JP2007508001A - 油糧種子ミール調製 - Google Patents

Abstract

カノーラタンパク質単離物を回収するためのカノーラ油糧種子ミールを生成するためカノーラ油糧種子を処理する。カノーラ油糧種子を加熱処理して、ミロシナーゼおよび他の酵素を不活性化し、脱殻した後、脱殻されたカノーラ油糧種子を破砕し、それからオイルを除去して、カノーラ油糧種子ミールを提供する。

Description

本発明は、油糧種子ミールからタンパク質を回収するための油糧種子ミールの調製を対象とする。

すべて本出願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる２００２年５月３日出願の同時係属の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（国際公開第０２／０８９５９７号）、および米国特許出願第１０／４７６，８３０号では、ケルダール法または等価の方法で窒素（Ｎ）パーセントとして決定し、換算係数６．２５をかけた場合少なくとも約１００ｗｔ％タンパク質を含有する高純度のタンパク質単離物の生成方法が記述されている。本明細書では、「タンパク質含有量」という用語は、乾燥重量ベースで表されたタンパク質単離物中のタンパク質量を指す。上述の米国特許出願では、油糧種子ミールを食品用塩溶液で抽出し、得られたタンパク質溶液を、望むなら着色材吸着剤で初期に処理した後、タンパク質含有量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに濃縮し、濃縮タンパク質溶液を冷水で希釈して、タンパク質ミセルを形成させ、放置して沈降させて、「タンパク質ミセル塊」またはＰＭＭと呼ばれる凝集し合体した稠密な非晶質粘性グルテン様のタンパク質単離物塊を形成し、残りの水相から分離し、そのままでまたは乾燥させて使用することができる方法によって、タンパク質単離物を作製する。

上記に記述する、具体的には米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，８３０号に記述する方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップで得られた上澄みを処理して、湿ＰＭＭおよび上澄みからのタンパク質を乾燥させて含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、最初に限外ろ過膜を使用して上澄みを濃縮し、濃縮上澄みを湿ＰＭＭと混合し、混合物を乾燥させることによって行うことができる。得られたカノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％という高純度のタンパク質（Ｎ×６．２５）を有する。

上記に記述する、具体的には米国特許出願第１０／１３７，３９１号および第１０／４７６，８３０号に記述する方法の別の実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップで得られた上澄みを処理して、上澄みからタンパク質を回収する。この手順は、最初に限外ろ過膜を使用して上澄みを濃縮し、濃縮物を乾燥させることによって行うことができる。得られたカノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％という高純度のタンパク質（Ｎ×６．２５）を有する。

上記の米国特許出願に記載されている手順は、本質的に回分手順である。本出願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（国際公開第０３／０４３４３９号）では、カノーラタンパク質単離物連続作製方法が記述されている。これによれば、カノーラ油糧種子ミールを塩溶液と連続混合し、混合物をパイプで運搬し、その間にタンパク質をカノーラ油糧種子ミールから抽出して、タンパク質水溶液を形成し、タンパク質水溶液を残留カノーラ油糧種子ミールから連続分離し、タンパク質水溶液を選択性膜操作によって連続運搬して、イオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含有量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続混合して、タンパク質ミセル形成を生じさせ、所望の量のＰＭＭが沈降器に沈降するまで上澄みを連続オーバーフローさせながらタンパク質ミセルを連続沈降することが可能になる。ＰＭＭを沈降器から除去し、乾燥することができる。ＰＭＭは、タンパク質含有量が少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％である。

タンパク質単離物の調製の初期のステップで抽出されたミールは、タンパク質単離物の風味および色に寄与することができるいくつかの成分を含む。例えば、抽出物に浸出することができるある種のフェノール性化合物を含む殻粒子がある。このようなフェノール性化合物は、酸化して着色された化合物を形成する傾向がある。

ミールおよびその生成物の品質に寄与することができる他の成分は、グルコシノレート、およびその分解生成物である。グルコシノレートの分解は、グルコシノレートをイソチオシアネート、チオシアネート、ニトリルおよび硫黄元素に分解するミロシナーゼと呼ばれる分解酵素を触媒として使用する。グルコシノレートの分解生成物は、ヒト用食品としてまたは動物飼料用として使用される場合のグルコシノレート含有植物の価値を低減させる。

カノーラは、菜種またはアブラナ(oil seed rape)とも呼ばれる。

本発明では、カノーラ油糧種子を加熱処理にかけてミロシナーゼを不活性化させ、脱殻にかけた後、脱殻した油糧種子を破砕して、それから油糧を除去する。この手順は、上記に記述する方法を使用して、油糧種子ミールに由来するタンパク質単離物の色および味に悪影響を及ぼすミール中の成分の存在を最小限に抑える。本明細書で提供される加熱処理手順を使用して、油糧種子中に存在するかもしれない他の酵素を失活させることもできる。

カノーラ油糧種子中に存在するミロシナーゼおよび他の酵素の不活性化は、酵素の不活性化を損なわない都合のよい任意の形で行うことができる。他の温度、時間および手順、例えば赤外、マイクロ波または高周波処理を使用することができるが、水蒸気を使用して約９０℃で最低１０分間不活性化を実施することが最も都合がよい。重要な特徴は、ミロシナーゼを含めて酵素を不活性化することである。

したがって、本発明の一態様では、カノーラ油糧種子を加熱処理して、その中の酵素を失活させ、カノーラ油糧種子を脱殻し、加熱処理し脱殻した油糧種子からカノーラ油糧を除去して、カノーラ油糧種子ミールを提供するステップを含むカノーラ油糧種子ミールの形成方法が提供されている。

この方法で生成されたカノーラ油糧種子ミールをその後処理して、それからタンパク質含有量が少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも１００重量％のカノーラタンパク質単離物を回収することができる。使用するカノーラタンパク質単離手順は、上記の米国特許出願に記載されるもののうちの１つであることが好ましい。
本発明の全般的な説明
本発明は、カノーラタンパク質単離物を調製することができるカノーラ油糧種子ミールを生成するカノーラ油糧種子の処理に関する。

この方法は、種子中に存在するミロシナーゼ酵素および他の酵素を不活性化するカノーラ油糧種子の加熱処理、および種子の脱殻を含む。脱殻は、加熱処理後、または加熱処理前に行うことができる。次いで、処理された種子を油糧除去ステップにかけて、カノーラ油糧種子ミールを得る。

加熱処理は、水蒸気加熱を使用して約９０℃で、最低約５分、好ましくは約１０分行うことができることが好都合である。上記に述べたように、赤外、マイクロ波、または高周波処理など他の温度、時間および手順を使用することができる。加熱処理した後、油糧種子を、通常は次の処理のため周囲温度に冷却する。

図１に示す本発明の一実施形態では、カノーラ油糧種子を、まず煮沸装置中で、水蒸気注入によって約９０℃で約１０分間不活性化する。次いで、不活性化された油糧種子を、流動床乾燥機を使用するなどして周囲温度に冷却する。次いで、冷却された失活カノーラ油糧種子を破砕ミルに送り、そこでカノーラ殻を破砕し、破砕された殻を空気吸引などによってカノーラミートから分離する。カノーラミートを、振動篩の使用などによって、より大きい（オーバー）断片とより小さい（アンダー）断片に分離する。図１の示された例では、１４メッシュの篩を分離ステップに使用している。

オーバー断片は、それに付随する未破砕の残留殻をより多く有する傾向があり、一般に破砕ミルに数回再循環させて、残留殻を除去する。オーバー断片を脱殻すると、ミートをフレーク状にし、そのフレークを溶媒抽出することによって、カノーラ油糧の回収およびカノーラ油糧種子ミールの生成のための処理を行うことができる。回収されたミールを、通常は脱溶媒する。

アンダー断片は、空気吸引などによって残留殻を除去するように処理する。アンダー断片を脱殻すると、ミートをフレーク状にし、そのフレークを溶媒抽出することによって、カノーラ油糧の回収およびカノーラ油糧種子ミールの生成のための処理を行うことができる。残留ミールを、通常は脱溶媒する。カノーラミートのオーバーとアンダーを、フレーク状にするステップの前に同時に組み合わせてもよい。

図２に示す本発明の別の実施形態では、脱殻した後に酵素不活性化を行う。カノーラ油糧種子ミールを破砕ミルに送り、そこでカノーラ殻を破砕し、破砕された殻をカノーラミートから分離する。カノーラミートを、振動篩の使用などによって、より大きい（オーバー）断片とより小さい（アンダー）断片に分離する。オーバー断片は、それに付随する未破砕の残留殻をより多く有する傾向があり、一般に破砕ミルに数回再循環させて、残留殻を除去する。

オーバー断片およびアンダー断片をそれぞれ、煮沸装置中で、水蒸気注入によって約９０℃で約１０分間の不活性化にかける。次いで、不活性化された断片を、流動床乾燥機を利用するなどして別々に冷却する。

次いで、冷却された断片を、カノーラ油糧の回収およびカノーラ油糧種子ミールの生成のために処理する。オーバー断片をフレーク状にし、空気吸引などによって残留殻を除去し、そのフレークを溶媒抽出する。残留ミールを脱溶媒することができる。

アンダー断片をフレーク状にし、そのフレークを溶媒抽出にかける。残留ミールを脱溶媒することができる。

これらの手順によって調製された残留ミールを、下記にさらに詳細に記述するように、上記の米国特許出願に記載されている手順を使用して、それからカノーラタンパク質単離物を回収するようにさらに処理する。

ＰＭＭ由来のカノーラタンパク質単離物および上澄み由来のカノーラタンパク質単離物はそれぞれ、一般に上記の米国特許出願に記載されている回分法（回分プロセス）、または連続法（連続プロセス）、または半連続法によってカノーラ油糧種子ミールから単離することができる。

カノーラタンパク質単離物を提供する方法の初期のステップは、タンパク質材料をカノーラ油糧種子ミールから可溶化するものである。カノーラ種子ミールから回収されたタンパク質材料は、カノーラ種子中に天然に生じるタンパク質とすることができ、あるいはタンパク質材料は、遺伝子操作によって改質されているものの天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を有するタンパク質とすることができる。カノーラミールは、例えば熱ヘキサン抽出または冷油糧押出方法によって得られた様々なレベルの非変性タンパク質を有するカノーラ油糧種子から、カノーラ油糧を除去することによって得られた任意のカノーラミールとすることができる。カノーラ油糧種子からのカノーラ油糧の除去は、通常は本明細書に記載するタンパク質単離物回収手順の分離操作として行う。

タンパク質可溶化は、本発明に従って塩溶液を使用することによって行う。この塩は、塩化カリウムや塩化カルシウムなど他の適切な塩を使用することができるが、通常は塩化ナトリウムである。塩溶液のイオン強度は、相当量のタンパク質の可溶化の実施が可能になるように少なくとも約０．１０、好ましくは少なくとも約０．１５である。塩溶液のイオン強度を上昇させるにつれて、油糧種子ミール中のタンパク質の可溶化度は、初めは最大値に到達するまで増大する。その後にイオン強度を上昇させても、可溶化タンパク質の全量は増大しない。最大のタンパク質可溶化をもたらす塩溶液のイオン強度は、選択された油糧種子ミールに応じて変わる。

イオン強度を上昇させるとタンパク質沈殿に必要とされた希釈度が増大することを考えると、通常は約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１５〜約０．６の値を利用することが好ましい。

回分法では、タンパク質の塩可溶化は、少なくとも約５℃、好ましくは約３５℃までの温度で、好ましくは可溶化時間を通常は約１０〜約６０分に短縮するために撹拌しながら行う。生成物の全収率が高くなるように、可溶化を行って、油糧種子ミールからタンパク質を実施可能な限り実質的に抽出することが好ましい。

温度の下限は約５℃を選択する。というのはこの温度より低い場合、可溶化が実施不可能なほど遅いからである。好ましい温度の上限は、約３５℃を選択する。というのは、回分モードでは、この方法はこれより高い温度レベルでは不経済になるからである。

連続法では、カノーラ油糧種子ミールからのタンパク質の抽出は、カノーラ油糧種子ミールからのタンパク質の連続抽出を行うのと一致した任意の方式で実施する。一実施形態では、カノーラ油糧種子ミールを、塩溶液と連続混合し、この混合物を、本明細書に記載するパラメータに従って所望の抽出を行うのに十分な滞在時間のための長さと流量を有するパイプまたは導管で運搬する。このような連続手順では、塩可溶化ステップを約１０分までの時間で急速に行って、好ましくは可溶化を行って、カノーラ油糧種子ミールからタンパク質を実施可能な限り実質的に抽出する。連続手順の可溶化は、高温、好ましくは約３５℃超、一般に最高約６５℃で行うことが好ましい。

より詳細に下記に記載するように、塩水溶液およびカノーラ油糧種子ミールの自然のｐＨは、ミセル経路でタンパク質単離物の形成が可能になるような約５〜約６．８である。

ｐＨ範囲の限界および限界近くでは、タンパク質単離物形成は、ミセル経路で、ｐＨ範囲の他のところで達成可能な収率より低い収率で部分的にしか生じない。これらの理由により、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。

塩溶液のｐＨは、必要なら都合のよい任意の酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、抽出ステップで使用する約５〜約６．８の範囲内の所望の任意の値に調整することができる。

可溶化ステップ中、塩溶液中の油糧種子ミール濃度は広範囲に変わり得る。典型的な濃度の値は、約５〜約１５ｗ／ｖ％である。

塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、カノーラミール中に存在する可能性がある脂肪を可溶化し、次いでその脂肪が水相に存在することになるという追加の効果を有する。

抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般にタンパク質濃度が、約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌである。

次いで、抽出ステップから得られた水相は、残留ミールを除去するためにデカンタ型遠心機、続いてディスク遠心、および／またはろ過を使用することによってなど都合のよい任意の方式で残留カノーラミールから分離することができる。分離された残留ミールを廃棄するために乾燥することができる。

粉末活性炭または他の色素吸着剤を、分離されたタンパク質水溶液と混合し、その後吸着剤を好都合にはろ過によって除去して、タンパク質溶液を得ることによって、最終カノーラタンパク質単離物の色を、明色および濃くない黄色という点で改善することができる。透析ろ過(diafiltration)も、色素除去のために使用することができる。

このような色素除去ステップは、一般に分離されたタンパク質水溶液の周囲温度で、適切な任意の色素吸着剤を使用して、都合のよい任意の条件下で実施することができる。粉末活性炭については、約０．０２５％〜約５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０５％〜約２ｗ／ｖ％の量を使用する。

本出願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載されているように、カノーラ種子ミールが相当量の脂肪を含有する場合、そこに記載されている脱脂ステップを、分離されたタンパク質水溶液、および下記で述べる濃縮されたタンパク質水溶液に行うことができる。色改善ステップを実施する場合は、このようなステップを第１の脱脂ステップ後に行うことができる。

