ácidos nucléicos (v.gr., una secuencia de ADN que codifica la región de variable deseada (v.gr., una cadena pesada o ligera modificada; los dominios de variable de los mismos, o fragmentos de unión a antigeno de los mismos)) .
En una modalidad, se puede preparar un vector de expresión incluyendo un promotor que se liga operablemente a una secuencia de ADN que codifica por lo menos VH o VL, si es necesario, o se desea, se puede preparar un segundo vector de expresión que incluye un promotor que se liga operablemente a una secuencia de ADN que codifica el dominio de variable de complementariedad (es decir, en donde el vector de expresión madre codifica VH, el segundo vector de expresión codifica VL y viceversa) . Una linea celular (v.gr., una linea celular de mamíferos inmortalizada) puede transformarse con uno ambos de los vectores de expresión o anticuerpo quimérico (véase, por ejemplo, Solicitud de Patentes Internacional No. PCT/GB85/00392 a Neuberger y otros) : En una modalidad, las regiones variables que comprenden CDR donadores y secuencias de aminoácidos de FR aceptores pueden estar hechas y luego se introdujeron cambios en las moléculas de ácidos nucléicos para efectuar la sustitución de aminoácidos de CDR.
Los métodos reconocidos en la técnica ilustrativos para hacer que una molécula de ácidos nucléicos que codifican una variante de secuencia de aminoácidos de un polipéptido incluyen, pero no se limitan a, preparación por mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos ) , mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de un ADN preparado antes que codifica el polipéptido.
La mutagénesis dirigida al sitio es un método preferido para preparar variantes de sustitución. Esta técnica es bien conocida en la materia (véase, por ejemplo, Cárter y otros, Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) y Kunkel y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 892:488 (1987)). En resumen, para llevar a cabo mutagénesis dirigida a sitio de ADN, el ADN madre se altera hibridizando primero un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a un ADN madre de una sola hebra. Después de la hibridización, una polimerasa de ADN se usa para sintetizar una segunda hebra, usando el oligonucleótido hibridizado como un iniciador y usando la única hebra del ADN madre como un modelo. Por lo tanto, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN de doble hebra resultante.
La mutagénesis de PCR también es adecuada para formar variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos . Véase Higuchi, en PCR Protocols, págs.. 177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette y otros, Nucí. Acids.
Res. 17:723-733 (1989). En resumen, cuando pequeñas cantidades de ADN de modelo se usan como material de partida en un PCR, los iniciadores que difieren ligeramente en secuencia de la región correspondiente en un ADN de modelo se pueden usar para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN especifico que difiere de la secuencia de modelo únicamente en las posiciones en donde los iniciadores difieren del modelo.
Otro método para preparar variantes, mutagénesis de cásete, se basan en la técnica descrita por Wells y otros, Gene 34:315-323 (1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN que será mutado. Los codones en el ADN madre que será mutado son identificados. Deberá haber un sitio de endonucleasa de restricción única en cada lado de los sitios de mutación identificados. Si no existen sitios de restricción, pueden generarse usando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descritos antes para introducirlos en ubicaciones apropiadas en el ADN que codifica el polipéptido. El ADN de plásmido se corta en estos sitios para linealizarlos . Un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contienen las mutaciones deseadas se sintetizan usando procedimientos normales, en donde las dos hebras del oligonucleótido se sintetizan por separado y se hibridizan juntos usando técnicas normales. Este oligonucleótido de doble hebra se denomina como el cásete. Este cásete se diseña para tener extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de manera que puede ligarse directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora a la secuencia de ADN imitada. Una región variable generada por los métodos de la invención puede remodelarse y además alterarse para incrementar además la unión de antigenos. Por lo tanto, los pasos descritos antes pueden precederse o seguirse por pasos adicionales, incluyendo, v.gr., maduración de afinidad. Además, los datos de unión empíricos pueden usarse para optimización adicional.
Se entenderá por alguien experto en la materia que los polipéptidos de la invención además pueden modificarse de manera que varían en secuencia de aminoácidos, pero no en actividad deseada. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos adicionales que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden estar hechas para la proteína. Por ejemplo, un residuo de aminoácidos no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina se puede reemplazar con otro residuo de aminoácidos de la familia de cadena del mismo lado. En otra modalidad, una cadena de aminoácidos puede reemplazarse con una cadena estructuralmente similar que difiere con orden y/o composición de miembros de familia de cadena lateral, es decir, una sustitución conservadora, en la cual un residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tienen una cadena lateral similar, puede realizarse.
Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia, incluyendo cadenas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (v.gr., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales son polares (v.gr., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (v.gr., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .
Además de las sustituciones de aminoácidos, la presente invención contempla otras modificaciones, v.gr., a las secuencias de aminoácidos de región de Fe con el fin de generar una variante de región de Fe con función efectora alterada. Por ejemplo, puede suprimir uno o más residuos de aminoácidos de la región de Fe con el fin de reducir y mejorar la unión a un FcR. En una modalidad, uno o más de los residuos de región de Fe pueden modificarse con el fin de generar dicha variante de región de Fe. Generalmente, no más de uno a aproximadamente diez residuos de región de Fe serán suprimidas de acuerdo con esta modalidad de la invención. La región de Fe en la presente comprendiendo una o más supresiones de aminoácidos preferiblemente retendrá por lo menos aproximadamente 80% y preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de la región de Fe de partida o de una región de Fe humana de secuencia nativa.
También se pueden formar variantes de región de Fe de inserción de aminoácidos, cuyas variantes tienen función efectora alterada. Por ejemplo, se puede introducir por lo menos un residuo de aminoácidos (v.gr., uno a dos residuos de aminoácidos y generalmente no más de diez residuos) adyacentes a una o más de las posiciones de región de Fe identificas en la presente como unión de FcR de impacto. Por "adyacente" se entiende dentro de uno o más residuos de aminoácidos de un residuo de región de Fe identificada en la presente. Dichas variantes de región de Fe pueden exhibir unión de FcRn incrementada o disminuida.
Dichas variantes de región de Fe generalmente comprenden por lo menos una modificación de aminoácidos en la región de Fe. En una modalidad las modificaciones de aminoácidos pueden combinarse. Por ejemplo, la región de Fe de variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc., sustituciones en la misma, v.gr., de las posiciones de región de Fe especificas identificadas en la presente. En otra modalidad, un polipéptido puede tener unión alterada a FcRn y a otro receptor de Fe.
En una modalidad, los polipéptidos descritos en la presente invención o generada por un método de la presente invención, v.gr., regiones variables de Ig humanizadas y/o polipétidos que comprenden regiones variables de Ig humanizadas pueden producirse por métodos recombinantes . Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifican un polipéptido pueden insertarse en un vector de expresión adecuada para expresión recombinante . En donde el polipéptido es un anticuerpo, los polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada adicional, ligada opcionalmente a regiones constantes, pueden insertarse en el mismo vector de expresión diferente. Una secuencia de etiqueta de afinidad (v.gr., una etiqueta His(6)) puede unirse opcionalmente o incluirse dentro de la secuencia de polipéptidos para facilitar purificación corriente abajo. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina están ligados operablemente para controlar secuencias en los vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (v.gr., promotores naturalmente asociados o heterólogos) , secuencias de señales, elementos incrimentadores y secuencias de terminación de transcripción. preferiblemente, las secuencias de control de expresión son sistemas de promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucarióticas . Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y la colección y purificación del polipéptido.
Estos vectores de expresión normalmente son replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (v.gr., resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, v.gr., Patente de E.U.A. No. 4,704,362).
E. coli es un huésped procariotico particularmente útil para clonar los polinucleótidos (v.gr., secuencias de ADN) de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para usare incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis y otros enterobacteriaceae, tales como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas.
Otros microbios, tales como levaduras, también son útiles para expresión. Saccharomyces y Pichia son huéspedes de levadura ilustrativos, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (v.gr., promotores); un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desea. Los promotores . normales incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicoliticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isotocromo C y enzimas responsables para uso de metanol, maltosa, y galactosa.
Dentro del alcance de la presente invención, E. coli y S. cerevisiae son células huésped preferidas.
Además de los microorganismos, el cultivo de tejido de mamíferos pueden usarse también para expresar y producir los polipéptidos de la present einvención (v.gr., polinucleótidos que codifican inmunoglobulians o fragmentos de las mismas) . Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Las célula seucarióticas son realmente preferidas, debido a un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas, (v.gr., inmunoglobulinas intactas) se han desarrollado en la materia e incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células Cos, Células HeLa, 293 células, líneas de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas. Los vectores de expresó de estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de replicación, un promotor y un mejorador (Queen y otros, Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y proceso necesario de sitios de información, tal como sitios de unión de ribosomas, sitios de división de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador transcripcional . Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma de bovinos, citomegalovirus y similares. Véase Co y otros, J. Immunol. 148:11249 (1992).
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleót idos de interés (v.gr., las secuencias de codificación de cadena pesada y ligera y secuencias de control de expresión) pueden transferirse en la célula huésped por métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se usa comúnmente para células procarióticas, mientras el tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolisticas o transfección con base viral puede usarse para otros huéspedes celulares. (Véase generalmente Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a. ed. , 1989). Otros métodos usados para transformar células de mamíferos incluyen el uso de polipreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroparacion y microinyección (véase generalmente, Sambrook y otros, supra) . Para producción de animales transgénicas, los transgenes pueden microinyectarse en oocitos fertilizados, pueden incorporarse en el genoma de células madre embriónicas y los núcleos de dichas células transferidas en oocitos enucleados.
El polipéptido presente también puede incorporarse en transgenes para introducción en el genoma de un animal transéncio y expresión subsiguiente, v.gr., en la leche de un animal transgénico (véase, v.gr., Deboer y otros, 5,741,957; Rosen 5,304,489; y Meade 5,849,992. Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para cadenas ligera y/o pesada en ligadura operable con un promotor e incrementador de un gen especifico de glándula de mamíferos, tal como caseína o lactoglobulina beta.
Los polipéptidos pueden expresarse usando un solo vector o dos vectores. Por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de anticuerpos pueden clonarse en vectores de expresión separados y cotransfectarse en células.
