JP2007517227A - ブドウ球菌(Staphylococcus)の検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ブドウ球菌(Staphylococcus)を検出する方法に関する。
Description
本発明は、ブドウ球菌(Staphylococcus)を検出する方法に関する。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(「S.aureus」)は、小さな皮膚膿瘍および創傷感染などの表在性病変と、心内膜炎、肺炎、および敗血症などの全身性で生命に関わる病状と、ならびに食中毒などの中毒をはじめとする広範な感染症を引き起こす病原体である。
臨床微生物学マニュアル(Manual of Clinical Microbiology)(ASM Press、Washington D.C.、1995年)の288〜289頁によれば、血漿を凝固させる能力が、急性感染に関連した病原性ブドウ球菌、すなわちヒトおよび動物における黄色ブドウ球菌(S.aureus)、および動物におけるS.インターメジウス(S.intermedius)およびS.ヒイカス(S.hyicus)の同定のために、最も広く使用され概して一般に認められた判定基準であり続けている。遊離コアグラーゼのための試験管試験、および結合コアグラーゼまたはクランピング因子のためのスライド試験の少なくとも2つの異なる血漿凝固テストについて述べられている。試験管試験が決定的であるのに対し、スライド試験は黄色ブドウ球菌(S.aureus)を同定するための迅速なスクリーニング試験技術として使用してもよい。双方の試験で多様な血漿タイプを使用してもよいが、エチレンジアミン四酢酸を含有する脱水ウサギ血漿が市販されている。
試験管コアグラーゼ試験は、0.1mlの脳−心臓浸出物ブロスの一晩培養液を0.5mlの水で戻した血漿と混合して、混合物を水浴またはヒートブロック中で37℃で4時間インキュベートし、凝塊形成について試験管を緩慢に傾けることで、試験管を凝塊形成について観察して実施されるとして述べられている。代案としては非阻害性寒天上の大型で良好に単離されたコロニーを0.5mlの水で戻した血漿内に移動させて、上述のようにインキュベートできる。いかなる程度の凝塊も陽性試験と見なされる。しかし綿状または繊維状沈殿物は真の凝塊でなく、陰性結果として記録されるべきである。黄色ブドウ球菌(S.aureus)については、小数の株が凝塊形成のために4時間を超える時間を必要とするかもしれないので、試験の一晩インキュベーションが推奨されている。より長い凝塊時間を要する珍しい黄色ブドウ球菌(S.aureus)株については、アイデンティティを確認するためにその他の特性を試験すべきである。
スライドコアグラーゼ試験は、蒸留水中で培養物の濃い均一の懸濁液を作成し、クランピングを自己凝集反応と混同しないように、混合物を撹拌して均質な組成物にして、1滴の血漿を添加し10秒以内のクランピングについて観察して実施されるとして述べられる。スライド試験は試験管試験よりも迅速で、血漿の節約になる。しかし10〜15%の黄色ブドウ球菌(S.aureus)株は陰性結果を生じるかもしれず、分離株を試験管試験によって再検査することが必要になる。10秒より長い反応時間では擬陽性結果が現れるかもしれないので、スライド試験は迅速に読み取らなくてはならない。スライド試験の代案の方法としては、クランピング因子のための市販の血球凝集−スライド試験、およびクランピング因子とタンパク質Aの双方を検出する市販のラテックス凝集試験が挙げられる。さらに黄色ブドウ球菌(S.aureus)のクランピング因子、タンパク質A、血清型5および8莢膜多糖類を検出するラテックス凝集試験もまた利用できる。試験される生物体が黄色ブドウ球菌(S.aureus)であることが疑われる場合、陰性スライド試験を試験管血漿凝固テストによって確認することが推奨される。
The Journal of Biological Chemistry(第273巻、第21号、13177〜13181頁、1998年5月22日発行)は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)からの5種類の異なるフィブリノーゲン結合性タンパク質について述べる。これらのフィブリノーゲン結合性タンパク質の内3種が精製された。このようなタンパク質の1つが、プロトロンビンにも結合できるタンパク質であるコアグラーゼである。細胞外フィブリノーゲン結合性(Efb)タンパク質と命名された第3のタンパク質は、レベルは異なるが、試験された100%の黄色ブドウ球菌(S.aureus)分離株中に存在することが分かった。さらにCa2+またはZn2+の存在が、Efbとフィブリノーゲンの等モル混合物からのタンパク質沈殿を増強することが報告された。
Analytica Chimica Acta 369(1998年)139〜145頁は、次のように述べる。「直列圧電水晶(SPQC)バイオセンサーを利用して、黄色ブドウ球菌(S.aureus)を生育させたミルクの凝固に基づき細菌数を測定した。薄膜を用いたPQCに基づく方法と比べて、それは早期には培養液の希釈が必要でなく、実験中ずっと振動停止を避けることができるという利点を有した。さらにそれは迅速で、それは応答曲線の低下後に周波数が戻り始める時間である定量的検出のための転換点時間(TT)が容易に判定され、TTと2.4×102〜2.4×105細胞/ml-1の範囲の黄色ブドウ球菌(S.aureus)初期濃度の対数の間には良好な相関があった。」
黄色ブドウ球菌(S.aureus)を検出する方法については技術分野で述べられているが、改善された検出方法には利点があるであろう。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を検出する方法について述べる。
一実施形態では、方法は、試験サンプルを提供するステップと、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質を提供するステップと、試験サンプルを黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質と合わせて少なくとも1つの物理的性質の変化をもたらすステップと、変化を横波型(shear horizontal)弾性表面波バイオセンサーによって検出するステップを含む。
別の実施形態では、方法は、試験サンプル提供するステップと、フィブリノーゲンを提供するステップと、試験サンプルをフィブリノーゲンと合わせるステップであって、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含んでなる試験サンプルは、少なくとも1つの物理的性質の変化をもたらすステップと、変化を機械的音響バイオセンサーによって検出するステップと、を含む。
述べられる全ての実施形態で、試験サンプルは約5×104cfu/ml、約5×103cfu/ml、約1000cfu/ml、約500cfu/ml、およびそれらの間のあらゆる濃度などの比較的低濃度の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含んでいてもよい。さらに検出時間は約150分、約100分、約60分、約30分、およびそれらの間のあらゆる検出時間など、比較的短い。
述べられる全ての実施形態で、少なくとも1つの物理的性質の変化は、好ましくは波位相および/または波の速度の変化をもたらす粘度の変化および/または結合質量の変化である。試験サンプルは、約0.5ml〜約1.5mlの範囲の低容量を含んでいてもよい。機械的音響バイオセンサーは、好ましくはポリイミドおよびポリスチレンなどの導波管を含む。
述べられる全ての実施形態で、試験サンプルおよび黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質は、多様な適切な様式で組み合わせてもよい。一態様では、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質および試験サンプルは、機械的音響バイオセンサーに別々の部分として順不同で提供される。いくつかの実施形態では、試験サンプルおよび黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質を合わせるステップは、固形物形成をもたらす。方法は固形物を分離するステップをさらに含んでいてもよい。
本発明は、試験管およびスライド血漿凝固テストなどの古典的臨床アッセイとは異なり、少なくとも1つの物理的性質変化を検出し、検出可能な変化に応じてシグナルを生じる機械的音響バイオセンサーを用いる。変化に応じたシグナルは、紙片などの実体のある出力部に記録されてもよい。例えば機械的音響バイオセンサーの場合、横波型弾性表面波の波位相および/または速度および/または周波数応答をセンソグラム上で記録して、定量的シグナルを提供してもよい。操作を簡単にするため、機械的音響バイオセンサーは好ましくは定量的出力を閾値シグナルに変換する。機械的音響バイオセンサー装置は、「陽性」または「陰性」試験結果を表示するスクリーン画面(例えば液晶画面)を含んでもよい。