代替の一手順は、油糧種子ミールを、約６．８超、一般に最高約９．９という相対的に高いｐＨ値の塩溶液で抽出することである。塩化ナトリウム溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液など都合のよい任意の食品用アルカリの使用によって所望のアルカリ値のｐＨに調整することができる。あるいは、油糧種子ミールをｐＨ約５未満、一般にｐＨ約３までという相対的に低いｐＨのそのナトリウム溶液で抽出することができる。このような代替手順を使用する場合、油糧種子ミール抽出ステップから得られた水相を、次いで残留ミールを除去するためにデカンタ型遠心機、続いてディスク遠心を使用することによってなど都合のよい任意の方式で、残留カノーラミールから分離する。分離された残留ミールを廃棄するために乾燥することができる。

次いで、高いまたは低いｐＨでの抽出ステップによって得られたタンパク質水溶液は、下記に述べる他の処理の前に、上記に述べるようにｐＨを約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲に調整する。このようなｐＨ調整は、塩酸などの都合のよい任意の酸か、または水酸化ナトリウムなどのアルカリを適切に使用して行うことができる。

次いで、タンパク質水溶液を濃縮して、そのイオン強度を実質的に一定に維持しながらそのタンパク質濃度を上昇させる。このような濃縮を一般に行って、タンパク質濃度が少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌの濃縮タンパク質溶液を得る。

濃縮ステップは、様々な膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンなどの適切な分画分子量の中空糸膜やスパイラル型膜などの膜を用いた限外ろ過や透析ろ過(diafiltration)など都合のよい任意の選択性膜技法を使用することなどによって、回分または連続操作と矛盾することのない都合のよい任意の方式で行うことができ、連続操作の場合は、タンパク質水溶液が膜を通過するとき所望の程度の濃縮が可能になるような大きさにすることができる。

次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液として同じモル濃度およびｐＨの塩化ナトリウム水溶液を使用する透析ろ過(diafiltration)ステップにかけることができる。このような透析ろ過(diafiltration)は、約２〜約２０体積の透析ろ過(diafiltration)溶液、好ましくは約５〜約１０体積の透析ろ過(diafiltration)溶液を使用して行うことができる。透析ろ過(diafiltration)操作では、別の量の汚染物を、透過物とともに膜に通すことによってタンパク質水溶液から除去する。この透析ろ過(diafiltration)操作を、顕著なさらなる量のフェノール類および可視色が透過物中に存在しなくなるまで行うことができる。このような透析ろ過(diafiltration)は、様々な膜材料および構成を考慮して分画分子量が約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の膜を使用して行うことができる。

酸化防止剤は、透析ろ過(diafiltration)ステップの少なくとも一部分の間、透析ろ過(diafiltration)媒体中に存在することができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムやアスコルビン酸など都合のよい任意の酸化防止剤とすることができる。透析ろ過(diafiltration)媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料によって異なり、約０．０１〜約１ｗｔ％、好ましくは約０．０５ｗｔ％となり得る。酸化防止剤は、カノーラタンパク質単離物の濃縮溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制するように働く。

濃縮ステップおよび透析ろ過(diafiltration)ステップは、都合のよい任意の温度、一般に約２０°〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮が行える時間行うことができる。使用する温度および他の条件は、溶液の濃縮および溶液の所望のタンパク質濃縮を行うために使用する膜装置にある程度依存する。

タンパク質溶液をこのステップで約２００ｇ／Ｌを超える好ましい濃度に濃縮すると、プロセス歩留まりを、乾燥タンパク質単離物として回収された抽出タンパク質の比率で表して約４０％を超える、好ましくは約８０％を超えるレベルに増大させるだけでなく、乾燥後の最終タンパク質単離物の塩濃度を低減する。単離物の塩濃度を制御する能力は、塩濃度のバラツキが特定の食品用途における機能および知覚特性(sensory properties)に影響を及ぼす単離物の用途において重要である。

よく知られているように、限外ろ過および同様の選択性膜技法によって、低分子量種がそれを通過し、その間、より高い分子量種の通過を阻止することが可能になる。低分子量種には、炭水化物、顔料、栄養阻害要因、およびタンパク質の任意の低分子量の形など、食品用塩イオン種だけでなく、供給材料から抽出される低分子量材料も含まれる。膜の分画分子量は、通常は様々な膜材料および構成を考慮して、溶液中のタンパク質の大幅な比率を保持する一方、汚染物質が通過することが可能になるように選択する。

濃縮し場合によっては透析ろ過した(diafiltered)タンパク質溶液を、必要なら、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載されるように、次の脱脂操作にかけることができる。

濃縮し場合によっては透析ろ過した(diafiltered)タンパク質溶液を、上記に記述する脱色操作の代替形態である脱色操作にかけることができる。本発明では、粉末活性炭、および粒状活性炭（ＧＡＣ）を使用することができる。色吸着剤として使用できる別の材料は、ポリビニルピロリドンである。

色吸着剤処理ステップは、都合のよい任意の条件下、一般にはカノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末活性炭の場合、約０．０２５％〜約５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０５％〜約２ｗ／ｖ％の量を使用することができる。ポリビニルピロリドンを色吸着剤として使用する場合、約０．５％〜約５ｗ／ｖ％、好ましくは約２％〜約３ｗ／ｖ％を使用することができる。色吸着剤は、ろ過など都合のよい任意の手段によってカノーラタンパク質溶液から除去することができる。

オプションの脱色ステップから得られた濃縮し場合によっては透析ろ過した(diafiltered)タンパク質溶液を、低温殺菌にかけて、貯蔵またはその他の結果元のミール中に存在していたかもしれない細菌、および抽出ステップでミールからカノーラタンパク質単離物溶液に抽出された細菌を死滅させることができる。このような低温殺菌は、所望の任意の低温殺菌条件下で行うことができる。一般に、濃縮し場合によっては透析ろ過した(diafiltered)タンパク質溶液を、約５５°〜約７０℃、好ましくは約６０°〜約６５℃の温度に、約１０〜約１５分、好ましくは約１０分加熱する。次いで、滅菌した濃縮タンパク質溶液を、下記に記載する次の処理のため、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に冷却することができる。

濃縮ステップで使用する温度に応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０°で最高約６０℃、好ましくは約２５°〜約４０℃の温度に加温して、濃縮タンパク質溶液の粘度を低下させると、その後の希釈ステップおよびミセル形成の実施が容易になる。濃縮タンパク質溶液は、冷水で希釈するとき濃縮タンパク質溶液の温度によってミセル形成ができなくなる温度を超えて加熱すべきではない。濃縮タンパク質溶液を、必要なら上記の米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載するように、次の脱脂操作にかけることができる。

次いで、濃縮ステップ、さらにオプションの透析ろ過(diafiltration)ステップ、オプションの脱色ステップ、オプションの低温殺菌ステップ、およびオプションの脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、所望の程度の希釈を実現するのに必要とされた体積の冷水と混合することによってミセル形成が行われるように、濃縮タンパク質溶液を希釈する。ミセル経路によって得られることが望まれるカノーラタンパク質の比率、および上澄みからの比率に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈の程度を変えることができる。より高い希釈レベルでは、一般に水相中のカノーラタンパク質の比率はより高いままである。

ミセル経路によるタンパク質の比率を最大にすることが望まれる場合、濃縮タンパク質溶液を約１５倍以下、好ましくは約１０倍以下に希釈する。

濃縮タンパク質溶液を混合する冷水は、温度が約１５℃未満、一般に約３°〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満である。というのは、使用する希釈倍率では、これらのより低い温度によって、タンパク質ミセル塊の形でのタンパク質単離物の収率が向上されるからである。

