CN107615070A - 检测方法和检测装置 - Google Patents

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Abstract

提供试样中包含的检测对象物的检测方法。另外，提供用于检测试样中包含的检测对象物的检测装置。一种检测方法，其具备从第1测定工序中测定的第1信号值和第2测定工序中测定的第2信号值得到检测值的第1检测工序。另外，一种检测装置，其具备从第1测定部中测定的第1信号值和第2测定部中测定的第2信号值得到检测值的第1检测部。

Description

检测方法和检测装置
技术领域
本发明涉及试样中包含的检测对象物的检测方法和检测装置。
背景技术
已知：使用具备在表面结合有抗体的检测元件的生物传感器，来检测试样中的目标物质的方法(例如，参照专利文献1或2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：专利第2625577号公报
专利文献2：日本特开2001-13142号公报
发明内容
发明要解决的课题
然而，以往的检测方法和检测装置中，由于受到试样中包含的检测对象物以外的物质的影响，有时无法准确地检测试样中的检测对象物。另外，例如，由于受到粘度和密度等的影响，有时无法准确地检测检测对象物的信号值。
因此，正在寻求能够通过降低试样中包含的检测对象物以外的物质的影响、和试样间的粘度差和密度差的影响，来更准确地检测试样中的检测对象物的检测方法和检测装置。
解决课题的方法
本发明的实施方式所涉及的检测方法为试样中包含的检测对象物的检测方法，所述检测方法具备：准备工序，准备一次物质，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与所述检测对象物反应；第1反应工序，将试样向所述检测体的表面供给，通过所述检测对象物与所述一次物质的反应使一次反应物在所述检测体的表面上形成；第1供给工序，在所述第1反应工序之后，将第1液体向所述检测体的表面供给；第1测定工序，在所述第1供给工序之后，基于所述检测体的表面状态测定第1信号值；信号扩大工序，在所述第1测定工序之后，将信号扩大用物质向所述检测体的表面供给，通过所述第1反应工序中形成的所述一次反应物所参与的反应使所述检测体的表面状态发生变化；第2测定工序，在所述信号扩大工序之后，基于所述检测体的表面状态测定第2信号值；和第1检测工序，从所述第1信号值和所述第2信号值得到检测值。
本发明的实施方式所涉及的检测装置是用于检测试样中包含的检测对象物的装置，所述装置具备：第1反应部，将试样向与检测体的表面结合且用于与所述检测对象物反应的一次物质供给，通过所述检测对象物与所述一次物质的反应使一次反应物在所述检测体的表面上形成；第1供给部，将第1液体向所述检测体的表面供给；第1测定部，在所述第1液体通过所述第1供给部被供给到所述检测体的表面后，基于所述检测体的表面状态测定第1信号值；信号扩大部，将信号扩大用物质向所述检测体的表面供给，通过所述一次反应物所参与的反应使所述检测体的表面状态发生变化；第2测定部，基于被供给所述信号扩大用物质的所述检测体的表面状态测定第2信号值；第1检测部，从所述第1信号值和所述第2信号值得到检测值；和显示部，显示所述第1检测部中得到的检测值。
发明效果
根据本发明的实施方式所涉及的检测方法和检测装置，通过如上所述的构成，能够降低试样中包含的检测对象物以外的物质的影响，因此，能够更准确地检测试样中包含的检测对象物。另外，由于能够降低因试样而产生的粘度和密度的影响，因此，能够更准确地检测试样中包含的检测对象物。
附图说明
图1是示出本发明的实施方式所涉及的检测方法的流程图的图。
图2是示出本发明的实施方式所涉及的检测方法的流程图的图。
图3是示出本发明的实施方式所涉及的检测装置的框图。
图4是本发明的实施方式所涉及的生物传感器装置200的立体图。
图5是本发明的实施方式所涉及的生物传感器装置200的分解立体图。
图6是本发明的实施方式所涉及的检测元件3的俯视图。
图7是本发明的实施方式所涉及的检测方法中取得的信号值的示意图。
图8是示出与本发明的实施方式所涉及的检测方法有关的实验数据的图。
具体实施方式
<检测方法>
(第1实施方式)
图1是示出本发明的第1实施方式的检测方法的流程图。
本发明的第1实施方式所涉及的检测方法为试样中包含的检测对象物的检测方法，其具备：
准备工序A1，准备一次物质，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与检测对象物反应，
第1反应工序A2，将试样向检测体的表面供给，通过检测对象物与一次物质的反应使一次反应物在检测体的表面上形成，
第1供给工序A3，在第1反应工序A2之后，将第1液体向检测体的表面供给，
第1测定工序A4，在第1供给工序A3之后，基于检测体的表面状态测定第1信号值，
信号扩大工序A5，在第1测定工序A4之后，将信号扩大用物质向检测体的表面供给，通过所述第1反应工序A2中形成的所述一次反应物所参与的反应使所述检测体的表面状态发生变化，
第2测定工序A6，在信号扩大工序A5之后，基于检测体的表面状态测定第2信号值，