En una modalidad, las secuencias de señales pueden usarse para facilitar la expresión de polipéptidos de la invención.
Una vez expresado, los polipéptidos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos normales de la materia, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad (v.gr., proteína A o proteína G) , cromatografía en columna, purificación de HPLC, elecroforesis de gel y similares (veas generalmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)).
Las regiones variables de Ig humanizadas o polipéptidos que las comprenden pueden expresarse por las células huéspedes o lineas celulares en cultivo. También pueden expresarse en célula sin vivo. La linea celular que se transforma (v.gr., transfectarse) para producir el anticuerpo alterado puede se runa linea celular de mamíferos inmortalizadas, tal como las de origen linfoide (v.gr., una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma) . La línea celular puede incluir también células linfoides normales, tales como células B, que se han inmortalizado por transformación con un virus (v.gr., el virus Epstein-Barr) .
Aunque normalmente la línea celular usada para producir el polipéptido es una línea celular de mamíferos, líneas celulares de otras fuentes (tales como bacterias y levadura) pueden usarse también. En particular, las cepas bacterianas derivadas de E. coli pueden usarse, especialmente, v.gr., exhibición de fagos.
Algunas líneas de células linfoides inmortalizadas, tales como líneas de células de mieloma, en su estado normal, las cadenas ligera o pesada de Ig aisladas secretas. Si dicha línea celular se transforma con un vector que expresa un anticuerpo alterado, preparado durante el proceso de la invención, no será necesario llevar a cabo los pasos restantes del proceso, provistos que la cadena secretada normalmente es complementaria al dominio de variable de la cadena de Ig codificada ro el vector preparado antes.
Si la linea celular inmortalizada no secreta o no secreta una cadena complementaria, será necesaria para introducir en las células un vector que codifica la cadena complementaria apropiada o fragmento de la misma.
En el caso en donde la linea célula inmortalizada secreta una cadena ligera o pesada complementaria, la linea celular transformada puede producirse por ejemplo transformando una célula bacteriana adecuada con el vector y luego fusionando la célula bacteriana con la linea celular inmortalizada (v.gr., por fusión de esferoplastos) . Alternativamente, el ADN puede introducirse directamente en la linea celular inmortalizada por electroporación.
En una modalidad, una región variable de Ig humanizada como se describió en la presente invención o generada por un método de la invención puede estar presente en un fragmento de unión a antigeno de cualquier anticuerpo. Los fragmentos pueden producirse recombinantemente y trabajarse, sintetizarse, o producirse digiriendo un anticuerpo con una enzima proteolitica . Por ejemplo, el fragmento puede ser un fragmento de Fab; la digestión con papaina rompe el anticuerpo en la región, antes del enlace de disulfuro de cadena interna (es decir, VH-VH) que unen las dos cadenas pesadas. Esto da como resultado la formación de dos fragmentos idénticos que contienen la cadena ligera y los dominios de VH y CH1 de la cadena pesada. Alternativamente, el fragmento puede ser un fragmento de F(ab' ) 2- Estos fragmentos pueden crearse digiriendo un anticuerpo con pepsina, que separa la cadena pesada después del enlace de disulfuro de cadena intermedia y da como resultado un fragmento que contiene ambos sitios de unión de antigenos. Aún otra alternativa es usar un anticuerpo de "una sola cadena. Los fragmentos de Fv de una sola cadena (scFv) pueden construirse en una variedad de formas. Por ejemplo, la terminación C de VH puede ligarse a la terminación N de VL. Normalmente, un entrelazador (v.gr., (GGGGS)4) se coloca entre VH y VL. Sin embargo, el orden en el cual las cadenas que pueden ligarse puede invertirse y las etiquetas que facilitan la detección y purificación (v.gr., etiquetas Myc, His, o FLAG) se pueden influir (las etiquetas tales como estas pueden anexarse a cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención; su uso no se restringe a scFv) . Consecuentemente y como se observa más adelante, los anticuerpos etiquetados están dentro del alcance de la presente invención. En modalidades alternativas, los anticuerpos descritos en la presente, o generados por los métodos descritos en la presente, pueden ser dimeros de cadena pesada o dimeros de cadena ligera. Aún además, una cadena ligera o pesada de anticuerpos, o porciones de los mismos, por ejemplo, se puede usar un anticuerpo de un solo dominio (DAb) .
En otra modalidad, una regí variable de Ig humanizadas como se describió en la presente invención o se generó por un método de la presente invención está presente en un anticuerpo de una sola dacena (ScFv) o un minicuerpo (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,837,821 o WO 94/09817A1) . Los minicuerpos son moléculas diméricas conformadas de dos cadenas de polipéptido cada una comprendiendo una molécula de ScFv (un solo polipéptido que comprende uno o más sitios de unión de antigenos, v.gr., un dominio de VL u orientación de VL-entrelazador-VH. El gozne flexible que entrelaza los dominios de VL y VH que conforman el sitio de unión de antigenos comprende preferiblemente de aproximadamente 10 a alrededor de 50 residuos de aminoácidos. Un péptido de conexión ilustrativa para este propósito es (Gly4Ser)3 (Huston y otros, (1988). PNAS, 85:5879). Otros péptidos de conexión son conocidos en la materia.
Los métodos para formar anticuerpos de una sola cadena son bien conocidos en la materia, v.gr., Ho y otros (1989), Gene, 77:51; Bird y otros (1988), Science 242:423; Pantoliano y otros (1991), Biochemistry 30:10117; Milenic y otros (1991), Cáncer Research, 51:6363; Takkinen y otros (1991), Protein Engineering 4:837. Los minicuerpos pueden formarse construyendo un componente de ScFv y conectando componente de péptido-CH3 usando métodos descritos en la materia (ver por ejemplo, patente de E.U.A. 5,837,821 o WO 94/09817A1) . Estos componentes pueden aislarse de plásmidos separados como fragmentos de restricción y luego ligados y reclonados en un vector apropiado. El ensamble apropiado puede verificarse por digestión por restricción y análisis de secuencia de ADN . En una modalidad, un minicuerpo de la invención comprende un péptido de conexión. En una modalidad, el péptido de conexión comprende un entrelazador de Gly/Ser, v . gr . , GGGSSGGGSGG .
En otra modalidad, un minicuerpo tetravalente puede construirse. Los minicuerpos tetravalentes pueden construirse de la misma manera que minicuerpos, excepto que dos moléculas de ScFv se entrelazan usando un entrelazador flexible, f.gr., que tiene una secuencia de aminoácidos (G4S)4G3AS: En otra modalidad, una región variable humanizada como se describió como se describió en la presente invención generada por un método de la presente invención puede estar presente en un diacuerpo. Los diacuerpps son similares a moléculas de scFv, pero usualmente tienen un entrelazador de residuo de aminoácido corto (menor a 10 y preferiblemente 1-5) que conecta ambos dominios variables, de manera que los dominios de VL y VH en la misma cadena de polipéptidos no pueden interactuar. En su lugar, el dominio de VL y VH de una cadena de polipéptido interactúa con el dominio de VH y VL (respectivamente) en una segunda cadena de polipéptido (WO 02/02781). En otra modalidad, una región variable humanizada de la invención puede estar presente en un fragmento inmunorreactivo o porción de un anticuerpo (v.gr., una molécula de scFv, un minicuerpo, un minicuerpo tetravalente, o un diacuerpo) ligado operablemente a una porción de unión de FcR. En una modalidad ilustrativa, la porción de unión de FcR es una región de Fe completa.
Preferiblemente, los métodos de humanización descritos en la presente dan como resultado regiones variables de Ig en los cuales la afinidad para antigeno no cambia sustancialmente comparado con el anticuerpo donador.
En una modalidad, los polipéptidos que comprenden los dominios variables de la presente invención se unen a antígenos con una afinidad de unión mayor a (o igual a) una constante de asociación Ka de aproximadamente 105 -1, 106 _1, 107 (incluyendo afinidades intermedias a estos valores) .
La afinidad, avidez, y/o especificidad pueden medirse en una variedad de formas. Generalmente, y sin importar la manera precisa en la cual la afinidad es definida o medida, los métodos de la invención mejoran la afinidad de anticuerpo cuando generan un anticuerpo que es superior en cualquier aspecto de su aplicación clínica al anticuerpo (o anticuerpos) de los cuales está hecho (por ejemplo, los métodos de la invención se consideran efectivos o exitoso cuando puede administrarse un anticuerpo modificado en una dosis inferior o meso frecuentemente o por una ruta más conveniente de administración que un anticuerpo (o anticuerpos) de los cuales está hecho) .
Más específicamente, la afinidad entre un anticuerpo y un antígeno al cual se une puede medirse por varios análisis, incluyendo, v.gr., un análisis ELISA, un análisis BiaCore o el análisis KinExA™ 3000 (v.gr., un antígeno cancerígeno; una proteína de superficie celular o proteína secretada; un antígeno de un patógeno (v.gr., un antígeno bacteriano o viral (v.gr., un antígeno HIV, un antígeno de influenza, o un antígeno de hepatitis)), o un alérgeno) por unión covalente. Las diluciones de anticuerpo que será probado se preparan y se agrega cada dilución a los pozos designados en una placa. Un anticuerpo de detección (v.gr., conjugado de IgG-HRP anti-humano de cabra) se agrega a cada pozo seguido por un sustrato cromagénico (v.gr., HRP) . La placa luego se lee en el lector de placa ELISA en 450 nM, y se calculan los valores de EC50. (Sin embargo, se entiende que los métodos descritos son generalmente aplicables; no pueden limitarse a la producción de anticuerpos que se une cualquier antígeno particular de antígenos) .
Los expertos ordinarios en la materia reconocerán que al determinar la afinidad no siempre es tan simple como se ve en una sola figura. Dichos anticuerpos tienen dos brazos, su afinidad aparente usualmente es bastante superior a la afinidad intrínseca entre la región variable y el antígeno (se piensa que se debe a la avidez) . La afinidad intrínseca puede medirse usando scFv o fragmentos de Fab.
