CN101952729A - 利用全细胞捕获和atp分析进行样品细菌分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及捕获细菌全细胞的方法,所述方法包括使用对特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,然后用直接或间接ATP测定法分析靶标全细胞。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2008年2月20日提交的美国临时申请序列号61/066,336的权利,将其以引用的方式并于本文。
背景技术
对常用抗生素具有耐药性的细菌的出现是一个日益成为的问题,严重影响对被感染个体的治疗。因此,在早期并以相对快速的方式确定这些细菌的存在以更好地控制这些细菌变得越来越重要。这也适用于多种其他微生物。
一种这类非常受关注的微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,“S.aureus”)。这是一种引起广谱感染的病原体,所述感染包括:浅表损伤,例如小的皮肤脓肿和伤口感染;全身性且致命的病症,例如心内膜炎、肺炎和败血病;以及中毒症,例如食物中毒和中毒性休克综合征。一些菌株(例如,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)对除少数精选的抗生素之外的所有抗生素具有耐药性。
目前检测微生物尤其是对抗生素具有耐药性的细菌的技术一般比较费时且通常涉及以纯种形式培养细菌。一种此类用于鉴定与急性感染相关的病原葡萄球菌(即人类和动物中的金黄色葡萄球菌以及动物中的中间葡萄球菌(S.intermedius)和猪葡萄球菌(S.hyicus))的技术是基于微生物凝结血浆的能力。已描述了至少两种不同的凝固酶试验:游离凝固酶的试管试验和“细胞结合的凝固酶”或聚集因子的玻片试验。试管凝固酶试验通常涉及将脑心浸出液肉汤中的过夜培养物与重构的血浆混合,将该混合物温育4小时并通过缓慢倾斜试管来观察血块形成。对于金黄色葡萄球菌建议将受试物温育过夜,因为少量的菌株可能需要4小时以上才能形成血块。玻片凝固酶试验通常更快并且更经济;然而,10%至15%的金黄色葡萄球菌菌株可能会产生阴性结果,这需要通过试管试验重新检验分离物。
尽管本领域已描述了检测金黄色葡萄球菌以及其他微生物的方法,但改进的检测方法中将存在优势。
发明内容
在一些实施例中,本发明提供捕获细菌全细胞然后直接或间接进行腺苷三磷酸(ATP)分析的方法。这些方法涉及使用对特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体(优选对特定细菌特征性的两种或更多种独特被分析物具有抗原特异性的两种或更多种抗体)。如果使用不止一种抗体,那么这两种或更多种抗体优选在它们的结合特性上协同。也就是说,它们能够同时结合靶标被分析物的各独特区域或最好为互补结合,通过所述互补结合,对某独特被分析物的结合可被另一种抗体的结合增强。
在一个这样的实施例中,本发明提供分析特定细菌的方法,其中该方法包括:提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;提供对该特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;提供包含磁性粒子的固体支撑物材料;使该样品、该固体支撑物材料和该一种或多种抗体之间在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下接触;从该样品分离捕获的靶标全细胞;裂解该靶标全细胞以形成裂解物;以及通过直接或间接分析裂解物的ATP来分析该特定细菌是否存在。
在一个优选的实施例中,该一种或多种(优选两种或更多种)抗体与该固体支撑物材料连接形成被分析物结合性材料,从而该方法包括在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的全细胞的话有效捕获所述全细胞的条件下,提供该样品和该被分析物结合性材料之间的接触。提供该样品和该被分析物结合性材料之间的接触可包括该样品和该一种或多种抗体之间的同时和/或依次接触,优选同时接触。
在另一个优选的实施例中,提供该样品、该固体支撑物材料和该一种或多种抗体之间的接触包括提供该一种或多种抗体和该样品之间的接触以形成结合抗体的全细胞,随后提供该抗体结合的全细胞和该固体支撑物材料之间的接触。
在某些实施例中,该特定细菌包括革兰氏阳性细菌,特别是金黄色葡萄球菌。
在某些实施例中,每个粒子具有设置在其上的结合不同被分析物的至少两种抗体。
在某些实施例中,先将靶标全细胞从磁性粒子移除再进行裂解。
在某些实施例中,通过直接或间接分析ATP来分析该特定细菌是否存在包括:使所述裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生ATP的条件下接触;以及检测是否存在所产生的ATP。在某些实施例中,检测是否存在所产生的ATP包括测量所产生ATP的量并将其与特定细菌或特定细菌特征性的胞内物质的存在和/或量关联。在某些实施例中,检测是否存在所产生的ATP包括使含有裂解物和ADP的混合物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与所产生的ATP的量成比例的光,并用光度计检测所述光。
在某些实施例中,通过直接或间接分析ATP来分析是否存在特定细菌包括:使裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;并用光度计检测所述光。在某些实施例中,分析特定细菌是否存在还包括测量ATP的存在量并将其与特定细菌或特定细菌特征性的胞内物质的存在量关联。
本发明也提供分析样品中的细菌的方法,该方法包括:提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品、所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;从该样品分离捕获的靶标全细胞;裂解该靶标全细胞以形成裂解物并且如果存在腺苷三磷酸(ATP)的话释放出ATP;使裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;用光度计检测所述光;和测量ATP的存在量并将其与特定细菌或特定细菌特征性的胞内物质的存在量关联。
本发明还提供分析样品中的细菌的方法,该方法包括:提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品、所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;从该样品分离捕获的靶标全细胞;裂解该靶标全细胞以形成裂解物;使裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生腺苷三磷酸(ATP)的条件下接触;和测量所产生的腺苷三磷酸的量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的量关联。
定义
“全细胞”意指在与其他生物材料分离的过程中保持其结构、但不一定需要能够繁殖的生物活性细菌细胞。
术语“被分析物”和“抗原”可互换使用,指所关注的微生物特征性的各种分子(例如,A蛋白)或分子表位(例如,A蛋白的不同结合位点),或微生物全细胞。这些包括细胞壁组分(例如,细胞壁蛋白如A蛋白,以及聚集因子,其为存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁相关纤维蛋白原受体)、外部细胞组分(例如荚膜多糖和细胞壁碳水化合物)等等。
“磁性粒子”指由铁磁性、顺磁性或超顺磁性粒子构成的粒子或粒子聚集物,包括所述粒子在聚合物小珠中的分散体。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明的实施例。然而,在相同的或其他情况下,其他实施例也可以是优选的。此外,述及一个或多个优选的实施例并非暗示其他实施例不可用,也并非旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。
术语“包含”和其变型形式在说明书和权利要求书中出现时不具有限制性意义。
如本文所用,“一种”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。因此,例如,包含“一种”抗体的被分析物结合性材料可解释为意指该被分析物结合性材料包括结合不同被分析物的“一种或多种”抗体。
术语“和/或”是指所列要素的一个或全部,或所列要素的任何两个或更多个的组合。
另外,在本文中,由端点界定的数值范围包括该范围内所含的所有数值(如,1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下“具体实施方式”更为具体地举例说明示例性实施例。在本专利申请中的几个地方,通过实例的列表给出指导,这些实例可以各种组合来应用。在每个情况中,所述及的列表只是用作代表性的群组,不应该被解释为是排他性的列表。