第1检测工序A7，从第1信号值和第2信号值得到检测值。
准备工序A1为准备一次物质的工序，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与检测对象物反应。
第1反应工序A2通过结合有一次物质的检测体、用于向该检测体供给试样的供给路、和使试样在供给路内流动的泵等来实施，构成没有限定。
第1供给工序A3通过用于供给第1液体的供给路、泵等来实施，构成没有限定，可以与第1反应工序A2同样地实施。
第1测定工序A4可以通过包含向检测体输入信号、并基于从检测体输出的信号取得预先确定的信号值的元件的装置等来实施，但构成没有限定。
信号扩大工序A5通过第1反应工序A2的检测体、用于向该检测体供给信号扩大用物质的供给路和泵等来实施，构成没有限定，可以兼用为反应部20。
第2测定工序A6可以通过包含向检测体输入信号、并基于从检测体输出的信号取得预先确定的信号值的元件的装置等来实施，但构成没有限定，可以与第1测定工序A4同样地实施。
第1检测工序A7可以通过包含从第1信号值和第2信号值取得检测值的运算元件的运算装置等来实施，但构成没有限定。
在此，本说明书中，“试样”例如可以为包括血液、尿、唾液、痰等的生物体试样本身，也可以为通过缓冲液等将生物体试样稀释后的物质。此外，也可以为生物体试样以外的试样。
在此，关于多个试样，在检测各试样中分别等量含有的检测对象物的情况下，即使在第1供给工序A3中将第1液体向检测体的表面供给，也无法从检测体的表面完全除去预先包含在试样中且作为与检测对象物不同的物质的夹杂物，有可能针对各检测对象物的信号值产生差异。然而，根据本实施方式的检测方法，通过从第1信号值和第2信号值获得检测值，由此能够降低各试样间的夹杂物的影响或者粘度差和密度差的影响。这是因为，从第1信号值和第2信号值获得的检测值不受来自在检测体的表面残存的夹杂物的量的影响。这样一来，通过降低各试样间的夹杂物(残渣)的影响，由此能够更准确地检测试样中包含的检测对象物。
以下，依次说明本实施方式的检测方法。
本实施方式的准备工序A1中准备一次物质，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与检测对象物反应。
本说明书中，“检测对象物”例如包括抗原、抗体等，并不限定于这些。此外，以下中，有时将检测对象物记作抗原。
本说明书中，“检测体”例如包括表面弹性波元件、输出QCM(Quartz CrystalMicrobalance)、SPR(Surface Plasmon Resonance)和FET(Field Effect Transistor)等的信号值的元件，并不限定于这些。
本实施方式的第1反应工序A2中，将试样向检测体的表面供给，通过检测对象物与一次物质的反应使一次反应物在检测体的表面上形成。
本说明书中，“一次物质”只要为与检测对象物特异性地进行反应的物质，则没有特别限制，例如，在检测对象物为抗原的情况下，包括与该抗原结合的抗体；在检测对象物为抗体的情况下，包括与该抗体结合的抗原等。
本说明书中，“一次反应物”例如是指一次物质捕捉检测对象物后的捕捉体、检测对象物与一次物质结合而成的复合体、一次物质的一部分与检测对象物结合后，上述一部分从一次物质解离后的解离体等，并不限定于这些，包含抗原与抗体反应而得的复合体等。
此外，作为变形例，如上所述，在第1反应工序A2中，也能够通过使检测对象物与一次物质的一部分结合的同时使一部分从一次物质解离，从而形成所述一次反应物。
本实施方式的第1供给工序A3中，将第1液体向检测体的表面供给。
本说明书中，“第1液体”例如可以为缓冲液等。缓冲液例如包括磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌啶乙烷磺酸)缓冲液、三(羟基甲基)氨基甲烷)缓冲液、和MOPS(3-吗啉基丙烷磺酸)缓冲液等，并不限定于这些，适当使用作为缓冲液而周知的液体即可。另外，缓冲液也可以包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锌和EDTA(乙二胺四乙酸)，根据需要，可以还包括Tween20(注册商标)、TritonX-100(注册商标)、Brii35(注册商标)等表面活性剂。另外，缓冲液中可以根据需要混合封闭物质。封闭物质例如可举出BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白、聚乙二醇、MPC(甲基丙烯酸磷酰胆碱)聚合物、甜菜碱聚合物、HEMA(羟基乙基甲基丙烯酸)聚合物等。这些方面中，后述的第2液体和第3液体中也同样。
本实施方式的第1测定工序A4中，基于检测体的表面状态测定信号值。
本实施方式中，在检测体的表面形成表面弹性波元件，作为基于检测体的表面状态的信号值，可以使用表面弹性波元件的相位特性的值。
另外，本实施方式中，基于所述检测体的表面状态的信号值，可以为通过选自QCM(Quartz Crystal Microbalance)传感器、SPR(Surface Plasmon Resonance)传感器和FET(Field Effect Transistor)传感器的方法测定的值。
本实施方式的信号扩大工序A5中，将信号扩大用物质向检测体的表面供给，通过第1反应工序A2中形成的所述一次反应物所参与的反应使检测体的表面状态发生变化。
本说明书中，“信号扩大用物质”只要是使检测体的表面状态发生变化的物质，则没有特别限制，例如包括与一次反应物特异性地进行反应的、标记化二次抗体、标记化肽、标记化配体和标记化适体等。标记只要使检测体的表面状态发生变化，则没有特别限制，包括链霉抗生物素等蛋白质、生物素、酶、荧光物质和金属粒子等纳米粒子等。
本说明书中，“第1反应工序中形成的一次反应物所参与的反应”只要是检测体的表面状态根据一次反应物的量而发生变化的反应，则没有特别限制，包括第1反应工序A2中形成的一次反应物与信号扩大用物质的结合反应、第1反应工序A2中形成的一次反应物与信号扩大用物质的酶反应、第1反应工序A2中形成的一次反应物与信号扩大用物质的还原反应等，一次物质与信号扩大用物质可以发生直接反应，一次物质与信号扩大用物质也可以经由其他物质间接地发生反应。
本实施方式中，在第1测定工序A4与信号扩大工序A5之间，可以还具备追加反应工序，所述追加反应工序中，将至少1种追加反应物质向所述检测体的表面供给。另外，至少1种追加反应物质可以具有多种追加反应物质，且可以分别供给每种该追加反应物质。
实施追加反应工序的情况下，信号扩大物质可以不特异性地与一次反应物进行反应，例如可以包括：链霉抗生物素、3，3’-二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氯-1-萘酚和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝等底物、以及氯金酸与羟基胺盐酸盐的组合、和硝酸银与硫酸铁的组合等金属离子与还原剂的组合等。
本说明书中，“追加反应物质”例如包括：生物素、链霉抗生物素、生物素标记抗体、过氧化物酶标记抗体、和碱性磷酸酶标记抗体等酶标记抗体、金属粒子标记抗体等纳米粒子标记抗体、过氧化物酶标记链霉抗生物素、和碱性磷酸酶标记链霉抗生物素等酶标记链霉抗生物素、以及金属粒子标记链霉抗生物素等纳米粒子标记链霉抗生物素等。
追加反应物质应根据所选择的信号扩大用物质进行选择。例如，在信号扩大用物质为链霉抗生物素的情况下，追加反应物质为生物素标记抗体。例如，在信号扩大用物质为3，3’-二氨基联苯胺的情况下，追加反应物质为生物素标记二次抗体、和过氧化物酶标记链霉抗生物素。例如，在信号扩大用物质为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝的情况下，追加反应物质为生物素标记二次抗体、和碱性磷酸酶标记链霉抗生物素。例如，在信号扩大用物质为氯金酸和羟基胺盐酸盐的情况下，追加反应物质为生物素标记二次抗体、和Au粒子标记链霉抗生物素。
在追加反应工序中，为了使检测体的表面状态的变化进一步扩大，可以重复供给追加反应物质。例如，在信号扩大用物质为链霉抗生物素、追加反应物质为生物素标记抗体的情况下，在追加反应工序中，第1步供给生物素标记二次抗体，第2步供给链霉抗生物素，第3步供给生物素标记抗体，第4步供给链霉抗生物素，第5步供给生物素标记抗体，接着在信号扩大工序A5中供给链霉抗生物素。
本实施方式中，在第1反应工序A2与第1供给工序A3之间，可以进一步具备将至少1种前体反应物质向上述检测体的表面供给的前体反应工序。另外，至少1种前体反应物质可以具有多种前体反应物质，可以分别供给每种该前体反应物质。
在实施前体反应工序的情况下，信号扩大物质可以不特异性地与一次反应物进行反应，例如可以包括：链霉抗生物素、3，3’-二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑、4-氯-1-萘酚、和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝等底物、以及氯金酸与羟基胺盐酸盐的组合、和硝酸银与硫酸铁的组合等金属离子与还原剂的组合等。
本说明书中，“前体反应物质”例如包括：生物素、链霉抗生物素、生物素标记抗体、过氧化物酶标记抗体、和碱性磷酸酶标记抗体等酶标记抗体、金属粒子标记抗体等纳米粒子标记抗体、过氧化物酶标记链霉抗生物素、和碱性磷酸酶标记链霉抗生物素等酶标记链霉抗生物素、以及金属粒子标记链霉抗生物素等纳米粒子标记链霉抗生物素等。
前体反应物质应根据所选择的信号扩大用物质进行选择。例如，在信号扩大用物质为链霉抗生物素的情况下，前体反应物质为生物素标记抗体。例如，在信号扩大用物质为3，3’-二氨基联苯胺的情况下，前体反应物质为生物素标记二次抗体、和过氧化物酶标记链霉抗生物素。例如，在信号扩大用物质为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝的情况下，追加反应物质为生物素标记二次抗体、和碱性磷酸酶标记链霉抗生物素。例如，在信号扩大用物质为氯金酸和羟基胺盐酸盐的情况下，前体反应物质为生物素标记二次抗体、和Au粒子标记链霉抗生物素。
在前体反应工序中，为了使检测体的表面状态的变化进一步扩大，可以重复供给前体反应物质。例如，在信号扩大用物质为链霉抗生物素、前体反应物质为生物素标记抗体的情况下，在前体反应工序中，第1步供给生物素标记二次抗体，第2步供给链霉抗生物素，第3步供给生物素标记抗体，第4步供给链霉抗生物素，第5步供给生物素标记抗体，并经过第1供给工序A3和第1测定工序A2后，在信号扩大工序A5中供给链霉抗生物素。
此外，信号扩大用物质、追加反应物质、前体反应物质可以为被缓冲液等稀释后的物质。
此外，也能够在信号扩大工序A5中，使信号扩大用物质与一次反应物中的检测对象物结合。
此外，本实施方式中，在信号扩大工序A5之后且第2测定工序A6之前，可以还具备将第2液体向检测体的表面供给的第2供给工序。
由此，通过将在信号扩大工序A5中未与一次反应物反应的信号扩大用物质从检测体的表面除去，由此，能够降低未与一次反应物反应的信号扩大用物质对第2信号值的影响，能够提高第2测定工序A6中测定的与检测对象物相关的信号值的准确性。
此外，本说明书中，“第2液体”例如可以为缓冲液等。
另外，本实施方式中，可以使第1液体与第2液体为相同种类的液体。
本实施方式的第2测定工序A6中，基于检测体的表面状态测定信号值。
本工序与上述第1测定工序A4同样地进行即可。
本实施方式的第1检测工序A7中，从第1信号值和第2信号值得到检测值。
本实施方式中，第2信号值可以大于第1信号值。在此，信号值的大小例如以与第1反应工序A2前的信号值的差的绝对值判断即可。
此外，本实施方式中，作为试样，可以使用还包含由与检测对象物不同的物质构成的夹杂物的物质。
此时存在如下情况，即，与检测对象物不同的夹杂物在第1反应工序A2中在检测体的表面附着，且之后无法通过在第1供给工序A3中将第1液体向检测体的表面供给从检测体的表面完全除去而残存的情况。因此，第1信号值会受到在检测体的表面残存的与检测对象物不同的夹杂物的影响。
此时，为了降低该夹杂物的残渣所致的影响，通过从第1信号值和第2信号值得到检测值，可以将来自于在检测体的表面残存的夹杂物的信号值从第2信号值中除去，因此能够测定检测对象物的更准确的信号值。
本发明的一个实施方式中，作为信号扩大工序A5的一个方式，可以具备第2反应工序。第2反应工序中，与一次反应物进行反应的二次物质被供给到检测体的表面，通过一次反应物与二次物质的反应，在检测体的表面上形成二次反应物。
第2反应工序通过第1反应工序的检测体、用于向该检测体供给二次物质的供给路、和泵等实施，但构成没有限定，可以与第1反应工序同样地实施。
本说明书中，“二次物质”只要是特异性地与一次反应物进行反应的物质，则没有特别限制，例如可以包含二次抗体等，且可以为信号扩大用物质的一个方式。
此外，二次物质例如可以使用由生物素、酶、纳米粒子、金属纳米粒子等标记了的标记化二次抗体。通过使用对二次物质赋予标记的标记化二次抗体，能够使来自于二次物质的信号值扩大，因此能够更高灵敏度地检测检测对象物。
本说明书中，“二次反应物”例如是指一次反应物捕捉二次物质而成的捕捉体、一次反应物与二次物质的复合体等，并不限定于这些，包含抗原与一次抗体与二次抗体的复合体等。
此外，二次反应物的分子量可以大于一次反应物的分子量。由此，通过在后述的第2测定工序A6中得到大的信号值，从而能够高灵敏度地检测检测对象物。
此外，也能够在第2反应工序中使二次物质与一次反应物中的检测对象物结合来形成二次反应物。
作为实施第2反应工序作为信号扩大工序A5的一个方式的一个实施例，以下示出检测对象物为抗原、作为检测体使用表面弹性波元件、作为一次物质使用一次抗体、作为第1液体使用缓冲液、作为二次物质使用标记化二次抗体的例子。
即，第1实施方式的一个实施例可以为试样中包含的抗原的检测方法，所述检测方法具备：
准备工序，准备预先与表面弹性波元件的表面结合、且针对抗原的一次抗体，
第1反应工序，将试样向表面弹性波元件的表面供给，使其与上述针对抗原的一次抗体反应，使上述试样中包含的抗原与上述一次抗体的一次复合体在表面弹性波元件的表面上形成，
第1供给工序，在第1反应工序之后，将缓冲液向表面弹性波元件的表面供给，
第1测定工序，在第1供给工序之后，基于表面弹性波元件的表面状态测定第1信号值，
第2反应工序，在第1测定工序之后，将针对上述抗原的标记化二次抗体向表面弹性波元件的表面供给，使上述一次复合体与上述标记化二次抗体的二次复合体在表面弹性波元件的表面上形成，
第2测定工序，在第2反应工序之后，基于表面弹性波元件的表面状态测定第2信号值，和
第1检测工序，从第1测定工序中测定的第1信号值和第2测定工序中测定的第2信号值得到检测值。
(第2实施方式)
图2是示出本发明的第2实施方式的检测方法的流程图。
本发明的第2实施方式所涉及的检测方法为试样中包含的检测对象物的检测方法，该检测方法具备：
准备工序B1，准备一次物质，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与检测对象物反应，
第1反应工序B2，将试样向检测体的表面供给，通过检测对象物与一次物质的反应使一次反应物在检测体的表面上形成，
第1供给工序B3，在第1反应工序B2之后，将第1液体向检测体的表面供给，
第1测定工序B4，在第1供给工序B3之后，基于检测体的表面状态测定信号值，
第2反应工序B5，在第1测定工序B4之后，将与一次反应物进行反应的二次物质向检测体的表面供给，通过一次反应物与二次物质的反应使二次反应物在检测体的表面上形成，
第3反应工序B6，在第2反应工序B5之后，将与二次反应物进行反应的三次物质向检测体的表面供给，通过二次反应物与三次物质的反应使三次反应物在检测体的表面上形成，
第3测定工序B7，在第3反应工序B6之后，基于检测体的表面状态测定信号值，和
第2检测工序B8，从第3测定工序B7中测定的信号值中减去第1测定工序B4中测定的信号值，得到检测值。
本实施方式中，第1反应工序B2、第1供给工序B3、和第1测定工序B4分别与第1实施方式同样，因此省略说明。
第2反应工序B5通过第1反应工序B2的检测体、用于向该检测体供给二次物质的供给路、泵等实施，构成没有限定。
第3反应工序B6通过第2反应工序B5的检测体、用于向该检测体供给三次物质的供给路、泵等实施，构成没有限定。
第3测定工序B7通过包括向检测体输入信号、并基于从检测体输出的信号取得预先确定的信号值的元件的装置等实施，构成没有限定，可以与第1测定工序B4同样地实施。
第2检测工序B8通过包括从第1测定工序B4中测定的信号值和第3测定工序B7中测定的信号值得到检测值的运算元件的运算装置等实施，构成没有限定。
本实施方式中，作为追加反应工序的一个方式实施第2反应工序B5，在第2反应工序B5之后，作为信号扩大工序的一个方式实施第3反应工序B6。在第3反应工序B6中，与二次反应物进行反应的三次物质被供给到检测体的表面，通过二次反应物与三次物质的反应，在检测体的表面上形成三次反应物。由此，通过使用三次物质，能够扩大来自于二次物质的信号值，因此，能够更高灵敏度地检测试样中包含的检测对象物。
本说明书中，“三次物质”只要是特异性地与二次物质进行反应的物质，则没有特别限定，例如，在二次物质为由生物素标记化了的标记二次抗体的情况下，包括特异性地与标记进行反应的链霉抗生物素等标记检测试药。
在此，如上述示例，在试样中还包含由与检测对象物不同的物质构成的夹杂物的情况下，在无法通过在第1供给工序B3中向检测体的表面供给第1液体来将夹杂物从检测体的表面完全除去时，第1测定工序B4中测定的信号值会受到在检测体的表面残存的夹杂物的影响。因此，为了降低在检测体的表面残存的夹杂物所致的影响，通过从第1测定工序B4中测定的信号值和第3测定工序B7中测定的信号值得到检测值，由此，能够在第3测定工序B7中测定的信号值中降低来自于在检测体的表面残存的夹杂物的信号值。这是因为，第1测定工序B4中测定的信号值与第3测定工序B7中测定的信号值的差实质上不受在检测体的表面残存的夹杂物的量影响。
另外，在对多个试样检测各试样中的检测对象物的情况下，在粘度、密度在多个试样间不同时，即使在第1供给工序B3中将第1液体向检测体的表面供给，也无法从检测体的表面完全除去与检测对象物不同的夹杂物，在各试样中检测体的表面残存不等量的夹杂物，有时在各试样间产生信号值差异。然而，在表面残存的夹杂物实质上不对第1测定工序B4中测定的信号值与第3测定工序B7中测定的信号值的差造成影响，因此，通过从第1测定工序B4中测定的信号值和第3测定工序B7中测定的信号值得到检测值，由此可以降低各试样间的夹杂物的残渣的影响。
这样一来，通过降低各试样间的夹杂物的残渣的影响，由此能够更准确地检测试样中包含的检测对象物。
此外，本实施方式中，可以设定为如下方式：二次物质预先由生物素标记，且三次物质包含链霉抗生物素。由此，能够扩大来自于二次物质的信号值，因此能够更高灵敏度地检测检测对象物。
此外，本实施方式中，可以在第2反应工序B5与第3反应工序B6之间还具备将第2液体向检测体的表面供给的第2供给工序。由此，能够除去在第2反应工序B5中未与一次反应物反应的二次物质，因此，能够在第3反应工序B6以后的工序中除去未与一次反应物反应的二次物质的影响，能够提高第3测定工序B7中测定的信号值的准确性。
另外，本实施方式中，可以在第2反应工序B5与第2供给工序之间还具备基于检测体的表面状态测定信号值的中间测定工序。由此，能够除去在第2反应工序B5中未与一次反应物反应的二次物质，因此能够除去未与一次反应物反应的二次物质的影响，能够提高中间测定工序中测定的信号值的准确性。
此外，本实施方式中，可以还具备从中间测定工序中测定的信号值和第3测定工序B7中测定的信号值得到检测值的第3检测工序。由此，能够测定因第3反应工序B6产生的信号值。
另外，本实施方式中，可以在第3反应工序B6与第3测定工序B7之间还具备将第3液体向检测体的表面供给的第3供给工序。由此，能够除去在第3反应工序B6中未与二次反应物反应的三次物质，因此，能够在第3测定工序B7中测定的信号值中除去未与二次反应物反应的三次物质的影响，能够提高第3测定工序B7中测定的信号值的准确性。
本说明书中，“第3液体”例如可以为缓冲液等。缓冲液例如包括磷酸缓冲液等，并不限定于这些。
此外，本实施方式中，可以将第1液体、第2液体和第3液体设为相同种类的液体。
作为实施第2反应工序B5作为追加反应工序的一个方式、实施第3反应工序B6作为信号扩大工序的一个方式的一个实施例，以下示出检测对象物为抗原、使用表面弹性波元件作为检测体、使用一次抗体作为一次物质、使用缓冲液作为第1液体、使用标记化二次抗体作为二次物质、使用标记检测试药作为三次物质的例子。