En otro aspecto, la presente invención caracteriza moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo de conejo humanizado, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión de antígeno del mismo, pueden derivatizarse o ligarse a otra molécula funcional, v.gr., otro péptido o proteína (v.gr., otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a por lo menos dos diferentes sitios de unión o moléculas blanco. El anticuerpo de la invención puede derivatizarse o ligarse a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas blanco; dichas moléculas multiespecíficas también se pretende que sean abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa en la presente. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede ligarse funcionalmente (v.br., por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, tumor especifico o antigenos específicos para patógenos, p ptidos o imitación de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica . Consecuentemente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden por lo menos una primera molécula de unión que tiene especificidad para un primer blanco y una segunda molécula de unión que tiene especificad de uno o más epítopes blanco adicionales.
En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, v.gr., un Fab, Fab', (F(ab')2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de una sola cadena como se describe en Ladner y otros, Patente de E.U.A. No. 4, 946, 778, el contenido de la cual se incorpora expresamente por referencia.
Mientras que se prefieren los anticuerpos monoclonales, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecificas de la invención son anticuerpos murinos, quiméricos y humanizados monoclonales.
Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes usando métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecifica puede generarse por separado y luego conjugarse una a la otra. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, una variedad de agentes de acoplamiento o entrelazamiento se pueden usar para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen proteína A, carbodiimida , N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5, 5 ' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) ( DTBNB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) y 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase v.gr., Karpovsky y otros (1984) J Exp. Med. 160:1686; Liu, A y otros (1985) Proc . Nati. Acad. SCI USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y otros (1985) Science 229:81-83), y Glennie y otros (1987) J Immunol. 139: 2367-2375) . Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse vía unión de sulfhidrilo de las regiones de gozne de terminación C de dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de gozne se modifica para contener un número par de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación .
Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil en donde la molécula biespecífica es mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprende un anticuerpo de una sola cadena y una determinante de unión, o una mole 'cual biespecífica de una sola cadena que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en la Patente de E.U.A. Número 5,260,203; Patente de E.U.A. Número 5,455,030; Patente de E.U.A. Número 4,881,175; Patente de E.U.A. Número 5,132,405; Patente de E.U.A. Número 5,091,513; Patente de E.U.A. Número 5,476,786; Patente de E.U.A. Número 5,013,653; Patente de E.U.A. Número 5,258,498; y Patente de E.U.A. Número 5,482,858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus blancos específicos pueden confirmarse por ejemplo, por análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) , radioinmunoanálisis (RIA) , clasificación de una sola célula basada en citometría de flujo (v.gr., análisis de FACS) , bioanaálisis (v.gr., inhibición de crecimiento), o análisis Western Blot. Cada uno de los análisis generalmente detecta la presencia de complejos de anticuerpos de proteínas de interés particular empleado un reactivo marcado (v.gr., un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de anticuerpos pueden detectarse usando v.gr., un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpos-VEGF. Alternativamente, los complejos pueden detectarse usando cualquiera de una variedad de otros inmunoanálisis . Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radioactivamente y usarse en un radioinmunoanálisis (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on radioligand Assay Techniques, The Endrocrine Society, Marzo, 1986, que se incorpora por referencia en la presente) . El isótopo radioactivo puede detectarse por dichos medios como el uso de contador ? o un contador de centelleo o por autoradiografía .
En otro aspecto, la presente invención caracteriza un anticuerpo de conejo humanizado, o un fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (v.gr., un inmunosupresor ) o una radiotoxina. Dichos conjugados se denominan en la presente como "inmunoconj ugados" . Los inmunoconj ugados que incluyen una más citotoxinas son denominadas como "inmunotoxinas" . Una citotoxina de agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para células (v.gr, las elimina). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina , daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona , mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona , glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol y puromicina y análoso u homólogos de los msimso. Los agentes terapéuticos también inlcuyen, por ejemplo, antimetabolitos (v.gr., metotrexato, 6-mercapto purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (v.gr., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNI) , ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina rtinum (II) (DDP) cispaltina) , antraciclinas (v.gr., daunorubicina (inicialmente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (v.gr., dactinomicina (inicialmente actinomicina) , beleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) y agentes antimitóticos (v.gr., vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas , calcheamicinas, maytansinas y auristatinas y sus derivados, un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de calcheamicina está comercialmente disponible (Mylotarg™, Wyeth-Ayerst) .
Las citoxinas pueden conjugarse a anticuerpos de la invención usando tecnología de entrelazador disponible en la materia. Ejemplos de tipos de entrelazador que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y entrelazadores que contienen péptidos. Un entrelazador que puede elegirse es, por ejemplo, susceptible a la división por pH bajo dentro del compartimiento lisosomal o susceptible a división por proteasas, tales como proteasas expresadas preferiblemente en tejido tumoral tal como catepsinas (v.gr., catepsinas B, C, D) .
Para discusión adicional de tipos de citotoxinas, entrelazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. y otros (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. y otros (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, CJ. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247- 264.
Los anticuerpos de la presente invención que pueden conjugarse a un isótopo radioactivo para generar radiofármacos citotoxicos, también denominados como radioinmunoconj ugados . Ejemplos de isótopos radioactivos que pueden conjugarse a anticuerpos para usarse diagnóstica o terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio17;. El método para preparar radioinmunoconjugados se estabilizan en la materia. Ejemplos de radioinmunoconjugados se estabilizan en la materia. Ejemplos de radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals ) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) y métodos similares pueden usarse para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invención.
Los conjugados de anticuerpos de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada y la porción de fármaco no será construida como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria, una proteína tal como un factor de necrosis tumoral o interferon-?; o modificadores de respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-ß ("IL-6"), factor de estímulo de colonias de macrofagos en granulocitos ("GM-CSF"), factor de estimulo de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento .
Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, véase por ejemplo, Arnon y otros, " onoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y otros (eds.) , pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson y otros (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin y otros (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:1 19-58 (1982).
En un aspecto, la invención provee formulaciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de conejo humanizados para tratar la enfermedad. El término "formulación farmacéutica" se refiere a preparaciones que tienen tal forma que permiten que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente efectiva y que no contenga componentes adicionales que son tóxicos para los sujetos a los cuales será administrada la formulación. Los excipientes "farmacéuticamente aceptable" (vehículos, aditivos) son aquellos que razonablemente se pueden administrar a un sujeto mamífero para proveer una dosis efectiva del ingrediente activo empleado.
Una formulación "estable" es una en la cual el anticuerpo o derivado de anticuerpo en el mismo retiene esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica por almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir estabilidad de proteína están disponibles en la materia y se revisan en, por ejemplo, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30 °C) o a 40 °C durante por lo menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8 °C durante por lo menos 1 año durante por lo menos 2 años. Además, la formulación preferiblemente es estable después de la congelación (a, v.gr., -70°C) y descongelación de la formulación .
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "retiene su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización por examen visual de color y/o claridad, o como se mide por luz UV de barrido o por cromatografía de exclusión de tamaño.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "retiene su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un tiempo dado es tal que la proteína se considera que aún retiene su actividad biológica como se define más adelante. La estabilidad química puede evaluarse detectando y cuantificando las formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar modificación de tamaño (v.gr., sujeción) que puede evaluarse usando cromatografía de exclusión de tamaño, SDS-PAGE y/o ionización de desorción de láser asistido por matriz/espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS) , por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen alteración de carga (v.gr., ocurriendo como resultado de desamidación) que puede evaluarse por cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "retiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un tiempo dado está dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores del análisis) de la actividad biológica exhibida en el tiempo en el que se prepara la formulación farmacéutica como se determina en un análisis de unión de antigeno, por ejemplo. Otros análisis de "actividad biológica" para anticuerpos se elaboran en la presente más adelante.
Por "isotónica" se entiende que la formulación de interés esencialmente tiene la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad puede medirse usando una presión de vapor u osmómetro de tipo de congelación de hielo, por ejemplo.
Un "poliol" es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo e incluye azucares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular que es menor a aproximadamente 600 kD (v.gr, en el rango de aproximadamente 120 a alrededor de 400 kD) . Un "azúcar reductor" es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un "azúcar no reductor" es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Ejemplos de azucares reductores son fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y sales metálicas del mismo. En donde se desea que la formulación sea estable al congelamiento-descongelamiento, el poliol preferiblemente es uno que no se cristaliza a las temperaturas de congelación (v.gr., -20°C de manera que desestabiliza el anticuerpo en la formulación. Los azúcares no reductores tales como sacaros ay trehalosa son polioles preferidos en la presente, siendo preferida la trehalosa sobre la sucrosa, debido a la estabilidad de solución superior de trehalosa.
Como se usa en la presente, "solución reguladora" se refiere a una solución regulada que resiste cambios en pH por la acción de sus componentes de conjugados de ácido-base. La solución reguladora de esta invención tiene un pH en la escala de aproximadamente 4.5 a alrededor de 6.0; preferiblemente de aproximadamente 4.8 a alrededor de 5.5; y más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5.0. Ejemplos de soluciones reguladoras que controlan el pH en esta escala incluyen acetato (v.gr., acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio) , gluconato, histidina, citrato y otras soluciones reguladoras de ácido orgánico. En donde se desea una formulación estable al congelamiento-descongelamiento, la solución reguladora preferiblemente no es de fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad efectiva en la prevención o tratamiento de un trastorno para el tratamiento del cual el anticuerpo o derivado de anticuerpo es efectivo. Una "enfermedad/trastorno" es cualquier condición que puede beneficiar el tratamiento con anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen las condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Un "conservador" es un compuesto que puede incluirse en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la presente, facilitando así la producción de una formulación de usos múltiples, por ejemplo. Ejemplos de conservadores potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los cuales los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservadores incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquil parabenos tales como metilo o propilo parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservador más preferido en la presente es alcohol bencílico.
La presente invención también puede proveer composiciones farmacéuticas que comprenden uno más anticuerpos o compuestos de derivados de anticuerpos, junto con por lo menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, soluciones reguladoras (v.gr., solución salina regulada neutra o solución salina regulada de fosfato) , etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsufoxido, carbohidratos (v.gr., glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos) , manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutationa y/o conservadores. Como se observó antes, otros ingredientes activos pueden (pero no necesariamente) pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas provistas en la presente.
