JP2007525982A - 非メチル化CpGモチーフを含むDNAに特異的に結合するタンパク質を用いて原核生物DNAの濃縮または分離のうち少なくともいずれか一方を行う方法 - Google Patents
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Abstract
Description
従って、臨床上重要な細菌の病原性因子および耐性を染色体レベルおよびプラスミドレベル、すなわち最終的にはDNAレベルで検出することは、多くの感染症や敗血症の診断に大きな利点をもたらす。このことは、そのレベルであれば病原細菌と共生細菌の区別もできるので一層妥当である。
アニル酸‐ジヌクレオチドである。
を、例えば担体に結合させてもよいし、結合するようにしてもよく、そうすることによってDNAの分離および濃縮のうち少なくともいずれか一方が実施可能である。ここで、本発明は、野生型CPGBタンパク質(656アミノ酸からなるCPGbP656)よりも短く、野生型CPGBタンパク質と25〜35%、特に約27.6%の相同性を示すタンパク質が、野生型CPGBタンパク質や80%以上の相同性を有するそのバリアントよりも、原核生物DNAの非メチル化CpGモチーフに対し高い結合性を有するという驚くべき発見に基づくものである。そのような短縮型タンパク質の例は、181アミノ酸のCPGbP181である。
原性細菌による感染症の早期診断が可能となる。逆に言えば、本発明は、患者の体液、特に血液中に細菌またはその切断産物が非生理的に存在している臨床状態について、精製するという意味で微生物DNAを除去するために使用することも可能である。このことは、細菌およびその切断産物、例えば細菌DNAなどが、患者に対して有害な種々の生物学的作用の原因であることが良く実証されていることからみても、一層妥当なことである。
(a)溶液中に存在する少なくとも1つの原核生物DNAを、原核生物DNAに特異的に結合し、野生型のCGPBタンパク質と25%〜35%の相同性を有するタンパク質と接触させることによって、タンパク質‐DNA複合体を形成する工程と、
(b)前記複合体を分離する工程と
からなる。
れた体液(例えば全血、血清または髄液)を、体内に戻すこともできる。この原理は、本発明のタンパク質の特異的結合性を利用した、精製という意味での生理学的液体からの原核生物DNAの除去についても使用することができる。
Aを除去するために検討可能である。さらに、その他の体外的手法、例えば血液潅流、心肺装置またはエンドトキシン吸着器などとの併用はさらに好都合な応用である。
完全長CPGbPタンパク質のDNA配列を用いて、CpGに結合する短縮型タンパク質CPGbP181をコードする短いDNA断片を増幅するプライマー1(GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG(順方向)、配列番号3)およびプライマー2(AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT‐CTGAG(逆方向)、配列番号4)を構築した。該DNA断片を、制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断済みのpQE9ベクター(キアゲン(Qiagen))にライゲーションした。pQE9ベクター内では、6×HisタグをコードするDNA断片が5’末端に融合したオープンリーディングフレーム(pQE9[6HisCPGbP181])が形成される。融合タ
ンパク質6His‐CPGbP181をコードする全アミノ酸配列を本明細書に後述するが、太字で示されている部分はCPGbP181ペプチドを表し、イタリック体で示されている部分はプラスミドpQE9由来の融合された外来アミノ酸を示している。
0.2Mトリス、6M塩酸グアニジン、0.001Mジチオエリスリトール(DTE)、0.02Mイミダゾールの緩衝液(pH7.5)中で、0‐0.5Mイミダゾールのグラジエントにより、Ni‐NTAアガロースからrCPGbP181タンパク質を塩基性物として溶出させる。実施の際には、rCPGbP181は0.2‐0.3Mイミダゾールでカラムから脱離する。こうして得られたタンパク質を、0.2Mトリス、6M尿素、0.001Mジチオエリスリトール(DTE)(pH7.5)に対して透析し、凍結させる。生理学的緩衝液に対して透析すると、精製rCPGbP181が沈殿する。
本方法では、rCPGbP181が結合したNi‐NTAアガロース上で塩酸グアニジンの濃度を6Mから0Mまでのグラジエントにより変化させる。このときのベースは0.2Mトリス、0.15M NaCl、0.001Mジチオエリスリトール(DTE)、0.02Mイミダゾールの緩衝液(pH7.5)とする。この場合、流速は0.5ml/分を選択した。続いて、0.2Mトリス、0.5M NaCl、0.001Mジチオエリスリトール(DTE)の緩衝液(pH7.5)をベースとして0‐0.5Mイミダゾールのグラジエントで溶出させた。この場合も、結合したタンパク質のかなりの比率(20%)が0.2‐0.3Mイミダゾールで溶出した。この天然型rCPGbP181溶出物はPBS中での透析後も上記緩衝液に溶解状態のままであった。しかしながら、これらの条件ではNi‐NTAアガロースに結合したrCPGbP181の約80%がカラムに残り、その後は方法1の変性条件でしか抽出できないことが欠点である。このことは、使用した方法2の収率が、わずか20%の、生理学的緩衝液に可溶な天然型rCPGbP181で
あったことを意味している。