回分操作では、濃縮タンパク質溶液の１回分を、上記に述べるように所望の体積の冷水の静域(static body)に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈、および結果として起こるイオン強度の低下によって、独立したタンパク質小滴の形のタンパク質分子がミセルの形で高度に会合した雲様塊の形成が引き起こされる。回分手順では、タンパク質ミセルを放置して冷水域中で沈降させて、凝集し合体した稠密な非晶質粘性グルテン様のタンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成させる。沈降を、遠心などによって援助することができる。このような誘導された沈降によって、タンパク質ミセル塊の液体含有量が減少し、それによって水分含有量が全ミセル塊の一般に約７０重量％〜約９５重量％から、一般に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少する。このようにミセル塊の水分含有量が減少すると、ミセル塊の吸蔵された塩含有量、したがって乾燥単離物の塩含有量も減少する。

あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字型管の一方の入口に連続的に入れ、その間、希釈用水をＴ字型管のもう１つの入口に送り込み、管中で混合することが可能になることによって、希釈操作を連続的に実施することができる。希釈用水は、濃縮タンパク質溶液の所望の程度の希釈を実現するのに十分な速度でＴ字型管に送り込む。

管中で濃縮タンパク質溶液と希釈用水が混合することによって、タンパク質ミセルの形成が開始し、混合物がＴ字型管から出口を通って沈降器に連続的に送り込まれ、満杯になると、そこから上澄みがオーバーフローすることが可能である。混合物は、液体域内の乱れを最小限に抑える方式で沈降器の液体域に送り込まれることが好ましい。

連続手順では、タンパク質ミセルを放置して沈降器中で沈降させて、凝集し合体した稠密な非晶質粘性グルテン様のタンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成させ、その手順を所望の量のＰＭＭが沈降器の底に蓄積するまで継続し、蓄積されたＰＭＭを沈降器から除去する。回分プロセスでは、沈降を、遠心などによって援助することができる。

タンパク質溶液を少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含有量に濃縮するプロセスパラメータの組合せ、および約１５倍未満の希釈倍率の使用によって、上記の米国特許で述べられている周知の従来技術のタンパク質単離物形成手順のいずれかを使用して実現されたものより、元のミール抽出物からのタンパク質ミセル塊の形でのタンパク質の回収の点で高い収率、しばしば大幅に高い収率、ならびにタンパク質含有量の点ではるかに高純度の単離物が得られる。

回分プロセスに比べて連続プロセスをカノーラタンパク質単離物の回収のために利用することによって、初期のタンパク質抽出ステップは、同じレベルのタンパク質抽出に関して時間を大幅に短縮することができ、および大幅により高い温度を抽出ステップで使用することができる。さらに、連続操作では、回分手順でよりも汚染の機会が少なく、より高い生成物品質が得られ、プロセスをよりコンパクトな装置で実施することができる。

沈降した塊から残留水相をデカンテーションする、または遠心することによって、沈降した単離物を残りの水相または上澄みから分離する。ＰＭＭは、湿潤した形で使用することができ、あるいは噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空ドラム乾燥など都合のよい任意の技法によって、乾燥した形に乾燥することができる。乾燥ＰＭＭは、タンパク質約９０ｗｔ％超、好ましくはタンパク質少なくとも約１００ｗｔ％（ケルダールＮ×６．２５として算出）という高タンパク質含有量を有し、実質的に未変性（示差走査熱分析によって決定）である。脂肪油糧種子ミールから単離された乾燥ＰＭＭも、必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を使用すると、残留脂肪含有量が低く、約１ｗｔ％未満となることがある。カノーラタンパク質単離物のフィチン酸含有量は、塩化ナトリウム水溶液を用いた同じ反応条件下でのミールの抽出に比べて減少し、好ましくは約１ｗｔ％未満となることがある。

ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄みは、希釈ステップで沈殿しなかったカノーラタンパク質を相当量含んでおり、カノーラタンパク質単離物をそれから回収するために処理する。希釈ステップ、続いてＰＭＭ除去からの上澄みを濃縮して、そのタンパク質濃度を増大させる。このような濃縮は、溶液中のカノーラタンパク質を保持しながら、塩や、タンパク質供給材料から抽出された他の非タンパク質低分子量材料を含めて低分子量種が膜を通過することが可能になる、適切な分画分子量の膜を用いた限外ろ過など都合のよい任意の選択性膜技法を使用して実施する。様々な膜材料および構成を考慮して、分画分子量約３，０００〜１００，０００ダルトンの限外ろ過膜を使用することができる。また、このようにした上澄みの濃縮は、タンパク質を回収するために乾燥することが必要とされる液体の体積を低減する。上澄みを、一般に乾燥する前に、タンパク質濃度約１００〜約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌに濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップに関して上記に記述するように、回分モードまたは連続操作で実施することができる。

濃縮された上澄みを、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空ドラム乾燥などの都合のよい任意の技法によって、乾燥した形に乾燥して、さらにカノーラタンパク質単離物を提供することができる。このようなさらなるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質約９０ｗｔ％超、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（ケルダールＮ×６．２５として算出）という高タンパク質含有量を有し、実質的に未変性（示差走査熱分析によって決定）である。

望むなら、湿潤ＰＭＭの少なくとも一部分を濃縮された上澄みの少なくとも一部分と組み合わせた後、その組み合わせたタンパク質の流れを都合のよい任意の技法によって乾燥して、一発明による組み合わせたカノーラタンパク質単離物組成物を提供することができる。得られるカノーラタンパク質単離物組成物が所望のタンパク質プロファイル２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓを有するように、一緒に混合するタンパク質材料の相対的比率を選択することができる。あるいは、乾燥タンパク質単離物を所望の任意の比率で組み合わせて、混合物として所望の任意の具体的なタンパク質プロファイル２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓを提供し、それによって本発明による組成物を提供する。組み合わせたカノーラタンパク質単離物組成物は、約９０ｗｔ％超、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（ケルダールＮ×６．２５として算出）という高タンパク質含有量を有し、実質的に未変性（示差走査熱分析によって決定）である。

濃縮された上澄みのみの一部分をＰＭＭのみの一部分と混合し、得られた混合物を乾燥する別の代替手順では、濃縮された上澄みの残部を、ＰＭＭの残部のいずれも乾燥することができるように乾燥することができる。さらに、乾燥ＰＭＭおよび乾燥上澄みを、上記に述べるように所望の任意の相対的比率で乾燥混合することもできる。

この方式で操作することによって、いくつかのカノーラタンパク質単離物を、乾燥ＰＭＭ、乾燥上澄み、および様々な重量比率、一般に約５：９５〜約９５：５（単位重量）のＰＭＭ由来のカノーラタンパク質単離物と上澄み由来のカノーラタンパク質単離物の乾燥混合物の形で回収することができ、これは組成物中のタンパク質２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓの様々な比率に基づいて様々な機能および栄養特性を達成するのに望ましいことがある。

上記に記述する冷水への濃縮タンパク質溶液の希釈、および得られた沈殿物と上澄みの処理の代替形態として、濃縮タンパク質溶液を透析してその塩含有量を低減することによって、タンパク質を濃縮タンパク質溶液から回収することができる。濃縮タンパク質溶液の塩含有量の低減によって、透析チュービング中でタンパク質ミセルの形成が生じる。透析に続いて、タンパク質ミセルを、上記に述べるように沈降、収集、かつ乾燥することが可能になることがある。タンパク質ミセル沈降ステップからの上澄みを、上記に述べるように処理して、さらにタンパク質をそれから回収することができる。あるいは、透析チュービングの内容物を直接乾燥することができる。後者の代替手順は、実験室規模の少量のタンパク質が望まれる場合に有用である。

実施例１：
この実施例は、カノーラタンパク質単離物を得るためのカノーラ油糧種子ミールの調製、およびその後の処理を記述する。

品種アルゼンチン（Ａｒｇｅｎｔｉｎａ）というカノーラ種子１２５ｋｇを、図１に示すプロセスに従って処理した。ミロシナーゼ、および他の酵素を失活させるために、まず種子に、水蒸気で加熱された煮沸装置中、９０℃で保持時間１０分間の加熱処理を施した。得られた不活性化されたカノーラ油糧１１５．８ｋｇを流動床乾燥機中で冷却した後、この種子を破砕し、殻を空気吸引によって部分除去した。

より大きいカノーラミート（オーバー）を１４メッシュの振動篩を用いて分離し、オーバーを破砕ミルに４回再循環して、主にカノーラミートおよびより小さい断片の殻からなる４２．４ｋｇを得た。残留殻を除去するため、アンダー（３６ｋｇ）を最終空気吸引に通した。カノーラフレーク３４．１ｋｇを溶媒によるオイル抽出用のソックスレー抽出器に通す前に、オーバー断片を廃棄しながら、最終ミート（３５．３ｋｇ）またはアンダー断片をフレーキングミルによってフレーク状にした。

下記の実施例２に記述するように、オイル抽出からの脱殻および脱脂ミール（１６．１７ｋｇ）を、タンパク質抽出用の出発材料として使用した。脱殻カノーラミールをＳＤ０２４と特定した。

図２の手順に従って、品種アルゼンチンというカノーラ種子の第２の回分１３０．４ｋｇから、脱殻および脱脂カノーラミールの追加の２つの断片を得た。この回分では、種子を初期に破砕し、殻を空気吸引によって部分除去した。

より大きいカノーラミートを１４メッシュの振動篩を用いて分離し、オーバーを４回再循環して、カノーラミートおよび殻からなる５２．２ｋｇを得た。振動篩を最後に通過した後、アンダー（４９．２ｋｇ）とオーバーとを、水蒸気を使用して９０℃で１０分間加熱処理した。断片を流動床乾燥機で冷却した。最終ミートをフレーキングミルでフレーク状にした。アンダー（３８．１ｋｇ）から得られたフレークを、ソックスレー抽出器を使用して直接溶媒抽出して、オイルを除去して、脱脂ミール（１１．３５ｋｇ）を得、ＳＤ０２９と特定した。オーバーから得られたフレークをもう１回空気吸引し、吸引されたフレークを、ソックスレー抽出器を使用して溶媒抽出して、オイルを除去し、脱脂ミール（１１．３７ｋｇ）を得、ＳＤ０２７と特定した。

試料ＳＤ０２４（「回分＃１」）、ＳＤ０２９（「回分＃２アンダー」）、およびＳＤ０２７（「回分＃２オーバー」）について、カノーラ油糧種子の不活性化中の温度プロフィルを図４に示す。

この手順では、合計３５．３ｋｇの脱殻ミート（アンダー）を、回分＃１の不活性化したカノーラ種子１１２．３ｋｇから回収して、全収率３１．４３ｗｔ％を得た。回分＃２のカノーラ１３０．４ｋｇから、合計３８．１ｋｇの脱殻しフレーク状にした微粉（アンダー）を生成し、収量２９．２ｗｔ％を得た。脱殻カノーラの比較的低い収率は、破砕ミルでの粗砕ローラの使用のためより小さいカノーラ種子の破砕不良に一部起因する可能性がある。より細かいピッチのロール（１８段／インチ）を使用すれば、ロール間のギャップをより狭くすることが可能になり、より小さい種子の破砕が可能になる。より大きくより均一な種子によっても、収率、および脱殻の一貫性を増大させることができる。

ミートからの殻の効果的な分離を実現するため、吸引条件を調整した。空気差圧を水０．４〜０．８インチに設定することによって、効果的な分離がもたらされた。差圧をより大きくすると、過剰の内胚乳(endosperm)が殻断片によって除去された。

空気吸引によって回収されたミート断片は、広範囲の粒径からなっており、より細かく破砕されたカノーラは、より小さい比率の殻断片を含んでいた。その結果、より小さい脱殻ミート断片は、１４メッシュの振動篩でふるいにかけることによって、より大きいミートおよび殻から回収される可能性がある。装置をセットアップする前に手動篩試験によって、最適の篩サイズを予備選択した。

脱殻された内胚乳断片を、Ｌａｕｈａｕｆフレーキングミルの一組の滑面ローラに通過させることによって、フレーク化を実施して、油糧細胞を破裂させた。

ギャップ設定を０．０８ｍｍにして、回分＃１と＃２とからの脱殻されたミートを効果的にフレーク状にし、０．１０１〜０．１２５ｍｍのフレーク厚さを得た。しかし、回分＃２プロセスによって生成されたフレークは、脆く、回分＃１のフレークに比べて幾分崩壊していた。この結果は、カノーラ種子を脱殻する前に不活性化すると、より安定なフレークが得られることを示唆するものであった。

脱脂した後、回分＃１の脱脂カノーラミールの残留オイル含有量は、１．５０ｗｔ％であった。回分＃２のミールは、アンダーおよびオーバー断片にそれぞれ、１．８７ｗｔ％および１．２３ｗｔ％のオイルを含有していた。
実施例２：
この実施例は、実施例１の手順に従って調整された脱脂ミールからの、カノーラタンパク質単離物の調製を示している。

実施例１に記載するように調製された、脱殻脱脂しミロシナーゼが不活性化されたカノーラミールを、図３の手順に従って処理して、カノーラタンパク質単離物を得た。

脱殻脱脂しミロシナーゼが不活性化されたカノーラミール「ａ」ｋｇを０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに周囲温度で添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留カノーラミールを、チーズクロスを用いたろ過または他の適切なろ過方法で除去した。得られたタンパク質溶液を遠心によって透明にして、タンパク質含有量「ｄ」ｇ／Ｌの透明タンパク質溶液「ｃ」Ｌを得た。

このタンパク質抽出溶液を「ｅ」Ｌずつ、「ｇ」ダルトン分画分子量膜を使用した限外ろ過システムで濃縮することによって、体積を「ｆ」Ｌに低減した。得られた濃縮タンパク質溶液は、タンパク質含有量が「ｈ」ｇ／Ｌであった。次いで、この濃縮タンパク質溶液を、「ｉ」ダルトン分画分子量膜を使用して、０．０５ｗｔ％のアスコルビン酸を含有する０．１５Ｍ 塩化ナトリウム溶液「ｊ」Ｌを用いて透析ろ過(diafiltered)して、タンパク質含有量「ｌ」ｇ／Ｌの最終体積「ｋ」Ｌの透析ろ過(diafiltered)タンパク質溶液とした。

「ｍ」℃で透析ろ過(diafiltered)されたタンパク質溶液を「ｏ」℃の水に入れて「ｎ」に希釈した。白色雲状物が即座に形成し、それを放置して沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘稠性で粘着性の塊（ＰＭＭ）を容器の底から、抽出タンパク質の収率「ｐ」ｗｔ％で回収した。乾燥したＰＭＭ由来タンパク質は、タンパク質含有量が「ｑ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂであることが判明した。生成物に「ｒ」という名称を与えた。

パラメータ「ａ」〜「ｒ」を下記の表Ｉに示す。

除去された希釈水は、「ｓ」ダルトン分画分子量膜を使用した限外ろ過によって体積を低減して、タンパク質濃度「ｔ」ｇ／Ｌにした。この濃縮物を乾燥した。追加のタンパク質を上澄みから回収して、タンパク質の全回収率は、抽出タンパク質「ｕ」ｗｔ％であった。この形成された乾燥タンパク質は、タンパク質含有量が「ｖ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂであった。

生成物に「ｗ」という名称を与えた。パラメータｓ〜ｗを下記の表ＩＩに示す。

実施例３：
この実施例は、実施例２の手順に従うことによって得られた結果を示している。
（ａ）抽出および分離ステップ：
下記の表ＩＩＩは、異なる３種類のミールについて見かけの抽出量を示している。見かけの抽出量は、生理食塩水の全体積を回収することができれば回収できるはずのタンパク質の百分率を表す。しかし、回収率は、ミールの違いのため、さらに／またはミール中の液滞留量の違いのため、変わることがある。透明化プロセス後の実際の体積を考慮に入れて計算すると、結果はタンパク質の収率である。見かけの抽出量は、３種の場合すべて４０％より高い。ＳＤ０２４およびＳＤ０２７のミールの場合、それぞれ４７．５ｗｔ％、および４６．１ｗｔ％と同じ大きさである。ＳＤ０２９ミールについての数値は、わずかにより小さい。見かけの抽出量は、抽出量数が低温脱溶媒または絞りかすミールの場合（データを図示せず）と同じ範囲であるとき、ミールの脱殻および加熱処理プロセスによって注目に値する程は影響されない。

（ｂ）限外ろ過＃１および＃２：
ＳＤ０２９およびＳＤ０２７のミールの場合、タンパク質回収率（表ＩＶ）は、ＰＶＤＦ５螺旋膜を使用した限外ろ過＃１の場合に他のミールで通常観察される値と同様である。ＳＤ０２４ミールの場合、５５ｗｔ％というより低い値は、透過物におけるタンパク質の一部損失に起因している。回分ＢＷ−ＳＤ０２４−Ｂ０３−０３Ａでは、透過物のクロマトグラムは、かなりの量の２Ｓタンパク質を示した。このタンパク質の損失は、使用する膜が新しいことに起因すると考えられる。

限外ろ過＃２の場合、タンパク質回収率は７５ｗｔ％（ＳＤ０２４）、９０ｗｔ％（ＳＤ０２９）、および１００ｗｔ％（ＳＤ０２７）であった。
（ｃ）最終生成物中のタンパク質分布：
下記の表ＶおよびＶＩは、完成したＰＭＭ由来単離物および上澄み由来単離物についてのタンパク質分布を示している。ＳＥＣクロマトグラムによるタンパク質ピークを、１００ｗｔ％である１群と見なした。これは、例えば８０ｗｔ％の７Ｓが存在すれば、タンパク質ピーク全部の全ピーク面積の８０ｗｔ％が、７Ｓタンパク質に属することを意味する。

わかるとおり、ＰＭＭにおけるタンパク質分布は、７ＳはＰＭＭ中で主なタンパク質であるという以前に観察された同じパターン（本出願の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる２００３年４月１５日出願の同時係属の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（国際公開第０３／０８８７６０号）を参照のこと）に従っている。ＳＤ０２４ミールから得られたＰＭＭでは、膜通過によるタンパク質損失に起因して、２Ｓ量が低減し、したがって１２Ｓ濃度がより高くなることが判明した。

ＳＤ０２４ミールの場合の２Ｓ損失の結果、抽出タンパク質のｗｔ％としての生成物収率は、ＳＤ０２７またはＳＤ０２９ミールの場合より大幅に低かった。上澄み由来単離物の組成は、ＰＭＭ由来単離物のそれに類似している。希釈液の場合、上澄み中に溶液として残存している２Ｓタンパク質は不十分な量であり、したがって２Ｓは主なタンパク質成分でない。７Ｓも上澄み中に、より低い濃度ではあるが見い出されるとき、２Ｓは存在しないので７Ｓが上澄み由来単離物中で主なタンパク質となる。しかし、ＳＤ０２９およびＳＤ０２７ミールを用いた最近の実施では、上澄み由来単離物組成物の組成は、上澄み由来単離物について以前観察された正常範囲内であることが判明している。

上記の結果は、一般にミールの脱殻および加熱処理プロセスが、得られたカノーラタンパク質単離物のタンパク質組成に影響を与えないことを示唆している。
（ｄ）カノーラタンパク質単離物の色：
下記の表ＶＩＩおよび表ＶＩＩＩは、乾燥生成物、または乾燥粉末を０．１Ｍ生理食塩水中で再懸濁し約１時間撹拌した再構成生成物について、「Ｌ」、「ａ」、「ｂ」の色値を、乾燥生成物にはＭｉｎｏｌｔａの色彩色差計ＣＲ−３１０を、または再構成生成物にはＨｕｎｔｅｒ Ｌａｂの色彩色差計ＤＰ−９０００を使用して測定して示している。０〜１００の範囲の「Ｌ」値は、生成物の明度を表している（Ｌ＝１００は、白色である）。「ａ」値（−６０〜＋６０）は、緑−赤の色空間を表している。「ａ」値が負になるほど、生成物は緑色になり、「ａ」値が＋６０に向かう傾向が強くなるほど、生成物は赤色になる。「ｂ」値（−６０〜＋６０）は、青−黄の色空間を表している。「ｂ」値が負になるほど、生成物は青色になり、「ｂ」値が＋６０に向かう傾向が強くなるほど、生成物は黄色になる。

乾燥および再構成の生成物の明度を比較すると、種子中で加熱処理されたミール回分から得られた生成物は、最高のＬ値を有している。これらの生成物は、種子を破砕して初めて加熱処理を行うミール回分＃２から得られたものより大幅に明るい。この結果は、ミロシナーゼは活性であり、最終的に不活性化される前にグルコシノレートの分解の触媒として働く時間が十分にあったことを示唆している。グルコシノレートの分解生成物は、このミールからのＰＭＭ由来単離物および上澄み由来単離物のより濃い色に寄与するものと考えられる。

ＳＤ０２４ミールから得られたタンパク質単離物は、緑色により向かう傾向にあるが、ＳＤ０２７およびＳＤ０２９からの単離物の場合の「ａ」値は、より大きい数値であり、より赤みを帯びた色である。乾燥粉末、および液体試料は、青−黄の色空間で同じ傾向を示さない。例えば、ＳＤ０２４のＰＭＭ由来単離物では乾燥生成物の場合の「ｂ」値は、異なる３種の実施のうち最小であり、一方ＳＤ０２４のＰＭＭ由来単離物の液体試料の場合の「ｂ」値は最高となる。ＳＤ０２７ミールの場合ＰＭＭ由来単離物でも上澄み由来単離物でも共に最も黄色の粉末が観測された。黄色の度合いが最も低い生成物が、ＰＭＭ由来単離物の場合はＳＤ０２４ミールから、上澄み由来単離物の場合はＳＤ０２９から得られる。

液体での色の分析を見ると、最も黄色のＰＭＭ由来単離物は、ＳＤ０２４ミールから得られたものであり、上澄み由来単離物の場合最も黄色はＳＤ０２７から得られる。

実施例４：
この実施例は、高周波処理を使用した酵素不活性化を示している。

水分含有量約９％の種子を有するカノーラ種子の一群を、３つの２ｋｇの試料に分けた。この試料のうち１つを対照とし、その後処理しなかった。

２つの２ｋｇのカノーラ種子試料を、高周波処理に暴露した。高周波に暴露すると、カノーラ種子試料の全体積にわたって急速な温度上昇が生じる。１つの試料を約１６０秒以内で、周囲温度から９０℃に加熱し、９０℃で５分間保持した。第２の試料を周囲温度から９０℃に約１６０秒以内で加熱し、次いで９０℃で１０分間保持した。