即，第3实施方式的一个实施例可以为试样中包含的抗原的检测方法，所述检测方法具备：
准备工序，准备预先与表面弹性波元件的表面结合、且针对抗原的一次抗体，
第1反应工序，将试样向表面弹性波元件的表面供给，使其与上述针对抗原的一次抗体反应，使上述试样中包含的抗原与上述一次抗体的一次复合体在表面弹性波元件的表面上形成，
第1供给工序，在第1反应工序之后，将缓冲液向表面弹性波元件的表面供给，
第1测定工序，在第1供给工序之后，基于表面弹性波元件的表面状态测定信号值，
第2反应工序，在第1测定工序之后，将针对上述抗原的标记化二次抗体向表面弹性波元件的表面供给，使上述一次复合体与上述标记化二次抗体的二次复合体在表面弹性波元件的表面上形成，
第3反应工序，在第2反应工序之后，将针对上述标记化二次抗体的标记检测试药向表面弹性波元件的表面供给，形成上述二次复合体与上述标记检测试药的三次复合体，
第3测定工序，在第3反应工序之后，基于表面弹性波元件的表面状态测定信号值，
第2检测工序，从第1测定工序中测定的信号值和第3测定工序中测定的信号值得到检测值。
<检测装置>
下面示出检测装置100的一例。图3为示出检测装置的一例的框图。检测装置100通过在生物传感器装置上连接用于测定信号值的测定部30、作为用于运算的运算装置的检测部40、和作为用于显示检测结果的显示器的显示部50而构成。其中，所述生物传感器具备供给各种液体的供给部10、和不仅进行用于信号扩大的反应、而且也进行前体反应和追加反应的反应部20。
在本实施方式的检测装置100中，前述第1供给工序、第2供给工序等各供给工序通过反复使用1个供给部10来实施。同样地，前述第1反应工序、第2反应工序等各反应工序也通过反复使用1个反应部20来实施，前述各测定工序通过反复使用1个测定部30来实施，前述各检测工序通过反复使用1个检测部40来实施。显示部50在本实施方式中不是必需构成，以能够从检测部40向外部输出检测结果的方式构成即可。另外，关于测定部30与检测部40之间、检测部40与显示部50之间等的电连接，可以是使用了信号线等的有线连接，也可以是使用了天线等的无线连接。
图4为生物传感器装置200的立体图，图5为生物传感器装置200的分解立体图，图6为检测元件3的俯视图。
生物传感器装置200包含基板1、流路构成体2和检测元件3。如图4所示，流路构成体2隔着检测元件3和支承部件4配置在基板1上。流路构成体2在长度方向的一个端部侧具有作为液体状试样的入口的流入口14，且在其内部形成有连通流入口14的流路。基板1为平板状，例如为树脂基板、陶瓷基板等，且在表层或内层设有布线导体等。
在基板1的上表面的一个端部侧安装有检测元件3。在检测元件3的两侧设有与检测元件3电连接的端子6。端子6上连接有装置、运算装置等。
检测元件3为弹性表面波元件，包括压电基板7、第1IDT(Inter DigitalTransducer)电极8、第2IDT电极9和检测部13。压电基板7包含钽酸锂等的具有压电性的单晶基板。第1IDT电极8具有一对梳齿电极。各梳齿电极具有相互对置的2根母线(bus bar)和从各母线向其他母线侧延伸的多个电极指。一对梳齿电极以使多个电极指相互咬合的方式配置。第2IDT电极9也与第1IDT电极8同样地构成。第1IDT电极8和第2IDT电极9构成横向型的IDT电极。
第1IDT电极8用于产生规定的弹性表面波，第2IDT电极9用于接受由第1IDT电极8产生的SAW。第1IDT电极8和第2IDT电极9例如包含铝、铝与铜的合金等。
检测部13设置于第1IDT电极8与第2IDT电极9之间。检测部13例如形成铬和在铬上成膜的金的2层结构。检测部13的金属膜的表面结合有与检测对象物进行反应的一次物质。试样被供给到检测部时，试样中的检测对象物与一次物质发生反应而形成一次反应物。
将第1IDT电极8、第2IDT电极9和检测部13设为1组时，检测元件3中设有2组。例如，一个检测部13可以测定试样，另一个检测部13可以测定参考值。例如，另一个检测部13未键合与检测对象物进行反应的一次物质。
利用了这样的SAW的检测元件3中，首先，从外部向第1IDT电极8施加规定电压的信号。在第1IDT电极8中，压电基板7的表面被激励，产生规定频率的SAW。所产生的SAW的一部分向检测部13传导，并通过检测部13由第2IDT电极9接受。检测部13中，根据检测对象物的量形成一次反应物，检测部13的质量仅由一次反应物的部分增加。通过检测部13的SAW的相位伴随质量的增加而发生变化时，在第2IDT电极9产生与变化相应的电压。测定对第1IDT电极8施加的信号的相位、与从第2IDT电极9输出的信号的相位的差异作为相位变化。
在基板1的上表面进一步搭载有支承部件4，支承部件4支承流路构成体2。流路构成体2以覆盖检测元件3的至少一部分的方式配置。流路构成体2例如由第1粘接层19、第1亲水性片22、第2粘接层23和第2亲水性片24构成。
第1粘接层19为具有贯通孔19h的框体，检测元件3的一部分通过贯通孔19h而露出。在第1粘接层19上层叠有第1亲水性片22。第1亲水性片22具有与贯通孔19h同样的贯通孔22h，第1粘接层19与第1亲水性片22以使贯通孔之间连通的方式层叠。在第1亲水性片22上层叠有第2粘接层23。第2粘接层23具有沿构成流路的长度方向延伸的贯通孔23h。贯通孔23h的一个端部延伸至与贯通孔22h重叠的位置。第2粘接层23上层叠有第2亲水性片24。在第2亲水性片24的靠近两端部处设有由贯通孔构成的流入口14和排气口18。流入口14和排气口18形成在与贯通孔23h重叠的位置。
图7所示的示意图为信号值的一例，其中，使用生物素标记二次抗体、和碱性磷酸酶标记链霉抗生物素作为前体反应物质来进行前体反应工序，并使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝作为信号扩大物质来进行信号扩大工序，并在SAW元件中取得信号值。
图7所示的示意图中实施的工序如下所述。首先，进行第1反应工序和第1供给工序，形成一次反应物。接着，进行第1前体反应工序，使生物素标记二次抗体与一次反应物反应。在第1前体反应工序之后，进行供给10mM PBS(，10mM磷酸盐，137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，0.005％Tween20(注册商标)，pH7.4)的第2供给工序，除去游离的生物素标记二次抗体。在第2供给工序之后，进行第2前体反应工序，使碱性磷酸酶标记链霉抗生物素进行反应。在第2前体反应工序之后，进行供给10mM PBS(10mM磷酸盐，137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，0.005％Tween 20(注册商标)，pH7.4)的第3供给工序，去除游离的碱性磷酸酶标记链霉抗生物素。在第3供给工序之后，进行第1测定工序，取得第1信号值。在第1测定工序之后，进行信号扩大工序，使5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/四唑硝基蓝进行反应。在信号扩大工序之后，进行第2测定工序，取得第2信号值。最后，从第2信号值中减去第1信号值而得到检测值。
实施例
以下，对上述的实施方式所涉及的检测方法的实施例进行说明。
本实施例中，使用生物体试样，检测生物体试样中包含的检测对象物。
作为生物体试样，准备在不同的2种试样中分别包含等量的抗原的试样(生物体试样A、B)。即，生物体试样A和生物体试样B中，虽然粘度、所含物质不同，但抗原含量相等。
所准备的检测体为：使用弹性表面波元件(SAW元件)，在SAW元件的表面预先结合有作为一次物质的抗体(以下简称为“抗体”。)。在此，抗体为与检测对象物结合的物质。
关于实施例1，首先，作为第1反应工序，将生物体试样向SAW元件的表面供给，形成作为检测对象物的抗原(以下简称为“抗原”。)与抗体反应而成的一次反应物。
接着，在第1供给工序中，将作为第1液体的缓冲液10mM PBS
(10mM磷酸盐，
137mM氯化钠，
2.7mM氯化钾，
1mM MgCl2，0.005％Tween20(注册商标)，pH7.4)向SAW元件的表面供给。
接着，在第1测定工序中，在SAW元件中取得输入信号与输出信号的相位变化作为信号值。
接着，在信号扩大工序中，将作为信号扩大用物质的生物素修饰二次抗体向SAW元件的表面供给，形成一次反应物与生物素修饰二次抗体反应而成的一次反应物与生物素修饰二次抗体的复合体。
接着，在第2测定工序中，在SAW元件中，取得输入信号与输出信号的相位变化作为信号值。
接着，在第1检测工序中，从第2测定工序中测定的第2信号值中减去第1测定工序中测定的第1信号值，得到检测值。
如上所述地得到的、针对各生物体试样的信号值在图8中以图表的形式示出。
如图8所示，实施例1中，分别包含等量抗原的生物体试样A的检测值与生物体试样B的检测值是同等的。
由此可知，根据本发明的实施方式所涉及的检测方法，能够降低生物体试样间的差异所致的影响，能够准确地检测各生物体试样中包含的检测对象物(抗原)。
另一方面，作为比较例，不实施如上所述的第1测定工序，而取得第2测定工序中测定的相位变化的值作为检测值。
这样的比较例中，各自包含等量抗原的生物体试样A的检测值与生物体试样B的检测值不同，可知，受到生物体试样间差异的影响无法准确地检测各生物体试样中包含的检测对象物(抗原)(参照图8)。
此外，作为实施例2，不使用生物体试样，而使用将与实施例1等量的抗原用缓冲液
10mM PBS(10mM磷酸盐，
137mM氯化钠，
2.7mM氯化钾，
1mM MgCl2，0.005％Tween20(注册商标)，pH7.4)稀释而得的物质作为试样，按照与实施例1同样的方法得到的检测值与实施例1是同等的。
由此可以证明，在实施例1中，能够准确地检测生物体试样中包含的检测对象物(抗原)。
本发明并不限定于上述实施例，检测对象物即使为不同种类的抗原，也发挥同样的效果。
以上，本发明并不仅限定于上述各实施方式和各变形例等所示的构成，在不脱离本发明的要旨的范围内能够进行改良、变更，这是不言自明的。
符号说明
1 基板
2 流路构成体
3 检测元件
4 支承部件
6 端子
7 压电基板
8 第1IDT电极
9 第2IDT电极
10 供给部
13 检测部
14 流入口
20 反应部
30 测定部
40 检测部