コロニー形成単位で1mlあたり103の化膿連鎖球菌(Streptococcus
pyogenes)を病原体として含む、ヘパリン処理した新鮮なヒト血液を、病原体の検出のために使用した。体液から全DNAを単離するための市販のキットを用いて、製造業者の指示書の変法によりDNA結合マトリクスに吸着させることでDNAを単離した。このために、プロテイナーゼKおよびSDSを含む200μlの全体溶解緩衝液を、エッペンドルフチューブに入った100μlの感染血液に添加する。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、次いで95℃で20分間加熱する。冷却後、20μgのムタノリシンを添加して37℃でさらに60分間インキュベートする。遠心分離後、該混合物を、DNA結合マトリクスを備えた遠心分離カラムに供し、製造業者の指示書に従ってDNAを精製する。精製されたDNAは、最終容量100μlの0.01Mトリス緩衝液(pH7.5)、または等容量の製造業者提供の溶出用緩衝液に含める。病原体の検出用に、ストレプトリシンO遺伝子(slo)を特定するためのプライマーを選択した。
前方向プライマー1:5’‐AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG
逆方向プライマー2:5’‐GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT
プライマー濃度 1mg/ml
出発材料:5μl 単離DNA
0.5μl 前方向プライマー1
0.5μl 逆方向プライマー2
14μl 蒸留水
Ready to go(商標)キット(アマシャム・ファルマシア)で総量25μl
反応:
95℃で5分間
40サイクル(95℃で30秒、51℃で30秒、72℃で3分、72℃で7分を1回)。
結果:最初の一次PCRでは陽性反応は得られていない。従って、続いて第2のPCR(ネスティドPCR)を実施した。
前方向プライマー3:5’‐CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT
逆方向プライマー4:5’‐CTGAAGGTAGCATTAGTCTTTGATAACG
プライマー濃度 1mg/ml
出発材料:PCR1(図1の試料1)から5μl
0.5μl 前方向プライマー1
0.5μl 逆方向プライマー2
14μl 蒸留水
Ready to go(商標)キット(アマシャム・ファルマシア)で総量25μl
反応:
95℃で5分間
40サイクル(95℃で30秒、54℃で30秒、72℃で3分、72℃で7分を1回)。
結果:ネスティドPCRでは、血液100μlあたり連鎖球菌の細胞100個の濃度で所望のsloDNA断片が増幅された(試料1)。1回目のPCR(図3)における出発材料5μlについては、鋳型約5〜10個に相当する。1:10希釈の場合(試料2)、感度が限界となっている(鋳型0.5〜1個)。
ゲル遅延度アッセイで、変性型および天然型rCPGbP181タンパク質の、メチル化および非メチル化状態のCpGモチーフ含有DNA分子に対する結合について調べた。大腸菌プラスミドpUC18に溶血性C群連鎖球菌(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)のMタンパク質遺伝子部分を挿入して試験DNAとして使用した(ガイヤー(Geyer)ら、FEMS Immuno.Med.Microbiol.第26巻、p.11−24、1999年)。プラスミド調製物を分け、半分をニュー・イングランド・バイオラボ(New England BioLabs)のCpGメチラーゼキットでメチル化した。調製物をいずれもrCPGbP181(天然型または変性型)と混合し、アガロースゲルで電気泳動により分離した。結果を図5および図6に示す。rCPGbP181の天然型および変性型のいずれも非メチル化状態のプラスミドDNAに高い親和性を示し、このことから非メチル化状態のCpGに富むDNAに対する選択的結合性が確認される。
精製CPGbP181を、キャンビアッソ(Cambiasso)らのプロトコール(キャンビアッソ、シー(Cambiasso、C)ら、Immunochemistry
第12巻、p.273−278、1975年)に従ってグルタルアルデヒドを用いてアミノヘキシルセファロース(アマシャム・バイオサイエンシズ(Amersham−Biosciences))に連結させた。固定化タンパク質の濃度はセファロース1mlあたり0.3mgとした。300μlのセファロースを、DNAもタンパク質も吸着しないがセファロースを担持するガラス材料を含んだ遠心ろ過チューブに入れた。
結合性について調べるために、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)およびヒトDNAのDNA混合物から、CNBrセファロースに直接連結させたCPGbP181タンパク質、またはジアミノヘキシル・スペーサー(AH)を介してセファロース(以下のAHセファロース)に間接的に連結させたCPGbP181タンパク質を用いて、原核生物DNAを濃縮した。
.24mgのCPGbP181タンパク質を該マトリクス上に載置した。室温で2時間インキュベートすることによりCPGbP181タンパク質をAHセファロースに結合させた。過剰なCPGbP181タンパク質を取り除いた。