具体实施方式
本发明涉及基于利用所关注细菌特有的一种或多种被分析物从样品中捕获所关注细菌的全细胞的各种方法。具体而言,本发明的捕获方法包括使用对该特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物(优选两种或更多种)具有抗原特异性的一种或多种抗体(优选两种或更多种)。如果使用两种或更多种抗体,优选它们在结合特性上协同。也就是说,它们能够同时结合靶标被分析物的各独特区域或最好为互补结合,通过所述互补结合,对某独特被分析物的结合可被另一种抗体的结合增强
靶标全细胞一旦连接至磁性粒子,可将它们在进一步分析之前先从样品中移除。在分析之前选择性结合靶标全细胞并将它们与样品其余部分分离的优点在于,这可选择性浓缩细胞并可提供更好的灵敏度和特异性。这也可除去可能存在于复杂样品中的抑制剂。
本发明方法中分析细菌的技术涉及直接或间接分析腺苷三磷酸(ATP)。在这种分析之前,可将被捕获的(靶标)全细胞在其不从磁性粒子释放的情况下或在从磁性粒子释放后进行裂解。
在许多其中全细胞捕获为检测或进一步分析之前的样品制备步骤的一部分的情况中,本发明是有利的。已知对于给定的细菌菌株,靶标蛋白的表达可变化很大。在某些情况下,可利用对以单一抗体技术即可很好地进行捕获的菌株的捕获。在其他情况下,针对靶标细菌的单一抗原的单一抗体可导致某些细菌菌株显示出较差的捕获效率或根本不能被捕获。对于这些菌株,样品制备步骤将导致可供检测的细菌大大减少。结果,这将增加该检测技术的假阴性数量,并且这也对该测定法的检测限具有不利影响。通过将包被有不同抗体的粒子混合或将不同抗体包被于同一粒子上,有可能增加对用单一抗体时显示较差捕获或不能被捕获的细菌菌株的捕获效率。因此,通过使用本发明优选的方法,采用对特定细菌特征性的两种或更多种不同被分析物具有抗原特异性的两种或更多种抗体,可改善使用全细胞捕获的测定法的测定灵敏度以及检测限。
优选地,可使用相对较小体积的试验样品。尽管可使用显著大于2毫升(mL)的试验样品体积,但是500微升(μL)左右的试验样品通常足够用于本发明方法,不过更小的样品量也是可以的。
优选地,使用本发明方法,捕获时间可相对较短。例如,捕获时间可少于30分钟、少于15分钟、少于5分钟、少于60秒,并且甚至短至30秒。
特别关注的细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。尤其相关的生物体包括以下各科属的成员:肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、志贺杆菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、弧菌属(Vibrio)、棒杆菌属(Corynebacteria)以及疱疹病毒、曲霉菌属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)以及假丝酵母属(Candida)。毒力特别强的生物体包括:金黄色葡萄球菌(包括耐药菌株例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(S.agalactiae)、产脓链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)、万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、厚孢镰刀菌(F.chlamydosporum)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、依氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、坂崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、大肠杆菌O157以及多重耐药性革兰氏阴性杆菌(MDR)。
特别值得关注的是革兰氏阳性细菌,例如金黄色葡萄球菌。通常,可通过检测这些细菌特征性的细胞壁组分(例如细胞壁蛋白)的存在来检测它们。而且,特别关注的是包括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR在内的抗生素耐药性微生物。通常,可通过另外检测造成抗生素耐药性的内部细胞组分(例如膜蛋白、转运蛋白、酶等)的存在来检测这些微生物。
本发明优选的方法可用于利用分别的分子(例如,像用于分析金黄色葡萄球菌的A蛋白和聚集因子的分子)或同一分子(例如蛋白质)的两个不同表位从样品捕获细菌全细胞。这些被分析物包括(例如)细胞壁蛋白质,例如A蛋白和微生物表面组分识别性粘附基质分子(MSCRAMMs)如纤维蛋白原结合蛋白(如聚集因子)、纤连蛋白结合蛋白、胶原结合蛋白、肝素相关多糖结合蛋白等等。A蛋白和聚集因子,例如纤维蛋白原结合因子和聚集因子A、B和Efb也尤其可用于检测金黄色葡萄球菌的存在的方法中。其他关注的细胞壁组分包括荚膜多糖和细胞壁碳水化合物(如,磷壁酸和脂磷壁酸)。
可在可源自多种来源的试验样品中分析的所关注的菌种,所述来源例如生理流体(如血液、唾液、眼睛晶状体液、滑膜液、脑脊液、脓汁、汗液、渗出物、尿液、粘液)、粘膜组织(例如口腔、牙龈、鼻部、眼睛、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、输尿管、阴道、子宫颈和子宫粘膜)、哺乳期乳汁、粪便等。另外,试验样品可源自身体部位,例如伤口、皮肤、前鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭、头皮、指甲、外耳、中耳、口、直肠、阴道、腋窝、会阴、肛门、直肠或其他相似的部位。
除了生理流体外,其他试验样品可包括其他液体以及溶于液体介质的固体。关注的样品可包括工艺液流、水、土壤、植物或其他植被、空气、表面(例如被污染表面)等等。
本领域描述了用于检测细菌例如金黄色葡萄球菌的多种患者取样技术。这些取样技术也适用于本发明方法。例如,通常通过用无菌拭子或取样装置拭抹,从患者的鼻孔例如患者的前鼻孔擦拭获得样品。例如,一个拭子用于对一名受试者取样,即一个拭子用于两个鼻孔。这种取样例如通过以下方式进行:将干燥的或用适当的溶液预润湿的拭子插入受试者鼻孔的前端并沿着鼻孔粘膜表面将拭子旋转整整两周。
有多种拭子或其他样品采集装置可例如以商品名PURE-WRAPS购自Puritan Medical Products Co.LLC(Guilford,ME),或以商品名microRheologics nylon flocked swab和ESwab Collection and TransportSystem购自Copan Diagnostics,Inc.(Murrietta,CA)。如果需要也可使用例如美国专利No.5,879,635(Nason)中公开的样品采集装置。拭子可为包括棉花、人造丝、藻酸钙、涤纶、聚酯、尼龙、聚氨酯等在内的各种材料。
然后可将样品采集装置(例如拭子)直接培养、直接分析或用适当的溶液提取(例如,通过洗涤,经涡旋洗脱)。这些提取(即洗脱)溶液通常包括水并可任选包括缓冲液和至少一种表面活性剂。洗脱缓冲液的例子包括(例如)磷酸盐缓冲液(PBS),其可与例如TWEEN 20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯,可购自Sigma-Aldrich Corp.)或PLURONIC L64(聚(氧乙烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物,可购自BASFCorp.)组合使用。其他的提取溶液可起到在从样品收集位置传送到样品分析位置的过程中保持样本稳定性的作用。这些类型的提取溶液的例子包括Amies和Stuart传送介质。
可在进一步分析之前对试验样品(例如液体)进行处理。这包括浓缩、沉淀、过滤、离心、蒸馏、透析、稀释、天然组分的失活、添加试剂、化学处理等。
使样品与合适的可连接至磁性粒状材料的抗体接触。可将结合的细胞从载体洗脱以获得纯化的靶标被分析物,或将其在与固体支撑物材料连接的情况下进行处理。
将一种或多种(优选两种或更多种)抗体(例如金黄色葡萄球菌抗体)用作金黄色葡萄球菌反应物。“金黄色葡萄球菌抗体”指具有特异结合给定抗原的能力的免疫球蛋白,包括其抗原结合片段。金黄色葡萄球菌抗体可商购自Sigma-Aldrich和Accurate Chemical。此外,其他金黄色葡萄球菌抗体(例如单克隆抗体Mab 12-9)在美国专利No.6,979,446中有描述。在某些优选的实施例中,抗体选自本文描述的那些(例如,选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9)、它们的片段以及它们的组合。这些抗体也在下列专利公布中公开:美国专利申请公布No.2008-0118937-A1和PCT专利公布No.WO 2008/140570中,二者的标题均为“ANTIBODY WITHPROTEIN A SELECTIVITY(具有A蛋白选择性的抗体)”,以及2006年11月22日提交的美国专利申请系列号11/562,747和PCT专利公布No.WO 2008/143697,二者的标题均为“ANTIBODY WITH PROTEIN ASELECTIVITY(具有A蛋白选择性的抗体)”,以及2006年11月22日提交的美国专利申请系列号60/867,089和2007年11月20日提交的美国专利申请系列号11/943,168,二者的标题均为“SPECIFICANTIBODY SELECTION BY SELECTIVE ELUTION CONDITIONS(通过选择性洗脱条件进行的特异抗体选择)”。
优选的抗体为单克隆抗体。尤其优选的是结合金黄色葡萄球菌(本文中也称作“S.aureus”或“Staph A”)的A蛋白的单克隆抗体。尤其优选的抗体为MAb-76、MAb-107、它们的片段以及它们的组合。
更具体地讲,在一个实施例中,合适的单克隆抗体及其抗原结合片段为显示杂交瘤细胞系358A76.1所产生的单克隆抗体76的免疫学结合特性的那些。鼠单克隆抗体76为从用A蛋白免疫的小鼠分离的鼠IgG2A κ抗体。根据布达佩斯条约(Budapest Treaty),可产生单克隆抗体76的杂交瘤358A76.1于2006年10月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)保藏库,10801University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209)并被给予专利保藏号PTA-7938(本文中也称作登录号PTA-7938)。杂交瘤358A76.1产生在本文中称作“Mab 76”的抗体。Mab 76在本文中也称作“Mab76”、“Mab-76”、“MAb-76”、“单克隆76”、“单克隆抗体76”、“76”、“M76”或“M76”,并且均可在本文中互换使用,是指于2006年10月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并分配登录号No.PTA-7938的杂交瘤细胞系358A76.1所产生的免疫球蛋白。
在另一实施例中,合适的单克隆抗体及其抗原结合片段为显示杂交瘤细胞系358A107.2所产生的单克隆抗体107特征性的免疫学结合特性的那些。鼠单克隆抗体107为从用A蛋白免疫的小鼠分离的鼠IgG2A κ抗体。根据布达佩斯条约,可产生单克隆抗体107的杂交瘤358A107.2于2006年10月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)保藏库,10801 UniversityBoulevard,Manassas,VA 20110-2209)并被给予专利保藏号PTA-7937(本文中也称作登录号PTA-7937)。杂交瘤358A107.2产生在本文中称作“Mab 107”的抗体。Mab 107在本文中也称作“Mab107”、“Mab-107”、“MAb-107”、“单克隆107”、“单克隆抗体107”、“107”、“M107”或“M 107”,并且均可在本文中互换使用,是指于2006年10月18日保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)并分配登录号PTA-7937的杂交瘤细胞系所产生的免疫球蛋白。
合适的单克隆抗体还有可抑制单克隆抗体MAb-76与金黄色葡萄球菌的A蛋白结合的那些。本发明可利用结合金黄色葡萄球菌A蛋白的被单克隆抗体MAb-76所识别的相同表位的单克隆抗体。测定单克隆抗体是否能抑制单克隆抗体MAb-76与金黄色葡萄球菌A蛋白的结合以及测定单克隆抗体是否结合金黄色葡萄球菌A蛋白的被单克隆抗体MAb-76所识别的同一表位的方法,是免疫学领域技术人员熟知的。
合适的单克隆抗体还有能抑制单克隆抗体MAb-107与金黄色葡萄球菌A蛋白的结合的那些。本发明可利用结合金黄色葡萄球菌A蛋白的被单克隆抗体MAb-107所识别的同一表位的单克隆抗体。测定单克隆抗体是否能抑制单克隆抗体MAb-107与金黄色葡萄球菌A蛋白的结合以及测定单克隆抗体是否结合金黄色葡萄球菌A蛋白的被单克隆抗体MAb-107所识别的同一表位的方法,是免疫学领域技术人员熟知的。
合适的单克隆抗体为由这个杂交瘤的子代或衍生物所产生的那些单克隆抗体以及等价的或相似的杂交瘤所产生的单克隆抗体。
本发明还包括各种抗体片段,也称作抗原结合片段,它们仅包括完整抗体的一部分,通常包括完整抗体的抗原结合位点并因而保留了结合抗原的能力。抗体片段的例子包括(例如)通过蛋白酶解消化和/或还原二硫键所产生的Fab、Fab′、Fd、Fd′、Fv、dAB和F(ab′)2片段以及从Fab表达文库中产生的片段。这些抗体片段可通过本领域熟知的技术生成。
可用于本发明的单克隆抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体、由Fab表达文库产生的线性抗体片段、包括VL或VH结构域的片段、细胞内产生的抗体(即胞内抗体),以及它们的抗原结合抗体片段。
可用于本发明的单克隆抗体可具有许多种同种型。可用于本发明的单克隆抗体可为(例如)鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE。可用于本发明的单克隆抗体可为(例如)人IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在一些实施例中,单克隆抗体可为鼠IgG2a、IgG1或IgG3。就本发明而言,给定的重链可与κ或λ形式的轻链配对。
可用于本发明的单克隆抗体可由动物(包括但是不限于人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、马、鸡或火鸡)产生、化学法合成或重组表达。可用于本发明的单克隆抗体可通过多种本领域已知用于纯化免疫球蛋白分子的方法来纯化,例如通过色谱法(如离子交换色谱、亲和色谱以及排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度法,或通过多种其他用于纯化蛋白质的标准技术来纯化。
合适的抗体还包括可以优选至少1皮克每毫升(pg/mL)、更优选最多100pg/mL的浓度检测金黄色葡萄球菌的重组聚集因子(rClf40)蛋白的高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品。合适的抗体还包括与金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白抗血清相比显示出检测灵敏度至少增加4倍的高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品。
在某些实施例中,可使用高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品,其中所述高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品的制备方法包括从用金黄色葡萄球菌的重组聚集因子(rClf40)蛋白免疫的动物获得抗血清;使该抗血清结合金黄色葡萄球菌聚集因子(rClf40)蛋白亲和柱;用含有0.5M盐且pH为4的洗涤缓冲液洗涤该柱;并用pH为2的洗脱缓冲液从柱子洗脱高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品。在本文中,来自兔和山羊的高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品分别称作亲和纯化的RxClf40和亲和纯化的GxClf40。在一些实施例中,高亲合力抗金黄色葡萄球菌聚集因子蛋白多克隆抗体制品可通过这样的方法来获得,该方法在使抗血清结合金黄色葡萄球菌聚集因子(Clf40)蛋白亲和柱之前还包括富集该抗血清的IgG型抗体。该富集可从制品中除去非免疫球蛋白蛋白质和/或富集样品当中的IgG型抗体。
本文所用的抗血清指来自经免疫的宿主动物并已从中去除了凝血蛋白和红血细胞(RBC)的血液。靶标抗原的抗血清可通过免疫多种宿主动物来获得。可使用多种免疫方案。
抗体亲合力为多克隆抗体制品的功能亲和力的量度。亲合力为多种抗体/抗原相互作用的复合亲和力。也就是说,亲合力为抗原/抗体结合的表观亲和力而不是真正的亲和力。尽管在大多数的抗血清中亲和力不均一,但可通过定义平均亲和力(K0)来表征这些群体。
被分析物结合性材料包括磁性粒状材料,例如铁磁性、顺磁性和超顺磁性材料。优选地,这些磁性粒子(例如小珠)的平均粒径(即单个粒子的最长维度,例如直径)小于2微米,并且优选在0.05至1微米的范围内。例如,用各种基团例如羧基、胺和甲苯磺酰基官能化的磁性粒子可商购自多个商业来源,例如Invitrogen(Carlsbad,美国加州)和Ademtech(Pessac,法国)。链霉抗生物素蛋白包被的粒子也可得自若干来源,例如Invitrogen(Carlsbad,美国加州)、Ademtech(Pessac,法国)和Miltenyi Biotec GmbH(Bergisch Gladbach,德国)。
被分析物结合性材料优选包括磁性粒状材料,其中粒状材料的每个粒子上设置有至少两种结合不同被分析物的抗体。例如,在某些实施例中,被分析物结合性材料包括其上设置有抗体MAb-107和亲和纯化的GxClf40(优选以1∶1的比率)的磁性粒状材料。
抗体可通过共价连接或非共价连接方式连接至磁性粒状载体材料。
抗体与磁性粒状载体材料的非共价连接包括通过例如离子相互作用或氢键的连接。包括于本发明中的非共价连接的一个例子为熟知的生物素-抗生物素蛋白系统。基于生物素-抗生物素蛋白系统的技术广泛应用于生物学和生物技术的许多领域。抗生物素蛋白和生物素之间的亲和常数非常高(解离常数Kd为大约10-15M,参见Biochem.J.,89,599(1963))并且当生物素与多种生物分子偶联时也不会显著减小。已确定了许多化学方法,来将生物分子与生物素偶联,同时该生物分子的活性或其他所需特性只有极少或可忽略的损失。生物素-抗生物素蛋白技术的综述可见于Applications of Avidin-Biotin Technology toAffinity-Based Separation,Bayer等人,J.of Chromatography,第3-11页(1990)。
链霉抗生物素蛋白及其功能同系物抗生物素蛋白为四聚体蛋白质,具有四个相同的亚基。链霉抗生物素蛋白由放线细菌阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)分泌。链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的单体含有一个对水溶性维生素生物素的高亲和力结合位点,从而链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白四聚体结合四个生物素分子。
生物素(也称作维生素H或顺式-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-[3-4]-咪唑-4-戊酸)是包括细菌和酵母在内的大多数生物体所必需的基本生物素。生物素的分子量为244道尔顿,远低于其结合伴侣抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。生物素也是丙酮酸羧化酶、转羧酶、乙酰辅酶A羧化酶和β-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(它们共同羧化多种底物)的酶辅因子。
链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白二者均显示与生物素非常紧密和高度特异性的结合,这是已知最强的蛋白质与配体间非共价相互作用之一,摩尔解离常数为10-15摩尔浓度(M)(Green,Advances in ProteinChemistry,第29卷,第85-133页(1975)),且配体解离的t1/2为89天(Green,N.M.,Advances in Protein Chemistry,第29卷,第85-133页(1975))。抗生物素蛋白-生物素结合在血清和血液循环中是稳定的(Wei等人,Experientia,第27卷,第366-368页(1971))。抗生物素蛋白-生物素复合物一旦形成,不受最极端的pH、有机溶剂和变性条件的影响。从生物素分离链霉抗生物素蛋白需要例如8M胍、pH 1.5或121℃高压烹煮10分钟(min)的条件。
可使用多种已知方法将抗体进行生物素酰化。例如,可使用活化的生物素类似物如N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-生物素)通过化学法将抗体进行生物素酰化,NHS-生物素例如可购自Pierce ChemicalCompany(Rockford,IL)的),其需要抗体上存在游离的伯氨基。
在本发明优选的方法中,可用链霉抗生物素蛋白包被磁性粒子并使其与生物素酰化的抗体接触。然后可将这些粒子用于细菌捕获。对于两种或更多种抗体,可发生同时或依次捕获。另一选择为可将生物素酰化的抗体与样品混合以捕获细菌,然后可将抗体-细菌复合物捕获于小珠(Dynal T 1MyOne Streptavidin Package insert)上。
对于某些实施例,可优化生物素分子数量与抗体数量的比率以对某些粒子避免聚集。例如,对于Ademtech 200-nm链霉抗生物素蛋白包被的粒子,优选约2∶1的比率。更高的比率,尤其是大于7∶1的比率对这些粒子已显示出聚集问题。
将抗体共价连接至粒状载体材料的代表性方法包括利用由活化化合物(例如戊二醛、碳二亚胺、溴化氰)活化的载体材料中的官能基团(例如羧基、胺、羟基、马来酰亚胺、酰肼)来与抗体中的另一反应性基团(例如羟基、氨基、酰胺基或巯基)反应。这个键合可为(例如)二硫键、硫酯键、酰胺键、硫醚键等等。抗体也可直接连接至用可与抗体上的官能团(例如胺)直接反应的基团(甲苯磺酰基、氯甲基)官能化的载体材料。
抗体可通过多种本领域已知的方法共价键合至磁性粒状载体材料。例如,用羧基衍生化的小珠可商购获得。可然后通过由碳二亚胺活化所介导的抗体上的伯胺和小珠表面上的羧基之间酰胺键的形成将抗体偶联至这些小珠。
通常,针对所关注的系统优化粒子浓度和抗体与粒子的比率以实现快速捕获。一般来讲,这取决于粒子。例如,对于Dynal 1-μm粒子,粒子浓度优选大于0.04mg/mL,更优选大于0.1mg/mL,且甚至更优选大于0.16mg/mL。对于上述的粒子,抗体与粒子的比率优选大于1μg/mg粒子,更优选大于10μg/mL,且甚至更优选大于40μg/mg粒子。
例如,对于Ademtech 200-nm粒子,粒子浓度优选大于0.04mg/mL,更优选大于0.1mg/mL,且甚至更优选大于0.16mg/mL。对于上述的粒子,抗体与粒子的比率优选至少为0.01μg/mg粒子,更优选大于0.1μg/mL,且甚至更优选大于1μg/mg粒子。对于上述的粒子,抗体与粒子的比率优选小于10μg/mg粒子。
合适的粒子可进行或不进行封闭以防止非特异性结合。这些封闭可在进行抗体连接之前或之后完成。例如,某些磁性小珠(例如DynalT1MyOne链霉抗生物素蛋白小珠)在购买时为用牛血清白蛋白(BSA)封闭的。可使用本领域熟知的其他合适的针对非特异结合的封闭剂。
含有靶标全细胞的样品和含有抗体的固体支撑物材料之间的接触时间(例如,混合时间)可不超过15分钟,然而可使用低至30秒和高至30分钟。这些组合物还可包括缓冲液,例如任选含有PLURONICL-64表面活性剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、BSA或它们的组合的PBS。尽管对于大的粒子和小的粒子两者均可使用物理搅拌(或混合),但小的粒子可在不进行混合的情况下使用。
可通过沉降、离心或过滤而从样品分离粒子。优选地,使用磁性粒子并通过使用磁场将它们分离。可用多种缓冲液(包括(例如)含PLURONIC L-64或TWEEN 20、含有或不含BSA等的PBS)洗涤这些分离的粒子(其上有全细胞)。
值得注意的是,使用本发明的全细胞捕获方法时,优选至少样品中20%靶标全细胞被捕获,更优选至少50%靶标全细胞被捕获,且甚至更优选至少80%靶标全细胞被捕获。
本发明方法包括裂解试验样品中的靶标全细胞。
可在裂解前将靶标全细胞从磁性粒子移除。既有化学方法也有物理方法可用于从磁性粒子移除细胞。最简单的方法依靠改变缓冲液pH或离子强度(或二者)来释放被捕获细胞。温度也可用作释放被捕获细胞的触发因素。另一种方法则依靠在固体支撑物表面和被捕获的抗体之间提供不稳定的连接基团。取决于该连接基团的构造,可使用若干种方式来触发不稳定的组分。光和热暴露是触发不稳定的连接基团以释放被捕获抗体的可能手段。也有可能通过使用对被捕获抗体具有更高亲和力的竞争性结合剂置换被捕获细胞来释放它们。作为另一种选择,可将靶标全细胞在它们与磁性粒子连接情况下进行裂解。
为了有效测量细胞中的ATP,期望能有效率地将它提取而又不造成其降解。文献描述了许多不同的提取处理法。参见,例如,Karl D.M.;Microbiology Review,44,739,1980;Stanley,P.E.Methods inEnzymology,133,14,1986。最常用的提取剂之一为三氯乙酸(TCA)。TCA可用于从细胞释放ATP以及使存在于样品基质中的可导致ATP降解的酶失活。通常的TCA浓度在0.5%至2.5%(以体积计)的范围内,但因为TCA可抑制荧光素/荧光素酶反应,通常采用最低所需浓度的TCA,该浓度仍能有效率地提取给定细胞靶标的ATP含量。提取后,通常通过加入适当的缓冲液(例如,Tris-醋酸盐)来中和样品,以获得大约7.7的溶液pH。
通过细胞裂解提取ATP也可以其他方式来完成。例如,裂解可在常规条件下例如5℃至42℃(可能高至50℃)的温度,优选在15℃至25℃的温度下进行。值得注意到是,可使用未培养的细胞即直接的试验样品进行裂解,但也可使用经培养的细胞。
裂解可在对细胞进行物理裂解时发生。物理裂解可在将试验样品与玻璃小珠一起涡旋、对试验样品进行超声处理、加热和煮沸,或使试验样品经历高压时发生,例如在使用弗氏细胞压碎器时发生。
也可使用裂解剂进行裂解。合适的裂解剂包括例如酶(如,蛋白酶、糖苷酶、核酸酶)。示例性的酶包括溶葡球菌酶、胃蛋白酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、溶菌酶、无色肽酶、内肽酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、ALE-1、DNA酶和RNA酶。如果需要,可使用酶的各种组合。溶葡球菌酶尤其可用于检测金黄色葡萄球菌的存在的方法中。
其他的裂解剂包括盐(如离液盐)、增溶剂(如,去污剂)、还原剂(如,β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP;Pierce Chemical Company,Rockford,IL)、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)、酸(如,HCl)以及碱(如,NaOH)。这些裂解剂可能更适用于某些生物体,例如,相对于革兰氏阳性细菌而言它们可更适用于革兰氏阴性菌。
如果需要,可使用裂解剂和/或方法的各种组合。裂解方法在美国专利申请公布No.2005/0153370A1中有进一步论述。
此外,如果需要,并且样品为含粘液的样品,可在裂解之前或之后用至少一种可包括溶粘液剂的试剂对其进行进一步处理。用溶粘液剂处理含粘液的样品可减少分析过程中因粘液的存在引起的干扰。
溶粘液剂的例子包括酶(如,胃蛋白酶、DNA酶、RNA酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖苷酶)、盐(如,离液盐)、增溶剂(如,表面活性剂、去污剂)、还原剂(如,β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、半胱氨酸、TCEP、N-乙酰半胱氨酸)和酸(如,HCl)。如果需要,可使用这些溶粘液剂的各种组合。本领域技术人员将理解裂解剂和溶粘液剂之间可以有重叠;不过不是所有裂解剂都例如是溶粘液的。
在某些实施例中,如果样品为含粘液的样品,且溶粘液剂为还原剂,则可酸化该还原剂(如,具有小于3的pH)。可使用多种酸例如无机酸(如HCl)或有机酸(如乳酸、柠檬酸)将还原剂酸化。作为另一种选择,如果以足够高的浓度使用,则不需要用酸调节还原剂的pH。
通常,但任选地,在加入还原剂后,样品制备涉及使组合物中的还原剂失活。这可(例如)通过提供竞争性底物(例如,对N-乙酰半胱氨酸用牛血清白蛋白)来完成。使还原剂失活的试剂的其他例子包括包含中和缓冲液的稀释剂。中和缓冲液的代表性成分可包括(例如)缓冲剂(如,磷酸盐)、盐(如,NaCl)、蛋白质稳定剂(如,BSA、酪蛋白、血清)聚合物、糖和/或去污剂或表面活性剂(如,一种或多种以下的列有商品名和通常来源的试剂:NINATE 411(烷基苯磺酸铵,购自Stepan Co.,Northfield,IL)、ZONYL FSN 100(具有聚乙二醇的调聚物B单醚,购自E.I.DuPont de Nemours Co.)、Aerosol OT 100%(琥珀酸二辛酯磺酸钠,购自American Cyanamide Co.)、GEROPONT-77(N-油酰基-N-甲基牛磺酸钠,购自Rhodia Novacare)、BIO-TERGEAS-40(烯烃(C14-C16)磺酸钠,购自Stepan Co.)、STANDAPOL ES-1(十二烷基聚氧乙烯(1)硫酸钠,购自Cognis Corp.,Ambler,PA)、TETRONIC 1307(乙二胺烷氧基化物嵌段共聚物,购自BASF Corp.)、SURFYNOL 465、485和104PG-50(均购自Air Products and Chemicals,Inc.)、IGEPAL CA210(辛基酚乙氧基化物,购自Stepan Co.)、TRITONX-45、X-100和X-305(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇类,均购自The DowChemical Co.)、SILWET L-7600(聚二甲基硅氧烷甲基乙氧基化物,购自Momentive Performance Materials,Inc.,Wilton,CT)、RHODASURFON-870(聚乙氧基化(2)油醇,购自Rhodia Novacare)、CREMOPHOREL(聚氧乙氧基化蓖麻油,购自BASF Corp.)、TWEEN 20和TWEEN80(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和单油酸酯,二者均购自Sigma-Aldrich Corp.)、BRIJ 35(聚氧乙烯(23)十二烷基醚,购自Sigma-Aldrich Corp.)、CHEMAL LA-9(聚氧乙烯(9)月桂醇,购自PCCChemax,Piedmont,SC)、PLURONIC L64(聚(氧乙烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物,购自BASF Corp.)、SURFACTANT 10G(对-壬基苯氧基聚(缩水甘油),购自Arch Chemicals Inc.,Norwalk,CT)、SPAN 60(单硬脂酸脱水山梨醇酯,购自Sigma-Aldrich Corp.)、CREMOPHOR EL(一种聚氧乙烯基化蓖麻油,购自Sigma-Aldrich Corp.))。如需要,也可用中和缓冲液调节样品的pH。
除还原剂外,或作为还原剂的替代,含粘液的样品的样品制备可包括使用一种或多种表面活性剂或去污剂(例如在将样品和酶裂解剂与溶粘液剂混合之后或同时使用)。合适的表面活性剂可为非离子型的、阴离子型的、阳离子型的或两性离子型的。合适的例子包括十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸鈉(SLS)。如果需要,可使用表面活性剂的各种组合。
任选地,样品制备方法可包括随后使表面活性剂失活。这可通过(例如)提供竞争性底物来完成。使表面活性剂失活的其他例子包括使用试剂中和缓冲液,例如足以将溶粘液试验样品和表面活性剂的pH调节至至少为5的pH的缓冲液。优选地,该缓冲液足以将pH调节至不大于8。
而且,如果一种或多种样品制备试剂为酸性的,则优选将随后的包括所关注的被分析物的组合物中和至7至7.5或接近7.2的pH。这可(例如)通过提供缓冲液和/或稀释剂来完成。
本发明提供多种基于分析腺苷三磷酸(ATP)来分析样品中所关注的细菌的方法。这可直接或间接完成。
ATP检测可用作细菌负荷的指标。在直接ATP测定法中,将具有结合的细菌细胞的固体支撑物与样品的其余部分(其可含有干扰性组分例如胞外ATP)分离之后,将细胞裂解(可在存在磁性粒子的情况下完成)并与萤光素和萤光素酶接触。然后可例如用光度计检测并且优选测量所产生的生物发光,该生物发光的强度与被捕获的细菌细胞的数量成比例。该方法描述于(例如)McElroy,W.D.和Deluca,M.A.;Firefly and bacterial luminescence:Basic science and applications;Journalof Applied Biochemistry,第5卷,197,(1983),以及Lundin,A.和Thore,A.;Analytical information obtainable by evaluation of the time course offirefly bioluminescence in the assay of ATP;Analytical Biochemistry,第66卷,47,(1975)。萤光素/萤光素酶制剂以及它们在直接ATP测定法中的使用方法为本领域技术人员所熟知并可商购获得(例如,可购自Promega Corporation(Madison WI)的ENLITEN rLuciferase/LuciferinReagent,或可购自Biotrace International(Bridgend UK)的Clean-Trace或Aqua-Trace)。典型的配方含有(例如)0.1毫克/升(mg/L)至10mg/L荧光素酶、15毫摩尔/升(mmol/L)至1000(mmol/L),优选15mmol/L至100mmol/L(如,36mmol/L)D-萤光素以及诸如MgCl2(2.5-25mmol)EDTA、BSA和pH 7缓冲液(更通常为pH7.8缓冲液)之类的物质。
ATP的量与细菌和/或其特征性的胞内内容物的量的关系可通过使用校准曲线容易地进行,所述校准曲线通过使用已知量的靶标细菌或其特征性的胞内内容物进行该测定法来产生并通过与其比较来估算未知量。对于优选的方法,将产生每一定数量的细菌发出的光的校准曲线,并从其获得每单位时间来自样品中未知量的物质的光输出的读数。
萤光素酶反应的速率决定发光信号的强度和衰减速率。因此,任何影响荧光素酶反应速率的环境变量也将影响发光信号的强度和时间上的稳定性。例如,温度将影响该系统的酶反应速率和发光输出。在进行该测定法时,期望保持温度控制以获得一致的结果。
反应的光输出也将随时间变化,所以期望了解该检测体系的动力学性质以便确保发光信号在其峰强度时得到测量。大多数的市售试剂被配制成可在更长时间内产生更恒定的光输出以使这些动力学效应减至最低。
萤光素酶反应的化学环境也将影响所产生的发光。例如,在来源处的或由于ATP检测之前的样品加工造成的污染样品的表面活性剂和溶剂会改变预期的光输出。因此,优选采取适当的控制并了解可能存在于具体样品类型中的对荧光素酶反应的潜在干扰源。同时,识别被分析样品是否含有污染性ATP(即,非细菌ATP)也是重要的。尽管本文描述的样品制备将减少污染性ATP的量,但是也可采用对样品的酶处理。例如,可在细胞捕获前用腺苷三磷酸双磷酸酶降解不包含在细胞中的ATP,以尽可能地使来自污染性ATP的背景信号最小化。
混合是ATP检测中的另一变量。将试剂与所提取的ATP完全混合可得到最佳性能。
而且,从靶标细胞提取ATP需要的时间不仅取决于所使用的提取剂而且还取决于靶标细胞的类型。从某些细菌提取ATP可能需要更长的时间。大多数的ATP试剂会固有地呈现ATP背景,不管它们的制备方法或纯度如何。这一背景信号可影响可达到的灵敏度,因此期望使用几乎没有背景ATP的试剂。
荧光素酶/荧光素试剂系统也应该包括热稳定剂以使它们的储存寿命最大化。大多数的市售荧光素酶/荧光素试剂被配制成热稳定的。
在间接ATP测定法中,在将具有结合的细菌细胞的固体支撑物与样品其余部分(其可能含有干扰性组分例如胞外ATP)分离之后,将细胞裂解(可在存在磁性粒子的情况下完成)并使裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生腺苷三磷酸(ATP)的条件下接触。该方法在(例如)美国专利No.5,798,214中有描述。腺苷酸激酶的使用也可用于富集含ATP的样品。
与样品混合的ADP的量优选足以提供在混合物中超过0.005mM,更优选超过0.01mM,并且最优选超过0.08mM的ADP浓度。转化步骤混合物中尤其优选的ADP量为约0.1mM。这可取决于ADP的纯度:高水平的ATP污染限制更高浓度的使用。实际可用的ADP范围为10mM至0.1mM。
有效产生ATP的条件包括存在摩尔浓度足以使得ADP向ATP的转化率最大的镁离子。对于上面列出的优选ADP浓度,在ADP向ATP转化过程中悬浮液或溶液中优选的镁离子浓度为1mM或更高,更优选5mM或更高,并且最优选10mM或更高。可以任何镁盐,但优选乙酸盐的形式提供镁离子。实际可用的Mg2-的范围为约0.1mM至约25mM。Mg2-的存在量可取决于ADP浓度等因素。
由于镁离子可引起ADP的不稳定(就使得污染性腺苷酸激酶过早地将其转化成ATP而言),优选在使用前不将它们在溶液中保持在一起,优选在即将使用前或在ADP转化步骤中将它们放在一起。由于腺苷酸激酶的活性需要镁离子,在加入ADP前将这些镁离子和样品混合在一起可能是优选的。在要将这些试剂保持在一起的情况中,优选将它们以冻干形式保存以避免任何不稳定作用。
有效产生ATP的条件包括将裂解物与ADP和镁离子温育能有效将ADP转化为ATP的一段时间。上文对直接ATP测定法讨论的条件和考虑因素可类似地应用于间接ATP测定法。
可检测所产生的ATP,并优选的是,可测量所产生ATP的量,并将与细菌或其特征性胞内内容物的存在和/或量关联。这可如下进行:使用荧光素酶/荧光素试剂产生与所产生ATP的量成比例的光,并用光度计以与直接ATP测定法中相同的方式检测光。荧光素/荧光素酶制剂及它们的使用方法在上文对直接ATP测定法作了描述。优选的实施例涉及在温育开始时向样品添加荧光素/荧光素酶发光测定试剂,优选作为与ADP和镁离子源一起的单一试剂添加。这一实施例通常使用高纯度的荧光素酶试剂。在其中所有的试剂在ADP向ATP转化开始时以该方式加入,和/或其中光度计计数在加入荧光素/荧光素酶(这为单独的步骤)之后持续进行的本发明实施例中,可通过荧光素/荧光素酶试剂提供镁。然而,由于荧光素酶和EDTA对镁离子的结合,通常通过预先试验或计算肯定地保证镁离子的量。本领域技术人员将认识到,要加至给定ADP样品和荧光素/荧光素酶混合物的最佳镁盐量,可通过使用含有可籍以获得最大信号的已知细菌量的样品进行常规实验而轻易测定。
在示例性实施例中,可使用一种并且有利的是两种抗体捕获和分离细菌,并进行分析。所分离的细菌可在选择性富集肉汤中富集并洗涤以移除未结合的物质。将含有裂解试剂(如溶葡球菌酶)和腺苷二磷酸的试剂加到洗涤过的样品中。裂解的细胞释放出可催化ADP向ATP的反应的腺苷酸激酶。然后,将荧光素和荧光素酶添加至样品,在存在ATP的情况下发光。
本发明还提供用于实施本发明各种方法的试剂盒或系统。在一个具体的实施例中,试剂盒将包括例如:(1)样品采集装置(例如美国专利No.5,879,635中描述的装置);(2)磁性小珠;(3)将该小珠从样品分离的磁体;(4)样品制备溶液(例如,用于除去非特异吸附的细胞和其他干扰性物质的洗涤溶液,用于提取ATP的裂解剂/提取剂),在例如用于将它们进行递送的适当移液管或试剂瓶中;(5)荧光素酶/荧光素试剂,在例如用于将它们进行递送的适当移液管或试剂瓶中;以及(6)读取光输出的光度计。
本发明提供以下示例性实施例:
1.一种分析样品中的细菌的方法,所述方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料;
使所述样品、所述固体支撑物材料和所述一种或多种抗体之间在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话能有效捕获所述靶标全细胞的条件下接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;
裂解所述靶标全细胞以形成裂解物;以及
通过直接或间接分析所述裂解物的ATP来分析所述特定细菌是否存在。
2.实施例1的方法,其中所述一种或多种抗体连接至所述固体支撑物材料而形成被分析物结合性材料,并且所述方法包括
使所述样品和所述被分析物结合性材料之间在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的全细胞的话能有效捕获所述全细胞的条件下接触。
3.实施例2的方法,其中提供所述样品和所述被分析物结合性材料之间的接触包括所述样品与所述一种或多种抗体之间的同时接触。
4.实施例1的方法,其中提供所述样品、所述固体支撑物材料和所述一种或多种抗体之间的接触包括提供所述一种或多种抗体和所述样品之间的接触以形成结合抗体的全细胞,并随后提供所述抗体结合的全细胞和所述固体支撑物材料之间的接触。
5.实施例1至4中任一项的方法,其中所述特定细菌包括革兰氏阳性细菌。
6.实施例5的方法,其中所述特定细菌包括金黄色葡萄球菌。
7.实施例1至6中任一项的方法,其中至少20%的所述靶标全细胞被捕获。
8.实施例7的方法,其中至少50%的所述靶标全细胞被捕获。
9.实施例8的方法,其中至少80%的所述靶标全细胞被捕获。
l0.实施例1至9中任一项的方法,其中所述固体支撑物材料包含浓度大于0.04mg/mL的粒子。
11.实施例1至10中任一项的方法,其中所述固体支撑物材料包含粒子并且所述抗体与所述粒子的比率大于1μg/mg粒子。
12.实施例1至11中任一项的方法,其中所述固体支撑物材料包含粒子并且所述抗体与所述粒子的比率为至少0.01μg/mg粒子。
13.实施例12的方法,其中所述抗体与所述粒子的比率小于10μg/mg粒子。
14.实施例1至13中任一项的方法,其中每个粒子具有设置在其上的结合不同被分析物的至少两种抗体。
15.实施例1至14中任一项的方法,其中所述靶标全细胞在裂解前从所述磁性粒子移除。
16.实施例1至15中任一项的方法,其中通过直接或间接分析ATP来分析是否存在所述特定细菌包括:
使所述裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在能有效通过任何存在的腺苷酸激酶产生腺苷三磷酸(ATP)的条件下接触;以及
检测所产生的ATP是否存在。
17.实施例16的方法,其中检测所产生的ATP是否存在包括测量所产生的腺苷三磷酸(ATP)的量并将其与特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的存在和/或量关联。
18.实施例16或实施例17的方法,其中检测所产生的ATP是否存在包括使含有所述裂解物和ADP的混合物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与所产生的ATP的量成比例的光,以及用光度计检测所述光。
19.实施例16至18中任一项的方法,其中所述有效产生ATP的条件包括存在足以使得ADP向ATP的转化率最大的摩尔浓度的镁离子。
20.实施例19的方法,所述有效产生ATP的条件包括将所述裂解物与所述ADP和所述镁离子温育将ADP有效转化成ATP的一段时间。
21.实施例1至15中任一项的方法,其中通过直接或间接分析ATP来分析所述特定细菌是否存在包括:
使所述裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;以及
用光度计检测所述光。
22.实施例21的方法,其中分析所述特定细菌是否存在还包括测量ATP的存在量并将其与细菌或胞内物质的存在量关联。
23.一种分析样品中的细菌的方法,该方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品、所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;裂解所述靶标全细胞以形成裂解物并且如果存在腺苷三磷酸(ATP)的话释放出ATP;
使所述裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;
用光度计检测所述光;以及
测量ATP的存在量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的存在量关联。
24.一种分析样品中的细菌的方法,所述方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品、所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;
裂解所述靶标全细胞以形成裂解物;
使所述裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生腺苷三磷酸(ATP)的条件下接触;以及测量所产生的腺苷三磷酸的量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的量关联。
25.实施例1至24中任一项的方法,其中所述固体支撑物材料包括连接有两种或更多种抗体的磁性粒子,所述抗体对所述特定细菌特征性的两种或更多种独特被分析物具有抗原特异性。
实例
现已结合发明人所预见的、给出了操作性描述(enabling description)的若干具体实施例描述了本发明。本发明的非实质修改形式,包括非当前所预见的修改形式,仍可构成其等同物。因此,本发明的范围不应受本文所述的细节和结构的限制,而是仅受以下权利要求书和其等同物的限制。
除非另外指明,否则实例以及说明书其余部分中的所有份数、百分数、比率等均以摩尔计。所有未指明供应商的溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)。水是用电阻系数为18.2Mohms/cm的U-V Milli-Q纯水器(Millipore,Bedford MA)进行纯化。
缩写表
制备实例1-抗体官能化磁性小珠的制备
鼠抗A蛋白单克隆抗体MAb-107在于2006年11月22日提交的美国专利申请系列号11/562,747和PCT专利公布No.WO 2008/143697(二者标题均为“ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY”(具有A蛋白选择性的抗体))中有描述。将鼠抗A蛋白单克隆抗体MAb-107用得自Pierce的EZ-Link NHS-PEO4-生物素(产品编号21330)按照生产商的说明书进行生物素酰化。链霉抗生物素蛋白包被的磁性粒子(1μm Dynal T1)从Invitrogen,Inc.(Carlsbad,CA)获得。除非另外指明,否则所有反应和洗涤均在PBS L-64缓冲液(含0.2%w/v PLURONICL64的磷酸缓冲盐水)中进行。洗涤步骤包括三次连续的洗涤,除非另外指明。洗涤过程包括将磁体靠近管子放置,以将粒子吸到管子靠近磁体的一侧,将液体从有磁体靠近的管子中移除,然后加入等体积的新鲜缓冲液代替被移除的液体。移除磁体,让粒子重悬和混合。
将浓度为2.5毫克/毫升(mg/mL)的链霉抗生物素蛋白包被磁性粒子与生物素酰化的抗体制品在500微升(μL)PBS L-64缓冲液中混合。抗体与用于缀合的粒子的质量比为40μg抗体/mg粒子。将所得的混合物在37℃下温育1小时。随后,将粒子在PBSL-64缓冲液中洗涤,以除去未结合的抗体。最后一次洗涤后,将粒子重悬成2.5mg/mL的粒子浓度。
制备实例2-含PLURONIC L64缓冲剂的磷酸缓冲盐水(PBS-L64
缓冲液)的制备
通过将10x PBS浓缩液(商购自EMD Biosciences(San Diego CA))稀释十倍制备磷酸缓冲盐水(PBS)溶液。这得到具有以下盐组成的PBS缓冲溶液:10mM磷酸钠、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾。该PBS缓冲液25℃时pH为7.5。为了制备含PLURONIC L64溶液的磷酸缓冲盐水(PBS-L64缓冲液),将0.2%(w/v)PLURONIC L64表面活性剂(购自BASF Corporation,(Mount Olive,NJ))加入PBS缓冲液中。该PBS-L64缓冲液25℃时pH为7.5。
制备实例3-金黄色葡萄球菌悬液的制备
金黄色葡萄球菌可以商品名ATCC 25923从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)获得。使细菌生长于通过用细菌接种5-10毫升制备的无菌胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics,Santa Maria,CA)而制备的过夜(37℃下17-22小时)肉汤培养物中。培养物通过在Eppendorf型号5804R离心机(Brinkman Instruments,Westbury,NY)中离心(8,000-10,000rpm)15分钟进行洗涤,然后重悬于PBS L64缓冲液中并通过用这个溶液另外离心3个循环进行洗涤。
制备实例4-表皮葡萄球菌悬液的制备
表皮葡萄球菌可以商品名ATCC 12228从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)获得。使细菌生长于通过用细菌接种5-10毫升制备的无菌胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics,Santa Maria,CA)而制备的过夜(37℃下17-22小时)肉汤培养物中。培养物通过在Eppendorf型号5804R离心机(Brinkman Instruments,Westbury,NY)中离心(8,000-10,000rpm)15分钟进行洗涤,然后重悬于PBS L64缓冲液中并通过用这个溶液另外离心3个循环进行洗涤。
制备实例5-裂解溶液的制备
通过在搅拌下将100mg的溶葡球菌酶(目录号L-4402,Sigma-Aldrich)溶解于10mL PBS L64缓冲液得到含10μg/mL浓度的溶葡球菌酶的裂解溶液,来制备裂解缓冲液。
实例1-6-响应金黄色葡萄球菌检测的样品
检测金黄色葡萄球菌的测定法如下进行:
(1)将十六(16)μL的用MAb 107抗体官能化的磁性小珠悬液(如制备实例1中制备)加入聚丙烯微量离心管(购自VWR Scientific,West Chester PA)。向所述微量离心管加入484μL的给定浓度(报告于表1)的于PBS-L64缓冲液(如制备实例2和3中制备)中的金黄色葡萄球菌悬液。所得混合物用Barnstead LabQuake摇动器(购自Barnstead International,Dubuque IA)在摇动搅动下于室温下温育15分钟。
(2)然后通过将该微量离心管放在Dynal磁性固定装置(获自Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)中至少5分钟,对小珠进行分离和集中。在不破坏聚集的小珠的情况下用微量移液器吸取上清液并弃去。
(3)然后通过向管中加入0.5mL PBS-L64缓冲液并以摇动运动搅动5分钟,将小珠进行洗涤。然后将微量离心管放在Dynal磁性固定装置中至少5分钟,对小珠再次进行分离和集中。在不破坏聚集的小珠的情况下用微量移液器吸取洗涤溶液并弃去。再一次重复这个洗涤步骤。
(4)将一百(100)μL的溶葡球菌酶溶液(如制备实例5中制备)加至洗涤过的磁性小珠。然后将该微量离心管旋涡混合10秒,让其静置5分钟。
(5)然后将微量离心管放在Dynal磁性固定装置中至少5分钟,对小珠再次进行分离和集中。然后,在移出拭子和移除BiotraceAqua-Trace测试装置的装有粒状裂解剂的底室的密封箔之后,用微量移液器将所有的上清液(100μL)吸取至该底室中。Biotrace装置的底室装有通过萤光素酶生物发光测定ATP的存在所需的所有干燥试剂(荧光素酶/荧光素和稳定剂)。将样品旋涡混合10秒并在向Biotrace装置加入步骤(4)的上清液后三十秒内置于Biotrace光度计(UniLiteNG)中。每个样品的生物发光响应以相对发光单位(RLU)在表1中报道。三次重复试验的平均RLU在表1中报道。表1还示出了所报道的RLU值的1σ标准偏差。该表示出了使用相同的官能化磁性小珠的两种不同制品的两次试验的结果。在实例1-3中,使用在4℃下保存了五个月的小珠制品,而实例4-6显示了使用新鲜制备的小珠溶液得到的结果。两个试验仅在最高的受试金黄色葡萄球菌浓度下具有统计学上显著的差异。这表明,新鲜制备的小珠溶液比已保存五个月的小珠溶液更有效地捕获细菌。通过捕获后对小珠进行接种和培养独立地验证该两个批次的小珠溶液的捕获效率,显示新鲜制备溶液的捕获效率为总细菌浓度(106cfu/ml)的大约80%,而保存过的溶液具有大约60%的捕获效率。这些实例证明了能够检测一定范围浓度的靶标生物体,检测限低至10000cfu/mL。
表1.