Un vehículo es una sustancia que puede asociarse con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administración a un paciente, con frecuencia con el fin de controlar estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los vehículos para usarse dentro de dichas formulaciones generalmente son biocompatibles y también pueden ser biodegradables . Los vehículos incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina de suero (.gr., humano o bovino), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano o poliamidoaminas . Los vehículos también incluyen materiales de soporte sólido tal como perlas y microparticulas que comprenden, por ejemplo, polilactato poliglicolato, poli ( lactido-co-glicólido) , poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un vehículo puede tener compuestos en una variedad de formas, incluyendo unión covalente (ya sea directamente o vía un grupo entrelazador ) interacción no covalente o mezcla.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, rectal o parental. En ciertas modalidades, las composiciones en una forma adecuada para el uso oral son preferidas. Dichas formas incluyen, por ejemplo, pildoras, tabletas, pastillas, trociscos, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersibles o gránulos, emulsión, capsulas duras o blandas, o jarabes o elíxires. Con aún otras modalidades, las composiciones provistas en la presente pueden formularse como un liofilizato. El término parenteral como se usa en la presente incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (v.gr., intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, asi como cualquier técnica de inyección o infusión similar.
Las composiciones que se pretenden para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la materia para la manufactura de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agente colorante y agentes conservadores con el fin de proveer preparaciones agradables y sabrosas. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la manufactura de tabletas. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (v.gr., carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio) , agentes de granulación y desintegrantes (v.gr., almidón de maíz o ácido alginico) , agentes de unión (v.gr., almidón, gelatina o acacia) y agentes lubricantes (v.gr., estearato de magnesio, ácido esteárico o talco) . Las tabletas pueden descubrirse o pueden revestirse por técnicas conocidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y ro lo tanto proveer una acción sostenida durante un largo periodo. Por ejemplo, un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo pueden emplearse.
Las formulaciones para uso oral pueden presentarse también como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (v.gr., carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o como cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso (v.gr., aceite de cacahuate, parafina líquida, o aceite de oliva) . Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo o derivado de anticuerpo mezclado con excipientes adecuados para la manufactura de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen agentes de suspensión (v.gr., carboximetil celulosa de sodio, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia); y agentes dispersantes o humectantes (v.gr., fosfatidos presentes en la naturaleza tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol , productos de condensación de óxido de etileno con estrés parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monoleato de polietilen sorbitan) . Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tal como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden comprender uno o más demucentos, conservadores, agentes saborizantes y/o agentes colorantes.
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal (v.gr, aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de ajonjolí, o aceite de cacahuate) o en un aceite mineral tal como parafina liquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abeja, parafina dura, o alcohol cetílico. Los agentes edulcorantes, tales como los exhibidos antes y/o agentes saborizantes se pueden agregar para dar preparaciones orales agradables. Dicha suspensiones pueden conservarse por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Los polvos dispersibles y gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por la adición de agua proveen el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes de dispersión o humectación adecuadas y agentes de suspensión se ejemplifican por los que se mencionaron antes. Los excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes, también pueden estar presentes.
Las composiciones farmacéuticas también pueden tener forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal (v.gr., aceite de oliva o aceite de arquis) , un aceite mineral (v.gr., parafina liquida) o una mezcla del mismo. Los agentes de emulsificación adecuados incluyen gomas presentes en la naturaleza (v.gr., goma acacia, o goma de tragacanto) , fosfatidos presentes en la naturaleza (v.gr., soya, lecitina y estrés o esteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol) , anhídridos (v.gr., monoleato de sorbitán) y productos de condensación de éteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (v.gr., monoleato de polioxietilen sorbitan) . Una emulsión también puede comprender uno o más agentes edulcorantes y/o saborizantes.
La composición farmacéutica puede prepararse como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril en la cual el modulador, dependiendo del vehículo y concentración usada, ya sea suspendida o disuelta en el vehículo. Tal como una composición se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando agentes humectantes dispersantes adecuados y/o agentes de suspensión tales como aquellos mencionados antes. Entre los vehículos aceptables y solventes que pueden emplearse son agua, 1, 3-butanodiol, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónico. Además, se pueden empelar aceites estériles, fijos, como un solvente o medio de suspensión. Para este fin cualquier aceite fijo blando puede emplearse, usando mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico pueden usarse en la preparación de composiciones inyectables y adyuvantes tales como anestésicos locales, conservadores y/o agentes reguladores pueden disolverse en el vehículo.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta de la siguiente administración de modulador) . Dichas formulaciones generalmente pueden prepararse usando tecnología bien conocida y administrarse por ejemplo, por implantación oral, rectal o subcutánea, o por implantación en el sitio blanco deseado. Los vehículos para usarse dentro de dichas formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación provee un nivel relativamente constante de liberación de modulador, la cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende de, por ejemplo, el sitio de implantación, el régimen y duración esperado de liberación y la naturaleza del la enfermedad/trastorno que Sera tratado o prevenido.
El anticuerpo o derivados de anticuerpos provistos en la presente generalmente se administran en una cantidad que logra una concentración en un fluido corporal (v.gr. f sangre, plasma, suero, CSF, fluido sinovial, linfa, fluido intersticial celular, lágrima su orina) que es suficiente para unirse detectablemente a un blanco tal como por ejemplo, VEGF y evita o inhibe dichas enfermedades/trastornos mediadas blanco, v.gr., enfermedades/trastornos mediadas por VEGF. Una dosis se considera efectiva si da como resultado un beneficio de paciente discernible como se describe en la presente. Las dosis sistémicas preferidas varían de aproximadamente 0.1 mg a alrededor de 140 mg por kilogramo de peso corporal por día (aproximadamente 0.5 mg a alrededor de 7 g por paciente por día) , con dosis orales siendo generalmente de aproximadamente 5-20 veces superiores a las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que se puede combinar con los materiales de vehículo para producir una sola forma de dosis variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Las formas de dosis unitarias generalmente contendrán entre aproximadamente 1 mg a alrededor de 500 mg de un ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden empacar para tratar condiciones respectivas a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido v.gr., a VEGF. Las composiciones farmacéuticas empacadas pueden incluir un contenedor que contiene una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se describe en la presente y las instrucciones (v.gr. , marcación) que indican que la composición contenida será usada para tratar una enfermedad/trastorno que responde a un anticuerpo o derivado de anticuerpo siguiendo la administración en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invención también pueden modificarse químicamente. Los grupos de modificación preferidos son polímeros, por ejemplo, un polialquileno de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituido, polialquileno, o polímero de polialquileno o un polisacárido ramificado o no ramificado. Dicho grupo efector puede incrementar la vida media de anticuerpo in vivo. Ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol ) (PEG), poli (propilenglicol) , poli (alcohol vinílico) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos. Los polímeros presentes en la naturaleza particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de los mismos. El tamaño del polímero puede variar según se desea, pero generalmente puede estar en un rango de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da. Para aplicación local en donde el anticuerpo se diseña para penetrar tejido, un peso molecular preferido del polímero es de aproximadamente 50000 Da. La molécula de polímero puede unirse al anticuerpo, en particular al extremo C-terminal de la cadena pesad del fragmento de Fab vía un péptido de gozne ligado covalentemente, como se describe en WO 0194585. Con respecto a la unión de porciones de PEG, se hace referencia a "Poly (ethyleneglycol ) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York and "Bioconj ugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Después de la preparación del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés como se describió antes, la formulación farmacéutica que lo comprende se prepara. El anticuerpo que será formulado no se ha sometido a liofilización previa y la formulación de interés presente es una formulación acuosa. Preferiblemente el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo presente en la formulación se determina tomando en cuenta, por ejemplo, los volúmenes de dosis deseadas y modos de administración. De aproximadamente 0.1 mg/ml a alrededor de 50 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0.5 mg/ml a alrededor de 25 mg/ml y más preferiblemente de aproximadamente 2 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml es una concentración de anticuerpo ilustrativa en la formulación .
Una formulación acuosa se prepara comprendiendo el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solución regulada para pH. La solución reguladora de esta invención tiene un pH en la escala de aproximadamente 4.5 a alrededor de 6.0, preferiblemente de aproximadamente 4.8 a alrededor de 5.5 y más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 5.0. Ejemplos de soluciones reguladoras que controlarán el pH dentro de esta escala incluyen acetato (v.gr., acetato de sodio) , succinato (tal como succinato de sodio) , gluconato, histidina, citrato y otros regladores de ácidos orgánicos. La concentración reguladora puede ser de aproximadamente 1 mM a alrededor de 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a alrededor de 30 mM, dependiendo, por ejemplo de la solución reguladora y la isotonicidad deseada de la formulación. La solución reguladora preferida es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM) , pH 5.0.
Un poliol que actúa como un tonificador y puede estabilizar el anticuerpo, se incluye en la formulación. En modalidades preferidas, la formulación con contiene una cantidad de tonificación de una sal tal como cloruro de sodio, dado que puede ocasionar que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se precipite y/o puede dar como resultado oxidación a bajo pH. En modalidades preferidas, el poliol es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se agrega a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. Preferiblemente la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en la escala de aproximadamente 1% a alrededor de 15% p/v, preferiblemente en la escala de aproximadamente 2% a alrededor de 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, las formulaciones hipertónicas o hipotónicas también pueden ser adecuadas. La cantidad de poliol agregada también puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, una cantidad inferior de un monosacárido (v.gr., manitol), se puede agregar comparado con un disacárido (tal como trehalosa) .
Un agente tensioactivo también se agrega al anticuerpo o formulación de derivado de anticuerpo. Los agentes tensioactivos ilustrativos incluyen agentes tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (v.gr., polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (v.gr., poloxamero 188). La cantidad de agente tensioactivo agregada es tal que reduce la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo y/o reduce la formulación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el agente tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad que aproximadamente 0.001% a alrededor de 0.5%, preferiblemente de aproximadamente 0.005% a alrededor de 0.2% y más preferiblemente de aproximadamente 0.01 % a alrededor de 0.1%.