９０℃で保持した後、両試料を焼付けパン上に広げることによって３０℃に冷却し、冷却室に４℃で約１０分間貯蔵した。

グルコシノレート分解の分解生成物であるグルコースについて試験することによって、ミロシナーゼ活性を試験した。試験手順は、以下の通りである。カノーラ種子を１００ｇずつ、２５０ｍＬの水道水中で、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎのホモジナイザを用いて６０００ｒｐｍで、混合物がペーストになるまで均質化する。この混合物を２０分間静置して、次いで１００００ｘｇで５分間遠心した。このステップからの上澄みをデカンテーションし、Ｄｉａｓｔｉｘグルコースモニタリングストリップ（Ｂａｙｅｒ）を使用してグルコースについて試験した。

加熱処理したものと対照の３種の種子試料はすべて、グルコースについて試験した。結果を下記の表ＩＸに示す。

９０℃で１０分間加熱処理したカノーラ種子試料では、グルコースが検出されない。これは、高周波を使用することは、ミロシナーゼ酵素を不活性化するのに効果的な手段であることを示している。
実施例５：
この実施例は、官能試験を実施するのに十分な量のタンパク質単離物試料の生成に使用するべき、酵素が不活性化されたカノーラミールの調製を示している。

３トンのカノーラ種子を連続処理して、酵素が不活性化されたカノーラミールを調製した。酵素の失活は、Ｓｉｍｏｎ−Ｒｏｓｅｄｏｗｎのトレー２枚を有する煮沸装置を使用して行った。実験を開始する前に、煮沸装置を予熱した。蒸気圧を、所望の種子温度を維持するように流しながら調整した。トレーにおける温度は、トップトレーでは６０℃（±５℃）、ボトムトレーでは８２〜８６℃であった。カノーラ種子の煮沸装置へのフィード速度は約３００ｋｇ／時であり、ボトムトレーにおける滞在時間は約１２分間であった。次いで、失活させた種子を穀物乾燥機に移動し、＜６０℃に急速冷却した。

失活した後、カノーラ種子は乾燥しすぎており、テンパーリングが必要であった。種子水分は、５．７４％であり、種子に３％の水（ｗ／ｗ）を噴霧して、水分含有量を約８．０％に上昇させることによってテンパーリングを行った。水と種子を約１５分間ブレンドし、次いでポルタビン（ｐｏｒｔａｂｉｎ）中に移動し、覆って、最低１２時間平衡化させた。

フレーク化を行って、油糧細胞を破壊し、種子をフレーキングミルに通すことによって煮沸／予備プレスするための大きな表面積を有する薄いフレークを調製した。フレーク厚さは、０．１８〜０．２３ｍｍであった。フィード速度は、プレス速度のバランスをとるように制御し、約１３０ｋｇ／時間であった。

煮沸を行って、さらに油糧細胞を破壊し、フレークを柔軟にし、含まれているオイルの粘度を低下させることによってエキスペラーの効率を増大させた。実験を開始する前に、煮沸装置を予熱した。蒸気圧を、所望のフレーク温度を維持するように流しながら調整した。トレーにおける温度は、トップトレーでは４２℃（±２℃）、ボトムトレーでは６５℃（±３℃）であった。

プレスによって、オイルの約２／３〜３／４を除去し、溶媒抽出に適した材料を調製した。材料は、抽出装置中で保持するべき圧搾抵抗性、および良好な物質移動および排水のための多孔性が必要である。フレーク状にし煮沸された種子を、Ｓｉｍｏｎ−Ｒｏｓｅｄｏｗｎの予備プレスを使用してプレスした。粗プレスオイルを廃棄した。

溶媒抽出は、プレスケーキをイソヘキサンと接触させて、ケーキ塊からオイルを除去した。２つの機構が働いた：オイルを溶媒に浸出させることと、絞りかすミール（イソヘキサン−固体）を徐々に弱くしたミセル（ヘキサン−オイル）で洗浄することである。抽出は、通常は連続向流プロセスである。

カノーラ種子のプレスケーキは、Ｃｒｏｗｎ Ｉｒｏｎ ＷｏｒｋｓのＬｏｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（タイプＩＩ）を用いて、イソヘキサンで、全滞在時間約１００分間（ループインからループアウトまで）、および溶媒と固体の比が約３．２：１（ｗ：ｗ）で抽出した。粗オイルを、上昇式薄膜蒸発器および蒸気ストリッパで脱溶媒した。オイルを廃棄した。

絞りかす（ヘキサン−固体）の脱溶媒を、蒸気ジャケット付きのＳｃｈｎｅｃｋｅｎスクリュー、およびトレー２枚を有する脱溶媒装置−トースタで行った。トレーにおける温度は、Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎ Ｅｘｉｔでは＜５０℃、脱溶媒装置トレーでは５０℃（±５℃）、およびトースティングトレーでは４５℃（±５℃）であった。

真空乾燥を行って、抽出されたカノーラミールの脱溶媒を完了した。脱脂カノーラミール約１５０ｋｇ／回分を、Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｒｅａｃｔｏｒに積み入れた。次いで、ミールを２３〜２５ｍｍＨＧの真空下で４７℃（±２℃）に加熱した。ミールをこの温度で２時間保持し、次いでプラスチックライニングしたファイバードラムに吐き出した。酵素が不活性化され、脱脂され、真空脱溶媒されたカノーラミールを合計１３１７．３ｋｇ生成した。
実施例６：
この実施例は、実施例５に従って脱脂され、酵素が不活性化されたミールから、および低温で脱溶媒された市販のミールからのカノーラタンパク質単離物の調製を示している。カノーラタンパク質単離物を使用して、色および香りを比較する。

実施例５による脱脂し酵素が不活性化されたミールにＳＡ０３４という名称を与え、市販のミールにＡＬ０２２という名称を与えた。

カノーラミール「ａ」ｋｇを０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液「ｂ」Ｌに周囲温度で添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留カノーラミールを、真空ろ過（ＢＷ−ＡＬ０２２−Ｂ２４−０３Ａの場合）、またはデカンタ遠心（ＢＷ−ＳＡ０３４−Ｅ０６−０４Ａ Ｃ３００の場合）、およびディスク遠心によって除去した。得られたタンパク質溶液をフィルタプレスろ過によって透明にして、タンパク質含有量「ｄ」ｇ／Ｌの透明タンパク質溶液「ｃ」Ｌを得た。

このタンパク質抽出溶液を「ｅ」Ｌずつ、「ｇ」ダルトン分画分子量膜を使用した限外ろ過システムで濃縮することによって、体積を「ｆ」Ｌに低減した。得られた濃縮タンパク質溶液は、タンパク質含有量が「ｈ」ｇ／Ｌであった。次いで、この濃縮タンパク質溶液を、「ｉ」ダルトン分画分子量膜を使用した透析ろ過(diafiltration)システムで、０．０５ｗｔ％のアスコルビン酸を含有する「ｋ」Ｍ塩化ナトリウム溶液「ｊ」Ｌを用いて透析ろ過(diafiltered)して、タンパク質含有量「ｍ」ｇ／Ｌの最終体積「ｌ」Ｌとした。

「ｎ」℃で濃縮された溶液を「ｐ」℃の水に入れて「ｏ」に希釈した。白色雲状物が即座に形成し、それを放置して沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘稠性で粘着性の塊（ＰＭＭ）を容器の底から、抽出タンパク質の収率「ｑ」ｗｔ％で回収した。乾燥したＰＭＭ由来タンパク質は、タンパク質含有量が「ｒ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂであることが判明した。生成物に「ｓ」という名称を与えた。

除去された希釈水は、「ｔ」ダルトン分画分子量膜を使用した限外ろ過によって体積を低減して、タンパク質濃度「ｕ」ｇ／Ｌにした。この濃縮物を乾燥した。追加のタンパク質を上澄みから回収して、タンパク質の全回収率は、抽出タンパク質「ｖ」ｗｔ％であった。この形成された乾燥タンパク質は、タンパク質含有量が「ｗ」ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂであった。

生成物に「ｘ」という名称を与えた。

実施例７：
この実施例は、実施例６の手順に従うことによって得られた結果を記載している。
（ａ）官能試験
カノーラタンパク質単離物試料に官能試験を行った。官能パネルは、訓練を受けた１１名の官能試験員から構成された。各官能試験員は、どの試料が最少量の香りであるか、ならびにどの試料を好むかと質問された。

実施例６の手順に従うことによって得られたカノーラタンパク質単離物を、０．０５Ｍ生理食塩水溶液に濃度５ｗ／ｖ％で再び懸濁した。官能試験を始める前に、タンパク質粉末を完全に可溶化した。

下記の表Ｘは、ＰＭＭ生成物についての官能試験の結果を示している。酵素が不活性化されたミールに由来する単離物は、最少量の香りをもつものであることが判明し、より好ましい生成物でもあったようである。官能試験員の６４％は、酵素が不活性化されたミールのＰＭＭが最少量の香りを有していると思い、２７％は、低温ミール由来のＰＭＭが最少量の香りを有していると思った。官能試験員の９％は、この２つの生成物間の違いをわかることができなかった。

どの生成物を好むかと質問すると、官能試験員の６４％は、酵素が不活性化されたミールに由来するＰＭＭを選択し、１８％は、低温ミール由来生成物を好み、１８％は、生成物のどちらも好まなかった。

下記の表ＸＩは、上澄み由来タンパク質単離物についての官能試験の結果を示している。酵素が不活性化されたミールに由来する単離物は、最少量の香りをもつものであることが判明し、より好ましい生成物でもあったようである。官能試験員の５５％は、酵素が不活性化されたミールの上澄み由来タンパク質が最少量の香りを有していると思い、２７％は、低温ミールから得られた生成物が最少量の香りを有していると思った。官能試験員の９％は、この２つの生成物間の違いをわかることができなかった。

どの生成物を好むかと質問すると、官能試験員の８２％は、酵素が不活性化されたミールに由来する上澄み由来タンパク質を選択し、９％は、低温ミール由来生成物を好み、９％は、生成物のどちらも好まなかった。

（ａ）色の分析
下記の表ＸＩＩは、再構成生成物（０．０５Ｍ生理食塩水中、５ｗ／ｖ％生成物）について、「Ｌ」、「ａ」、「ｂ」の色値を、Ｈｕｎｔｅｒ Ｌａｂの色彩色差計Ｄ９０００を使用して測定して示している。０〜１００の範囲の「Ｌ」値は、生成物の明度を表している（Ｌ＝１００は、白色である）。「ａ」値（−６０〜＋６０）は、緑−赤の色空間を表している。「ａ」値が負になるほど、生成物は緑色になり、「ａ」値が＋６０に向かう傾向が強くなるほど、生成物は赤色になる。「ｂ」値（−６０〜＋６０）は、青−黄の色空間を表している。「ｂ」値が負になるほど、生成物は青色になり、「ｂ」値が＋６０に向かう傾向が強くなるほど、生成物は黄色になる。

液体試料の明度を比較すると、タンパク質単離物ではＰＭＭ由来も上澄み由来も、酵素が不活性化されたミール由来生成物の場合は、低温ミール由来生成物の場合よりＬ値がかなり高かった。これは、酵素が不活性化されたミールは、どちらの場合でもさらに明るいタンパク質単離物を生成したことを意味する。

赤−緑の色空間、および青−黄の色空間について、ＰＭＭと上澄み単離物とは共に同じ傾向に従っている。酵素が不活性化されたミールを出発材料として使用すると、「ａ」値は、低温ミールに比べてわずかに低くなり、これは、試料が緑がかった色により向かう傾向にあることを意味している。酵素が不活性化されたミールを使用すると、「ｂ」値は上昇し、これは試料が低温ミールから得られた試料に比べてより黄色に見えることを意味している。

開示の要約
この開示を要約すると、本発明は、カノーラ油糧種子中のミロシナーゼおよび他の酵素を初めに加熱−不活性化した後、油糧種子の他の処理をすることによって、色および風味を改善したカノーラタンパク質単離物の生成方法を提供した。様々な修正形態は、本発明の範囲内となることが可能である。

本発明の好ましい一実施形態に従って脱殻脱脂カノーラ油糧種子を得るための調製手順のプロセスフローチャートである。 本発明の好ましさが低い一実施形態に従って脱殻脱脂カノーラ油糧種子を得るための調製手順のプロセスフローチャートである。 図１または図２の手順に従って調製された脱殻脱脂カノーラ油糧種子からカノーラタンパク質単離物を調製するためのフローチャートである。 カノーラ油糧種子および脱殻ミート断片の加熱処理のための温度プロフィルのグラフである。

Claims (10)

1. カノーラ油糧種子を加熱処理して、その中の酵素を失活させるステップと、
   カノーラ油糧種子を脱殻するステップと、
   加熱処理され脱殻された油糧種子からカノーラ油糧を除去して、前記カノーラ油糧種子ミールを提供するステップと
   を含むカノーラ油糧種子ミールの形成方法。
2. 前記加熱処理され脱殻された油糧種子を、前記油糧除去ステップの前にフレーク状にする請求項１に記載の方法。
3. カノーラ油糧種子を加熱処理して、その中の酵素を不活性化させるステップと、
   加熱処理されたカノーラ油糧種子を冷却するステップと、
   加熱処理されたカノーラ油糧種子の殻を破砕するステップと、
   破砕された殻をカノーラ種子から除去するステップと、
   カノーラ油糧を溶媒抽出によってカノーラミートから除去して、ミールを残すステップと
   によって行われる請求項１に記載の方法。
4. オーバーおよびアンダー断片を破砕された殻から分離し、オーバー断片を破砕および分離ステップに再循環し、アンダー断片を次の殻除去のために空気吸引にかけ、再循環されたオーバー断片および／または空気吸引されたアンダー断片を前記溶媒抽出ステップの前にフレーク状にする請求項３に記載の方法。
5. カノーラ油糧種子の殻を破砕するステップと、
   破砕された殻をカノーラミートから除去するステップと、
   カノーラミートを加熱処理して、その中の酵素を不活性化するステップと、
   カノーラ油糧を溶媒抽出によってカノーラミートから除去して、ミールを残すステップとによって行われる請求項１に記載の方法。
6. オーバーおよびアンダー断片を破砕された殻から分離し、オーバー断片を破砕および分離ステップに再循環し、再循環に続いて、オーバー断片を加熱処理ステップにかけ、その後に冷却し、アンダー断片を加熱処理ステップにかけ、その後に冷却し、加熱処理されたオーバー断片および加熱処理されたアンダー断片をフレーク状にした後、フレーク状にされたアンダー断片の前記溶媒抽出を行い、フレーク状にされたオーバー断片を空気吸引した後、フレーク状にされたオーバー断片の前記溶媒抽出を行う請求項５に記載の方法。
7. カノーラ油糧種子ミールを処理して、それからタンパク質含有量が少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のカノーラタンパク質単離物を回収する請求項１に記載の方法。
8. カノーラ油糧種子ミールを処理して、それからタンパク質含有量が少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のカノーラタンパク質単離物を回収する請求項１に記載の方法。
9. 水蒸気を使用して加熱することによって前記不活性化を行う請求項１に記載の方法。
10. 高周波照射を使用して加熱することによって前記不活性化を行う請求項１に記載の方法。

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