CN115927244A - 一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法 - Google Patents
一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927244A CN115927244A CN202211160359.6A CN202211160359A CN115927244A CN 115927244 A CN115927244 A CN 115927244A CN 202211160359 A CN202211160359 A CN 202211160359A CN 115927244 A CN115927244 A CN 115927244A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- seq
- buffer
- library
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于微流控技术的单细胞ChIP‑seq文库的构建方法。所述构建方法使用本发明所述的Tn5突变体、本发明所述的融合蛋白、本发明所述的接头组合或本发明所述的试剂盒来构建单细胞ChIP‑seq文库。本发明的文库构建方法中,所有的单细胞收集在一个管中进行一管操作,操作简便,减轻体力劳动,缩短了文库制备的时间;且微流控技术降低了单细胞获取的难度,可以轻易实现高通量;此外,本发明提升了ProteinX‑Tn5的比活性,细胞污染率可低至2%以下;通过微流控技术和ChIP‑seq技术的结合,采用原管建库,保证了DNA片段的捕获率。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法。
背景技术
细胞群体中不同细胞间的异质性在疾病的发展和进展中起着重要作用,但目前大多数传统的基因分析方法掩盖了单个细胞的差异。单细胞测序可以展示单个细胞的内在异质性,并揭示复杂和稀有的细胞群。近十年来,针对单细胞研究出现了不同的微流控技术,成为领域前沿。单细胞测序技术主要过程包括:单细胞分离、单细胞裂解、核酸扩增、高通量测序、数据处理和数据分析。
目前,单细胞测序技术已经非常成熟,已经可以实现大规模的转录组,甲基化组,染色质可接近性(ATAC)等的高通量测序。然而这些领域所研究的要么是生物个体已经产生的生命现象,要么是粗范围、浅层次的基因调控。如何精确的预测和解释细胞的命运决定、疾病的发生及细胞的衰老等生物学过程,我们需要用到染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)技术。ChIP也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。ChIP可用来研究某种特殊的蛋白与DNA相互作用或全基因组范围内组蛋白的变化情况。首先通过ChIP特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。因此,ChIP可以解释为什么基因的表达会出现差异,产生差异的上游调控机制是如何产生的。目前,实现单细胞分辨率的方式有三种,基于微孔板技术、基于组合标签策略和基于液滴技术。
微孔板技术:采用内孔直径为微米级孔板,微孔板直径与细胞直径接近,在细胞流动过程中,恰好细胞可以落入内孔当中,通过物理大小的方式达到区分单细胞的目的。
组合标签技术:借用“split and pool”的思想,在多轮混合和分散的过程中分别引入不同的标签,以达到区分单细胞的目的。
液滴技术:基于微流控的液滴产生,单个液滴中包含一个细胞和一个微球,利用引物功能化的微球来靶向捕获RNA或DNA。因此,可以通过微流控液滴技术来绘制整个组织中细胞的多组学图谱。
将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
但目前的ChIP-Seq技术还存在以下不足:
1、标签化的Tn5(例如ProteinA-Tn5)的比活性需进一步提升。
2、基于微孔版和组合标签策略的最大劣势是工序异常繁琐,需要繁重的体力劳动(需要排枪(移液器)重复的洗吹,属于体力劳动),这些劣势限制了两者的大规模应用。
3、单细胞ChIP-seq的方法还没有被大规模普及,主要原因是建库的简便程度和DNA的富集程度不足。
因此,目前急需一种新的ChIP-Seq文库构建方法。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法。本发明的文库构建方法中,所有的单细胞收集在一个管中进行一管操作,操作简便,减轻体力劳动,缩短了文库制备的时间;且本发明微流控降低单细胞获取的难度,可以轻易实现高通量;此外,本发明的细胞污染率可低至2%以下;本发明是微流控技术和ChIP-seq技术的结合,采用原管建库,保证DNA片段的捕获率;本发明也提升了ProteinX-Tn5的比活性。
本发明第一方面提供了一种Tn5突变体,所述Tn5突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明所述的Tn5指的是Tn5转座酶。
本发明第二方面提供了一种融合蛋白,其包含如本发明第一方面所述Tn5突变体,所述融合蛋白的结构为ProteinX-linker1-Tn5突变体。
较佳地,所述linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,和/或,所述protein X包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