本発明では、検出のために機械的音響手段を用いるバイオセンサーが好ましい。より好ましくは、ここで用いられる機械的音響バイオセンサーは、弾性表面波(SAW)バイオセンサーである。これらの装置では、音波が、圧電基板上の交差指電極(IDT)から弾性表面波またはバルク音波のどちらかとして発生する。第2のIDTは、測定のために音波を元の電気的シグナルに変換してもよい。これは遅延回路と称される。代案としては装置を共振器として操作してもよい。2つのIDT間の空隙は、化学またはバイオ検出用途のための反応性分子を含んでもよいコーティングによって修正できる。
図1に関して述べると、いくつかの実施形態では、IDTの間の機械的音響バイオセンサー表面100は、好ましくは2つの遅延回路を含んでなる。第1のチャンネル、すなわち「活性」チャンネル20は、試験サンプルの受け入れのために提供される。第2のチャンネル、すなわち「基準」チャンネル30は、ベースラインまたは対照として提供される。従って物理的性質における変化は、活性チャンネルと基準チャンネル間の差である。
本発明との関連で使用してもよいものなどの機械的音響センサー(遅延回路装置、共振器などとしての)を駆動およびモニタリングする技術および手段の例は、例えばフライ(Frye)らに付与された米国特許第5,076,094号明細書、マーティン(Martin)らに付与された米国特許第5,117,146号明細書、マーティン(Martin)らに付与された米国特許第5,235、235号明細書、ベイン(Bein)らに付与された米国特許第5,151,110号明細書、セルノセック(Cernosek)らに付与された米国特許第5,763,283号明細書、レンシュラー(Renschler)らに付与された米国特許第5,814,525号明細書、マーティン(Martin)らに付与された米国特許第5,836,203号明細書、およびカサルヌオーボ(Casalnuovo)らに付与された米国特許第6,232,139号明細書などにある。さらに別の例は、例えばブランチ(Branch)らの「36°YX LiTaO3上のラブ波バイオセンサーを使用した炭疽菌(Bacillus anthracis)模造品の低レベル検出(Low−level detection of a Bacillus anthracis simulant using Love−wave biosensors on 36°YX LiTaO3)」Biosensors and Bioelectronics(2003年8月22日受領)、ならびに本願と同日付で出願され(代理人整理第58927W0003号)、2003年12月30日に出願され、PCT出願第_____号を有し、「表面音響波センサーを通じた伝播速度の推定(Estimating Propagation Velocity Through A Surface Acoustic Wave Sensor)」と題された米国特許出願第60/533,177号明細書で述べられる。
圧電ベースのSAWバイオセンサーは、質量または粘度における微小変化を検出するそれらの能力に基づいて典型的に作動する。米国特許第5,814,525号明細書で述べられるように、圧電ベースの機械的音響バイオセンサーのクラスは、それらの質量変化検出の様式次第で弾性表面波(SAW)、音響プレートモード(APM)、または水晶マイクロバランス(QCM)装置にさらに細分できる。
いくつかの実施形態では、機械的音響バイオセンサーは、関心のある黄色ブドウ球菌(S.aureus)生体分子を圧電機械的音響バイオセンサーの表面に付着する反応物質(例えば抗体)を含む。その他の実施形態では、機械的音響バイオセンサーは、液体(例えば水性溶液)中の粘度変化などの物理的変化を検出する。表面波伝播速度は、質量、弾性、粘弾性、伝導率、および誘電率などの変化を検出できる感応性プローブである。したがってこれらの特性のいずれかにおける変化は、弾性表面波に検出可能な変化をもたらす。すなわち物質がSAW装置の表面コーティングに接触、吸収、または別の様式で接着すると、対応する応答が生じる。APMはまた、液体と接する装置でも使用できる。同様にQCM(典型的にATカット水晶)装置上の2つの反対側の電極に印可される交互の電圧は、その共振周波数変化が、コーティング材料中の質量変化に比例する厚み剪断波モードを誘導する。
音波伝播方向(例えば導波管に平行なまたは導波管の平面に垂直な平面)は、機械的音響バイオセンサーがそれから構築される圧電材料の結晶カットによって定まる。大部分の音波が平面を出入りして伝播する(すなわちレイリー波、大部分ラム波)SAWバイオセンサーは、表面に接触する液体からの過度の音響減衰があるため、典型的に液体検出用途では用いられない。
液体サンプル培地では、横波型弾性表面波バイオセンサー(SH−SAW)は、好ましくは波伝播を水平剪断モードに回転できる(すなわちバイオセンサー導波管の平面で)結晶カットおよび配向がある圧電材料から構築され、バイオセンサー表面に接する液体に音響減衰損失の低下をもたらす。水平剪断音波としては、厚み剪断モード(TSM)、音響プレートモード(APM)、表面スキミングバルク波(SSBW)、ラブ波、漏洩音波(LSAW)、およびブルースタイン−グリヤエフ(BG)波が挙げられる。
特にラブ波センサーは、ST水晶のSSBWまたは36°YXLiTaO3の漏洩波などのSH波モードを担持する基質からなる。これらのモードは薄い音響導波層または導波管の適用によってラブ波モードに転換される。これらの波は周波数依存であり、導波管層の剪断波の速度が圧電基板のそれよりも低いという条件で、発生させることができる。SiO2は水晶上の音響導波層として使用されている。ポリメチルメタクリレート、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂(例えば商品名「ノヴァラック(Novalac)」)、ポリイミドおよびポリスチレンなどのその他の熱可塑性架橋ポリマー導波管材料もまた用いられている。
代案としては、QCM装置は液体サンプル媒質と共にも使用できる。
機械的音響手段を用いたバイオセンサーおよびこのようなバイオセンサー構成要素については、既知である。例えば米国特許第5,076,094号明細書、米国特許第5,117,146号明細書、米国特許第5,235,235号明細書、米国特許第5,151,110号明細書、米国特許第5,763,283号明細書、米国特許第5,814,525号明細書、米国特許第5,836,203号明細書、米国特許第6,232,139号明細書を参照されたい。SH−SAW装置は、ニューメキシコのアルバカーキーのサンディア・ナショナル・ラボラトリーズ(Sandia National Laboratories(Albequerque,NM)などの様々な製造業者から得ることができる。特定のSH−SAWバイオセンサーについてはまた、「36°YXLiTaO3上のラブ波バイオセンサーを使用した炭疽菌(Bacillus anthracis)模造品の低レベル検出(Low−level detection of a Bacillus anthracis stimulant using Love−wave biosensors of 36°YXLiTaO3)」Biosensors and Bioelectronics(2003年8月22日受領)でも述べられる。SAWバイオセンサー、ならびに生物学的作用物質を検出する方法については、2003年12月30日に出願され、「生物学的作用物質のための機械的音響検出システムおよび方法(Acousto−mechanical Detection Systems and Methods for Biological Agents)」と題された、米国仮特許出願第60/533169号でも述べられる。
いくつかの実施形態では、機械的音響バイオセンサーは音響導波層のみを含むので、バイオセンサーは実質的に黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えば抗体)を含まない。この実施形態では、バイオセンサーは典型的に粘度中の変化を検出する。その他の実施形態では、センサー表面は黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えば抗体)を含む。この実施形態では、バイオセンサーは、典型的に粘度および/または黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質によって結合された質量の変化を検出する。この実施形態のためには、バイオセンサーは好ましくは固定化層およびつなぎ層を含んでなる。