En una modalidad, la formulación contiene los agentes identificados antes (es decir, el anticuerpo o derivado de anticuerpo, solución reguladora, poliol y agente tensioactivo) y es esencialmente libre de uno o más conservadores, tal como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y Cl benxetonio. En otra modalidad, un conservador puede incluirse en la formulación, particularmente en donde la formulación es una formulación de múltiples dosis. La concentración de conservador puede estar en la escala de aproximadamente 0.1% a alrededor de 2; más preferiblemente de aproximadamente 0.5% a alrededor de 1%. Uno o más vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006) puede incluirse en la formulación siempre y cuando no afectan adversamente las características deseadas de la formulación. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos a los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: agentes reguladores adicionales; co-solventes ; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metales (v.gr., complejos de proteínas de Zn) ; polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones de formación de sales tales como sodio.
Las formulaciones que serán usadas para la administración in vivo deberán se r estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril antes de, o después de la preparación de la formulación .
La formulación se administra a un mamífero que necesita de tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un ser humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa tal como un bolo o por infusión continua durante un tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intrecerebroespinal, subcutánea, intra-particular, intrasinovial, intretecal, oral, tópica, o por inhalación. En modalidades preferidas, la formulación se administra al mamífero por administración intravenosa. Para dichos fines, la formulación puede inyectarse usando una jeringa o vía una línea IV, por ejemplo.
La dosis apropiada ("cantidad terapéuticamente efectiva) del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la condición que será tratada, la severidad y transcurso de la condición, por lo que el anticuerpo se administra para fines preventivos o de terapia, terapia previa, de la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo usado y la discreción del medido que atiende. El anticuerpo o derivado de anticuerpo es administrada adecuadamente para la patente en un tiempo o en una serie de tratamientos y se puede administrar a la patente en cualquier momento de diagnóstico en curso. El anticuerpo o derivado de anticuerpo puede administrarse como el único tratamiento o junto con otros fármacos o terapias útiles para tratar la condición en cuestión.
Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrado estará en la escala de aproximadamente 0.1 a alrededor de 50 mg/kg del peso corporal de patente ya sea por una o más administraciones, con la escala típica de anticuerpo usada siendo de aproximadamente 0.3 a alrededor de 20 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0.3 a alrededor de 15 mg/kg, administrada diariamente, por ejemplo. Sin embargo, laos regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por técnicas convencionales.
En otra modalidad de la invención, se provee un artículo de manufacturar que comprende un contenedor que contiene la formulación farmacéutica de la presente invención, preferiblemente una formulación acuosa y opcionalmente provee instrucciones para su uso. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos viales y jeringas. El contenedor puede estar formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un contenedor ilustrativo es un frasco vial de vidrio de un solo uso de 3-20 ce. Alternativamente, para una formulación de múltiples dosis, el contenedor puede ser de frascos de vidrio de 3-100 ce. El contenedor contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada con, el contenedor puede indicar direcciones de uso. El articulo de manufactura además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones reguladoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaques con instrucciones de uso.
En ciertas modalidades preferidas, el articulo de manufactura comprende un inmunoaglutinante liofilizado como se describió en la presente o se generó por los métodos descritos en la presente.
EJEMPLIFICACIÓN La presente descripción se ilustra además por los siguiente es ejemplo, que no deberán interpretarse como limitantes. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a través de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente por referencia en su totalidad.
MATERIALES Y MÉTODOS En general, la práctica de la presente invención empela, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, v.gr., tecnología de anticuerpos) y técnicas normales de preparación de polipéptido. Véase, v.gr., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. , Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlo et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons (1992) . Los métodos para injertar CDR de Conejos y otros anticuerpos monoclonales no humanos en estructuras de anticuerpos humanos seleccionados se describió en detalle antes. Ejemplos de dichos experimentos de injerto se exhiben más adelante.
Para fines de mejor entendimiento, los injertos denominados "min" son aquellos en donde los CDR se injertaron en la estructura 1.4 o un dominio variable de los mismos, mientras que los injertos denominados "max" son aquellos en donde CDR se injertaron en la estructura 1.4 o un dominio variable del mismo y en donde la estructura comprende de residuos de estructura de donador que interactúan con el antigeno .
EJEMPLO 1: DISEÑO DE rFWl . 1.1 Análisis de secuencia primaria y búsqueda de base de datos 1.1.1. Recolección de Secuencias de Inmunoglobulina de Conejo Las secuencias de dominios variables de anticuerpo maduros de conejo y lineas germinales se recopilaron de diferentes bases de datos de fuente abierta (v.gr., base de datos Kabat y I GT) , y se introducen en una base de datos común como una secuencia de aminoácidos de código de letra. Para todo el análisis se usaron únicamente la porción de aminoácidos que corresponde a la región V (variable) . Las secuencias en la base de datos de KDB menor a 70% completo o que contiene múltiplos residuos no determinados en las regiones de estructura se descartaron. Las secuencias con identidad del más del 95% a cualquier otra secuencia dentro de la base de datos también se excluyeron para evitar el ruido aleatorio en el análisis. 1.1.2. Alineaciones y numeración de Secuencias de Conej o Las secuencias de anticuerpo de conejo se alienaron usando herramientas de alineación de secuencia convencionales basadas en el algoritmo de Needleman-Wunsch y matrices Blossum. La introducción de espacios y nomenclatura de posiciones de residuos se realizó siguiendo el sistema de numeración de AHo para los dóminos variables de inmunoglobulina (Honegger y Pluckthun, 2001) . El esquema de numeración de Kabat también se aplicó en paralelo dado que es el estándar más ampliamente adoptado para numerar los residuos en un anticuerpo. La numeración de Kabat se asignó usando el programa SUBI . Este programa analiza las regiones variables de una secuencia de anticuerpos y números de secuencia de acuerdo con el sistema establecido por Kabat y colaboradores Deret y otros 1995) .
La definición de estructura y regiones de CDR se realizó siguiendo la definición de Kabat que se basó en la variabilidad de secuencia y es la más comúnmente usada. Sin embargo, la designación de CDR-H1 fue un compromiso entre diferentes definiciones incluyendo, AbM, Kabat, datos de contacto medios generados por análisis de contactos entre anticuerpo y antigeno de un subgrupo de estructuras de complejo 3D MacCallum y otros, 19996) y Chotia que se basa en la ubicación de Lars regiones de bucle estructurales (descritas antes y mostradas en la Figura 1). 1.1.3. Frecuencia y Conservación de posiciones de residuo La diversidad de secuencia de aminoácidos se analizó usando un grupo de 423 secuencias de conejo de la base de datos de Kabat. La frecuencia de residuos (f(r), para cada posición, i, en las secuencias de conejo maduras se calculó por el número de veces que se observó el resido particular dentro del grupo de datos dividió por el número total de secuencias. El grado de conservación de cada posición, i, se calculó usando el Indice de Simpson, que toma en cuenta el número de diferentes aminoácidos presentes, asi como la abundancia relativa de cada residuo. en donde: N número total de aminoácidos, r es el número de diferentes aminoácidos diferente presente en cada posición y n es el número de residuo de un tipo de aminoácidos particular . 1.1.4. Análisis de linaje de la región V de conejo Las herramientas de análisis de filogenia se usaron para estudiar el repertorio de conejos. Las secuencias de aminoácidos de la región V se agruparon usando los algoritmos de grupos y topológicos. La matriz de distancia se calculó para toda la disposición y se uso como indicación del uso de linea germinal. La secuencia consensual de cada grupo se calculó y se identificó la contraparte de secuencia de linea germinal de conejo más cercana. También la secuencia consensual general se derivó para todo el grupo de secuencias . 1.1.5. Asignación de subgrupo humano Para cada secuencia representativa de conejo de diferentes grupos, el subgrupo humano más homólogo se identificó usando una implementación EXCEL de algoritmos de análisis de secuencias y los métodos de clasificación basados en análisis del repertorio de anticuerpos humanos (Knappik y otros, 2000) . 1.2. Diseño de Estructura de Aceptores Humanos Con la impresión azul del repertorio de conejo del análisis de secuencia descrita antes, los residuos en la estructura implicados generalmente en la posición de CDR de conejo se identificaron. Entre las estructuras que tienen alta homología en relación con el repertorio de conejo y los grupos respectivos, uno que tiene buenas propiedades biofísicas se seleccionó de una combinación de secuencias completamente humanas. La estructura seleccionada para servir como una estructura de aceptor pertenece al subgrupo de cadena ligera variable kapa 1 y el subgrupo de cadena variable pesada III con ESBATech ID KI 27, a43 correspondientemente. Esta estructura de anticuerpo estable y soluble se ha identificado por el tamizado de un banco de scFv de bazo humano usando un método de tamizado basado en levadura nombrado sistema "Quality Control" (Auf der Maur y otros, 2004) y se designó "FW1.4". Aunque la secuencia de estructura estable y soluble FW1. exhibe alta homología, no es la secuencia más homologa disponible. Los residuos identificados se incorporaron en la estructura aceptor para generar rF 1.4.