更佳地,所述protein X还包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某一较佳实施方案中,所述SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4之间由linker2连接,所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在某一较佳实施方案中,所述融合蛋白的N端还含有6个组氨酸,即融合蛋白结构为His6-ProteinX-linker1-Tn5。
本发明第三方面提供一种用于转座酶组装的接头组合,所述接头组合包括:如SEQID NO:6所示的ME-A、如SEQ ID NO:7所示的ME-B以及如SEQ ID NO:8所示的ME-reverse。
较佳地,所述转座酶为本发明第二方面所述的融合蛋白。
本发明第四方面提供一种用于测序文库构建的试剂盒,所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的Tn5突变体或如本发明第一方面所述的融合蛋白,和/或,所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的接头组合。
优选地,所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:
(1)组装buffer:50mM HEPES pH7.2,100mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.1%Triton X-100,60%甘油,溶剂为水;
(2)Buffer 1:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1×cocktail,2mM EDTA,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate;
(3)Buffer 2:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1×cocktail,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate;
(4)裂解液:10mM Tris-HCl pH 8.5,0.05%SDS和0.1mg/ml Proteinase K;
(5)酶反应液:2×KAPAmaster mix;
(6)Buffer 3:10mM TAPS-NaOH、pH 8.3,10mM MgCl2;
(7)P5和P7扩增引物,或含有index标签的P5和P7扩增引物。
(8)Triton X-100、EDTA、BSA、H3K27ac抗体、蛋白酶K、dNTP、DNA聚合酶、微球、XP磁珠和微流控芯片中的一种或多种。
较佳地,所述P5和P7扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示,含有index标签的P5和P7扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;
本发明第五方面提供一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法,其使用如本发明第一方面所述的Tn5突变体或如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的接头组合,和/或,如本发明第四方面所述的试剂盒来构建单细胞ChIP-seq文库。
在某一较佳实施方案中,所述制备方法包括以下步骤:
I.制备含单细胞的液滴:
(1)制备细胞相:
i)将如本发明第二方面所述的融合蛋白与如本发明第三方面所述的接头组合混合,使得所述融合蛋白组装上接头;
ii)将抗DNA结合蛋白的抗体和组装上接头的融合蛋白混合,获得混合物;
iii)将所述混合物与单细胞混合并孵育后,依次使用Buffer 3和EDTA处理;
(2)制备反应相:DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和dNTP;
(3)制备含有barcode序列的微球;
(4)将步骤(1)获得的细胞相、(2)获得的反应相、(3)获得的微球与液滴生成油共同加入微流控芯片中,运行获得单细胞微滴;
II.ChIP-seq文库制备:
i)将上述步骤(4)获得的单细胞微滴进行扩增反应,
ii)随后破坏所述单细胞微滴获得水相中的目标DNA,去除微球颗粒;
iii)加入含有index标签的P5和P7扩增引物,进行文库扩增。
较佳地,步骤I中满足以下条件中一项或多项:
i)中所述融合蛋白与所述接头组合的摩尔比为(0.8~1.2):1,例如1:1;
ii)中所述抗体为H3K27ac抗体或control IgG(或其他抗体,包括针对其他组蛋白修饰,DNA结合蛋白,转录因子的抗体等);优选溶剂为buffer 1;
ii)中所述抗体与所述组装上接头的融合蛋白的比例为1:(20~30)μg/μM,例如1:25μg/μM;
ii)中还包括将所述混合物孵育的步骤,例如4℃孵育4~12h;
iii)中所述混合物中抗体与单细胞的比例为1μg:(0.8~1.2)×105cell,例如1μg:1×105cell;
所述DNA聚合酶为Q5 DNA聚合酶;
所述细胞相中的细胞总数为20-30k。
较佳地,步骤II中,i)中所述扩增反应前还包括紫外线处理所述单细胞微滴的步骤。
较佳地,步骤II中,使用回收试剂例如1%PFO破坏所述单细胞微滴。
较佳地,步骤II中,在所述文库扩增后进一步还包括纯化目标DNA的步骤。
例如,使用0.5*XP磁珠进行纯化。
在某一较佳实施方案中,步骤I中,(1)中iii)的处理步骤为:
1)将所述混合物与单细胞混合后,低温孵育2-4小时;
2)低温下300g离心例如3min,用buffer 2清洗两次;