固定化層は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えば抗体)の表面への結合の目的のために提供される。例示的な固定化層としては、N−アシルサッカリントリクロロシランが挙げられる。本発明のシステムおよび方法に関連して使用してもよいいくつかの固定化技術については、例えば2003年11月14日に出願された米国特許出願第10/713,174号明細書、2004年11月12日に出願された米国特許出願第10/987,522号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,162号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,178号、2004年7月22日に出願された米国特許出願第10/896,392号明細書、2003年11月14日、に出願された米国特許出願第10/714,053号明細書、2004年11月12日に出願された米国特許出願第10/987,075号明細書、「アミン捕獲作用物質としての可溶性ポリマーおよび方法(Soluble Polymers as Amine Capture Agents and Methods)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59995US002号)_____、「多官能性アミン捕獲作用物質(Multifunctional Amine Capture Agents)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59996US002号)_____、および「音響センサーおよび方法(Acoustic Sensors and Methods)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第60209W0003号)PCT出願第_____号で述べられる。
固定化層が導波管層に直接に塗布できない場合、つなぎ層が導波管と固定化層の間に配置されてもよい。N−(11トリクロロシリルウンデセノイル)サッカリンつなぎ層と組み合わせて使用するための例示的なつなぎ層としては、国際特許公開第01/66820 A1号パンフレットで述べられるようなダイヤモンド様ガラス層が挙げられる。ダイヤモンド様ガラスは、炭素と、ケイ素と、水素、酸素、フッ素、イオウ、チタン、または銅を含む非晶質から選択される1つ以上の元素とを含む材料である。いくつかのダイヤモンド様ガラス材料は、プラズマプロセスを使用して、テトラメチレンシラン前駆物質から形成される。疎水性材料が生成され、それを酸素プラズマ中でさらに処理して表面のシラノール濃度が調節できる。例えば金などのその他のつなぎ層を使用してもよい。
ダイヤモンド様ガラスは、薄膜形態または別の層上のコーティングの形態または基質中の材料であることができる。いくつかの用途では、ダイヤモンド様ガラスは、少なくとも30wt%の炭素、少なくとも25wt%のケイ素、および45wt%までの酸素を有する薄膜の形態であることができる。このようなフィルムは、可撓性かつ透明であることができる。いくつかの多層基質中ではダイヤモンド様ガラスはダイヤモンド様炭素層の上に付着される。ダイヤモンド様炭素は、いくつかの実施形態では、多層基質中のポリマー層とダイヤモンド様ガラス層の間の第2のつなぎ層またはプライマー層として機能する。ダイヤモンド様炭素フィルムは、例えばプラズマ反応装置内のアセチレンから調製できる。このようなフィルムを調製するその他の方法は、参照によってここに編入する米国特許第5,888,594号明細書および米国特許第5,948,166号明細書で述べられ、ならびにM.ディビッド(David)ら、AlChE Journal、37(3)、367〜376(1991年3月)の論文中で述べられる。
本発明の方法は、試験サンプルを提供するステップと、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質を提供するステップと、試験サンプルを黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質と混合するステップであって、黄色ブドウ球菌(S.aureus)(すなわち分析物)を含む試験サンプルが、少なくとも1つの物理的性質の変化をもたらすステップと、バイオセンサー(すなわちSH−SAWセンサーなどの機械的音響センサー)で物理的変化を検出するステップと、を含む。
「黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質」とは、試験サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌(S.aureus)と相互作用できる構成物を指す。したがって黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質とは「検出可能な結合試薬」の一タイプであり、すなわち分析物(測定の関心対象)を特異的に認識し、相互作用または結合する作用物質であり、作用物質が結合時に検出を可能にする特性を有する。「特異的に相互作用する」とは、サンプル中に同様に存在するその他の分析物の実質的な除外をもって、結合作用物質が測定を望む分析物と物理的に相互作用することを意味する。本発明に従った有用な検出可能な結合試薬の結合は、結合の測定を可能にする安定性を有する。検出可能な結合試薬は、直接的検出を可能にする固有特性を有することができ、またはそれは検出可能な部分で標識できる。「検出可能な部分」とは、結合試薬の検出を与える特定の方法または方法群によって、結合試薬に付着できる部分を指す。検出可能な部分としては、放射標識(例えば32P、35S、125Iなど)、酵素(例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど)、フルオロフォア(例えばフルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、テキサス・レッド(Texas Red)、Cy3.0、Cy5.0、緑色蛍光タンパク質など)、およびコロイドの金属粒子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の装置をコーティングする適切な方法としては、2003年6月27日に出願された出願人の同時係属出願米国特許出願第10/607698号明細書が挙げられる。
相互作用は、バイオセンサーによって検出可能な少なくとも1つの物理的性質(例えばSH−SAWバイオセンサーの場合は、結合質量および/または粘度)における変化を生じる。好ましい黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質としては、黄色ブドウ球菌(S.aureus)(例えば特異的)抗体、フィブリノーゲン、それらの組み合わせなどが挙げられる。
試験サンプルと黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質は、多様な適切な様式で組み合わせてもよい。一態様では、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えばフィブリノーゲン−含有する溶液)が機械的音響バイオセンサーに提供され、(例えば液体)試験サンプルが別個の部分として、しかし順不同でバイオセンサーに提供される。別の態様では、(例えば液体)試験サンプルおよび黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えばフィブリノーゲン−含有する溶液)が混合物として組み合わされ、混合物が機械的音響バイオセンサーに提供される。その他の実施形態では、黄色ブドウ球菌(S.aureus)が機械的音響バイオセンサー表面に組み込まれるので、バイオ検出装置と一体である。例えば導波管表面をフィブリノーゲン含有溶液で被覆して、任意に乾燥してもよい。代案としては固定化層の手段によって固定化された抗体などの黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体が、機械的音響バイオセンサー表面に存在してもよい。機械的音響バイオセンサー表面は、試験サンプルの注入時間間近または直前に、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質で被覆されてもよいが、操作の速度のためには、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質がバイオセンサーまたはその構成要素の製造中に被覆され、および/または組み込まれることが好ましい。