50 显示部
100 检测装置
200 生物传感器装置

Claims (16)

1.一种检测方法，其为试样中包含的检测对象物的检测方法，所述检测方法具备：
准备工序，准备一次物质，所述一次物质预先与检测体的表面结合，且用于与所述检测对象物反应，
第1反应工序，将试样向所述检测体的表面供给，通过所述检测对象物与所述一次物质的反应使一次反应物在所述检测体的表面上形成，
第1供给工序，在所述第1反应工序之后，将第1液体向所述检测体的表面供给，
第1测定工序，在所述第1供给工序之后，基于所述检测体的表面状态测定第1信号值，
信号扩大工序，在所述第1测定工序之后，将信号扩大用物质向所述检测体的表面供给，通过所述第1反应工序中形成的所述一次反应物所参与的反应使所述检测体的表面状态发生变化，
第2测定工序，在所述信号扩大工序之后，基于所述检测体的表面状态测定第2信号值，和
第1检测工序，从所述第1信号值和所述第2信号值得到检测值。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，
在所述信号扩大工序与所述第2测定工序之间还具备第2供给工序，所述第2供给工序中，将第2液体向所述检测体的表面供给。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，
在所述第1测定工序与所述信号扩大工序之间还具备追加反应工序，所述追加反应工序中，将至少1种追加反应物质向所述检测体的表面供给。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，
所述至少1种追加反应物质具有多种追加反应物质，分别供给每种所述追加反应物质。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，
在所述第1反应工序与所述第1供给工序之间还具备前体反应工序，所述前体反应工序中，将至少1种前体反应物质向所述检测体的表面供给。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中，
所述至少1种前体反应物质具有多种前体反应物质，分别供给每种所述前体反应物质。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的检测方法，其中，
所述试样还包含与所述检测对象物不同的夹杂物，
所述第1反应工序中使所述夹杂物附着于所述检测体的表面，在所述第1供给工序之后，所述夹杂物残存在所述检测体的表面。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其中，
所述试样为生物体试样。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，
在所述第1反应工序中，通过使所述检测对象物与所述一次物质结合来形成所述一次反应物。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的检测方法，其中，
在所述第1反应工序中，通过使所述检测对象物与所述一次物质的一部分结合的同时使所述一部分从所述一次物质解离，从而形成所述一次反应物。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的检测方法，其中，
预先在所述检测体的表面形成表面弹性波元件，
基于所述检测体的表面状态的信号值为所述表面弹性波元件的相位特性的值。
12.根据权利要求1～10中任一项所述的检测方法，其中，
基于所述检测体的表面状态的信号值是通过选自QCM传感器即石英晶体微型天平传感器、SPR传感器即表面等离子体共振传感器和FET传感器即场效应晶体管传感器的方法测定的值。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的检测方法，其中，
所述第2信号值大于所述第1信号值。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的检测方法，其中，
所述第1液体为缓冲液。
15.根据权利要求2～14中任一项所述的检测方法，其中，
所述第1液体与所述第2液体相同。
16.一种装置，是用于检测试样中包含的检测对象物的装置，
所述装置具备：
第1反应部，将试样向一次物质供给，所述一次物质与检测体的表面结合且用于与所述检测对象物反应，通过所述检测对象物与所述一次物质的反应使一次反应物在所述检测体的表面上形成，
第1供给部，将第1液体向所述检测体的表面供给，
第1测定部，在所述第1液体通过所述第1供给部被供给到所述检测体的表面后，基于所述检测体的表面状态测定第1信号值，
信号扩大部，将信号扩大用物质向所述检测体的表面供给，通过所述一次反应物所参与的反应使所述检测体的表面状态发生变化，
第2测定部，基于被供给了所述信号扩大用物质的所述检测体的表面状态测定第2信号值，
第1检测部，从所述第1信号值和所述第2信号值得到检测值，和
显示部，显示所述第1检测部中得到的检测值。
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