实例7-10-在存在表皮葡萄球菌的情况下响应金黄色葡萄球菌检
测的样品
在存在表皮葡萄球菌的情况下检测金黄色葡萄球的测定法按照实例1-6所述进行,包括将表皮葡萄球菌的样品(如制备实例4中制备)混合进含有金黄色葡萄球菌的溶液中,以证明在存在显著浓度的干扰性生物体(表皮葡萄球菌)的情况下能够检测靶标被分析物(金黄色葡萄球菌)。三次重复试验的平均RLU在表2中报道。表2还示出了所报道的RLU值的1σ标准偏差。实例7为阴性对照,实例8和9分别为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的阳性对照,实例10为混合样品。
表2.
实例11-24-裂解剂对不同细菌靶标的ATP检测的影响
这些实例证明不同裂解剂对基于ATP的对不同细菌的检测的影响。在实例11-17中,将10μL的金黄色葡萄球菌在PBS-L64缓冲液中的悬液(如制备实例2和3中制备)或表皮葡萄球菌在PBS-L64缓冲液中的悬液(如制备实例2和4中制备)加至90μL的溶葡球菌酶溶液(如制备实例5中制备)中,以得到表3中报道的细菌浓度。将各样品旋涡混合5分钟并如上文实例1-6所用程序的步骤(5)中所述加到Biotrace Aqua-Trace检测装置的底层腔室。作为另一种选择,对于实例18-24,将10mL的金黄色葡萄球菌在PBS-L64缓冲液中的悬液或表皮葡萄球菌在PBS-L64缓冲液中的悬液掺到Biotrace Clean-Trace检测的拭子上。然后,根据生产商说明进行该检测的其余部分。Clean-Trace检测使用非酶裂解剂。两次重复试验的平均RLU在表3中报道。表3还示出了所报道的RLU值的1σ标准偏差。参见表格,当使用非特异性裂解剂(例如Clean-Trace产品所使用的那些)时,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的检测之间未观察到显著差异。然而,特异性酶裂解剂(例如溶葡球菌酶)可显示出差异裂解作用,这种可用于在存在密切相关的细菌的情况下对靶标生物体进行特异性检测。具有特异性裂解步骤的特异性样品制备与ATP检测的组合,可得到能够检测低至1000cfu/mL细菌浓度的优良系统。
表3.
藉此将本文引用的所有专利、专利申请、出版物和包括例如GenBank登录号在内的核酸和蛋白质数据库信息的完整公开内容以引用的方式并于本文,如同单独并入本文一样。在不背离本发明的范围和精神的前提下,本发明的各种修改和更改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,并且应该理解,本发明不应不当地受限于本文所述的示例性实施例。
Claims (25)
1.一种分析样品中的细菌的方法,所述方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述靶标全细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料;
使所述样品、所述固体支撑物材料和所述一种或多种抗体之间在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;
裂解所述靶标全细胞以形成裂解物;以及
通过直接或间接分析所述裂解物的ATP来分析所述特定细菌是否存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述一种或多种抗体连接至所述固体支撑物材料形成被分析物结合性材料,并且所述方法包括
在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的全细胞的话有效捕获所述全细胞的条件下,提供所述样品和所述被分析物结合性材料之间的接触。
3.根据权利要求2所述的方法,其中提供所述样品和所述被分析物结合性材料之间的接触包括所述样品与所述一种或多种抗体之间的同时接触。
4.根据权利要求1所述的方法,其中提供所述样品、所述固体支撑物材料和所述一种或多种抗体之间的接触包括提供所述一种或多种抗体和所述样品之间的接触以形成结合抗体的全细胞,并随后提供所述结合抗体的全细胞和所述固体支撑物材料之间的接触。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述特定细菌包括革兰氏阳性细菌。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述特定细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中至少20%的所述靶标全细胞被捕获。
8.根据权利要求7所述的方法,其中至少50%的所述靶标全细胞被捕获。
9.根据权利要求8所述的方法,其中至少80%的所述靶标全细胞被捕获。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述固体支撑物材料包含浓度大于0.04mg/mL的粒子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述固体支撑物材料包含粒子并且所述抗体与粒子的比率大于1μg/mg粒子。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述固体支撑物材料包含粒子并且所述抗体与粒子的比率为至少0.01g/mg粒子。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述抗体与粒子的比率小于10μg/mg粒子。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中每个粒子具有设置在其上的结合不同被分析物的至少两种抗体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述靶标全细胞在裂解前从所述磁性粒子移除。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中通过直接或间接分析ATP来分析所述特定细菌是否存在包括:
使所述裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生ATP的条件下接触;以及
检测所产生的ATP是否存在。
17.根据权利要求16所述的方法,其中检测所产生的ATP是否存在包括测量所产生的腺苷三磷酸(ATP)的量并将其与特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的存在和/或量关联。
18.根据权利要求16或17所述的方法,其中检测所产生的ATP是否存在包括使含有所述裂解物和ADP的混合物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与所产生的ATP的量成比例的光,以及用光度计检测所述光。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法,其中所述有效产生ATP的条件包括存在足以使得ADP向ATP的转化率最大的摩尔浓度的镁离子。
20.根据权利要求19所述的方法,所述有效产生ATP的条件包括将所述裂解物与所述ADP和所述镁离子温育将ADP有效转化成ATP的一段时间。
21.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中通过直接或间接分析ATP来分析所述特定细菌是否存在包括:
使所述裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;以及
用光度计检测所述光。
22.根据权利要求21所述的方法,其中分析所述特定细菌是否存在还包括测量ATP的存在量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的存在量关联。
23.一种分析样品中的细菌的方法,所述方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述靶标全细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品、所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;
裂解所述靶标全细胞以形成裂解物,并且如果存在腺苷三磷酸(ATP)的话释放ATP;
使所述裂解物与荧光素酶/荧光素试剂接触以产生与ATP的存在量成比例的光;
用光度计检测所述光;以及
测量ATP的存在量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的存在量关联。
24.一种分析样品中的细菌的方法,所述方法包括:
提供疑似包括靶标全细胞的样品,所述靶标全细胞包含特定细菌特征性的一种或多种被分析物;
提供包含磁性粒子的固体支撑物材料,所述磁性粒子上连接有对所述特定细菌特征性的一种或多种独特被分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体,其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合;
在如果存在具有特定细菌特征性的一种或多种被分析物的靶标全细胞的话有效捕获所述靶标全细胞的条件下,提供所述样品和所述连接有所述一种或多种抗体的磁性粒子之间的接触;
从所述样品分离捕获的靶标全细胞;
裂解所述靶标全细胞以形成裂解物;
使所述裂解物与含有腺苷二磷酸(ADP)的溶液在通过任何存在的腺苷酸激酶有效产生腺苷三磷酸(ATP)的条件下接触;以及
测量所产生的腺苷三磷酸的量并将其与所述特定细菌或所述特定细菌特征性的胞内物质的量关联。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述固体支撑物材料包含连接有两种或更多种抗体的磁性粒子,所述抗体对所述特定细菌特征性的两种或更多种独特被分析物具有抗原特异性。
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2009
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