有利なことに、本発明の方法は感度を改善した。本発明者らは低レベルの黄色ブドウ球菌(S.aureus)を検出した。続く実施例でさらに述べられるように、黄色ブドウ球菌(S.aureus)は、1mLあたり5×104コロニー形成単位(「cfu」)、5×103cfu/ml、および5×102cfu/mlの濃度で検出できる。最小検出レベルは約100cfu/mlであると推測される。したがって当業者は本発明の方法を用いて、約100cfu/mlと約5×102cfu/mlの間のあらゆる濃度(例えば10cfu/ml刻みで記載濃度間のあらゆる特定濃度)の黄色ブドウ球菌(S.aureus)を検出できることを理解する。黄色ブドウ球菌(S.aureus)は、5×107cfu/ml程度までの範囲の高レベルでも検出できる。
代案としては、またはそれに加えて、本発明の方法はまた、有利なことに改善された検出速度をもたらす。ここで用いられる機械的音響バイオセンサー装置は、比較的短時間で黄色ブドウ球菌(S.aureus)を検出できる。例えば黄色ブドウ球菌(S.aureus)は、既述のあらゆる濃度において300分未満(例えば250分、200分、150分、100分)で検出できる。さらに続く実施例で述べられるように、黄色ブドウ球菌(S.aureus)は約30分以下で検出できる。
あらゆる適切な試験サンプルは、機械的音響バイオセンサーのサンプルポート内に注入してもよい。ここでの用法では「試験サンプル」は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)を含有しているかもしれないサンプルを指す。好ましくはサンプルは液体または気体であり、より好ましくは液体である。試験サンプルは、例えば血液、唾液、眼球内流体、関節液、脳脊髄液、膿、汗、浸出液、尿、粘液、痰、大便、催乳ミルクなどの生理学的流体などのあらゆる供給源から誘導されてもよい。さらに試験サンプルは、例えば創傷、皮膚、鼻孔、頭皮,爪などの身体部位から誘導されてもよい。
技術は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)検出のための様々な患者サンプリング技術について述べる。このようなサンプリング技術はまた、本発明の方法でも適切である。患者の鼻孔を拭ってサンプルを得ることは、一般的である。特に好ましいサンプリング技術としては、被験者の(例えば患者の)前側鼻孔を滅菌レーヨンぬぐい棒で拭うことが挙げられる。1本のぬぐい棒が各被験者からのサンプリングに使用され、すなわち1本のぬぐい棒が双方の鼻孔に使用される。サンプリングは、英国イースト・グリンステッドのピューリタン(Puritan(East Grinstead,UK))から商品名「ピュアラップ(Pure−Wraps)」の下に市販されるレーヨンぬぐい棒を乾燥したまま、または適切な溶液であらかじめ湿らせて、被験者の鼻孔前側先端内に挿入し、ぬぐい棒を鼻孔粘膜表面に沿って完全に2回回転させて実施した。次にぬぐい棒を直接培養し、または典型的に、任意に緩衝液および少なくとも1つの界面活性剤と組み合わせた水を含む適切な溶液で抽出した。
生理学的流体に加えて、その他の試験サンプルとしては、その他の液体ならびに液体媒質中に溶解された固体が挙げられる。関心のあるサンプルとしては、プロセス流、水、土壌、植物またはその他の植生、空気、(例えば汚染された)表面などが挙げられる。試験サンプル(例えば液体)は、粘稠な流体の希釈などの事前処理を施してもよい。試験サンプル(例えば液体)をサンプルポートへの注入に先だって、濾過と蒸留と透析などによる濃縮、希釈、濾過、天然構成成分の不活性化、試薬の添加、薬剤処理などのその他の方法で処理してもよい。「細胞の細胞壁構成成分シグナル検出を増強する方法(Method of Enhancing Signal Detection of Cell−Wall Components of Cells)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59467US002号)米国特許出願第_____号明細書は、本発明との関連で使用してもよい試験サンプルを処理する一方法として、溶解の使用について述べる。
いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質として黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体が用いられる。「黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体」とは、その抗原結合断片を包含する特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリンを指す。「抗体」という用語は、あらゆるイソタイプ(IgG、IgA、IgM、IgEなど)のホール(whole)抗体、および(例えば哺乳類の)タンパク質に対して特異的に反応性であるその断片を含むことが意図される。抗体は従来の技術を使用して断片化して、断片はホール抗体と同一様式で有用性についてスクリーニングできる。したがって用語は、特定のタンパク質と選択的に反応できる、タンパク分解的に開裂されまたは組換え的に調製された抗体分子の部分のセグメントを含む。このようなタンパク分解および/または組換え断片の制限を意図しない例としては、F(ab’)と、F(ab)2と、Fvと、ペプチドリンカーによって結合されたVLおよび/またはVH領域を含有する一本鎖抗体(scFv)とが挙げられる。scFv’sは、共有結合的または非共有結合的に結合して、2つ以上の結合部位を有する抗体を形成できる。抗体は、当業者に知られているあらゆる検出可能な部分で標識できる。いくつかの態様では、測定を望む分析物に結合する抗体(一次抗体)は標識されず、代わりに一次抗体に特異的に結合する標識された二次抗体の結合によって検出される。
様々な黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体が、技術分野で知られている。例えば黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体は、シグマ・アンド・アキュレート(Sigma and Accurate Chemical)から市販される。さらに黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体については、米国特許第4,902,616号明細書で述べられる。用いられる抗体濃度は、少なくとも2ng/mlである。典型的に抗体濃度は少なくとも100ng/mlである。例えば50μg/mlの濃度を用いることができる。典型的に約500μg/ml以下が用いられる。既述のように、黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体を機械的音響バイオセンサー表面に固定することが好ましい。
その他の実施形態では、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質としてフィブリノーゲンが用いられる。理論によって拘束されることは意図しないが、黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌によって発現するフィブリノーゲン結合性タンパク質は、フィブリノーゲンと反応してフィブリンと称される繊維の網目状組織を生成すると考えられる。これは一般に「クランピング」と称される重合反応であり、それは粘度および/または結合質量において物理的変化をもたらし、それはSH−SAWバイオセンサーによって検出できる。
この反応を生じるフィブリノーゲンの濃度は、典型的に少なくとも0.0001wt%であり、概して5wt%以下である。例えばフィブリノーゲンと黄色ブドウ球菌(S.aureus)との反応を使用して液体粘度を変化させることができ、次にそれはSH−SAWバイオセンサーによって検出できる。代案としては、このフィブリノーゲン反応を使用して、既述のようなサンプル調製物技術として、存在する黄色ブドウ球菌(S.aureus)を選択および/または濃縮できる。
ヒト血漿および動物(例えばウサギ)プラズマは、適切なフィブリノーゲン含有媒質である。市販される血漿製品は、概してEDTA、クエン酸、ヘパリンなどの抗凝固剤を含む。ヒト由来のフィブリノーゲンは、ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich(St.Louis,MO))から商品名「F4129」の下に市販される。
比較的小さな容量の試験サンプルを用いることが、概して好ましい。試験1〜2ml程度に高いサンプル容量を利用してもよいが、有利なことに、概して約50μl程度の試験サンプルで十分である。試験サンプルとフィブリノーゲン含有培養液との比率は、異なってもよい。しかし典型的に、フィブリノーゲン含有培養液(例えば溶液)容量と試験サンプル容量との比率は、10:1程度である。