3)加入Buffer 3低温处理1~2h后,加入等体积EDTA,低温下放置例如10min;
4)低温下300g离心例如3min,用buffer 2重悬,并加入1×DAPI染色。
较佳地,所述低温为0~10℃,例如4℃
本发明的构建方法中,较佳地,所述单细胞分离自未经交联或固定培养的细胞系或组织细胞,或者,经交联或固定培养的细胞系或组织细胞。
更佳地,所述未经交联或固定培养的细胞系或组织细胞为新鲜组织样本,经交联或固定的细胞系或组织细胞为甲醛固定的细胞系或组织细胞。
进一步更佳地,当所述单细胞分离自甲醛固定的细胞系或组织细胞时,去除微球颗粒后还包括加入蛋白酶K处理的步骤。
本发明第六方面还提供一种样品的测序方法,其使用通过如本发明第五方面所述的构建方法获得的单细胞ChIP-seq文库进行测序。
本发明第七方面还提供如本发明第一方面所述的Tn5突变体、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的接头组合或如本发明第四方面所述试剂盒在基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建中的应用。
本发明所述cocktail指的是蛋白酶抑制剂。
本发明所述的ME指的是Mosaic End镶嵌端。
本发明所述的PFO指的是1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(1H,1H,2H,2H-perfluorooctanol)。
本发明使用的微球可为本领域常规,例如为具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球(参考专利PCT/CN2021/129694),或为单细胞测序的具有寡核苷酸序列的双层微球(参考专利PCT/CN2021/12970)。
本发明所述的barcode序列可为本领域常规的barcode的序列。
本发明使用的微流控芯片可为本领域常规。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明的文库构建方法中,所有的单细胞收集在一个管中进行一管操作,操作简便,减轻体力劳动,缩短了文库制备的时间;且本发明微流控降低单细胞获取的难度,可以轻易实现高通量;此外,本发明的细胞污染率可低至2%以下;本发明是微流控技术和ChIP-seq技术的结合,采用原管建库,保证DNA片段的捕获率;本发明也提升了ProteinX-Tn5的比活性。
附图说明
图1为单细胞ChIP-seq的原理图,分为四个部分:细胞预处理,液滴封装,模板扩增,文库制备。
图2为PXTn5(即ProteinX-Tn5融合蛋白)的纯化结果:以BSA标准品作为参照。
图3为PXTn5的活性检测结果。
图4为PXTn5接头变换的结果。
图5为双物种污染率评估图:一个点或者一个三角代表一个细胞,总细胞数为529个,其中黑点(纵坐标附近的点)代表3T3细胞,灰点(横坐标附近的点)代表HEK293T细胞,三角代表污染的双物种细胞。
图6活细胞与甲醛固定细胞的ChIP-seq(H3K27ac)结果比较:将每个样品的所有单细胞分别混合进行分析。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
本发明涉及一种单细胞ChIP-seq文库的制备方法,该方法整合了DNA定点突变,基因工程,蛋白质工程,微流控技术和ChIP技术。单细胞ChIP-seq的原理图如图1。首先,通过微流控实现单细胞水平的分辨率,然后通过抗体识别目标位点,进一步利用突变的高活性ProteinA-Tn5融合蛋白(简称PXTn5)切割目标位点,最后通过PCR富集目标位点的DNA信息。具体细节见以下实施例。
以下实施例中使用的试剂如下:
组装buffer:50mM HEPES pH7.2,100mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.1%TritonX-100,60%甘油,溶剂为超纯水。
Buffer 1:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1X cocktail,2mM EDTA,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate。
Buffer 2:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1X cocktail,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate。
裂解液:10mM Tris-HCl pH 8.5,0.05%SDS和0.1mg/ml Proteinase K。
酶反应液:2×KAPA master mix。
Buffer 3:10mM TAPS-NaOH、pH 8.3,10mM MgCl2。
实施例1
1.通过DNA定点突变技术获取PXTn5融合蛋白的表达基因。
传统的Tn5转座酶的产率受到一定限制,主要由于目标基因的结构决定的。在Tn5的编码基因内部具有两个翻译起始的位点,分别居于第一位和第56位的Met,这两个位点的氨基酸翻译起始具有一定的随机性。然而,截短编码的肽链不仅不具有催化活性,还会充当抑制剂。其与全长的肽链结合后会形成异源二聚体,这种形式会阻碍全长的Tn5蛋白发挥催化活性。因此本发明利针对Tn5的编码基因做了定点突变,除了在野生型序列上发生M56L突变以外,本发明的Tn5转座酶还包括P214R/G251R/A338V突变。
Tn5原基因序列(SEQ ID NO:13)经以下位点(下划线)的突变形成Tn5突变后基因序列(SEQ ID NO:14),其编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13:
SEQ ID NO:14:
Protein A的序列优化为Protein X的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:28),具体碱基序列(SEQ ID NO:15)如下:
其中,下划线部分为原protein A(氨基酸序列为SEQ ID NO:3),斜体加下划线部分为protein G(氨基酸序列为SEQ ID NO:4),加粗部分(无下划线)为linker2(氨基酸序列为GGSGGSGGSTT(SEQ ID NO:5))
突变后的Tn5与优化后的Protein X通过His6-ProteinX-linker1-Tn5结构形成PXTn5融合蛋白,其中linker1对应的氨基酸序列为GGSGGSGGS(SEQ ID NO:2),His6对应的氨基酸序列为HHHHHH。
1)设计了12条克隆用的引物:PX-1和PX-2用于Protein X基因的克隆,MUT1~4-A和MUT1~4-B用于Tn5定点突变,Tn5-F和Tn5-R用于Tn5基因的克隆。
PX-1:5’-TGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCaccatgattacgccaagcttaa(SEQ ID NO:16);
PX-2:5’-ggctggcgtcaactcagacg(SEQ ID NO:17);
Tn5-F:5’-cgtctgagttgacgccagccggaggatccggaggatccattaccagtgcactgcatcg(SEQ ID NO:18);
MUT1-A:5’-gccttcctgcagggctttgctgccttcgctgc(SEQ ID NO:19);
MUT1-B:5’-gcaaagccctgcaggaaggcgcgtatcgttttattc(SEQ ID NO:20);
MUT2-A:5’-ctttacgacgatgacggctacgcaccacaaaacgttcg(SEQ ID NO:21);
MUT2-B:5’-cgtagccgtcatcgtcgtaaagatgtggaaagcggcctg(SEQ ID NO:22);
MUT3-A:5‘tttacgtttacgacgtttatccaccacgcctt(SEQ ID NO:23);
MUT3-B:5’-ataaacgtcgtaaacgtaaaaaccgtccggcgcg(SEQ ID NO:24);
MUT4-A:5’-ctgacgttccacacccgcacccgttttccacgctt(SEQ ID NO:25);
MUT4-B:5’-gtgcgggtgtggaacgtcagcgtatggaagaacc(SEQ ID NO:26);
Tn5-R:5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTtcagattttaatgccctgcgcc(SEQ ID NO:27)。
表达载体PET28a通过限制性内切酶BamH I和Hind III酶切。
1)利用多片段重组的方式将突变的目的基因克隆至表达载体中。
2)通过桑格测序(一代测序),确定插入基因是否有突变。
2.PXTn5融合蛋白的表达和活性鉴定。
1)转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。
2)于18℃的环境中进行诱导表达。
3)离心收集菌体。
4)用蛋白纯化buffer(20mM Hepes、pH 7.2、0.8M NaCl、10%甘油、0.2%TritonX-100)重悬菌体,加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roch,Cat No.04693132001)和PMSF(VWR,Cat No.97064-898)。
5)通过超声波破碎的方式破碎菌体,进而通过亲和层析的方式纯化蛋白。
6)用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度(纯度需大于90%),以已知浓度的BSA标准品作为参照,结果如图2所示。
实施例2
3.PXTn5的组装及活性测定
1)组装的接头通过重新设计的,相比现有接头的优势:目前常规的ME的反向互补(ME-reverse)的序列为19bp,本发明缩短至15bp(删除常规ME-reverse的5’端的“ATCT”四个碱基)和9bp(通过删除常规ME-reverse 5’端的“ATACACATCT”十个碱基获得)。
ME-reverse分别与ME-A、ME-B退火,形成称为局部双链的A和B接头,配合使用。
PXTn5组装的接头序列:
ME-reverse:5’-Phos/CTGTCTCTTATACAC-3’(SEQ ID NO:9)。
ME-reverse-9:5’-Phos/CTGTCTCTT-3’。
粗体表示ME的正向序列,为19bp,斜体部分是能与ME-reverse互补的区域,其中斜体加下划线部分是能与ME-reverse-9互补的区域。
2)PXTn5、接头和组装buffer按一定量混合均匀(PXTn5为25μM,接头为25μM,其余用组装buffer补足至50μl)。
3)于25℃条件下,孵育60min。
4)用19bp反向接头组装的PXTn5记为PXTn5-a/b,用15bp反向接头组装的PXTn5记为PXTn5-A/B,用9bp反向接头组装的PXTn5记为PXTn5-9bp。
5)组装好的PXTn5可于-20℃冻存。
实施例3
PXTn5-a/b的活性测定
1)取200ng常规小鼠基因组DNA。
2)加入2μl 5×Tn5反应缓冲液(50mM TAPS-NaOH、pH 8.3,50mM MgCl2),分别加入0.5μl和1μl PXTn5-a/b(不加的作为对照),加水补足至10μl。
