JP2020526768A - バイオセンサーデバイスにおける信号増幅 - Google Patents

Abstract

弾性波バイオセンサー部品を提供する。分析物がバイオセンサー上の捕捉剤に付着した後、ポリマーまたは金属材料を分析物に塗布するステップを含む、バイオセンサー信号を増幅する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／５３１，２３８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、タンパク質、細胞、および核酸を含む標的分析物を含む試験試料を分析するためのデバイスおよび方法に関する。より詳細には、本開示は、分析物結合からの信号の変調または増幅に関し、本明細書で開示されたプラットフォーム技術は、高感度および高い選択性を備えた様々なバイオセンサーの開発に好適である。

弾性波センサーは、摂動（例えば、振幅、周波数、位相、時間遅延などの変化）に敏感な材料を通過する機械波または弾性波のそのような摂動の検出に基づく検出機構を使用する。弾性波が弾性波センサー材料の表面にわたってまたは表面上で伝播するとき、センサー材料の物理的または化学的特性の変化（例えば、波路における分析物の質量および／または粘度変化などを含む）により、弾性表面波またはバルク弾性波の速度および／または振幅に影響を与える場合がある。これらの変化を検出し、それらの表面にある対応する量と相関させ、次いで測定して、センサー材料内／上にある分析物の物理的／化学的特性を感知／検出することができる。残念ながら、標的分子とセンサー表面との間の結合は弱い場合があり、従来の弾性波センサーは多くの場合感度が不足し、標的が提示されると効率的に動作しない。したがって、当技術分野において、弾性波センサー信号の検出感度および選択性を高めるデバイスおよび方法が必要である。

一態様では、本開示は、バイオセンサーにおいて信号を増幅する方法であって、捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、捕捉試薬は、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部分を含み、捕捉試薬はバイオセンサー上に固定化されている、ステップと；信号増幅材料を導入するステップであって、信号増幅材料は、分析物に結合するための１つまたは複数の第２の認識部分を有する、ステップと、を含む方法を提供する。

一実施形態では、信号増幅材料は、ポリマー、金属、または金属酸化物である。

一実施形態では、信号増幅材料は、ポリスチレンである。

一実施形態では、信号増幅材料は、種々の材料のビーズの形態である。

一実施形態では、ビーズは、約１ｎｍ〜約１００μｍの範囲の平均直径を有する。

一実施形態では、信号増幅材料は、分析物がバイオセンサーに結合した後に導入される。

一実施形態では、信号増幅材料は、分析物がバイオセンサーに結合する前に導入される。

一実施形態では、この方法は、試料をバイオセンサーに塗布する前に、ベースレベル信号を測定するステップを含む。

一実施形態では、この方法は、信号増幅材料が分析物に結合した後に、試験レベル信号を測定するステップを含む。

一実施形態では、この方法は、ベースレベル信号を試験レベル信号と比較して、試料中の分析物の存在を判定するステップを含む。

一実施形態では、第１の認識部分は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、小分子またはタンパク質に結合する部分である。

一実施形態では、第１の認識部分は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、アフィマー（affirmer）およびアプタマーからなる群から選択される。

一実施形態では、第２の認識部分は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、またはタンパク質に結合する部分である。

一実施形態では、第２の認識部分は、ポリマー、金属または金属酸化物材料とコンジュゲートした、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、アフィマー（affirmer）およびアプタマーからなる群から選択される。

一実施形態では、試料は、環境試料または生体試料である。

一実施形態では、生体試料は、血液、血清、血漿、尿、痰、糞便、鼻もしくは膣スワブ、涙、脳脊髄液、心膜液、眼内液、嚢胞液、または唾液である。

一態様では、本開示は、試料中の分析物の存在または量を判定する方法であって、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部位を有する捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、捕捉試薬はバイオセンサー上に固定化されている、ステップと；信号増幅材料を導入するステップであって、ポリマーまたは金属材料は、分析物を結合するための１つまたは複数の第２の認識部位を有する、ステップと、分析物が信号増幅材料に結合した結果としての、バイオセンサー信号の振幅、位相、または周波数の変化を測定する、ステップと、を含む方法を提供する。

一態様では、本開示は、圧電基材と；捕捉試薬であって、捕捉試薬は圧電基材上に固定化されており、捕捉剤は分析物に対する第１の認識部位を有する、捕捉試薬と、分析物に対する第２の認識部位を有する信号増幅材料と、を有する、バイオセンサー部品を提供する。

一実施形態では、バイオセンサーは、捕捉試薬を圧電基材に付着させるアンカー物質をさらに含む。

一実施形態では、圧電基材は、アルミニウム（Ａｌ）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ₃）、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ₃）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）、およびホウケイ酸塩からなる群から選択される。

一実施形態では、アンカー物質は、シラン基またはチオール基を介して圧電基材の表面に結合する。

一実施形態では、アンカー物質は、アビジン、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから選択されるリンカータンパク質を含む。

一実施形態では、リンカータンパク質は、ニュートラアビジン、天然アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアビジンである。

一実施形態では、捕捉試薬は、アンカー物質のリンカータンパク質に結合するためのビオチン部分を含む。

一実施形態では、第１の認識部位は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、またはタンパク質に結合するように構成されている。

一実施形態では、バイオセンサー部品は、弾性波トランスデューサをさらに備える。

一実施形態では、弾性波トランスデューサは、バルク弾性波を生成する。

一実施形態では、バルク弾性波は、厚みすべりモード、音響プレートモード、および水平プレートモードからなる群から選択される。

一実施形態では、バイオセンサー部品は、フィルムバルク弾性波共振器ベース（ＦＢＡＲベース）のデバイスである。

一実施形態では、弾性波トランスデューサは、弾性表面波を生成する。

一実施形態では、弾性表面波は、横波型弾性表面波、表面横波、レイリー波、およびラブ波からなる群から選択される。

一態様では、本開示は、前述のいずれか１つのバイオセンサー部品を含むバルク波共振器を提供する。

いくつかの実施形態は、捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、捕捉試薬は、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部分を含み、捕捉試薬はバイオセンサー上に固定化されている、ステップと；信号増幅材料を導入するステップであって、信号増幅材料は、分析物に結合するための１つまたは複数の第２の認識部分を有する、ステップと、を含む、バイオセンサーへの信号を増幅する方法に関する。

いくつかの実施形態は、分析物の存在または量を判定する方法であって、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部位を有する捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、捕捉試薬はバイオセンサー上に固定化されている、ステップと；信号増幅材料を導入するステップであって、ポリマーまたは金属材料は、分析物の異なる部分で分析物を結合するための１つまたは複数の第２の認識部位を有する、ステップと、分析物が信号増幅材料に結合した結果としての、バイオセンサー信号の振幅、位相、または周波数の変化を測定する、ステップと、を含む方法に関する。

いくつかの実施形態は、圧電基材と；捕捉試薬であって、捕捉試薬は圧電基材上に固定化されており、捕捉剤は分析物に対する第１の認識部位を有する、捕捉試薬と、分析物に対する第２の認識部位を有する信号増幅材料と、を有する、バイオセンサー部品に関する。

いくつかの実施形態は、本明細書に記載のバイオセンサー部品を含むバルク波共振器に関する。

特定の用語
以下の用語は、下記でそれらに与えられた意味を有するものとする。

「アンカー物質」とは、（ｉ）圧電基材（「直接」結合用）またはセンサー表面の金属部分またはその上の中間コーティングと、（ｉｉ）「捕捉試薬」（以下で定義する）との両方に結合するコーティング材料を指す。この用語には、アビジンであって、特異的結合パートナーとして機能するビオチンに結合する能力によって機能的に定義されたタンパク質ファミリーのメンバーであるもの（すなわち、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン）、ならびに、特異的親和性結合パートナーを有するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドおよびタンパク質であって、これらを使用して、捕捉試薬を改変し、したがって捕捉試薬をアンカーコーティング圧電／センサー材料に結合させることができるもの、が含まれる。また、例えば、抗体および抗体断片（Ｆｅ断片）ならびに単一ドメイン抗体およびアプタマーなどのヌクレオチド断片における、炭水化物群に結合する天然の炭水化物結合レクチンも含まれる。試験の精度に影響を与える立体配座の変化または捕捉試薬の部分的な変性のリスクがあるため、一般に、捕捉試薬をアンカーとして使用することは好ましくない。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、イオン交換法により直接に、または適用された中間の銀コーティングを介し、イオンまたは双極子部位を介して、圧電材料に結合することができる。それらの特異的結合パートナーは相補的ヌクレオチド分子であり、それらは捕捉試薬を改変するために使用することができる。

「捕捉試薬」とは、生体試料中の分析物に特異的に結合し、生体試料からの分析物を捕捉することにより、分析物を識別および／または定量するために使用することができる物質を意味する。この用語には、抗体、アプタマー、およびそれらの抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。捕捉試薬は、アンカー物質の特異的結合パートナーであるリンキング基による改変（例えば、ビオチン化または相補的核酸）の有無にかかわらず、アンカー物質に結合する。換言すれば、捕捉試薬は、アンカー物質の特異的結合パートナーであるかまたはそれを含み、同時に特異的に分析物を認識する。

基質表面へアンカー物質を結合するのに適用される「直接的」または「直接に」とは、基材表面上に中間コーティングが付与されずに、基質表面に結合することを意味する。基材表面は、たとえばプラズマ、紫外線照射の適用によって、または表面上の金属イオンを置換するが圧電表面上の表面金属イオンに中間材料の追加層を堆積させない、銀イオンのイオン交換堆積によって、改質してもよい。

「有機小分子」とは、約１０ダルトン超約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１０〜約１０００ダルトンの間、より好ましくは約１０〜約５００ダルトンの間の分子量を有する、天然または合成のいずれかの有機分子を指す。

本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値の略記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０を含む群の任意の数、数の組合せ、または部分範囲、ならびに前述の整数の間にあるすべての小数、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９が含まれると理解される。部分範囲に関しては、範囲のいずれかの端点から延びる「入れ子になった部分範囲」が特に考えられる。例えば、１〜５０の例示的な範囲の入れ子になった部分範囲は、ある方向に１〜１０、１〜２０、１〜３０、および１〜４０、または他の方向に５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、および５０〜１０を含んでもよい。

ビオチン化ビーズの結合に対する、チオール化ニュートラアビジン修飾表面弾性波センサー（ＳＡＷ）の応答を示す。図１Ａは、チオール化ニュートラアビジン修飾表面のビオチン化ポリスチレンビーズへの結合スキームを示し；図１Ｂは、ポリスチレンビーズのＳＡＷセンサーへの結合によって誘発された質量誘発周波数シフトを示し；図１Ｃは、デバイスを洗浄して過剰のビオチン化ポリスチレンビーズを除去した後の蛍光顕微鏡法を示し；図１Ｄは、異なるビーズ希釈による周波数シフトを示す。 上記参照。 上記参照。 上記参照。 ＳＡＷデバイスのアルミニウム表面上での質量増幅による、分析物の捕捉および検出強化のための、例示的な親和性ベースの／ナノ粒子戦略を示す。

本開示は、少なくとも部分的に、信号増幅材料（例えば、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、ビーズ、ポリスチレンビーズなど）が、標的分析物またはバイオセンサー表面に適用された二次抗体（例えば、結合活性を有する抗体、抗体断片、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど）に直接結合またはコンジュゲートされ得るという発見に基づいている。信号増幅材料は、標的分析物に直接結合またはコンジュゲートされてもよく、または（例えば、増幅材料の積層を作成するために）、信号増幅材料の第２の層に結合またはコンジュゲートされてもよい。本明細書の信号増幅材料および技術は、ＳＡＷセンサーの質量負荷または粘度変化を増加させることにより、信号感度と選択性の両方を高めることによって、従来技術の方法を上回る大きな利点を提供する。

バイオセンサー部品
いくつかの実施形態は、圧電基材と；捕捉試薬であって、捕捉試薬は圧電基材上に固定化されており、捕捉剤は、分析物に対する第１の認識部位を有する、捕捉試薬と、分析物に対する第２の認識部位を有する信号増幅材料と、を含む、バイオセンサー部品に関する。

センサーの表面は、金属層（例えば、アルミニウムまたはアルミニウム合金、金、銀、チタン、クロム、白金、タングステンなど）であっても圧電結晶材料上に堆積された金属表面を有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、センサーの表面は、圧電結晶材料上に堆積した金属層（例えば、アルミニウムまたはアルミニウム合金）であり得る。いくつかの実施形態では、センサーのセクションは、結晶と交互に金属コーティングを含んでいても、または誘電体材料層で覆われていてもよい。いくつかの実施形態では、誘電体層はポリマーまたはセラミック層であり得る。いくつかの実施形態では、誘電体層は、ＳｉＯ₂、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、酸化亜鉛、または窒化アルミニウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、誘電体層は、金、チタン、白金などの金属からなってもよい。いくつかの実施形態では、好適な結晶を種々の結晶カットとともに使用することができる。いくつかの実施形態では、センサーのセクションは、圧電基材上に堆積した誘電体層を含み得る。いくつかの実施形態では、センサーのセクションは、金属層上に堆積した誘電体層を含んでもよく、さらに金属層は圧電基材上に堆積している。いくつかの実施形態では、センサーのセクションは、誘電体層上に堆積した金属層を含んでもよく、さらに誘電体層は金属層上に堆積している。いくつかの実施形態では、センサーのセクションは、誘電体層上に堆積した第１の金属層を含んでもよく、さらに誘電体層は第２の金属層上に堆積しており、さらに第２の金属層は圧電基材上に堆積している。標的分析物の検出のためのＳＡＷおよびバルク弾性波（「ＢＡＷ」）センサーの使用に関するすべての好適なアプローチは、本明細書に記載の好適なコーティングでセンサー表面を修飾する能力に基づくことができる。生体分子の検出のために、センサー表面は、所望の標的分析物を選択的に捕捉することができる好適な材料で固定化または改変することができる。

圧電表面は、任意の好適な圧電材料で製造することができる。いくつかの実施形態では、圧電基材は、水晶、ニオブ酸リチウムおよびタンタル酸リチウム、３６°Ｙ水晶、３６°ＹＸタンタル酸リチウム、ランガサイト、ランガテート、ランガナイト、チタン酸ジルコン酸鉛、硫化カドミウム、ベルリナイト、ヨウ素酸リチウム、四ホウ酸リチウム、酸化ビスマスゲルマニウム、酸化亜鉛、窒化アルミニウム、窒化ガリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、圧電基材は、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、Ａｌ合金、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される金属材料でコーティングされている。いくつかの実施形態では、圧電基材はアルミニウムでコーティングされている。いくつかの実施形態では、圧電基材はＡｌ合金でコーティングされている。いくつかの実施形態では、金属は、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、アルミニウム合金、銀、チタン、クロム、白金、タングステン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、誘電体層はポリマーまたはセラミック層であり得る。いくつかの実施形態では、誘電体層は、ＳｉＯ₂、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、酸化亜鉛、または窒化アルミニウムを含むことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバイオセンサー部品は、捕捉試薬を圧電基材に付着させるアンカー物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、アンカー物質は、シラン基またはチオール基を介して圧電基材の表面に結合する。

いくつかの実施形態では、リンカータンパク質は、アビジン、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、リンカータンパク質は、ニュートラアビジン、天然アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアビジンである。

捕捉試薬は、以下の、ビオチン化オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、（Pon, Richard T. (1991). "A long chain biotin phosphoramidate reagent for the automated synthesis of 5'-biotinylated oligonucleotides". Tetrahedron Letters 32 (14): 1715-1718）、タンパク質、ペプチド、およびＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、膜受容体、キナーゼ、プロテインＡ、ポリＵ、ポリＡ、ポリリジン受容体、多糖、キレート剤、炭水化物および糖のいずれかから形成された、抗体またはアプタマーまたは他の特定のリガンドまたは受容体であり得る。

いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、アンカー物質の結合タンパク質に結合するためのビオチン部分を含む。

いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、抗体、タンパク質または小分子に結合するための部分を含む。いくつかの実施形態では、部分は、抗体、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチド、アフィマー、抗体断片、単一ドメイン抗体、アプタマーまたはヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、抗体であり得る。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、アフィマーまたはアプタマーまたはキレート剤であり得る。

いくつかの実施形態では、表面改質は、捕捉剤を固定化するために使用される１つまたは複数の官能基を有する結合成分を含む。いくつかの実施形態では、表面改質は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳ、エポキシ、カルボン酸、カルボニル、マレイミドおよびアミンからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を有する。

いくつかの実施形態では、分析物は、ジカ（Zika）ウイルスの断片であり得る。いくつかの実施形態では、分析物は、ジカウイルスのＥタンパク質であり得る。

例示された検出方法のいくつかは、捕捉分子として付着した抗体を有する表面として示されている。しかし、方法は、抗体に限定されなくてもよく、センサー表面上にタンパク質断片、アフィマー、抗体断片、アプタマーまたはヌクレオチドを含むがこれらに限定されない他の捕捉剤を固定化するように適合させることができる。

いくつかの実施形態では、第２の認識部位は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、小分子、またはタンパク質に結合するように構成されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバイオセンサー部品は、弾性波トランスデューサをさらに備える。いくつかの実施形態では、弾性波トランスデューサは、ＢＡＷを生成する。

いくつかの実施形態では、バルク弾性波は、厚みすべりモード、音響プレートモード、および水平プレートモードからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、バイオセンサー部品は、フィルムバルク弾性波共振器ベース（ＦＢＡＲベース）のデバイスである。

いくつかの実施形態では、弾性波トランスデューサは、弾性表面波を生成する。

いくつかの実施形態では、ＳＡＷは、横波型弾性表面波、表面横波、レイリー波、およびラブ波からなる群から選択される。

バルク弾性波共振器
バルク弾性波（ＢＡＷ）共振器は、２つの電極の間に挟まれた少なくとも１つの圧電材料で構成されるデバイスである。電極は、圧電材料に交番電界を印加して、これにより、応力が発生し、ＢＡＷが生成される。設計によっては、１つまたは複数の音響インピーダンスの高い層と低い層を付加して、ブラッグ反射器を作製するか、またはこれらの層を懸架してもよい。ＢＡＷ共振器には、複数の層、例えば、圧電基材（ＡｌＮ、ＰＺＴ、水晶、ＬｉＮｂＯ₃、ランガサイトなど）、電極（金、アルミニウム、銅など）、ブラッグ反射器（高音響インピーダンスまたは低音響インピーダンス材料）、分析物を捕捉するための層（生物活性層、抗体、抗原、ガス感受性層、パラジウムなど）、および弾性波を伝播することができる任意の材料を含めることができる。ＢＡＷセンサーは、本明細書に記載の種々の層の混合物であり得る。感知層（分析物を捕捉する層）は、電極（Ａ）と直接接触してもよく、またはブラッグ反射器上にあってもよく、または弾性波を伝播することができる任意の材料上にあってもよい。

いくつかの実施形態は、本明細書に記載のバイオセンサー部品を含むＢＡＷ共振器に関する。液体またはガスセンシング用のＢＡＷセンサーの構築は、ＢＡＷセンサーの表面と直接相互作用するものはすべて、その共振周波数を変更するという原則に基づいている。共振周波数（測定または位相周波数）をトラッキングおよびデコードすることにより、センサーの表面に付着した粒子の質量負荷および粘度を測定することができる。

バイオコーティング法
いくつかの実施形態は、材料の表面を生物活性フィルムでコーティングするプロセスであって、アンカー物質を含む第１の組成物を金属材料の表面に塗布して、表面上に単層を形成するステップであって、アンカー物質は、結合タンパク質および少なくとも１つの硫黄を有する官能基を含む、ステップ、および／またはビオチン化捕捉試薬を含む第２の組成物をアンカー物質の単層に塗布するステップであって、ビオチン化捕捉試薬は、結合タンパク質を介してアンカー物質に結合して、ビオチン化捕捉試薬の層を形成する、ステップとによる、プロセスに関する。

いくつかの実施形態は、金属表面を生物活性フィルムでコーティングするプロセスであって、アンカー物質を含む第１の組成物をアルミニウム、金、二酸化ケイ素またはＰＭＭＡ表面に塗布して、センサー表面上に単層を形成するステップであって、アンカー物質は、結合タンパク質およびチオール官能基を含む、ステップ、および／またはビオチン化捕捉試薬を含む第２の組成物をアンカー物質の単層に塗布するステップであって、ビオチン化捕捉試薬は、結合タンパク質を介してアンカー物質に結合し、ビオチン化捕捉試薬の層を形成する、ステップによる、プロセスに関する。

いくつかの実施形態は、圧電材料の表面をバイオフィルムでコーティングするプロセスであって、バイオフィルムは、アンカー物質の特異的結合パートナーを含むかまたは構成する捕捉試薬に結合する特性を有するアンカー物質を含み、このプロセスは、圧電材料の基材表面を処理して基材表面を活性化するステップと、アンカー物質の層を圧電基材の活性化表面に直接付与するステップと、を含む、プロセスに関する。

いくつかの実施形態では、この方法は、分析物に結合するための１つまたは複数の認識部位を有する信号増幅材料を導入するステップを含む。

いくつかの実施形態は、アルミニウム表面をバイオフィルムでコーティングするプロセスであって、バイオフィルムは、アンカー物質の特異的結合パートナーを含むかまたは構成する捕捉試薬に結合する特性を有するアンカー物質を含み、このプロセスは、アンカー物質の層を処理アルミニウム表面に付与して、圧電表面上にアンカー層を形成するステップを含み、アンカー物質は、チオール官能基を含む、プロセスを提供する。

いくつかの実施形態は、生体液試料中の分析物の存在または量を判定する方法であって、前述のバイオセンサー部品を、捕捉試薬を含む組成物と接触させるステップであって、捕捉試薬は、アンカー物質に対する特異的結合パートナーを含むか、または構成し、また分析物を特異的に認識する、ステップと、捕捉試薬をアンカー物質に結合させ、捕捉試薬層を形成させ、結合させた捕捉試薬層を生体液試料と接触させ、これにより信号増幅材料を分析物に結合させ、圧電表面にわたって／全体に弾性波を生成させるステップと、分析物が捕捉試薬層に結合した結果としての、波の振幅、位相、時間遅延、または周波数の変化を測定するステップと、を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アンカー物質の表面を活性化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、アンカー物質の表面を活性化するステップは、プラズマ洗浄を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、直接コーティングである。いくつかの実施形態では、コーティングは、数時間ではなく数秒または数分で実行される単純で迅速なコーティング化学を含む。直接コーティングは、物質の単層を配置するために精度と能力を必要とする、インクジェット印刷などの、スケーラブルで連続的な、最小限のオペレーターの介入で簡単に自動化されるインライン方式を使用して製造され得る。これは、リジェクトの数が少なく、有害廃棄物の発生量がより少ない。このコーティング方法は、材料の中間層なしで、圧電表面上にアンカー物質を直接堆積させる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調製方法は、圧電基材表面を洗浄するステップを含む。洗浄ステップは、酸処理、紫外線曝露、および反応性の高い種の生成を介して圧電基材の表面上のすべての有機汚染物質を実質的に除去することができるプラズマ処理の種々の方法を含むが、これらに限定されない複数の方法によって達成することができる。いくつかの実施形態では、調製方法は、プラズマ洗浄するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アンカー物質の表面を活性化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、アンカー物質の表面を活性化するステップは、酸素または酸素／アルゴン混合物を使用して表面を処理することを含むプラズマ洗浄を含む。プラズマ洗浄は、１〜１０分間、１〜２０分間、１〜３０分間、または１〜６０分間続く可能性がある。プラズマ洗浄は、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、１．５時間、２時間、３時間、または４時間より長く続く可能性がある。いくつかの実施形態では、プラズマ洗浄は、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、１．５時間、２時間、３時間、または４時間未満続く。いくつかの実施形態では、プラズマ洗浄は、５０〜１５０ＫＨｚ、５０〜２００ワットでの処理を含む。

アビジンは、鳥類、爬虫類および両生類などの卵白に由来するタンパク質であり、多くの生化学反応において使用されている。アビジンファミリーには、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンおよびアビジンが含まれ、これらすべてのタンパク質は、ビオチンを高い親和性および特異性で結合する能力によって機能的に定義される。アビジンには、ストレプトアビジンなどの細菌アビジン、およびニュートラアビジンなどの改変アビジンも含まれる（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の脱グリコシル化アビジン）。それらは小さなオリゴマータンパク質であり、それぞれ４つ（または２つ）の同一のサブユニットを含み、各サブユニットはビオチンのための単一の結合部位を有する。本開示においてバイオセンサーの表面に結合する場合、いくつかの部位は金属コーティング圧電材料表面に面していることがあり、したがってビオチン結合には利用することができない。他のいくつかの部位は、圧電材料から離れて面しており、したがってビオチン結合に利用することができる。アビジンのビオチンへの結合親和性は、非共有結合ではあるが、非常に高いため、不可逆的と見なすことができる。アビジンの解離定数（ＫＤ）は約１０−１５Ｍであり、したがってこの結合は最も強力な既知の非共有結合の１つとなっている。その四量体形態では、アビジンは６６〜６９ｋＤａのサイズであると推定される。分子量の１０パーセントは、４〜５つのマンノースと３つのＮ−アセチルグルコサミン残基で構成される炭水化物含有量に起因する。アビジンの炭水化物部分には、構造および組成が類似した少なくとも３つの固有のオリゴ糖構造タイプが含まれている。

ビオチンは、ｄ−ビオチンまたはビタミンＨ、ビタミンＢ７、およびコエンザイムＲとも呼ばれ、アビジンの特異的結合パートナーである。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む複数の供給元から市販されている。

本明細書に記載のバイオセンサー技術により、高精度および高感度の生物学的センシングのための音響法の使用が可能になる。本明細書に記載の技術を使用して、生物学的感受性薬剤を、音響透過性材料の表面に適合させて、結合することができ、これは検出用途のための音響法の使用をさらに拡大するのに役立つ。いくつかの実施形態は、標的分析物のバイオセンサーへの結合から生成される信号を増強し、バイオセンサーの感度を何倍も高めるための信号増幅材料の使用に関する。

ＳＡＷセンサーの本質的な感度は高い可能性があり、様々な生物学的分析物の検出は、ナノグラムからピコグラムまでの範囲、場合によってはフェムトグラムの範囲にもなり得る。しかし、一部のＳＡＷバイオセンサーの感度は、高ピコモル範囲の通常の生物学的分析物の検出に、およびまた生体液中の感染粒子の数が少ない可能性のある細菌またはウイルス感染の検出に不十分な場合がある。さらに、生体液の体積も限られているため、感度の低い検出方法は、多くの場合適用できない。

本明細書に記載の検出および定量化方法は、高ピコモルから低ピコモルまでの範囲の生物学的分析物を検出するのに十分な感度を有し得る。本明細書に記載の技術によって、生体液中の感染粒子の数が少ない（すなわち、＜１０粒子／ｍＬ）細菌感染またはウイルス感染の検出も可能になり得る。加えて、本明細書に記載の検出方法の増強された感度によって、生体液の体積も制限されている場合（例えば、１０〜２５０マイクロリットル）にも使用することができる。

信号を増幅する方法
いくつかの実施形態は、バイオセンサーへの信号を増幅する方法に関する。この方法は、（ｉ）分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部分を有する捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップと、（ｉｉ）バイオセンサーに信号増幅材料を導入するステップと、を含んでもよい。捕捉試薬は、アンカー物質（例えば、アビジン、抗体、抗体断片、ポリペプチドなど）を介してバイオセンサー上に固定化されている。試料がバイオセンサーに曝露されると、試料中の分析物がバイオセンサーの表面上の捕捉試薬に結合する。信号増幅材料には、表面結合部分の質量を増加させることができる材料が含まれる。信号増幅材料の例としては、生体分子、高分子材料、または金属もしくは金属酸化物材料を挙げてもよい。信号増幅材料は、理想的には、バイオセンサー上の捕捉試薬に結合していない分析物に結合するように構成された１つの認識部分も有する。

信号増幅材料の結合により、表面に結合した分析物に質量が加えられ、これにより、バイオセンサー信号の振幅および感度が増加する。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は、生体分子、ポリマーまたは金属もしくは金属酸化物材料である。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は粒子の形態であり得る。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は金属材料であり得る。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は金属または金属酸化物粒子であり得る。いくつかの実施形態では、金属材料は、Ａｕ、Ｐｄ、またはＰｔであり得る。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は、ＳｉＯ₂および酸化鉄などの酸化物材料、ならびに量子ドットであり得る。いくつかの実施形態では、信号増幅材料はポリマー粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は、ポリマーまたは規定されたサイズおよび質量を備えたそのような材料で構成されたビーズの形態であり得る。いくつかの実施形態では、信号増幅材料はポリスチレンである。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は、１つまたは複数の蛍光染料を含むポリスチレンである。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は、メラミン樹脂（ＭＦ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリジビニルベンゼン（ＰＤＶＢ）、またはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、信号拡大材料は、１つまたは複数の蛍光染料を含む。

いくつかの実施形態では、信号増幅材料はビーズの形態の粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は約１ｎｍ〜約１００μｍまたは約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１７０ｎｍ〜約２３０ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１ｎｍ超、約５ｎｍ超、約１０ｎｍ超、約５０ｎｍ超、約７５ｎｍ超、約１００ｎｍ超、約１５０ｎｍ超、約２００ｎｍ超、または約３００ｎｍ超の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２５０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、または約５００ｎｍ未満の平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約１フェムトグラム（ｆｇ）超、約２ｆｇ超、約５ｆｇ超、約１０ｆｇ超、約１５ｆｇ超、約２０ｆｇ超、約５０ｆｇ超、約７５ｆｇ超、約１００ｆｇ超、または約２００ｆｇ超の質量を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、約５ｆｇ未満、約１０ｆｇ未満、約５０ｆｇ未満、約７５ｆｇ未満、約１００ｆｇ未満、約２００ｆｇ未満、または約５００ｆｇ未満の質量を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリマー粒子は、１ｆｇ〜約２０ｆｇ、約１ｆｇ〜約１００ｆｇ、約１ｆｇ〜約５００ｆｇ、約１０ｆｇ〜約１００ｆｇ、約１０ｆｇ〜約５００ｆｇ、約５０ｆｇ〜約２５０ｆｇ、約５０ｆｇ〜約８００ｆｇ、または約１００ｆｇ〜約１ｆｇの範囲の質量を有し得る。

いくつかの実施形態では、信号増幅材料は、分析物がバイオセンサーに結合した後に導入される。いくつかの実施形態では、信号増幅材料は測定中に分析物とともに導入される。いくつかの実施形態では、増幅材料は、分析物と予混合し、その後、測定中にセンサーの表面に塗布する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、試料をバイオセンサーに塗布する前に、ベースレベル信号を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、信号増幅材料が分析物に結合した後に、試験レベル信号を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ベースレベル信号を試験レベル信号と比較して、試料中の分析物の濃度を判定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ベースレベル信号を試験レベル信号と比較して、試料中の分析物の存在を判定するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、試験レベル信号と標準曲線とを比較して、試料中の分析物の濃度を判定するステップを含む。特定の信号増幅材料の標準曲線は、信号増幅材料の異なる数または濃度で周波数、位相シフトまたは周波数もしくは位相シフトの変化率を測定およびプロットすることにより作成することができる。

いくつかの実施形態では、第１の認識部分は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、ペプチド、またはタンパク質および小分子に結合する部分である。いくつかの実施形態では、第１の認識部分は、リガンド、抗体（全体、断片または単一ドメイン）、アフィマー、およびアプタマーからなる群から選択することができる。

いくつかの実施形態では、第２の認識部分は、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、ペプチド、またはタンパク質または小分子に結合する部分である。いくつかの実施形態では、第２の認識部分は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、アフィマー（affirmer）およびアプタマーからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、第２の認識部分は、信号増幅材料（例えば、ポリマー、金属または金属酸化物材料）とコンジュゲートしている。

いくつかの実施形態では、試料は、環境試料または生体試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、血清、血漿、尿、鼻もしくは膣スワブ、痰、糞便、涙、脳脊髄液、心膜液、眼内液、嚢胞液、または唾液である。

いくつかの実施形態は、試料中の分析物の存在または量を判定する方法に関する。この方法は、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部位を有する捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、捕捉試薬はバイオセンサー上に固定化されている、ステップと、信号増幅材料を導入するステップであって、アフィマーまたは抗体またはリガンドと連結したポリマーまたは金属もしくは金属酸化物は、分析物を結合するための１つまたは複数の第２の認識部位を有する、ステップと、分析物が信号増幅材料に結合した結果としての、バイオセンサー信号の振幅、位相、または周波数の変化を測定する、ステップと、を含む。

本明細書に記載の方法は、開示された信号増幅材料を欠く先行技術の方法と比較した場合、検出感度を大幅に高めることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍、約８００倍、約１０００倍だけ感度を増加させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約５％、約２５％、約５０％、約７５％、または約９０％だけ感度を増加させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約５％〜約２００％、約５％〜約５００％、約５０％〜約５００％、約５０％〜約１０００％の範囲で感度を増加させることができる。

本明細書に記載の方法は、信号増幅材料を使用しない方法と比較した場合、検出精度を大幅に高めることができる。本明細書に記載の方法は、約０．０１ｐｇ、約１ｐｇ、約５ｐｇ、約１０ｐｇ、約５０ｐｇ、約１００ｐｇという低い感度レベルを有し得る。本明細書に記載の方法は、約０．０１ｐｇ〜約５００ｐｇ、約１ｐｇ〜約５００ｐｇ、または約１０ｐｇ〜約１００ｐｇの範囲の感度レベルを有し得る。

コーティングバイオセンサーへの分析物の結合
いくつかの実施形態では、圧電基材表面上の結合アビジンは、目的の分析物を結合させるために、活性化を必要とする。活性化には、目的の分析物抗原に特異的な、抗体などのビオチン化バインダーが含まれる。抗体または他の薬剤は、アビジンコーティングチップに付着される前にビオチン化される。抗体は、アビジン基質に付着する前または後に分析物抗原に結合することができる。分析物ビオチン化抗体複合体は、センサーの外側で形成することができ、複合体をセンサーと接触させることができ、これにより、抗体上のビオチンがアビジンコーティングチップに結合する。２つの方法のどちらが好ましいかは、分析物および試料処理に依存する。両方法は、本発明の範囲内にある。チップ表面上のアビジンに結合した特定の抗体による表面コーティングの分析により、再び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して６〜９ｎｍの深さを測定して、抗体が実際にアビジン層に結合していることが示された。

抗原特異的ビオチン化捕捉試薬を適用して、スクロース、トレハロース、グリセロールなどの、しかしこれらに限定されない当技術分野で既知のタンパク質安定剤も含む非乾燥媒体中で結合した過剰の遊離ビオチン化試薬からなる第２の層を形成する。多くの薬剤はビオチン化することができ、それらの中で最も一般的に使用されるのは、目的の分析物を特異的に認識するビオチン化抗体である。タンパク質捕捉試薬は、化学的にまたは酵素的にビオチン化することができる。化学的ビオチン化は、種々の既知のコンジュゲート化学を利用して、アミン、カルボキシレート、スルフヒドリル、および炭水化物の非特異的ビオチン化をもたらす。また、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングにより、タンパク質中の任意の第一級アミンがビオチン化されることが理解されている。酵素的ビオチン化は、細菌ビオチンリガーゼによる特定の配列内の特定のリジンのビオチン化をもたらす。ほとんどの化学的ビオチン化試薬は、リンカーを介してビオチンの吉草酸側鎖に結合した反応基で構成されている。酵素的ビオチン化は、ほとんどの場合、（当業者に既知のビオチン化技術を使用して、）目的のタンパク質をそのＮ末端、Ｃ末端、または内部ループで、Ａｖｉタグ（AviTag）またはアクセプターペプチド（Acceptor Peptide）（ＡＰ）と呼ばれる１５アミノ酸ペプチドに結合することによって実行される。

一旦結合すると、捕捉試薬は短時間、加熱空気に曝露され、塗布された流体から水分が部分的に除去されて、保護および安定化ゲルを形成し、これにより、非乾燥ゲル層において抗体のような結合タンパク質性バインダーの長期安定性が確保され、このことにより、第２の抗原特異的バインダー層の本質的に完全な時間依存形成が可能になる。これらのガラス様層は、カートリッジのパウチ内のシリカまたはモレキュラーシーブの乾燥剤ペレットの存在下での保管のために任意に脱水される。カートリッジの上部チャンバは密閉されて、流体区画を形成する。次いで、前記チャンバを備えたカートリッジは、プラスチック製の保管パウチ内で、好ましくはＮ₂雰囲気中で密閉される。

アンカー物質（アビジン）とビオチン化捕捉試薬との結合により、チップ上に第２の捕捉試薬層が形成され得る。使用前に、保護ゲル層において残っている未結合のビオチン化捕捉試薬およびその他の成分は、分析手順中にアッセイバッファーで、または試験体液でも簡単に洗い流すことで容易に除去することができる。これらのセンサーは、抗原を検出することが実証されている。

本明細書に記載のバイオセンサーに、目的の分析物に特異的に結合する捕捉剤を含む適切なバイオフィルムコーティングを付与すると、様々な薬剤および生化学マーカーを検出するのに使用することができる。この統合バイオセンサーが可能な使用例には、ヒト診断および獣医の診断が含まれる。分析物は、感染性病原体中に存在する、または見出される、またはそれによって生成され、かつ検出に使用することができる任意の物質として定義され、これには、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ペプチド、病原体断片、溶解病原体、およびＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、毒素、膜受容体、キナーゼ、プロテインＡ、ポリＵ、ポリＡ、ポリリジン、多糖、アプタマー、およびキレート剤が含まれるが、これらに限定されない。抗原抗体相互作用の検出は以前に記載されている（米国特許第４，２３６，８９３号明細書、第４，２４２，０９６号明細書、および第４，３１４，８２１号明細書、これらはすべて参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。さらに、病原菌および真核細胞（哺乳類腫瘍細胞を含む）などの、全細胞（原核細胞を含む）、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）、真菌、寄生生物、および芽胞（血清型（serovars）または血清型（serotypes）などの感染因子の表現型の変形形態を含む）の検出は、本発明の範囲内である。

信号増幅材料の調製方法
抗体、抗体断片および単一ドメイン抗体、アフィマーまたはアプタマーは、信号増幅材料／粒子の表面上に物理吸着させるか、信号増幅材料／粒子の表面に共有的にコンジュゲートさせることができる。ＣＯＯＨまたはＮＨ₂またはマレイミドまたはエポキシまたはニュートラアビジンを含む機能化ポリマー、金属または金属酸化物材料は、購入することができる。これらの粒子は、例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳまたはカルボジイミドまたはマレイミド化学を使用して、抗体、抗体断片および単一ドメイン抗体、アフィマーまたはアプタマーと共有的にコンジュゲートさせることができる。一方、ビオチン化抗体、抗体断片、および単一ドメイン抗体、アフィマーまたはアプタマーを使用して、ニュートラアビジン／アビジンコンジュゲート粒子を連結させることができる。アフィマーは、利用可能なＳＨ部分を含む金属ナノ粒子とコンジュゲートさせることもできる。

[実施例１]
図１は、使用されているＳＡＷセンサーは、生理食塩水環境において中〜高フェムトグラム範囲の感度を示し、低ピコグラム範囲の表面質量変化を容易に検出できることを示す。

図１Ａでは、ＳＡＷセンサーのアルミニウムまたは結晶表面は、約１０億コピー／ｍｍ²の密度のチオール化ニュートラアビジンで修飾されていた。図１Ｂでは、過剰なタンパク質を洗い流した後、試料（青または上）と参照チャネル（赤または下）の周波数シフトを監視した。１．６分で、生理食塩水中のビオチン化蛍光ポリエチレンビーズ（平均直径２００ｎｍ）の１：１０３希釈液を、試料チャネルに加えた（参照は、生理食塩水のみを受けた）。表面アビジンへのビオチン化ビーズの急速な結合（左パネル）は、周波数シフト（中央パネル）によって検出され、その半減期（ｔ １／２）は約１２秒であった。参照チャネルでは、生理食塩水に対する応答は観察されなかった。図１Ｃでは、デバイスを広範囲に（extensive）激しく洗浄した後、蛍光顕微鏡法により、ＳＡＷセンサーのアビジン修飾表面に約３００個のビーズがしっかりと結合していることを確認した。図１Ｄでは、同様の実験（図示せず）を異なるビーズ希釈で繰り返した場合、絶対周波数シフトならびに周波数シフトの変化率（速度定数Ｋ１として表される）は、３桁を超えるビーズの数に、線形的に相関した。ｘ軸との関係の線形外挿を想定すると、約１１個のビーズの結合が、現在の最適化されていないプラットフォームで電気的応答を引き出すことができる最小の閾値であるように見える。１１個のビーズの結合は、センサーの７５フェムトグラム（つまり、７５×１０^-15グラム）の表面質量変化に対応していた。

[実施例２]
以下の例と動作原理は、ジカウイルスに特に言及した感染性病原体の検出の強化を示しているが、それに限定されず、感度が高められた小分子の検出にも適用され、これらの小分子を検出することもできる。

ジカ関連およびデング熱関連ウイルス血症の急性最大期中、診断に有用なウイルスコート成分の最大循環濃度は、ピコグラム〜ナノグラム／マイクロリットルの範囲に及ぶと考えられる（Ａｌｃｏｎら）。しかし、ウイルスコート成分（例えば、Ｅタンパク質）の循環濃度は、感染のごく初期段階と慢性段階の両方で少なくとも２桁であり、場合によっては数桁低くなる。したがって、ＳＡＷベースの検出デバイスは、理想的には、非常に低いフェムトグラム範囲の動作感度を必要とする。

図２は、抗体（またはそれらのＦａｂ断片、またはアプタマーなど）のペアをサンドイッチ形式で使用して、感度レベルの向上を達成する方法を示す。ＳＡＷセンサーは質量に敏感であるため、所望の分析物（青い点）が表面バイオコーティングによって既に捕捉された後、第２抗体を加えると、センサーに追加の質量が加えられ、それによって任意の所与の分析物に対する感度が向上する。第２抗体自体がはるかに大きな質量（図２緑色のボール、例えばポリスチレンまたは金ビーズ）でタグ付けされている場合、センサーに結合した質量の得られた増加は、元の分析物または第２抗体自体の質量より何桁も大きくなり得る。

単一の２００ｎｍポリスチレンビーズの質量（２．５１フェムトグラム）は、Ｅタンパク質モノマーの質量（０．０６６アトグラム）よりも５桁近く大きくなり得る。したがって、分析物の感度に対する二重増幅戦略の影響は多大である。例えば、図１の予備データに基づいた簡単な計算では、二重増幅（図２のＣ）を使用したサンドイッチアプローチでは、ＳＡＷセンサーが、単一の解離されたジカウイルスから生じたＥタンパク質の１０分の１（すなわち、ウイルスの１０分の１相当物）未満を検出することができることが示唆されている。対照的に、１つの抗体（図２のＡとＤ）のみで修飾された同じＳＡＷセンサーは、同じ信号を得るために、約２００個のジカウイルス粒子相当物を必要とする。さらに、さらにより大きな直径のポリスチレンビーズ（直径１μｍのビーズは、２００ｎｍのビーズの質量の１００倍をわずかに超える）を使用して、感度をさらに高めることができる。さらに、ポリスチレンビーズを高密度の金属ビーズ（例えば、金）に置き換えて、感度をさらに高めることができる。したがって、質量増幅によって強化されたサンドイッチ技術の使用は、バイオコーティングＳＡＷデバイスの分析物感度を劇的に増強するための新規な手段である。さらに、抗体またはアプタマーの特異的ペアが利用可能である分析物（大きな粒子から小分子まで）を用いて質量増幅を使用することができる。

Claims (32)

1. バイオセンサーにおいて信号を増幅する方法であって、
   捕捉試薬を有する前記バイオセンサーに試料を塗布するステップであって、前記捕捉試薬は、分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部分を含み、前記捕捉試薬は前記バイオセンサー上に固定化されている、ステップと、
   信号増幅材料を導入するステップであって、前記信号増幅材料は、前記分析物に結合するための１つまたは複数の第２の認識部分を有する、ステップと、を含む方法。
2. 前記信号増幅材料が、ポリマー、金属、または金属酸化物である、請求項１に記載の方法。
3. 前記信号増幅材料がポリスチレンである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記信号増幅材料が、種々の材料のビーズの形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ビーズが、約１ｎｍ〜約１００μｍの範囲の平均直径を有する、請求項４に記載の方法。
6. 前記信号増幅材料は、前記分析物が前記バイオセンサーに結合した後に導入される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記信号増幅材料は、前記分析物が前記バイオセンサーに結合する前に導入される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記試料を前記バイオセンサーに塗布する前に、ベースレベル信号を測定するステップを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記信号増幅材料が前記分析物に結合した後に、試験レベル信号を測定するステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ベースレベル信号を前記試験レベル信号と比較して、前記試料中の前記分析物の存在を判定するステップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１の認識部分が、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、小分子またはタンパク質に結合する部分である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の認識部分が、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、アフィマー（affirmer）およびアプタマーからなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第２の認識部分が、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、またはタンパク質に結合する部分である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２の認識部分が、ポリマー、金属または金属酸化物材料とコンジュゲートした、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、アフィマー（affirmer）およびアプタマーからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記試料が、環境試料または生体試料である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記生体試料が、血液、血清、血漿、尿、痰、糞便、鼻もしくは膣スワブ、涙、脳脊髄液、心膜液、眼内液、嚢胞液、または唾液である、請求項１５に記載の方法。
17. 試料中の分析物の存在または量を判定する方法であって、
    分析物を結合するための１つまたは複数の第１の認識部位を有する捕捉試薬を有するバイオセンサーに試料を塗布するステップであって、前記捕捉試薬は前記バイオセンサー上に固定化されている、ステップと、
    信号増幅材料を導入するステップであって、ポリマーまたは金属材料は、前記分析物を結合するための１つまたは複数の第２の認識部位を有する、ステップと、
    分析物が前記信号増幅材料に結合した結果としての、バイオセンサー信号の振幅、位相、または周波数の変化を測定する、ステップと、を含む方法。
18. 圧電基材と、
    捕捉試薬であって、前記捕捉試薬は前記圧電基材上に固定化されており、捕捉剤は分析物に対する第１の認識部位を有する、捕捉試薬と、
    前記分析物に対する第２の認識部位を有する信号増幅材料と、
    を有する、バイオセンサー部品。
19. 前記捕捉試薬を前記圧電基材に付着させるアンカー物質をさらに含む、請求項１８に記載のバイオセンサー部品。
20. 前記圧電基材が、アルミニウム（Ａｌ）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ₃）、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ₃）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）、およびホウケイ酸塩からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のバイオセンサー。
21. 前記アンカー物質が、シラン基またはチオール基を介して前記圧電基材の前記表面に結合している、請求項１９または２０に記載のバイオセンサー部品。
22. 前記アンカー物質が、アビジン、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから選択されるリンカータンパク質を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品。
23. 前記リンカータンパク質が、ニュートラアビジン、天然アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアビジンである、請求項２２に記載のバイオセンサー部品。
24. 前記捕捉試薬が、前記アンカー物質の前記リンカータンパク質に結合するためのビオチン部分を含む、請求項１８から２３のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品。
25. 前記第１の認識部位が、全細胞、細菌、真核細胞、腫瘍細胞、ウイルス、真菌、寄生虫、芽胞、核酸、またはタンパク質に結合するように構成されている、請求項１８から２４のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品。
26. 弾性波トランスデューサをさらに備える、請求項１８から２５のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品。
27. 弾性波トランスデューサが、バルク弾性波を生成する、請求項２６に記載のバイオセンサー部品。
28. 前記バルク弾性波が、厚みすべりモード、音響プレートモード、および水平プレートモードからなる群から選択される、請求項２７に記載のバイオセンサー部品。
29. フィルムバルク弾性波共振器ベース（ＦＢＡＲベース）のデバイスである、請求項１から２８のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品。
30. 前記弾性波トランスデューサが、弾性表面波を生成する、請求項２６に記載のバイオセンサー部品。
31. 前記弾性表面波が、横波型弾性表面波、表面横波、レイリー波、およびラブ波からなる群から選択される、請求項３０に記載のバイオセンサー部品。
32. 請求項１８から３１のいずれか一項に記載のバイオセンサー部品を含むバルク波共振器。