粘度の増大速度は(例えば黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌によって発現されるフィブリノーゲン結合性タンパク質とフィブリノーゲンとの反応速度)は、様々な反応条件によって影響され、それらのいくつかについては技術分野で述べられる。最短検出速度を得るためには、反応条件を最適化することが好ましい。
フィブリノーゲンの結合速度を増大させるために、カルシウムイオンを試験サンプルおよび/またはフィブリノーゲン含有媒質に組み込むことが好ましい。操作を容易にするために、典型的にカルシウムイオンをフィブリノーゲン含有溶液に組み込むことが好ましい。典型的に、カルシウムイオンはCaCl2・2H2Oなどの水和塩の形態で添加される。カルシウムイオンの濃度は、典型的に少なくとも0.1wt%(例えば0.2、0.3、0.4)であり、より好ましくは少なくとも0.5wt%である。カルシウムイオン濃度は典型的に2wt%未満である。文献によれば、亜鉛イオンが反応速度に同様の影響を有するかもしれない。
フィブリノーゲン結合反応速度に影響する別の要素は、温度である。好ましくは試験サンプルを黄色ブドウ球菌(S.aureus)と組み合わせる温度は、37℃未満である。さらに温度は、好ましくは5℃を超える。機械的音響バイオセンサーは室温(すなわち20〜25℃)で操作してもよいが、フィブリノーゲン結合は、約15℃〜約25℃の範囲の温度が最適である。
本発明をそれについて実施可能な程度の説明が得られる、本発明者によって予見されたいくつかの具体的実施形態を参照して述べた。現在予見されていない修正をはじめとする、本発明の重要でない修正はそれでもなお、その同等物とみなされる。したがって本発明の範囲はここで述べられる詳細と構造ではなく、続く特許請求の範囲およびその同等物によってのみ制限される。
SH−SAWバイオセンサー1〜3
実施例において、3種の異なる機械的音響バイオセンサーを使用した。全ての3種のバイオセンサーは、回転角度約36°のYX LiTaO3上の漏洩弾性表面波を用いた。
実施例において、3種の異なる機械的音響バイオセンサーを使用した。全ての3種のバイオセンサーは、回転角度約36°のYX LiTaO3上の漏洩弾性表面波を用いた。
オハイオ州イーストレークのソイヤー・リサーチ・プロダクツ(Sawyer Research Products Inc.(Eastlake,OH))からの片面研磨36°YX LiTaO3ウエハを最初にアセトン、メタノール、イソプロパノール、および18MΩcm水のそれぞれですすいで、次にN2で乾燥させて清浄にした。リフトオフ法を使用して、各遅延回路について交差指電極を画定した。接着を促進するために、CVCプロダクツ(CVC Products Inc.)からの電子ビーム蒸発器を使用して、100Åチタン(Ti)結合層をLiTaO3ウエハ上で蒸発させた。次に抵抗蒸発によって、800Åの金の層をTiフィルム上に蒸着した。
ダイシング中にIDTパターンを保護するために、AZ4110光レジストをウエハに塗布し90°で90秒間焼付けした。ダイシングに先だって、ウエハの細密研磨面をアリゾナ州メサのセミコンダクター・エクィップメント(Semiconductor Equipment Corp.(Mesa,AZ))からの青色媒体タック上にマウントした。次に0.2mm/秒の供給速度と12,000rpmの主軸速度を使用して、1.8mm幅のホイールでウエハをダイシングした。
分割二重交差指電極構成をLiTaO3ウエハ上にパターン化した。このパターンを複製して、活性センサーおよび基準遅延回路の双方を作り出した。遅延回路間の間隔は130λであった。IDTは、アパチャー38λおよびメタライゼーション比率=0.5の56組のフィンガーペアから構成された。IDT中心間分離は220λであった。これらの装置は、103MHzの中心周波数および−8dBの挿入損失でSH波を担持した。
SH−SAWバイオセンサー1は、N−メチルピロリドンでのセンサーの浄化、および強力UV光への曝露、カリフォルニア州サンタクララのHDマイクロシステムズ(HD Microsystems Ltd.(Santa Clara,CA)から商品名「ポリイミド2613」の下に市販されるポリイミド溶液のスピンコーティング、次に325℃で約4時間のコーティングのキュアリングによって調製される0.5μm厚のポリイミド層を有する導波管を用いた。遅延回路のみが導波管材料で覆われるように、ポリイミドをセンサーのパッドから除去した。
アルドリッチ(Aldrich)から市販されるポリスチレン(カタログ番号18,242−7)のトルエン中10%固形分溶液を厚さ1.4μmにスピンコーティングしたこと以外は、SH−SAWバイオセンサー2をSH−SAWバイオセンサー1と同一様式で調製した。
SH−SAWバイオセンサー3は、0.5μm厚のポリイミド導波管上に配置されるつなぎ層、つなぎ層上に配置される固定化層、および固定化層上に配置される黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質(例えば抗体)を含んだ。層は次のようにして構築された。
フロリダ州セント・ピーターズバーグのプラズマ・サーム(Plasma Therm(St.Petersburg,FL))から商品名「モデル2480」の下に得られる平行板容量結合反応性イオンエッチャーを使用し、アセチレンプラズマを使用して、ポリイミドフィルム上にダイヤモンド様コーティング(DLC)を付着させ、テトラメチルシランプラズマを使用して、ダイヤモンド様コーティング(DLC)上にダイヤモンド様ガラス(DLG)コーティングを付着させた。
ミネソタ州セントポールの3M社(3M Company(St.Paul,MN))からの3M 811接着テープを使用して、デラウェア州ウィルミントンのE.I.デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー(E.I.du Pont de Nemours & Co.(Wilmington,DE))から商品名「カプトン(KAPTON)E」の下に入手できるポリイミドフィルムのおよそ20cm×30cmのサンプルをイオンエッチャーの電動電極に付着した。イオンエッチャー・チャンバーを閉じて、チャンバーを0.67Pa(0.005トル)の圧力に脱気した。酸素ガスを毎分500cm3(標準状態換算)の流速でチャンバー内に導入し、チャンバー圧を6.7Pa(0.050トル)に維持した。プラズマを発火させ、出力2000Wに15秒間維持した。次に酸素ガスのフローを打ち切って、チャンバーを圧力0.67Pa(0.005トル)に脱気した。次にアセチレンガスを毎分200cm3(標準状態換算)の流速でチャンバー内に導入し、チャンバー圧を2Pa(0.015トル)に維持した。プラズマを発火させ、出力1600Wに10秒間維持した。次にアセチレンガスのフローを打ち切って、チャンバーを圧力0.67Pa(0.005トル)に脱気した。
酸素ガスを毎分500cm3(標準状態換算)の流速で再度チャンバー内に導入し、チャンバー圧を20Pa(0.15トル)に維持した。プラズマを発火させ、出力300Wに10秒間維持した。酸素ガス流速を毎分500cm3(標準状態換算)に維持し、テトラメチルシランガスを毎分150cm3(標準状態換算)の流速でチャンバー内に導入した。チャンバー圧を20Pa(0.15トル)に維持した。プラズマを発火させ、出力300Wに12秒間維持した。テトラメチルシランガスのフローを打ち切った。1分後、酸素ガスのフローと20Pa(0.15トル)のチャンバー圧の双方を維持し、プラズマを発火させ、出力300Wに20秒間維持した。次に酸素ガスのフローを打ち切って、チャンバー圧を0.67Pa(0.005トル)の圧力に脱気した。次にチャンバーを大気に開放し、ポリイミドフィルムのサンプルを電動電極から外して、DLGコーティングが電極を向くように回転させ、再度電極に付着させた。一連のプラズマ処理を繰り返して、DLCおよびDLGコーティングが両側にあるポリイミドフィルムのサンプルを提供した。
DLC/DLG被覆されたセンサーを5mlジクロロメタン中1mMのN−アシルサッカリン溶液中に15分間浸漬した。センサーを取り出して追加のジクロロメタンで洗浄し、試験室窒素内で乾燥させて固定化層を形成した。
本発明は、その内容全体を本願明細書に引用したものとする以下に特定する様々な米国特許出願で述べられる様々な材料、方法、システム、装置などと組み合わせて利用してもよい。それらとしては2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,162号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,178号明細書、2004年7月22日に出願された米国特許出願第10/896,392号明細書、2003年11月14日に出願された米国特許出願第10/713,174号明細書、2004年11月12日に出願された米国特許出願第10/987,522号明細書、2003年11月14日に出願された米国特許出願第10/714,053号明細書、2004年11月12日に出願された米国特許出願第10/987,075号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,171号明細書、2004年10月7日に出願された米国特許出願第10/960,491号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,177号明細書、2003年12月30日に出願された米国特許出願第60/533,176号明細書、「細胞の細胞壁構成成分シグナル検出を増強する方法(Method of Enhancing Signal Detection of Cell−Wall Components of Cells)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59467US002号)、米国特許出願第_____号明細書、「アミン捕獲作用物質としての可溶性ポリマーおよび方法(Soluble Polymers as Amine Capture Agents and Methods)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59995US002号)米国特許出願第_____号明細書、「多官能性アミン捕獲作用物質(Multifunctional Amine Capture Agents)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第59996US002号)PCT出願第_____号、「表面音響波センサーを通じた伝播速度の推定(Estimating Propagation Velocity Through A Surface Acoustic Wave Sensor)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第58927W0003号)PCT出願第_____号、「表面音響波センサーアセンブリー)(Surface Acoustic Wave Sensor Assemblies)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第58928W0003号)PCT出願第_____号、「検出カートリッジ、モジュール、システムおよび方法(Detection Cartridges,Modules,systems and Methods)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第60342W0003号)PCT出願第_____号、「音響センサーおよび方法(Acoustic Sensors and Methods)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第60209W0003号)PCT出願第_____号が挙げられる。
実施例1〜7は、機械的音響バイオセンサーによる黄色ブドウ球菌(S.aureus)の検出を実証する。黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質としてフィブリノーゲンを用いた。実施例1〜3はポリイミド導波管を有するSH−SAWバイオセンサー1を使用し、一方、実施例4〜6はポリスチレン導波管を有するSH−SAWバイオセンサー2を使用した。実施例7はSH−SAWバイオセンサー3を使用した。1〜7の各実施例で、バイオセンサーを28℃の恒温器に入れて温度差に起因するゆらぎとドリフトを防止した。
実施例1
黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関から、商品名「ATCC25923」の下に得た。細菌を37℃で18時間ブロス培養(カリフォルニア州サンタマリアのハーディ・ダイアグノスティクス(Hardy Diagnostics(Santa Maria,CA))からの5mLのトリプチックソイブロス)で生育させた。培養液を遠心分離(8000rpm/15分)よって洗浄し、リン酸塩−緩衝食塩水(「PBS緩衝液」)中に再懸濁した。
黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関から、商品名「ATCC25923」の下に得た。細菌を37℃で18時間ブロス培養(カリフォルニア州サンタマリアのハーディ・ダイアグノスティクス(Hardy Diagnostics(Santa Maria,CA))からの5mLのトリプチックソイブロス)で生育させた。培養液を遠心分離(8000rpm/15分)よって洗浄し、リン酸塩−緩衝食塩水(「PBS緩衝液」)中に再懸濁した。
1%カルシウムイオン溶液をCaCl2・2H2Oから調製した。
シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)から商品名「I2900」の下に得られたpH7.35のイミダゾール緩衝液中で希釈して、シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)から商品名「F4129」の下に得られたヒトフィブリノーゲンの0.5%溶液を調製した。
バイオセンサーを空気中で平衡化して、バイオセンサーが−15dbを超える振幅を有し、安定であることを確実にした。空気中での平衡化後、329μlの0.5%フィブリノーゲン溶液および121μlの1%カルシウムイオン溶液を合わせて、バイオセンサーポッドに入れ、30分間平衡化させた。対照として、50μlの水をバイオセンサーポッド内に注入した。図2のセンソグラムによって記録されるように、反応を30分間実施した。x軸の「0」点は、水を注入した点である。相または速度変化は検出されなかった。
バイオセンサーポッドを空にして、450μlのフィブリノーゲンとカルシウムの混合物をバイオセンサーポッド添加し、30分間平衡化した。その後、500cfu/ml細菌の濃度を有する50μlの黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を添加し、シグナルを30分間モニターした。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図3aに示す。
実施例2
5000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って、実施例1で述べられる手順を繰り返した。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図3bに示す。
5000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って、実施例1で述べられる手順を繰り返した。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図3bに示す。
実施例3
50,000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って、実施例1で述べられる手順を繰り返した。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図3cに示す。
50,000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って、実施例1で述べられる手順を繰り返した。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図3cに示す。
実施例4
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例1で述べられる手順を繰り返した(すなわち500cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4aに示す。
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例1で述べられる手順を繰り返した(すなわち500cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4aに示す。
実施例5
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例2で述べられる手順を繰り返した(すなわち5000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4bに示す。
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例2で述べられる手順を繰り返した(すなわち5000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4bに示す。
実施例6
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例3で述べられる手順を繰り返した(すなわち50,000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4cに示す。
ポリイミド導波管の代わりにポリスチレン導波管を使用したこと以外は、実施例3で述べられる手順を繰り返した(すなわち50,000cfu/mlの濃度を有する黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌溶液を使って)。バイオセンサーによって記録された得られたセンソグラムを図4cに示す。
図2と比べて、図3a〜3cおよび図4a〜4cの各センソグラムは、各黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌注入時の右下がり位相変化を描写する。位相変化の規模は、30分間終了時の位相値を開始時(すなわち0)の位相値から差し引いて計算された。様々な黄色ブドウ球菌(S.aureus)濃度で、30分間終了時に観察された位相変化を図5に示す。
図6は、ポリイミド導波管を用いた、黄色ブドウ球菌(S.aureus)濃度の関数としての伝播速度変化間の直線関係を示す。伝播速度変化は、「表面音響波センサーを通じた伝播速度の推定(Estimating Propagation Velocity Through Surface Acoustic Wave Sensor)」と題され、本願と同日付で出願された(代理人整理第58927号)、出願人の同時係属出願で述べられるようにして計算される。
実施例7
実施例7は、フィブリノーゲンを用いて、バイオセンサー表面に結合した黄色ブドウ球菌(S.aureus)に結合することで、検出シグナルを増幅することを例証する。
実施例7は、フィブリノーゲンを用いて、バイオセンサー表面に結合した黄色ブドウ球菌(S.aureus)に結合することで、検出シグナルを増幅することを例証する。
シグマ(Sigma)から商品名「CHES」の下に得られた100mM緩衝塩溶液(pH9)中で50μg/mlに希釈した、ニューヨーク州ウェストベリーのアキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション(Accurate Chemical and Scientific Corporation(Westbury,NY))から商品名「アクセル(Axell)」No.YVS6881、H6161の下に得られたウサギ黄色ブドウ球菌(S.aureus)抗体によって、黄色ブドウ球菌(S.aureus)反応物質層を調製した。この溶液の15μlアリコートをセンサーの活性面にのせた。同様にペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソン・イムノリサーチ(Jackson Immunoresearch(West Grove,PA))から商品名「クロムピュア(ChromPur)タンパク質IgY」の下に得られたニワトリIgY抗体を同一様式で希釈して基準面にのせた。抗体を固定化層と30分間反応させた。センサーを最初に、シグマ(Sigma)から商品名「ツイーン20」の下に得られた、0.1%(v/v)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートを含有するPBS緩衝液中で洗浄し、引き続いてPBS緩衝液のみで洗浄した。センサーをPBS緩衝液中で保存した。
SH−SAWバイオセンサー3では、6個のポートバルブをフロー設定に含め、それにシリンジポンプを接続して緩衝液をセンサー上に通過させ、廃棄物中に戻した。細菌注入のために、別のループを6ポートバルブに取り付けた。フィブリノーゲン注入のために、6個のポートバルブにさらに別のループを接続した。スイッチが注入ループを制御した。
各実験の開始時に、電子板に接続されたセンサーポッド内にセンサーを入れた。シリンジポンプを使用して緩衝液を5ml/分の速度で注入し、あらゆる気泡をフラッシュした。次に速度を0.03ml/分に設定した。各実験開始時に細菌含有サンプルを装入し、サンプルは手動に切り替えるまでループ内に残された。30秒間の各データポイントで45番目のデータポイントまで、システムを緩衝液フローで平衡化させた。この時点で手動スイッチを使用して、1,000cfu/mlの濃度で黄色ブドウ球菌(S.aureas)細菌を含有するサンプルを注入した。このフローを持続させながら、フィブリノーゲンを6個のポートバルブ内の別のループに挿入し、さらなる手動切り替えまでその場に留めた。細菌プラグに続いて、システムを70データポイントにわたり速度0.03ml/分の緩衝液で再度平衡化させた後、手動切り替えによってフィブリノーゲンをセンサー上に流した。ループサイズは、注入容量次第で変動した。センサー上を流れた注入容量は、250μl(所要時間8分)または350μl(所要時間14分)または500μl(所要時間20分)のいずれかであった。フィブリノーゲン濃度は0.1〜0.5%の間で変動し、注入ループは細菌ループのように変化した。実験全体にわたり位相および規模データを収集し、下で言及されるように進行させた。
フィブリノーゲン注入ポイントの位相と、8分間のフィブリノーゲン注入のサンプル数(注入ポイント+30データポイント)における位相の間の差として、位相変化を測定した。20分プラグでは、注入ポイントの位相と、サンプル数(注入+54データポイント)における位相の間の差として、位相変化を測定した。位相変化だけで、黄色ブドウ球菌(S.aureus)濃度に対する統計学的に不良な相関を示すことが分かった。
細菌なしの6回の注入および細菌ありの13回の注入からなる19個の無作為に選択された実験のデータを検討すると、位相変化とフィブリノーゲン注入前の位相ドリフトとの間に相関があることが発見された。この効果を定量化するために、ウェーブレット回帰を使用して全位相応答をモデリングした。時間に関する位相の導関数は、フィブリノーゲン注入時において計算され、注入前のドリフトを定量化するのに使用された。次に回帰を使用して、位相変化と細菌濃度ならびに注入時の導関数との間の相関を定量化した。
回帰から、注入前の位相中の初期導関数が、位相変化に対して統計学的に顕著な効果を有することが分かった。効果は十分顕著であったので、フィブリノーゲン注入によって引き起こされた位相応答を全体的位相応答から区別するのは困難であった。
この分析に基づいてアルゴリズムを開発し、注入前の初期ドリフトについて補正する修正された位相変化を画定するのに使用した。アルゴリズムをマス・ワークス(Math Works)から商品名「マットラブ(MATLAB)」の下に市販されるソフトウェアに実装した。アルゴリズムは、
データセットをフィルターして異常値を除去するステップと、
適切な非線形モデルを使用して時間の関数として波位相データ応答をモデリングし、
フィブリノーゲンが最初に提供される点(すなわち注入点)における位相変化の第1の導関数を計算し、
フィブリノーゲンが最初に提供される点からフィブリノーゲン全体が検出表面を通過する点に至る全体的位相変化を計算する
ことによって、センサードリフトを計算するステップと、
位相変化とセンサードリフトの間の相関を定量化する(例えば直線)回帰からのセンサードリフトに起因する推定位相変化を計算するステップと、
全体的位相変化からセンサードリフトに起因する推定位相変化を差し引いて修正された位相変化を計算するステップから構成された。
データセットをフィルターして異常値を除去するステップと、
適切な非線形モデルを使用して時間の関数として波位相データ応答をモデリングし、
フィブリノーゲンが最初に提供される点(すなわち注入点)における位相変化の第1の導関数を計算し、
フィブリノーゲンが最初に提供される点からフィブリノーゲン全体が検出表面を通過する点に至る全体的位相変化を計算する
ことによって、センサードリフトを計算するステップと、
位相変化とセンサードリフトの間の相関を定量化する(例えば直線)回帰からのセンサードリフトに起因する推定位相変化を計算するステップと、
全体的位相変化からセンサードリフトに起因する推定位相変化を差し引いて修正された位相変化を計算するステップから構成された。
位相応答をモデリングするための適切な非線形モデルとしては、ウェーブレット回帰、神経回路網、多変量加法、回帰スプラインなどが挙げられる。
19の全実験について、修正された位相変化を計算した。黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌のないサンプルの修正された位相変化を1,000cfu/mlの黄色ブドウ球菌(S.aureus)細菌を有する実験のものと比較した。
分散の分析から、E0(細菌なし)とE3(1,000cfu/mlの菌度濃細)の間の差の95%信頼区間は[−3.58,−0.92]であり、平均値は−2.25であることが分かった。換言すると、E3注入は、E0注入で得られるよりも2.25高い修正された位相変化を生じ、差は統計学的に有意であった。したがって修正された位相変化を使用して、黄色ブドウ球菌(S.aureus)のE3注入をブランクのE0注入から区別できる。
実施例は、非常に低レベル(例えば500cfu/ml)で黄色ブドウ球菌(S.aureus)が検出できることを示す。実施例はまた、伝統的試験管およびスライド試験と比べて、黄色ブドウ球菌(S.aureus)が30分未満の比較的短時間で検出できることを示す。検出感度および検出時間は、約25℃〜約15℃の範囲の温度で増幅し改善することができる。フィブリノーゲン濃度を増大させて反応速度を増大させてもよい。
ここで引用した完全な特許の開示、特許出願、および公報は、その全体を個々に編入したものとする。本発明の範囲と精神を逸脱することなく本発明の様々な変更と修正が可能であることは、当業者には明らかである。本発明はここに記載される例証的な実施形態および実施例によって不当に制限されないものとし、このような実施例および実施形態は例としてのみ提示され、本発明の範囲は、冒頭に記載された特許請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
Claims (34)
- 試験サンプルを提供するステップと、
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質を提供するステップと、
試験サンプルを黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質と混合するステップであって、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む試験サンプルが少なくとも1つの物理的性質の変化をもたらすステップと、
横波型弾性表面波バイオセンサーで変化を検出するステップと、
を含む、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を検出する方法。 - 試験サンプルが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を約5×104cfu/ml未満の濃度で含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を約5×103cfu/ml未満の濃度で含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルが黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を約1000cfu/ml未満の濃度で含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を約500cfu/mlのブドウ球菌(Staphylococcus)の濃度で含む、請求項1に記載の方法。
- 検出時間が150分未満である、請求項1に記載の方法。
- 検出時間が100分未満である、請求項1に記載の方法。
- 検出時間が60分未満である、請求項1に記載の方法。
- 検出時間が約30分である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの物理的性質の変化が粘度の変化である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの物理的性質の変化が結合質量の変化である、請求項1に記載の方法。
- 検出が波位相の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出が波の速度の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルが約0.5ml〜約1.5mlの範囲の容量を含む、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルを中程度の温度で混合するステップが、約5℃〜約37℃の範囲の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルを中程度の温度で混合するステップが、約15℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルが約0.1wt%〜約2wt%の範囲の濃度のカルシウムイオンをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- バイオセンサーがポリマー導波管を含む、請求項1に記載の方法。
- バイオセンサーがポリイミドおよびポリスチレンから選択される導波管を含む、請求項18に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質がフィブリノーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
- フィブリノーゲンが0.0001wt%〜5wt%の範囲の濃度で存在する、請求項20に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質が血漿を含む、請求項1に記載の方法。
- 血漿がヒト血漿および動物血漿から選択される、請求項22に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質がフィブリノーゲン溶液を含む、請求項1に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質が液体中で提供される、請求項1に記載の方法。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質がバイオセンサーに提供され、引き続いて試験サンプルがバイオセンサーに提供される、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルがバイオセンサーに提供され、引き続いて黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質がバイオセンサーに提供される、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルを黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)反応物質と合わせるステップが固形物の形成をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 試験サンプルを提供するステップと、
フィブリノーゲンを提供するステップと、
試験サンプルをフィブリノーゲンとを混合するステップであって、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を含む試験サンプルが少なくとも1つの物理的性質の変化をもたらすステップと、
機械的音響バイオセンサーによって変化を検出するステップと、
を含む、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)を検出する方法。 - バイオセンサーが固定化層と反応した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)抗体を含む検出表面を含む、請求項29に記載の方法。
- フィブリノーゲンが検出表面と結合した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の検出を増幅する、請求項30に記載の方法。
- 検出が波位相変化を含む、請求項31に記載の方法。
- 修正された波位相変化がセンサードリフトをセンサー応答から区別することで計算される、請求項32に記載の方法。
- 波位相データをフィルターして異常値を除去するステップと、
適切な非線形モデルを使用して時間の関数として波位相データ応答をモデリングし、
フィブリノーゲンが最初に提供される点における位相変化の第1の導関数を計算し、そして
フィブリノーゲンが最初に提供される点からフィブリノーゲン全体が検出表面を通過する点に至る全体的位相変化を計算する
ことによって、センサードリフトを計算するステップと、
位相変化とセンサードリフトとの間の相関を定量化する回帰からのセンサードリフトに起因する推定位相変化を計算するステップと、
全体的位相変化からセンサードリフトに起因する推定位相変化を差し引いて修正された位相変化を計算するステップと、
を含むアルゴリズムによって修正された波位相変化が計算される、
請求項33に記載の方法。
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