3)55℃,反应10min,加入2μl终止buffer(250mM EDTA,0.2%SDS)终止反应,55℃,反应10min。
4)通过2%的琼脂糖凝胶检测,120V,40min。
5)结果显示PXTn5-a/b切割DNA的峰在350bp左右(对照组没有被切割),证明突变后的PXTn5具有高的活性,如图3所示。
PXTn5-A/B的活性测定
1)取200ng常规小鼠基因组DNA。
2)加入2μl 5xTn5反应缓冲液(50mM TAPS-NaOH pH 8.3,50mM MgCl2),分别加入1μl PXTn5-A/B(1μl PXTn5-a/b作为对照),加水补足至10μl。
3)55℃,反应10min,加入2μl终止buffer(250mM EDTA,0.2%SDS)终止反应,55℃,反应10min。
4)通过2%的琼脂糖凝胶检测,120V,40min。
5)结果显示PXTn5-A/B和PXTn5-a/b切割DNA的峰都在350bp左右,证明改变接头反向序列对酶的活性不产生影响,如图4所示。
实施例4
4.ChIP-seq文库制备方法的验证。
为了验证所制备的PXTn5是否具有生物学活性,以及所设计的文库构建方法是否可行,通过少量细胞的ChIP-seq实验进行说明。
A制备抗体和PXTn5的混合物
1)取0.5μg的H3K27ac抗体(abcam,ab4729)或control IgG(abcam,ab172730),并用100μl buffer 1稀释。
2)加入0.3μl,12.5μM的PXTn5(已组装上PXTn5-A/B或PXTn5-a/b),于4℃孵育4小时,或直至过夜。
B细胞准备
a)培养的K562细胞(普诺赛,货号CL-0130)经胰酶消化,常温300g,离心3min,用PBS清洗三次。
b)细胞数目和活率计数。
c)取50k的细胞,用buffer 2(含有0.01%digitonin)将其重悬。
d)将提前制备好的抗体和PXTn5的混合物加入细胞中(50k的细胞中加入12.5μM的PXTn5以及0.5μg摩尔的抗体),并于4℃孵育2-4小时。
e)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2清洗两次。
f)加入10μl Buffer 3(10mM TAPS-NaOH、pH 8.3,10mM MgCl2),37℃,60min。
g)加入等体积40mM EDTA,冰上放置10min。
h)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2重悬,并加入1×DAPI染色。
i)于荧光显微镜下计数,分五千个核到200μl离心管,300g,离心3min,弃掉上清。
j)加入6μl裂解液,55℃裂解2小时,85℃失活蛋白酶K,15min。
k)加入1.5μl还原剂(1.8%Triton X-100),37℃孵育30min
l)加入扩增用的酶反应液和引物(P5:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTTCGTCGGCAGCGTC-3’;P7:5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG-3’),扩增16-18循环。
m)加入0.5×XP磁珠(Beckman,AMPure XP,A63881),弃掉磁珠,保留上清。
n)在上清中再加入0.5×XP磁珠,弃掉上清,保留磁珠,用200μl 80%乙醇清洗两次。
o)目的DNA吸附在磁珠上,最后用水洗脱DNA。
通过Qubit测定文库浓度,结果显示采用PXTn5-A/B的浓度最高,代表使用本发明的PXTn5-A/B增加了文库DNA的富集,如表1所示。
表1文库浓度测定
实施例5
5.基于微流控的单细胞ChIP-seq文库的制备(活体细胞系或组织细胞)。
A制备抗体和PXTn5的混合物
1)取0.5μg的H3K27ac抗体或control IgG(或其他抗体,包括针对其他组蛋白修饰,DNA结合蛋白,转录因子的抗体等),并用100μl buffer 1稀释。
2)加入0.3μl,12.5μM的PXTn5(已组装上接头),于4℃孵育4小时,或直至过夜。
B细胞准备
a)获得K562(普诺赛,货号CL-0130),HEK293T和3T3单细胞悬液(本领域常规),常温300g,离心3min,用PBS清洗三次。
b)细胞数目和活率计数。
c)以下试验分两组进行:一组取100k的活体细胞K562细胞,另外一组取50k的活体细胞HEK293T和50k的活体细胞3T3细胞混合,用buffer 2(含有0.01%digitonin,若组织细胞,则应含有0.05%Triton X-100)将其重悬。
d)将提前制备好的抗体和PXTn5的混合物加入细胞中,并于4℃孵育2-4小时。
e)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2清洗两次。
f)加入10μl Buffer 3,37℃,60min。
g)加入等体积40mM EDTA,冰上放置10min。
h)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2重悬,并加入1×DAPI染色。
i)于荧光显微镜下计数。
C液滴制备
1)配置细胞相:用PBS悬浮细胞,加入0.1%BSA(SIGMA,货号:A1933-25G),细胞总数为20-30k。
2)配置反应相:加入Q5 DNA聚合酶(NEB,货号:M0491L),DNA聚合酶缓冲液(NEB,B9027S)和dNTP(Thermofisher,货号:R0192)。
3)制备微球:含有barcode序列。
4)将1),2),3)和液滴生成油(bioRad,货号:1863005)加入芯片中。
5)开始运行,形成含单细胞微滴。
D文库制备