Con la información para diversidad de secuencia de aminoácidos, el uso de la línea germinal y los aspectos estructurales de los anticuerpos de conejo, se analizó FW1.4 para la compatibilidad de posiciones de residuos requerida para conservar la conformación de CDR en la nueva estructura humana. Se examinaron las regiones variables de FW1.4 para compatibilidad de las siguientes características: i. Residuos que son pares de secuencias canónicas para estructuras de bucle ii. Residuos de estructura localizados en la interfaz de VL/VH. iii. La plataforma de residuos directamente debajo de los CDR. iv. Residuos de núcleo superior e inferior v. Residuos de estructura que definen el subtipo 1.3. Injerto de CDR de Conejo Los injertos se generaron por la combinación simple de las secuencias de CDR (de acuerdo con la definición anterior) de un anticuerpo con la secuencia de estructura de F 1.4 o rFWl.4. Los residuos implicados potencialmente en la unión se identificaron. Para cada secuencia de dominio de variable de conejo, se identificó la contraparte de la linea germinal de conejo más cercana. Si no se puede establecer la línea germinal más cercana, la secuencia se comparó contra el subgrupo consensual o las secuencias de conejo consensúales con un alto porcentaje de similitud. Los residuos de estructura raros se consideraron como resultado posible de hipermutación somática y por lo tanto juegan un papel en la unión. Consecuentemente, dichos residuos se injertaron en la estructura aceptara. 1.4 Resultados Analizando el repertorio de anticuerpos de conejo en términos de estructura, la diversidad de secuencia de aminoácidos y el uso de la línea germinal, se encontraron las 5 posiciones de residuos en la cadena ligera de F 1.4 que se modifican para mantener conformación de bucles de CDR de conejo. Estas posiciones son altamente conservadas en anticuerpos de conejo. El residuo consensual para estas 5 posiciones se dedujo del repertorio de conejo y se introdujo en la estructura de aceptor humano 1.4. Con la modificación de estas posiciones conservadas, dicha estructura es covirtualmente compatible con las seis regiones de determinación de complementariedad (CDR) de cualquier CDR de conejo. El rFWl .4 maestro que contiene diferentes CDR de conejo se expresa bien y tiene buena producción contrario a las cadenas únicas de tipo silvestre. 16 miembros derivados de la combinación de esta estructura y CDR de conejo en don de la caracterización detallada mostró funcionalidad.
EJEMPLO 2: SISTEMA DE TAMIZADO DE CÉLULAS B Un sistema de tamizado basado en FACS (clasificación de una sola célula basada en citometria de flujo) se ha establecido en ESBATech con el fin de seleccionar células B que se unen a un blanco de interés vía los receptores de células B (BCR) . Un blanco por ejemplo es una proteína soluble, a saber, un anticuerpo de una sola cadena (ESBA903) marcado con un colorante fluorescente (Pe y PerCP) . La suspensión de linfocitos se preparó del bazo de conejos inmunizado con el blanco recombinante . Las células se incubaron con Pe y ESBA903 marcado con PerCP así como con anticuerpos específicos para IgG (APC-marcado) o IgM (FITC arcado) . Las células B positivas para ESBA903 que expresan IgG pero sin IgM en su superficie se clasificaron en placas de 96 pozos (Figura 3; tabla 2) . Por medio de una línea celular auxiliar de timoma (EL4-B5: véase Zubler otros, 1985, J. Immunol, 134(6): 3662-3668), proliferación de células B seleccionadas, diferenciadas en células de plasma y anticuerpos secretados. La afinidad de estos IgG para el blanco se verificó por ELISA y mediciones de Biacore. Los parámetros cinéticos se describen en la tabla 1 para siete clones seleccionados. Estos clones, de una combinación de ~200 células clasificadas, muestran afinidades de unión en el rango nanomolar a picomolar bajo. Finalmente, mARN se asiló de 6 clones de interés y se injertaron CDR en la estructura de una sola cadena FW1.4.
Tabla 1: Valores Cinéticos para Sobrenadantes de Cultivo de células B 7 Tabla 2: Estadística de Clasificación Población # Eventos % Madre % total Todos (os Eventos 100.000 1 00.0 Linfocitos 86.585 86,6 86,6 Linfocitos solos 1 86.013 99,3 86,0 Linfocitos sotos 2 85.523 99,4 85,5 ¿Células B de memoria? 5.450 6,4 5,4 Células clasificadas 16 0,3 0,0 903-células de unión 160 2,9 0,2 EJEMPLO 3: DETECCIÓN DE LA INTERACCIÓN ENTRE PERLAS REVESTIDAS CON ANTICUERPO ANTI-TNFalfa Y CÉLULAS CHO QUE EXPRESAN TNFalfa UNIDO A MEMBRANA Con el fin de evaluar si hay o no la presión alta en la corriente de citometria de flujo rompe la unión no covalente entre dos células, se lleva a cabo el siguiente experimento. Las células de CHO transfectadas establemente con TNF-alfa unido a membrana (células B-220) se incubaron con perlas revestidas con un anticuerpo anti-TNFalfa marcad con PE. En este establecimiento las perlas imitan las células B de memoria (tienen más o menos el mismo tamaño) . Como controles negativos, las células de CHO no transfectadas se usaron, así como perlas revestidas con un anticuerpo no relacionado marcado con APC (anti-CD19) . Después de 2 horas de incubación a 4°C con agitación, se analizó la suspensión de células-perlas por FACS (usando una boquilla de 130 um) . La Figura 4 muestra que una unión especifica entre perlas anti-TNF-alfa y células CHO TNFalfa-transfectadas se detecta claramente con FACS. Además, en esta muestra (panel superior) aproximadamente dos tercios de las perlas se unen a las células (585 unidas contra 267 no unidas) . En contraste, en las muestras de control (paneles medio e inferior) , casi ninguna perla se une a células CHO. Además, ambas poblaciones de perlas (anti-TBNFalfa-PE y anti-CD19-APC) se mezclaron juntas con células CHO transfectadas con TNFalfa. La Figura 5 y la tabla 4 muestra que aproximadamente la mitad de las perlas anti-TNFalfa se unen a células CHO, mientras que la vasta mayoría de las perlas anti-CD19 permanecen no unidas. El porcentaje de perlas que se unen a la célula en cada muestra se detalla en la Tabla 5. Por lo tanto, se lleva a cabo la demostración de que la selección especifica de las células B solas que se unen a una proteína blanco de membrana integral a través de su receptor de células B es posible usando citometría de flujo.
Tabla 3a: Estadísticas de Clasificación (véase también Fig. 4a) .
Tabla 3b: Estadísticas de Clasificación (véase también Fig. 4b) .
Tabla 3c: Estadísticas de Clasificación (véase también Fig. 4c) .
Tabla 4: Estadísticas de Clasificación (véase también Fig . 5 ) .
Tabla 5: Porcentaje de perlas unidas a células CHO cada muestra EJEMPLO 4: INJERTO DE CDR Y HUMANIZACIÓN FUNCIONAL DE ANTICUERPOS DE DONADOR DE CONEJO ANTI-TNFa Se seleccionaron cuatro anticuerpos de conejo anti- TNFa "Rebmabs" (EPI-I, EPI-15, EP-34, EP-35 y EP -42) para injerto de CDR. El esquema experimental general para el injerto de CDR, humanización y caracterización preliminar de anticuerpos de donado de conejo humanizado se realizó como se describió en la descripción. A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean la estructura de aceptores de anticuerpos humanos que comparte la homología de secuencia mayor con el anticuerpo donador no humano, los CDR de conejo se injertaron en una estructura humana (FW 1.4) que se preseleccionó para propiedades funcionales convenientes (solubilidad y estabilidad) usando un análisis de Control de Calidad ( O 0148017) . Esta secuencia de estructura estable y soluble exhibió alta homología con RabMabs.
Los injertos de CDR se generaron para cada RabMabs usando la metodología descrita en 1 presente. En injertos " in", únicamente los CDR de conejo se trasplantaron de dominios de VL y VH del anticuerpo de donador de conejo a la estructura de aceptores humanos FW1.4. Los Injertos "Max" al injerto de CDR de conejo a rFW1.4.
Los scFvs descritos y caracterizados en la presente se produjeron de la siguiente manera. Las secuencias de VL humanizadas están conectadas con las secuencias de VH humanizadas vía el entrelazador de SEC ID NO: 8 para dar un scFv de la siguiente orientación: NH2~VL-entrelazador-VH-COOH. En muchos casos las secuencias de ADN que codifican varios scFvs fueron sintetizados de nuevo con el proveedor de servicio Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Los insertos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión bacteriana pGMP002 vía los sitios de restricción Ncol y HindIII introducidos en el extremo 5' y 3* de la secuencia de AD scFv respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio de VL y el dominio VH, se localiza un sitio de restricción de BamHI . En algunos casos el ADN que codifica scFv no fue sintetizado de nuevo, pero las construcciones de expresión de scFv se clonaron por cambio de dominio. Consecuentemente, los dominios de VL se cortaron e introdujeron en nuevas construcciones via los sitios de restricción de Ncol y BamHI, los dominios de VH via los sitios de restricción de BamHI y HindIII. En otros casos, las mutaciones de punto se introdujeron en el dominio de VH y/o VL usando el estado de la materia ensamblado métodos de PCR. La clonación de GMP002 se describió en el Ejemplo 1 de WO2008006235. La producción de scFvs se volvió análogo para ESBA105 como se describió en el Ejemplo 1 de O2008006235.
La Tabla 3 describe un resumen de los datos de caracterización detallados para los cuatro monoclonales de conejo (EP6, EP 19, EP34, EP35 y EP43) y sus variantes injertadas de CDR. Aunque los injertos de CDR exhibieron un rango amplio de actividades en análisis de unión de BIACore y L929, los análisis de citotoxicidad mediados por TNFa, 3 de los 4 injertos máximos ("max") exhibió actividades terapéuticamente relevantes. EP43 máx exhibió la afinidad de unión más favorable (Kd de 0.25 nM) y un excelente EC50 en el análisis de citotoxicidad. Estos datos muestran que FW1.4 (SEC ID NO: 1 y 2) es una región de estructura aceptora humana ilustrativa soluble y estable para injertar CDR de conejo.
ANÁLISIS DE POTENCIA La actividad de neutralización de aglutinantes anti-TNFa se evaluaron en un análisis de citotoxicidad mediada por TNFOÍ L929. La toxicidad de células de fibroblastos L929 de Ratón tratadas con Actinomicina se indujo con TNF humano recombinante (hTNF) . 90% de citotoxicidad inducida por hTNF máxima se determinó para ser una concentración de TNF de 1000 pg/ml. Todas las células L929 se cultivaron en RPM1 1640 con rojo fenol, con medio L-glutamina suplementado con suero de becerro fetal (10% v/v) . La actividad de neutralización de aglutinantes anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo de fenol y 5% de suero de becerro fetal. Las concentraciones diferentes (0-374 ng/ml) de aglutinantes anti-TNF se agregaron a las células L929 en presencia de 100 pg/ml hTNF con el fin de determinar la concentración que alcanza la inhibición media-máxima de efecto antagonistico (EC50%) . La curva de respuesta de dosis se adaptó con regresión sigmoidal no lineal con inclinación variable y EC50 se calculó.
