JP2007507576A

JP2007507576A - 蛍光化合物

Info

Publication number: JP2007507576A
Application number: JP2006530575A
Authority: JP
Inventors: リンチ、ダニエル、エリック; ヘプティンストール、ジョン
Original assignee: コベントリーユニバーシティー
Priority date: 2003-10-03
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2007-03-29
Also published as: GB0323171D0; ATE390469T1; EP1668091B1; WO2005033245A1; US20060292658A1; ES2302544T3; CN1863889A; WO2005033245A8; EP1668091A1; KR20070009972A; DE602004012762D1

Abstract

式（Ａ）の対称的骨格構造を有する水溶性フォトルミネセンス化合物が開示される。このような化合物を含むタンパク質検出剤及び流体サンプル中の全溶解タンパク質含有量の測定方法も開示される。
【化１】

式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい。

Description

本発明は新規なフォトルミネセンス化合物、新規なタンパク質検出剤、及び流体、特に水又は体液、中のタンパク質の存在を検出する新規な方法に関する。

フォトルミネセンス化合物が知られており、既知のフォトルミネセンス化合物としては、スクアレン染料、特にインドレニン系スクアレン染料、として知られている種類の染料が挙げられ、インドレニン系スクアレン染料は次の一般式の置換及び無置換化合物である。

式中、ＸはＳ、Ｓｅ又はＣ（ＣＨ₃）₂であり、Ｒ₁はアルキルであり、Ｒ₂はＨ、アルキル又はハロゲンである。

既知のインドレニンスクアレン染料としては対称的及び非対称的化合物の両方があり、例えば、非特許文献１に記載されている。

これらの染料は水に不溶であり、特に、流体中のタンパク質の存在を定性的に検出するのに使用される。タンパク質はそれ自体が流体（特に水性流体）中で水溶性であるが、このタンパク質の存在を検出するのにこれらの染料を使用するには、この染料は水とメタノールのようなアルコールとの混合物を含む溶媒に溶けなくてはならない。タンパク質をインドレニンスクアレン染料の水／メタノール溶液に添加すると、蛍光が増加する。上で引用した文献に開示されている分析方法は純粋に定性的方法であり、試験流体サンプル中のタンパク質の存在又は不存在を単に記録するのみであるので、存在するタンパク質の量を決定するのには使用することができない。

流体中のタンパク質の定量分析及びゲル中のタンパク質のステインとしての半定量的／定量的分析のための現在の方法としては、流体のためのブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法［非特許文献２］、ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法［非特許文献３］、及びビシンコニン酸（ＢＣＡ）法［非特許文献４］、並びにゲルのための銀ステイン［非特許文献５］及びクーマシー・ブルー［非特許文献６］が挙げられる。ブラッドフォード法、ローリー法及びＢＣＡ法は比色技術（即ち、色変化）であり、８〜２０００μｇ／ｍＬの溶液タンパク質範囲に適しているが、複数の試薬及び培養時間を必要とし、多数の一般的な試薬からの妨害を受ける。クーマシー・ブルーはブラッドフォード法に使用されているが、２０〜３０分を要し、トリス緩衝液に妨害されない。銀ステインは非常に高感度（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）の色素形成技術であり、ゲルステインとして使用されるが、ゲルの取扱いに注意を払わなくてはならず、また技術全体で２〜３時間を要する。クーマシー・ブルーもゲル染料であり、タンパク質範囲が色素形成μｇ範囲内である場合に銀ステインの代わりに使用できる。タンパク質濃度の検出のための他の商業的技術としては、共にモレキュラー・プローブズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）からの、ナノオレンジ（ＮａｎｏＯｒａｎｇｅ）（商標）タンパク質定量キット及びＣＢＱＣＡ（商標）タンパク質定量キットが挙げられ、これらは蛍光変化に依存する超高感度溶液技術であるが、スクアレン誘導体について与えられる範囲に亘って直線的ではない。また、これらの二つの技術は３０分の調製時間を必要とする。
Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、第２８２巻（１９９３年）、第６３３−６４１頁に於けるＥ．Ｔｅｒｐｅｔｓｃｈｎｉｇらによる論文Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７２巻（１９７６年）、第２４８頁Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第１９３巻（１９５１年）、第２６５頁Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１５０巻（１９８５年）、第７６頁Ｃ．Ｒ．Ｍｅｒｒｉｌ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８２巻（１９９０年）、第４７７頁Ｓ．ＦａｚｅｋａｓｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第７１巻（１９６３年）、第３７７頁Ｅ．Ｈａｖｉｎｇａら、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＭｅｔａｌｓ、第６９巻（１９９５年）、第５８１−５８２頁Ｓｐｒｅｎｇｅｒ及びＺｉｅｇｅｎｂｅｉｎ、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．第６版（１９６７年）、第５３３頁

本発明の目的は、新規なフォトルミネセンス化合物、特に、水又は水含有溶媒混合物に可溶であり、これらの媒体中でそのフォトルミネセンス特性を保有する新規なフォトルミネセンス化合物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、前記の時間制約が減少するか又は実質的に取り除かれ、より高い感度で、流体中の又はゲルステインとしてのタンパク質の存在を検出するための方法を提供することである。

本発明は、下記の式の対称的骨格構造を有する水溶性フォトルミネセンス化合物を提供する。

本発明に従った特に好ましい化合物には、ｘが３であるものが含まれる。

本発明に従った更に好ましい化合物には、置換されていないか、又は一方若しくは両方のフェニル環が、５位でアルキル基（イソプロピル及びｔ−ブチルを含む）若しくはハロゲン基によって置換されているものが含まれる。

本発明に従った特に好ましい化合物には、２，４−ビス（１−（プロパン−３−スルホン酸）−３，３−トリメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオラート（diolate）又はこのスルホン酸の全ての金属若しくは第四級窒素（即ち、アンモニウム、モノ−、ジ−又はトリアルキルアンモニウム、ピリジニウムなど）塩が含まれる。

本発明は、更に、１×１０^-9〜１モル／リットルの濃度で水又は水含有溶媒混合物に溶けた状態の、下記一般式の対称的骨格構造を有する化合物を含むタンパク質検出剤を提供する。

本発明は、更に、
（ａ）下記一般式（式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい）の対称的骨格構造を有する化合物を、１×１０^-10〜１モル／リットルの濃度で水に溶けた状態に溶解させる工程、

（ｂ）工程（ａ）の溶液を試験流体サンプルと混合する工程、
（ｃ）そのサンプルの蛍光を測定する工程、及び
（ｄ）この蛍光を、標準値又は標準値群（即ち、較正プロット）と比較して、全タンパク質含有量についての値を得る工程、
を含む流体サンプルの全溶解タンパク質含有量の測定方法を提供する。

本発明は、更に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下又は不存在下で、水性メタノール及び酢酸を含む水／有機／酸混合物中に固定された支持マトリックス（例えば、ポリアクリルアミド、アグロース又はデンプン）中で電気泳動的に分離されたタンパク質の検出及び／又は定量方法であって、このマトリックスを、続いて、１×１０^-10〜１モル／リットルの濃度で１０％メタノール水溶液又は酢酸水溶液に溶けた状態の、下記一般式の対称的骨格構造を有するフォトルミネセンス化合物を用いて、染色し、バンド（帯域）を可視化するために脱色する方法を提供する。

必要な検出範囲に亘る、タンパク質水溶液の蛍光に関する標準値を確立するために、既知の濃度のタンパク質ＢＳＡを含有する溶液の蛍光を、下記の一般式（式中ｘは３）の対称的骨格構造を有する化合物の５×１０^-8Ｍ水溶液を使用して、６２４ｎｍの励起波長（ε＝１．０×１０⁵ｍｏｌ^-1ｃｍ^-1）及び６３８ｎｍの検出波長で測定した。
染料１

０〜１００ｎｇ／ｍＬのＢＳＡの範囲に亘る２個の別個の較正プロットについての結果を図１に示し、０〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＳＡの検出範囲に亘る３個の別個の較正プロットについての結果を図２に示し、０〜１０μｇ／ｍＬのＢＳＡの検出範囲に亘る３個の別個の較正プロットについての結果を図３に示す。

これらの検出範囲に亘る直線的応答に気づくことが特に際だっている。

また、一旦ＢＳＡを使用して検量線を作図すると多くのタンパク質濃度を即座に決定できることが、本発明のフォトルミネセンス化合物の利点である。また、この蛍光は高波長にあり、如何なる拡散性のより低い波長の有機蛍光によってもマスクされない。

実験での出発物質

２，３，３−トリメチル−１−（プロパン−３−スルホニル）インドレニンを、非特許文献７の文献記載の方法を使用して、過剰の１，３−プロパンスルトン及びトルエン中で２，３，３−トリメチルインドレニンを、ディーン−スターク装置を使用して加熱することによって製造した。冷却して、過剰の溶媒をデカンテーションによって除去し、生成物を石油エーテルで繰り返して洗浄して、赤色油状物質を得た。数週間放置すると、この油状物質から２，３，３−トリメチル−１−（プロパン−３−スルホニル）インドレニンの結晶が生成した。単結晶のＸ線構造を図４に示す。

染料１の製造

２，４−ビス（１−（プロパン−３−スルホン酸）−３，３−ジメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンビス（イリウム）−１，３−ジオラート（diolate）を、非特許文献８の文献記載の方法を使用して、２：１モル量の２，３，３−トリメチル−１−（プロパン−３−スルホニル）インドレニン及び四角酸を、触媒量のキナリン（ｑｕｉｎａｌｉｎｅ）と共に、５０／５０トルエン／ブタン−１−オール中で、ディーン−スターク装置を使用して還流させることによって製造した。反応溶媒を除去した後、生成物を真空中で集め、石油エーテルによる熱洗浄を繰り返した。

０〜１００ｎｇ／ｍＬのＢＳＡの範囲に亘る２個の別個の較正プロットについての結果を示す。０〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＳＡの検出範囲に亘る３個の別個の較正プロットについての結果を示す。０〜１０μｇ／ｍＬのＢＳＡの検出範囲に亘る３個の別個の較正プロットについての結果を示す。２，３，３−トリメチル−１−（プロパン−３−スルホニル）インドレニンの構造についての分子立体配座及び原子命名図式を示す。

Claims

下記式の対称的骨格構造を有する水溶性フォトルミネセンス化合物。

（式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい。）
ｘが３である請求項１記載のフォトルミネセンス化合物。
置換されていない、請求項１又は請求項２記載のフォトルミネセンス化合物。
一方又は両方のフェニル環が、５位で、イソプロピル及びｔ−ブチルを含むアルキル基又はハロゲン基によって置換されている、請求項１又は請求項２記載のフォトルミネセンス化合物。
２，４−ビス（１−（プロパン−３−スルホン酸）−３，３−トリメチル−２−インドリニリデンメチル）シクロブテンジイリウム−１，３−ジオラート又はこのスルホン酸の全ての金属若しくは第四級窒素（即ち、アンモニウム、モノ−、ジ−又はトリアルキルアンモニウム、ピリジニウムなど）塩である、請求項１から４のいずれか１項記載のフォトルミネセンス化合物。
本明細書に於いて及び実施例を参照して実質的に記載された、フォトルミネセンス化合物。
１×１０^-10〜１モル／リットルの濃度で水に溶けた状態の、下記一般式の対称的骨格構造を有するフォトルミネセンス化合物を含むタンパク質検出剤。

（式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい。）
（ａ）下記一般式の対称的骨格構造を有するフォトルミネセンス化合物を、１×１０^-10〜１モル／リットルの濃度で水に溶けた状態に溶解させる工程、

（式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい）
（ｂ）工程（ａ）の溶液を試験流体サンプルと混合する工程、
（ｃ）そのサンプルの蛍光を測定する工程、及び
（ｄ）この蛍光を、標準値と比較して全溶解タンパク質含有量についての値を得る工程、
を含む流体サンプルの全溶解タンパク質含有量の測定方法。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下又は不存在下で、水性メタノール及び酢酸を含む水／有機／酸混合物中に固定された支持マトリックス中で電気泳動的に分離されたタンパク質の検出及び／又は定量方法であって、このマトリックスを、続いて、１×１０^-10から１モル／リットルの濃度で１０％メタノール水溶液又は酢酸水溶液に溶けた状態の、下記一般式の対称的骨格構造を有するフォトルミネセンス化合物を用いて、染色し、帯域を可視化するために脱色する方法。

（式中、ｘは全ての整数を表すことができ、フェニル環は置換されていてもよい。）
支持マトリックスが、ポリアクリルアミド、アグロース又はデンプンである、請求項９記載の方法。