6)微滴经紫外线处理5min后,将其分到200μl离心管中,进行扩增反应。
7)加入回收试剂(1%PFO,Sigma-370533)以破坏液滴,获得水相,DNA在水相中。
8)过滤,去掉微球颗粒。
9)加入含有index标签的P5和P7扩增引物(P5:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT[8nt i5 index]TCGTCGGCAGCGTC;P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[8nt i7 index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC,Q5 DNA聚合酶,dNTP,以进行文库扩增,扩增12-13循环。
j)待扩增完成后,加入0.5×XP磁珠,弃掉磁珠,保留上清。
k)在上清中再加入0.5×XP磁珠,弃掉上清,保留磁珠,用200μl 80%乙醇清洗两次。
l)目的DNA吸附在磁珠上,最后用水洗脱DNA,送二代测序。
m)HEK293T和3T3双物种实验的结果分析表明,本发明的单细胞区分精度高,污染率仅为1.13%,如图5所示。
实施例6
6.基于微流控的单细胞ChIP-seq文库的制备(甲醛固定的细胞系或组织细胞)。
A制备抗体和PXTn5的混合物
3)取0.5μg的H3K27ac抗体或control IgG(或其他抗体,包括针对其他组蛋白修饰,DNA结合蛋白,转录因子的抗体等),并用100μl buffer 1稀释。
4)加入0.3μl,12.5μM的PXTn5(已组装上接头),于4℃孵育4小时,或直至过夜。
B细胞准备
a)获得K562细胞的单细胞悬液,常温300g,离心3min,用PBS清洗三次。
b)细胞数目和活率计数。
c)取100k的甲醛固定的K562细胞,用buffer 2(含有0.01%digitonin,若组织细胞,则应含有0.05%Triton X-100)将其重悬。
d)将提前制备好的抗体和PXTn5的混合物加入细胞中,并于4℃孵育2-4小时。
e)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2清洗两次。
f)加入10μl Buffer 3,37℃,60min。
g)加入等体积40mM EDTA,冰上放置10min。
h)4℃,300g,离心3min,用200μl buffer 2重悬,并加入1×DAPI染色。
i)于荧光显微镜下计数。
C液滴制备
1)配置细胞相:用PBS悬浮细胞,加入0.1%BSA(SIGMA,货号:A1933-25G),细胞总数为20-30k。
2)配置反应相:加入Q5 DNA聚合酶(NEB,货号:M0491L),DNA聚合酶缓冲液(NEB,B9027S)和dNTP(Thermofisher,货号:R0192)。
3)制备微球:含有barcode序列。
4)将1),2),3)和液滴生成油(bioRad,货号:1863005)加入芯片中。
5)开始运行,形成含单细胞微滴。
D文库制备
1)微滴经紫外线处理5min后,将其分到200μl离心管中,进行扩增反应。
2)加入回收试剂(1%PFO,Sigma,370533)以破坏液滴,获得水相,DNA在水相中。
3)过滤,去掉微球颗粒。
4)加入蛋白酶K,55℃处理30min,85℃失活15min。
5)加入含有index标签的P5和P7扩增引物(P5:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT[8nt i5 index]TCGTCGGCAGCGTC-3’;P7:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[8nt i7 index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC3’),Q5 DNA聚合酶,dNTP,以进行文库扩增,扩增12-13循环。
6)待扩增完成后,加入0.5×XP磁珠,弃掉磁珠,保留上清。
7)在上清中再加入0.5×XP磁珠,弃掉上清,保留磁珠,用200μl 80%乙醇清洗两次。
8)目的DNA吸附在磁珠上,最后用水洗脱DNA,送二代测序。
9)结果如图6所示,其中“活体”代表实施例5中使用活体K562细胞进行文库扩增的结果,“固定”代表本实施例中使用甲醛固定K562细胞进行文库扩增的结果,结果表明本发明的建库流程合格,活体细胞和甲醛固定的细胞结果相似,两种处理方式都可以进行单细胞的ChIP-seq实验,且相较ENCODE(H3K27ac ChIP-seq)的数据,本发明文库构建方法的捕获深度更大。
Claims (11)
1.一种Tn5突变体,其特征在于,所述Tn5突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含如权利要求1所述的Tn5突变体,且其结构为ProteinX-linker1-Tn5突变体;
较佳地,所述linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,和/或,所述protein X包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;
更佳地,所述protein X还包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,优选SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4之间由linker2连接,所述linker2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.一种用于转座酶组装的接头组合,其特征在于,所述接头组合包括:如SEQ ID NO:6所示的ME-A、如SEQ ID NO:7所示的ME-B以及如SEQ ID NO:8所示的ME-reverse;较佳地,所述转座酶为如权利要求2所述的融合蛋白。