ANÁLISIS DE UNIÓN DE BIACORE DE ANTI-TNF scFvs Para la medición de afinidad de unión, las mediciones de resonancia Plasmon superficial con BIAcore™-T100 se empelaron usando un microcircuito sensor de NTA y TNF etiquetado con His (producido en ESBATech) . La superficie del microcircuito de sensor de NTA consiste de una matriz de dextrana carboximetilada preinmovilizada con ácido nitrilotriacético (NTA) para capturar moléculas etiquetadas con histidina vía quelatación de NÍ2+NTA. Los trímeros N-his de TNFa humanos (5 nM) se capturaron por el níquel vía sus etiquetas de his N-terminales y se inyectó ESBA105 (analito) a varias concentraciones variando de 30 nM a 0.014 nM en pasos de dilución en series triples. En el paso de regeneración, el complejo formado por níquel, el ligando y analito se lavan. Esto permite el uso de las mismas condiciones de regeneración para diferentes muestras. La señal de respuesta se genera por la tecnología de resonancia de Plasmon superficial (SPR) y se mide en unidades de resonancia (RU) . Todas las mediciones se llevan a cabo a 25°C. Los sensogramas se generaron para cada muestra de scFv anti-TNF después de la corrección de células de referencia en línea seguida por la sustracción de muestra reguladora. La constante de régimen de disociación evidentes (kd), la constante de régimen de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (KD) se calcularon usando un modelo de unión Langmuir de uno a uno con el Software de evaluación BIAcore T100 versión 1.1.
TABLA 3: SEGUNDA GENERACIÓN TNF-alfa DE AGLUTINANTES IV) en o OI Oí Descripción ID L929* kan Qff FT-IR TM°C Rendimiento Rf EPl_min 1071 ND*** - - - - 7 EP6_mÍn 673 ND**" 4.67E+04 4.94E-03 1.06E-O7 50.2 35 EPI5_min 1073 ND*** I.57E+05 4.I0E-02 2.62E-07 - 41.5 EP!9_min 616 ND*** - - - - - EP34_min 643 ND*** - - - - - EP42_min 1076 ND*** 1.42E+05 8.35E-03 5.87E-08 - EP43 rain 705 ND*** 5.38E+03 2.98E-02 5.54E-06 70.2 30.0 5.69E-08 - 44 EPl_max 1072 ND*** I.ltE+04 6.30E-04 BPó max 674 1.1 .84£+05 1.45E-Q4 5.I2E-I0 48.1 12 EP 15_max 1074 0.39 1.53E+06 2.26E-03 I.48E-09 68. 578 EP1 _max I0O7 0.6 2.25E+04 6.S4E-05 2.91E-09 53.5 52 EP34_max 791 10.5 2.86E+05 1.68E-05 2.86E-II 72.4 4.05 EP35_max 1089 5.20 7.72Et 05 1.5OE-04 1.94E-I0 - 0.66 EP42_max 1077 ND*** 1.21E+05 4.19E-04 3.46E-09 - 47,6 EP43 max 676 6.4 1.78E+05 4.48E-05 2. 1 £-10 74.3 21.73 CP34min_C-Ilis 790 0.2 EPl9max C-His 789 !.9 *L929 [EC50-E105tf_C50-X], comparado en unidades de masa (ng/rri) en relación con el desempeño de ESBA 105 (WO06/131013) ** (mgl solución doble); *" No Determinado EJEMPLO 5: INJERTO DE CDR Y HUMANIZACIÓN FUNCIONAL DE ANTICUERPOS DONADORES DE CONEJO anti-VEGF Ocho Rabmabs anti-VEGF (375, 435, 509, 511, 534, 567, 578 y 610) se seleccionaron para injerto de CDR. A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean la estructura de aceptor de anticuerpos humanos que comparte la homología de secuencia mayor con el anticuerpo donador no humano, los CDR de conejo se injertaron en una estructura de aceptor humana FW 1.4 (SEC ID NO. 1 y 2) que se preseleccionó para propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) usando un análisis de Control de Calidad (WO0148017) .
Un número de injertos de CDR se generaron para cada uno de los RabMabs (anticuerpos de conejo) usando la metodología descrita en la presente (véase Ejemplo 4). Los injertos "Min" comprendiendo un injerto mínimo en donde únicamente los CDR de conejo se trasplantaron de los dominios VL y VH del anticuerpo donador de conejos a la estructura de aceptor humano FW1.4 (SEC ID NO: 1). Los injertos "raax" no solo comprendieron los CDR de conejo para BL y VH, sino también algunos residuos de estructura adicionales del donador de conejos que se predijeron para ser importantes para la unión de antígeno. En el caos de 578max, la región de estructura de dominio de variable de cadena pesada de FW1.4 tiene alteraciones de aminoácidos adicionales en las posiciones 23H, 49H, 73H, 78H y 94H de Kabat .
La Tabla 4 muestra un resumen de los datos de caracterización detallados para las variantes injertadas de CDR "Min" y "Max" . Se describe su potencia como inhibidores de VEGF que se midió usando análisis de ELISA y/o HUVEC en competencia de VEGFR. Estos datos muestran que FW1.4 SEC ID NO. 1 y 2) es una región de estructura aceptora humana soluble y estable ilustrativa para injertar CDR de conejo.
ANÁLISIS DE UNIÓN BIACORE DE scFvs anti-VEGF La capacidad de unión Biacore de scFvs se probó y la afinidad de unión se midió usando el método de resonancia de plasmon de superficie ilustrativo con BIAcore™-T100. Las proteínas VEGF, probadas para unión por estos candidatos de scFv, en este ejemplo y ejemplos finales incluyen VEG Fi65 humanos recombinantes expresados para Escherichia coli purificada (PrepoTech EC Ltd.), VE FG121 humano recombinante (PrepoTech EC Ltd.), VEFGuo humano recombinante (ESBATech AG) , VEGF164 de murinos recombinante (PrepoTech EC Ltd.), VEGF164 de rata recombinante (Biovision) , VEGFno de conejo recombinantes (ESBATech AG) y PLGF humano recombinante (PrepoTech EC Ltd.). Para el experimento de resonancia de plasmon superficial los microcircuitos de biosensores de dextrana carboximetiladas (CM4, GE Healthcare) se activaron con clorhidrato de N-etil-N ' - (3-dimetilaminopropil ) carbodiimida y N-hidroxisuccinimida de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada una de las 6 formas de VEGF diferentes, como se ejemplificó antes, se acopló a 1 de las 4 células de flujo diferentes en un microcircuito de sensor de CM4 usando un procedimiento de acoplamiento de amina normal. El rango de respuestas obtenidas con estas moléculas de VEGF inmovilizadas después del acoplamiento y bloqueo fueron unidades de respuesta ~250-500 (RU) para hVEGFi65, -200 RU para hVEFGU0, hVEGFm, VEGFi64 de murinos, VEGFi64 de ratas y VEGFuo de conejo y -400 RU para PLGF. La célula de flujo 4th de cada microcircuito se trató similarmente excepto que no se inmovilizaron proteínas antes del bloqueo y la célula de flujo se usó como la referencia en línea. Varias concentraciones de anti-VEGF scFvs (v.gr., 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3.33 nM, 1.1 1 nM, 0.37 nM, 0.12 nM y 0.04 nM) en solución reguladora HBS-EP (0.01 HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% agente tensioactivo P20) se inyectaron en las células del flujo a un régimen de flujo de 30 µ?/min durante 5 min. La disociación de anti-VEGF scFv de VEGF en el microcircuito CM4 se dejó proceder durante 10 minutos a 25°C. Los sensogramas se generaron para cada muestra de scFv anti-VEGF después de la corrección de células de referencia en línea seguida por la substracción de muestra reguladora. La constante de régimen de disociación aparente (kd), la constante de régimen de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (KD) se calcularon usando un modelo de unión Langmuir de uno a uno con Software de evaluación T100 Biacore versión 1.1.
ANÁLISIS HUVEC DE INHIBICIÓN DE FEGF El análisis de HUVEC es un método para medir la potencia de los candidatos de scFv anti.-VEGF descritos como inhibidores de VEGF.
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Promocell), combinados de varios donadores, se usaron en el paso 2 a 1 paso 14. Las Células se sembraron a 1000 células/pozo en medio de crecimiento de células endoteliales completo de 50 µ? (ECGM) (Promocell), que contuvo 0.4% ECGS/H, 2% Suero de Becerro Fetal, 0.1 ng/ml de Factor de Crecimiento Epidérmico, 1 µ?/ml de Hidrocortisona, 1 ng/ml de Factor de Fibroblastos básico y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) , 7 a 8 horas después, 50 µ? medio de ayuno (ECGM sin suplementos que contienen FCS inactivados por calor al 0.5% y 1% penicilina/estreptomicina) se agregó a las células y las células ayunaron durante 15 a 16 horas. Las diluciones en serie triples de scFvs anti-VEGF (0.023-150 nM) y uno de VEGF165 humano recombinante siguiente (0.08 nM) , VEGF164 de ratón recombinante (0.08 nM) , o VEGFi64 de rata recombinante (0.3 nM) se prepararon en medio en ayuno y se preincubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Las diferentes concentraciones de VEGF se usaron para compensar sus diferentes actividades biológicas relativas. Se usaron las concentraciones que estimulan VEGF submáxima indujeron proliferación (EC90) . 100 µ? de las mezclas se agregaron a las placas de cultivo de tejido de 96 pozos conteniendo la suspensión HUVEC y se incubaron durante 4 días en una incubadora humidificado de 37°C/5% C02. La proliferación de HUVEC se evaluó midiendo la absorbancia a 450 nm (620 nm usado como longitud de onda de referencia) después de la adición de reactivo de proliferación celular 20 µ?/???? WST-1 usando una adaptación de curva de logística de 4 parámetros y la concentración de scFvs anti-VEGF requeridos para inhibir proliferación de HUVEC por 50% (EC50) se derivó de curvas de inhibición.
Tabla 4 EQUIVALENTES Numerosas modificaciones y modalidades alternativas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia en vista de la descripción anterior. Consecuentemente, esta descripción será interpretada como ilustrativa únicamente y se pretende que enseñe a los expertos en la materia el mejor modo de llevar a cabo la presente invención. Se reservan los detalles de la estructura pueden variar sustancialmente sin alejarse del espíritu de la invención y el uso exclusivo de todas las modificaciones que están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se pretende que la presente invención sea limitada únicamente al grado requerido por las reivindicaciones anexas y las reglas de ley aplicables.
Toda la literatura y material similar citado en esta solicitud, incluyendo, patentes, solicitudes de patentes, artículos, libros, tratados, disertaciones, páginas web, figuras y/o apéndices, sin tomar en cuenta el formato de dicha literatura y materiales similares, se incorporan expresamente por referencia en su totalidad. En el caso de que uno o más de los materiales de literatura y similares incorporados difiera de o contradiga su aplicación, incluyendo los términos definidos, uso de término, técnicas descritas, o similares, controla esta solicitud.

Claims (47)

REIVINDICACIONES
1. - Una estructura aceptora de inmunoaglutinante que comprende : (i) CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de un inmunoaglutinante de lagomorfo donador; y (ii) una estructura de cadena pesada variable humana que tiene una identidad de por lo menos 95% a SEC ID NO. 4, que comprende además por lo menos seis aminoácidos del grupo que consiste de Treonina (T) en la posición 84, Valina (V) en la posición 89 y Arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) .
2. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de la reivindicación 1, en donde la estructura de cadena pesada variable se selecciona del grupo que consiste de SED ID NO. 4 y SEC ID NO. 6.
3. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una estructura de cadena ligera variable que tiene identidad de por lo menos 85% a SEC ID NO. 2.
4. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de la reivindicación 3, que comprende además una treonina (T) en la posición 87 de la estructura de variable de cadena ligera (numeración de AHo) .
5. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de la reivindicación 3, que comprende además CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de un inmunoaglutinante lagomorfo donador .
6. - La estructura aceptora inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la estructura de cadena pesada variable y la estructura de cadena ligera variables se entrelazan via un entrelazador de SEC ID NO. 8.
7. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprenden una estructura que tiene identidad de por lo menos 70% a SEC ID NO. 3, SEC ID NO. 5 o SEC ID NO. 7.
8. - Una estructura de aceptor de cadena pesada variable inmunoaglutinante humana o humanizada que comprende por lo menos tres aminoácidos del grupo que consiste de treonina (T) en la posición 24, valina (V) en la posición 25, alanina (A) o glicina (G) en la posición 56, lisina (K) en la posición 82, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo) .
9. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aminoácido en la posición 12, 103 y/o 144 (numeración de AHo) se sustituyó contra un aminoácido hidrofilico.
10. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de la reivindicación 9, que tiene (a) Serina (S) en la posición 12, (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición 103 y/o (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición 144 (numeración AHo) en la estructura de cadena pesada.
11. - La estructura de aceptor inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tienen ácido glutámico (E) en la posición 1, valina (V) en la posición 3, leucina (L) en la posición 4, Serina (S) en la posición 10, Arginina (R) en la posición 47, Serina (S) en la posición 57, fenilalanina (F) en la posición 91 y/o Valina (V) en la posición 103 en la estructura de cadena ligera variable (numeración AHo) .
12. - La estructura de aceptor inmunoaglutinante de la reivindicación 11, que comprende además residuos de estructura implicada en unión de antigeno.
13. - La estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además Glicina (G) en la posición 141 de la cadena pesada variable (numeración de AHo) .
14. - Uso de estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para el injerto de CDR lagomorfos.
15. - Un inmunoaglutinante, que comprende la estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 15, que es un anticuerpo scFv.
17. - El inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, que comprende además una o más moléculas unidas, en particular un agente terapéutico tal como un agente citotoxico, una citoquina, una quimioquina, un factor de crecimiento u otra molécula de señalamiento, un agente de formación de imágenes o una segunda proteina, en particular un activador de transcripción de un dominio de unión de ADN.
18. - El uso de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 en aplicaciones de diagnóstico, aplicación terapéutica, validación blanco o terapia de genes.
19. - Un ácido nucléico, en particular una ácido nucléico aislado, que codifica la estructura de aceptor inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
20. - Un vector que comprende el ácido nucléico de la reivindicación 19.
21. - Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 20.
22. - El uso del ácido nucléico de la reivindicación 19 o el vector de la reivindicación 20 en terapia de genes.
23. - Una composición que comprende la estructura de aceptor de inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, el ácido nucléico de la reivindicación 19 o el vector de la reivindicación 20.
24. - Un método para humanizar un inmunoaglutinante de conejo, el inmunoaglutinante de conejo que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, el método comprendiendo : (i) injertar en la cadena pesada por lo menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres CDR del grupo que consiste de secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 en una estructura de aceptor de cadena ligera humana que tiene por lo menos identidad de 50%, preferiblemente de por lo menos 55%,. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95% a SEC ID NO. 1; y/o (ii) injertar en la cadena pesada por lo menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres CDR del grupo que consiste de secuencias de CDR1, cDR2, CDR3 en una estructura de aceptor de cadena ligera humana, la estructura de cadena ligera humana que tiene por lo menos identidad de 50%, preferiblemente de por lo menos 55%, . 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, más preferiblemente por lo menos 95% a SEC ID NO. 2.
25. - El método de la reivindicación 24, en donde: (i) la estructura de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácido de estructura de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6; Y (ii) la estructura de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de estructura de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 9.
26. - El método de la reivindicación 24 ó 25, que comprende además sustituir residuos de estructura por los residuos de estructura del inmunoaglutinante de conejo que está implicado en unión de antigeno.
27. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, que comprende además el paso: de sustituir un residuo de estructura de la estructura de aceptor de cadena pesada con una sustitución en por lo menos una de las posiciones, amino de cadena pesada 12, 103 y 144 (numeración AHo) , en particular por: sustitución contra un aminoácido hidrofilico, preferiblemente por una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: (a) Serina (S) en la posición 12; (b) Treonina (T) en la posición 103; y (c) Treonina (T) en la posición 144.
28. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 24-27, que comprende además sustituir un residuo de estructura de la estructura de aceptor de cadena ligera con una sustitución de aumento de estabilidad en por lo menos una de las posiciones 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 y 103 de la región variable de cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de AHo, en particular con una sustitución seleccionada del grupo que consiste de (a) ácido glutámico (E) en la posición 1, (b) valina (V) en la posición 3, (c) leucina (L) en la posición 4; (d) Serina (S) en la posición 10; (e) Arginina (R) en la posición 47, (e) Serina (S) en la posición 57, (f) fenilalanina (F) en la posición 91; y (g) Valina (V) en la posición 103, .
29. - Un inmunoaglutinante humanizado de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 24-28.
30. - El inmunoaglutinante de la reivindicación 29, en donde el antigeno blanco es VEGF o TNFa.
31. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en donde el método además comprende la identificación de CDR donador de un dominio de variable de anticuerpos generada por células B de acuerdo con los pasos de: a) incubar células B de conejo con un antigeno blanco; b) seleccionar las células B que se unen al antigeno blanco; y c) identificar los CDR del dominio de variable de anticuerpo generado por las células B.
32.- El método de la reivindicación 31, en donde las células B se aislan de un conejo que se inmuniza contra el antigeno blanco, preferiblemente por vacuna de AD .
33.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, en donde las células B y el antigeno blanco se tiñen de manera diferente y la co-ocurrencia de las dos cepas se seleccionan positivamente por citometria de flujo basadas en clasificación de células solas.
34.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-3 3, en donde el anfígeno blanco es una proteina soluble.
35.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-33, en donde el antigeno blanco se expresa en la superficie de una célula, en particular en donde el antigeno blanco es una proteina de transmembrana, en particular una proteina de extensión de múltiples membranas.
36.- El método de la reivindicación 35, en donde el antigeno blanco se tiñe indirectamente por tincan de la célula que expresa el antigeno blanco con un colorante fluorescente intracelular .
37.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-36, en donde las células B se tiñen con uno o más anticuerpo marcados siendo específicos para los marcadores de superficie de células B.
38. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-37, en donde las células B se tiñen con anticuerpos anti-IgG macados.
39. - El método de la reivindicación 38, en donde las células B se tiñen con anticuerpos anti-IgG marcados con anticuerpos anti-IgM marcados diferencialmente .
40. - El método de la reivindicación 39, en donde las células B que se tiñen con anticuerpos anti-IgM marcados se seleccionan negativamente
41. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 31-40, que comprenden además el paso de cultivar las células B seleccionadas en el paso b) de la reivindicación 31, de manera que los anticuerpos generados se secretan en el medio de cultivo, en particular en presencia de una línea celular auxiliar.
42. - El método de cualquiera de las reivindicación 41, que comprende además el paso de probar los anticuerpos secretados para unión específica al antígeno blanco.
43. - El método de la reivindicación 42, en donde los CDR de los anticuerpos se amplifican, en particular por medio de RT-PCR e injertado en una estructura de acepto para a producir un inmunoaglutinante que se prueba subsiguientemente para unión específica al antígeno blanco.
44. - Uso de una estructura de aceptor de inmunoaglutinante que comprende una secuencia que tiene una identidad de por lo menos 90% a SEC ID NO. 1 y/o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos 85% a la SEC ID NO: 2 para el injerto de CDR de conejo.
45. - El uso de la reivindicación 44, en donde la estructura comprende SEC ID NO. 1 y SEC ID NO: 2, ambos conectados via un entrelazador que tiene SEC ID No. 8:
46.- Una composición farmacéutica que comprende el inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, formulada para administración tópica, oral, nasal, local, intracerebroespinal, rectal o parenteral.
47.- Un método de tratamiento que comprende administrar a un mamífero que necesita de tratamiento un inmunoaglutinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores por las rutas intremuscular, intraperitoneal, intrecerebroespinal, subcutánea, intraart icular , intrasinovial, intratecal, local, oral, tópica o por inhalación .
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