DNA混合物を、各々330ngのヒトDNAと150ngの原核生物DNA(黄色ブドウ球菌DNA)とから構成されるものとした。このDNA混合物を、CNBrセファロースまたはAHセファロースで作製されたカラムにそれぞれ載置し、室温で1分間インキュベートした。次いで、カラムを遠心分離して100μlのトリス緩衝液(10μM、pH7)で洗浄した。この洗浄および遠心分離の工程を5回繰り返した。
Claims (25)
- 原核生物DNAの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、
(a)溶液中に存在する少なくとも1つの原核生物DNAを、原核生物DNAに特異的に結合し、野生型のCGPBタンパク質と25%〜35%の相同性を有するタンパク質と接触させることによって、タンパク質‐DNA複合体を形成する工程と、
(b)前記複合体を分離する工程と
からなる方法。 - 前記タンパク質が配列番号2のアミノ酸配列を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質が非メチル化CpGモチーフを認識可能であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記分離工程の後に複合体のタンパク質からDNAを分離する工程が続くことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が担体に結合していることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が担体に直接結合していることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質が同タンパク質に対する抗体を介して担体に結合していることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質がスペーサーを介して担体に結合していることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- スペーサーとしてジアミノヘキサン残基が使用されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 担体が、マトリクス、微小粒子、またはメンブレンとして提供される、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- マトリクスとしてセファロースが用いられる、請求項10に記載の方法。
- 分離工程が前記タンパク質に対する抗体または抗血清を用いて実施される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 分離が電気泳動によって実施される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が非メチル化CpGモチーフに対する抗体または抗血清である、請求項6〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液が真核生物DNAおよび原核生物DNAの混合物を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 原核生物DNAは細菌DNAである、請求項15に記載の方法。
- 溶液が体液または体液に由来する溶液であり、特に全血、血清、血漿、全血からの細胞
調製物、尿、髄液、胸膜液、心嚢液、腹膜液、滑液ならびに気管支肺洗浄物である、請求項15または16に記載の方法。 - 分離工程が前記DNA‐タンパク質複合体をろ過するフィルタを用いて実施される、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質がフィルタのマトリクスに固定化されている、請求項18に記載の方法。
- 環境技術、水管理および廃水管理ならびに空調技術において使用するための請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)の後で工程(c)において原核生物DNAが増幅される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- (a)タンパク質‐DNA複合体から原核生物DNAを単離する工程と、
(b)該二本鎖DNAを変性させる工程と、
(c)個々のDNA鎖を相補的プライマーとハイブリダイズさせる工程と、
(d)ポリメラーゼ反応により二本鎖の断片を生成させる工程と、
(e)上記工程を所望の程度に増幅されるまで繰り返す工程と
からなる請求項21に記載の方法。 - (a)単離した原核生物DNA配列をベクターにクローニングする工程と、
(b)上記ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する工程と、
(c)上記形質転換細胞を培養する工程と、
(d)上記細胞からベクターを単離する工程と、
(e)DNAを単離する工程と
からなる請求項22に記載の方法。 - 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法を用いて原核生物DNAの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行うためのキット。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法を用いて、1組または数組の特異的プライマーを使用して原核生物DNAを検出するための試験キット。
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