4.一种用于测序文库构建的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求1所述的Tn5突变体或如权利要求2所述的融合蛋白,和/或,所述试剂盒包括如权利要求3所述的接头组合;
优选地,所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:
(1)组装buffer:50mM HEPES pH7.2,100mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.1%TritonX-100,60%甘油,溶剂为水;
(2)Buffer 1:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1×cocktail,2mMEDTA,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate;
(3)Buffer 2:20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,0.5mM Spermidine,1×cocktail,0.01%Digitonin和10mM sodium butyrate;
(4)裂解液:10mM Tris-HCl pH 8.5,0.05%SDS和0.1mg/ml Proteinase K;
(5)酶反应液:2×KAPA master mix;
(6)Buffer 3:10mM TAPS-NaOH、pH 8.3,10mM MgCl2;
(7)P5和P7扩增引物,或含有index标签的P5和P7扩增引物;较佳地,P5和P7扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示,含有index标签的P5和P7扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;
(8)Triton X-100、EDTA、BSA、H3K27ac抗体、蛋白酶K、dNTP、DNA聚合酶、微球、XP磁珠和微流控芯片中的一种或多种。
5.一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法,其特征在于,其使用如权利要求1所述的Tn5突变体或如权利要求2所述的融合蛋白,如权利要求3所述的接头组合,和/或,如权利要求4所述的试剂盒来构建单细胞ChIP-seq文库。
6.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,其包括以下步骤:
I.制备细胞液滴:
(1)制备细胞相:
i)将如权利要求2所述的融合蛋白与如权利要求3所述的接头组合混合,使得所述融合蛋白组装上接头;
ii)将抗DNA结合蛋白的抗体和组装上接头的融合蛋白混合,获得混合物;
iii)将所述混合物与单细胞混合并孵育后,依次使用Buffer 3和EDTA处理;
(2)制备反应相:DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和dNTP;
(3)制备含有barcode序列的微球;
(4)将步骤(1)获得的细胞相、步骤(2)获得的反应相、步骤(3)获得的微球与液滴生成油共同加入微流控芯片中,运行获得单细胞微滴;
II.ChIP-seq文库制备:
i)将上述步骤(4)获得的单细胞微滴进行扩增反应,
ii)随后破坏所述单细胞微滴获得水相中的目标DNA,去除微球颗粒;
iii)加入含有index标签的P5和P7扩增引物,进行文库扩增。
7.如权利要求6所述的构建方法,其特征在于,其满足以下条件中的一项或多项:
步骤I中,i)中所述融合蛋白与所述接头组合的摩尔比为(0.8~1.2):1,例如1:1;
步骤I中,ii)中所述抗体为H3K27ac抗体;优选溶剂为Buffer 1;
步骤I中,ii)中所述抗体与所述组装上接头的融合蛋白的比例为1:(20~30)μg/μM,例如1:25μg/μM;
步骤I中,ii)中还包括将所述混合物孵育的步骤,例如4℃孵育4~12h;
步骤I中,iii)中所述混合物中抗体与单细胞的比例为1μg:(0.8~1.2)×105cell,例如1μg:1×105cell;
步骤I中,所述DNA聚合酶为Q5 DNA聚合酶;
步骤I中,所述细胞相中的细胞总数为20-30k;
步骤II中,i)中所述扩增反应前还包括紫外线处理所述单细胞微滴的步骤;
步骤II中,使用回收试剂例如1%PFO破坏所述单细胞微滴;
步骤II中,所述文库扩增后进一步还包括纯化步骤;例如使用0.5*XP磁珠进行纯化。
8.如权利要求5~7任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤I的(1)中,iii)包括以下处理步骤:
1)将所述混合物与单细胞混合后,低温孵育2-4小时;
2)低温下300g离心例如3min,用Buffer 2清洗例如两次;
3)加入Buffer 3低温处理例如1~2h后,加入等体积EDTA,低温下放置例如10min;
4)低温下300g离心例如3min,用buffer 2重悬,并加入1×DAPI染色;
较佳地,所述低温为0~10℃,例如4℃。
9.如权利要求5~8任一项所述的构建方法,其特征在于,所述单细胞分离自未经交联或固定培养的细胞系或组织细胞,或者,经交联或固定培养的细胞系或组织细胞;优选地,所述未经交联或固定培养的细胞系或组织细胞为新鲜组织样本,经交联或固定的细胞系或组织细胞为甲醛固定的细胞系或组织细胞;当所述单细胞分离自甲醛固定的细胞系或组织细胞时,去除微球颗粒后还包括加入蛋白酶K处理的步骤。
10.一种样品的测序方法,其特征在于,其使用如权利要求5~8任一项所述的构建方法获得的单细胞ChIP-seq文库进行测序。
11.如权利要求1所述的Tn5突变体、如权利要求2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的接头组合或如权利要求4所述试剂盒在基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2022105894429 | 2022-05-26 | ||
CN202210589442 | 2022-05-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115927244A true CN115927244A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=86649602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211160359.6A Pending CN115927244A (zh) | 2022-05-26 | 2022-09-22 | 一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115927244A (zh) |
-
2022
- 2022-09-22 CN CN202211160359.6A patent/CN115927244A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9624252B2 (en) | Selective nucleic acid fragment recovery | |
US6617105B1 (en) | Solid-phase nucleic acid isolation | |
CA2652052A1 (en) | Nucleic acid separation and purification method based on reversible charge interactions | |
CN101878304A (zh) | 用于从单个样品中分离基因组dna、rna和蛋白质的方法 | |
JP2003519495A (ja) | 多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法 | |
JP4848358B2 (ja) | 非メチル化CpGモチーフを含むDNAに特異的に結合するタンパク質を用いて原核生物DNAの濃縮または分離のうち少なくともいずれか一方を行う方法 | |
CN102625838A (zh) | 用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒 | |
US20070015169A1 (en) | Isolation of nucleic acid using colored buffers | |
EP3980537A2 (en) | Methods of barcoding nucleic acid for detection and sequencing | |
CN110577979B (zh) | 一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的结构开关型核酸适配体 | |
CN106591285B (zh) | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 | |
CN114507711A (zh) | 一种单细胞转录组测序方法及其应用 | |
CN113528612A (zh) | 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术 | |
CN111500583B (zh) | 特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体及其应用 | |
CN111801428B (zh) | 一种获得单细胞mRNA序列的方法 | |
CN108473983A (zh) | 使用单一洗涤和洗脱缓冲溶液的核酸纯化系统 | |
CN115927244A (zh) | 一种基于微流控技术的单细胞ChIP-seq文库的构建方法 | |
CN113026111A (zh) | 用于构建人单细胞tcr测序文库的试剂盒及其应用 | |
CN113026112A (zh) | 用于构建人单细胞bcr测序文库的试剂盒及其应用 | |
CN111334511B (zh) | 一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白的核酸适配体及其应用 | |
CN113039283B (zh) | 分离和/或富集宿主源核酸和病原核酸的方法和试剂及其制备方法 | |
CN116162690B (zh) | 一管式靶向高通量测序方法 | |
US10132798B2 (en) | Multiplexed microcolumn devices and processes for selection of nucleic acid aptamers | |
CN116813800B (zh) | 一种双链dna结合蛋白-转座酶融合蛋白及文库构建方法 | |
WO2024077439A1 (zh) | 一种单细胞转录组及染色质可及性双组学测序文库构建方法及测序方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |