JP2007223962A - 抗バベシア剤および新規クアシノイド誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】副作用の少ない化学療法薬剤として用いることができ、しかも抗バベシア活性の高いバベシアの予防及び/又は治療剤、およびそれに有効な新規化合物の提供。
【解決手段】一般式およびその特定の類縁体である化合物（式中、Ｒ_１はＣＯ_２ＣＨ_３またはＣＯＯＨであり、Ｒ_２は特定の脂肪族アシル基を示す。）を有効成分として含有する抗バベシア剤。

【選択図】なし

Description

本発明は、抗バベシア剤および抗バベシア剤として有用な新規クアシノイド（ｑｕａｓｓｉｎｏｉｄ）誘導体に関する。特に、本発明は、バベシアの予防及び/又は治療剤に用いられる抗バベシア剤に関する。

イヌ、ウシなどの家畜類にバベシア症が知られている。本疾病はバベシア原虫が寄生する事により発症し、ダニを介して媒介される。最悪の場合、バベシア原虫に寄生され疾病が発症すると死に至る。また、近年ではヒトへの感染も報告され、公衆衛生上、注目されつつある寄生性原虫である。特効薬としてジミナゼン製剤（商品名：ガナゼック）が知られていたが副作用が強く、販売が中止されている。よって、現在、バベシア症に有効な市販の薬剤は無い。

より具体的には、バベシア・ギブソニ（Babesia gibsoni）は、野生及び飼育下のイヌに溶血性貧血を引き起こす赤血球寄生虫である（J. Am. Vet. Med. Assoc. 180, 507-511, 1982（非特許文献１）; J. Proto zoo1. Res, 3, 111-125, 1993（非特許文献２））。バベシア・ギブソニは、イヌの赤血球に奇生し、その中で増殖し、最後には破壊する。そして、その後、バベシア・ギブソニは、新しい赤血球に寄生する。したがって、イヌがバベシア・ギブソニに感染すると、貧血を誘導する。バベシア・ギブソニのイヌヘの感染は、日本の、特に関西において、長く問題になっている。最近では、この感染の地理的分布が更に拡大している。更に、他の動物での感染の拡大やヒトヘの感染も危惧されている。

従来、バベシア・ギブソニの感染の治療のために、ジミナゼン・アセチュレート（Diminazene aceturate）（ガナゼック：Ganazeg））、フェナミジン イセチアネート（phenamidine isethionate）（ロマディン：Lomadine）及びイセチオン酸ペンタミジン（phentamidine isethionate）（ロミディン：Lomidine）が開発され、バベシア・ギブソニ感染に対して効能を示してきた（Treatment of Babesia gibsoni infection with Phenamidine iset hionate. Vet. Rec. 86, 8-10, 1970（非特許文献３）; J. Am. Vet. Med. Assoc. 180, 507-511, 1982（非特許文献４））。ガナゼック：Ganazeg）の構造式を以下に示す。

しかしながら日本においては、ジミナゼン・アセチュレート（ガナゼック：Ganazeg）のみが、バべシア・ギブソニ感染の治療に用いられてきた。ジミナゼン・アセチュレートは、バベシア・ギブソニに対して有効であるが、衰弱、過敏症、麻痺、刺激への無反応、及び中枢神経系の致命的な出血（fatal central nervous system haemorrhage）といった副作用を誘導することがある（Greene C. E. ed. B. W. Saunders Philadelphia. 796-803, 1990（非特許文献５））。しかし、この薬剤の日本国内での販売は最近になって停止された。したがって、バベシア・ギブソニに感染したイヌの治療については、代わりとなる、副作用の少ない化学療法薬剤が用意できない状況にあり、その開発が急務となっている。

近年、抗バベシア作用を有するいくつかの化合物や物質が開示されている（特開平２００１−８１０３４号公報（特許文献１）、特表平８−５０２６４６号公報（特許文献２）、特表平１０−５０７４４６号公報（特許文献３）、特表平１０−５１１３４５号公報（特許文献４）、特表２０００−５１５８７７号公報（特許文献５）、特表平２００１−５１７２２３号公報（特許文献６）、特表２００３−５０３０３９号公報（特許文献７）、特表２００３−５０５３５７号公報（特許文献８）、及び特表２００３−５３４０１６号公報（特許文献９））。しかし、これらのものもまだ開発途中のものであり、副作用の少ない化学療法薬剤で、しかもバベシアに有効な薬剤は開発されていない。
特開平２００１−８１０３４号公報 特表平８−５０２６４６号公報 特表平１０−５０７４４６号公報 特表平１０−５１１３４５号公報 特表２０００−５１５８７７号公報 特表２００１−５１７２２３号公報 特表２００３−５０３０３９号公報 特表２００３−５０５３５７号公報 特表２００３−５３４０１６号公報 J. Am. Vet. Med. Assoc. 180, 507-511, 1982 J. Protozoo1. Res. 3, 111-25, 1993 Treatment of Babesia gibsoni infection with Phenamidine iset hionate. Vet. Rec. 86, 8-10, 1970 J. Am. Vet, Med. Assoc. 180, 507-511, 1982 Greene C. E. ed. B. W. Saunders Philadelphia. 796-803, 1990

本発明が解決しようとする課題は、抗バベシア剤、特に、副作用の少ない化学療法薬剤として用いることができ、しかも抗バベシア活性の高いバベシアの予防及び/又は治療剤を提供すること、およびそれに有効な新規化合物を提供することにある。

上記課題を解決する本発明は以下の通りである
[1]一般式(1)で示される化合物を有効成分として含有する抗バベシア剤。

［式中、Ｒ₁はＣＯ₂ＣＨ₃またはＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂は下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかである。］

[2]一般式(1)において、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ａ）〜（ｄ）のいずれかである[1]に記載の抗バベシア剤。
[3]一般式(1)において、Ｒ₁がＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂が（ｅ）または（ｆ）である[1]に記載の抗バベシア剤。
[4]一般式(2)で示される化合物を有効成分として含有する抗バベシア剤。

［式中、Ｒは、ＣＨ₃またはＣＨ₂ＯＨである。］
[5]一般式(2)において、ＲがＣＨ₃である[4]に記載の抗バベシア剤。
[6]一般式(2)において、ＲがＣＨ₂ＯＨである[4]に記載の抗バベシア剤。
[7][1]〜6のいずれか１項に記載の化合物の少なくとも1種を含む植物(Brucea javanica)の種子の抽出物を含む抗バベシア剤。
[8]バベシアの予防及び/又は治療剤として用いられる[1]〜[7]のいずれかに記載の抗バベシア剤。
[9]一般式(1)で示される化合物。

［式中、Ｒ₁はＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂は下記（e）または（ｆ）である。］

本発明によれば、副作用の少ない化学療法薬剤として用いることができ、しかも抗バベシア活性の高いバベシアの予防及び/又は治療剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、抗バベシア剤として有効な新規化合物を提供することができる。

[抗バベシア剤]
本発明の抗バベシア剤は、一般式(1)で示される化合物を有効成分として含有する。

式中、Ｒ₁はＣＯ₂ＣＨ₃またはＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂は下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかである。

本発明の抗バベシア剤は、より具体的には、例えば、一般式(1)の化合物が、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ａ）〜（ｄ）のいずれかである化合物である。Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ａ）である化合物は、Ｂｒｕｃｅｉｎｅ Ａとして知られた化合物であり、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ｂ）である化合物は、Ｂｒｕｃｅａｎｔｉｎｏｌとして知られた化合物であり、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ｃ）である化合物は、ＢｒｕｃｅｉｎｅＢとして知られた化合物であり、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ｄ）である化合物は、ＢｒｕｃｅｉｎｅＣとして知られた化合物である。

さらに本発明の抗バベシア剤は、より具体的には、例えば、一般式(1)の化合物が、Ｒ₁がＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂が（ｅ）または（ｆ）である化合物である。
Ｒ₁がＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂が（ｅ）である化合物は、ＢｒｕｃｅａｎｔｉｎｏｌＡであり、Ｒ₁がＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂が（ｆ）である化合物は、ＢｒｕｃｅｉｎｅＪである。ＢｒｕｃｅａｎｔｉｎｏｌＡおよびＢｒｕｃｅｉｎｅＪは新規化合物であり、本発明はこれらの化合物も包含する。

また、本発明は、一般式(2)で示される化合物を有効成分として含有する抗バベシア剤も包含する。

式中、Ｒは、ＣＨ₃またはＣＨ₂ＯＨである。

一般式(2)において、ＲがＣＨ₃である化合物は、ＢｒｕｃｅｉｎｅＤとして知られた化合物である。また、一般式(2)において、ＲがＣＨ₂ＯＨである化合物は、ＹａｄａｎｚｉｏｌｉｄｅＡとして知られた化合物である。

本発明の抗バベシア剤において有効成分として含有される、一般式(1)および(2)で表される化合物は、いずれも植物(Brucea javanica)の種子の抽出物に含まれ、この抽出物から分画、精製して得ることができる。より具体的には、植物(Brucea javanica)の種子の乾燥粉末を、熱水抽出に付し、次いで、熱水抽出物から酢酸エチルにて溶媒抽出した成分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、溶出される分画をさらに精製することで、上記各物質を得ることができる。シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の条件は実施例において詳述する。植物(Brucea javanica)の種子の乾燥粉末は、市販品を容易に入手することができる。また、上記熱水抽出に代えて、例えば、エタノール等の有機溶媒を用いた溶媒抽出により、本発明の抗バベシア剤において有効成分として含有される、一般式(1)および(2)で表される化合物を得ることもできる。

本発明では、上記の化合物の少なくとも1種を含む、熱水抽出物をそのまま抗バベシア剤として用いることもできる。その際、必要により適当なキャリアー物質を併用することもできる。

本発明の抗バベシア剤は、バベシアの予防及び/又は治療剤として用いられる。

本発明の有効成分である化合物を医薬等として用いる場合には、本発明の有効成分である化合物を薬理学的に許容される塩の形で用いることができる。かかる薬理学上許容される塩としては、薬理学上公知のものを用いることができるが、例えば、薬理学上許容される金属塩、アンモニウム塩、含有アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を適宜用いることができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、有機アミン付加塩としてはモルホリン、ピペリジン等の付加塩、アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩が挙げられる。

本発明の有効成分を医薬として投与するには、該有効成分を、製薬上用いられる適宜の形態に製剤化して、全身又は局所的に、経口又は非経口の形で投与することができる。製剤形態としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、液剤、乳剤、懸濁剤、軟膏等適宜の形態を挙げることができる。該製剤化に際しては、例えば、各種の賦形剤、潤沢剤、結合剤、崩壊剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を用いることができる。本発明の有効成分を、動物用医薬として用いる場合には、本発明の有効成分を適宜の投与形態に製剤化して用いることができる。また、本発明の有効成分を飼料等に混合した形で投与することができる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
市販の植物(Brucea javanica)の種子の乾燥粉末１ｋｇを熱水抽出し、酢酸エチル可溶部と水可溶部に分画した。酢酸エチル可溶部により強い抗バベシア活性が確認された。酢酸エチル可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ，３５０ｇ，展開溶媒、クロロホルム、３％、２０％、７０％ メタノール クロロホルムおよびメタノール）により分画１−５を得た。ここまでのスキームを図１に示す。図中に分画等の条件や溶媒量等を記載する。

分画３−５から、強い抗バベシア活性が確認された。そこで、分画３をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ，３５０ｇ，展開溶媒、５０％酢酸エチル ヘキサン）により精製し、化合物（１）（３６２ｍｇ）、化合物（２）（２４７ｍｇ）、化合物（３）（５３３ｍｇ）、化合物（４）（１６７ｍｇ）を得た。ここまでのスキームを図２に示す。図中に分画等の条件や溶媒量等を記載する。

分画４をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ，３５０ｇ，展開溶媒、５％酢酸エチル メタノール）により精製し、化合物（５）（１５９ｍｇ）、化合物（６）（４４ｍｇ）、活性分画４−６を得た。活性分画４−６をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ，３５０ｇ，展開溶媒、クロロホルム：メタノール：Ｈ₂Ｏ＝６０：３０：４）により精製し、分画４−６−２、分画４−６−３を得た。分画４−６−２、分画４−６−３をそれぞれシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｉ，３５０ｇ，展開溶媒、クロロホルム：メタノール：Ｈ₂Ｏ＝６０：３０：４）により精製し、化合物（７）（４１ｍｇ）、化合物（８）（３６ｍｇ）を得た。ここまでのスキームを図３に示す。図中に分画等の条件や溶媒量等を記載する。上記化合物（１）〜（８）は以下のとおりである。

得られた化合物（１）〜（８）の機器分析データを以下の表に示す。表１に¹³Ｃ−ＮＭＲデータを示し、表２に¹Ｈ−ＮＭＲデータを示す。

さらに、得られた化合物（１）〜（８）の抗バベシア活性を表３に示す。試験方法は、試験例として後述する。上記化合物（１）〜（８）は、いずれも優れた抗バベシア活性を示し、特に、化合物（１）および（２）は、ガナゼックより高い抗バベシア活性を示した。また、化合物（４）は、ガナゼックと同等の抗バベシア活性を示した。

試験例
抗バベシア活性試験は、バベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)を用いたin vitro抗バベシア活性試験を指標として行った。B. gibsoniは、Levy and Ristic法を応用した方法で培養した。(Levy M.G. and Ristic M,. Science 1980, 207, 1218-1220.) 犬の血液は静脈注射により採取し、抗凝結剤としてEDTAを含む滅菌チューブに注入した。血球は遠心（4000 rpm、5 ℃、for 5 min）し、血清と赤血球（RBCs）に分配した。赤血球は、mVYM液(modified Vega Y Martinez phosphate-bufferd saline solution) (Vega C.A., Buening G.M., Green T.I., and Carson C.A., Am. J. Vet. Res. 1985, 46, 416-420.) を入れて懸濁・遠心（4000 rpm、5 ℃、for 5 min）を3回繰り返して洗浄した。結果、血漿、赤血球から白血球が除かれる。その後、赤血球にRPMI 1640培地を入れて懸濁・遠心（4000 rpm、5 ℃、for 5 min）を2回繰り返した。最後に赤血球の量が全体の5 %、犬血清が40 %になるようにRPMI 1640培地と犬血清で調整した。B. gibsoni培養用赤血球に、B. gibsoniが感染している赤血球培養液を25 %加えた。

サンプルは、分画から適量とりマイクロチューブにいれて乾固させた後、RPMI 1640培地に溶解し、0.45μmのメンブランフィルターに供したものを用意しておく。B. gibsoniを含む懸濁液25μlと、サンプル25μlを合わせて、96-well flat-bottom microculture platesに供し、1サンプルあたり、2ヶ所で培養する。37℃、二酸化炭素5 ％、酸素5 ％、窒素90％の条件下で3日間インキュベートした。培養液20μlと、Cytospin solution 80μlを混合し、遠心（450 rpm、for 5 min）でスライドグラスに塗布した。ギムザ染色液で1時間染色し、顕微鏡で観察した後、赤血球500個あたりの寄生率を計算し、これを1スライドあたり3回繰り返してその平均から寄生率(Parasitemia)を求めた。

IC₅₀は1000 μlのRPMI 1640培地に10 μlのDMSOを混合し、サンプルの濃度が100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20 μg / mlになるように調整したのち、それぞれについて上記の生物検定試験を行った。各濃度の寄生率をControl (0 μg / ml)と比較することによって、各サンプルのB. gibsoniに対するIC₅₀を算出した。

実施例２
実施例1で用いたものと同様の市販の植物(Brucea javanica)の種子の乾燥粉末10ｇ当たり200mlの水で2回、熱水抽出を行った。1回につき30分間、乾燥粉末を水中で煮沸し、1回目の煮沸終了後、上澄みを除去して、再度水を加え、2回目の煮沸を30分間行い、2回分の上澄みを合計して、抽出物とした。この抽出物について、実施例1に示したと同様の試験方法で抗バベシア活性を測定した。結果を以下の表4に示す。

本発明は、畜産業等の抗バベシア剤を必要とする分野に有用である。

分画１−５を得るまでの抽出およびカラムクロマトグラフィー精製のスキームを示す。 分画３から化合物（１）〜（４）を得るまでのカラムクロマトグラフィー精製のスキームを示す。 分画４から化合物（５）〜（８）を得るまでのカラムクロマトグラフィー精製のスキームを示す。

Claims (9)

1. 一般式(1)で示される化合物を有効成分として含有する抗バベシア剤。
   

   

   ［式中、Ｒ₁はＣＯ₂ＣＨ₃またはＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂は下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかである。］
   

   
2. 一般式(1)において、Ｒ₁がＣＯ₂ＣＨ₃であり、Ｒ₂が（ａ）〜（ｄ）のいずれかである請求項1に記載の抗バベシア剤。
3. 一般式(1)において、Ｒ₁がＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂が（ｅ）または（ｆ）である請求項1に記載の抗バベシア剤。
4. 一般式(2)で示される化合物を有効成分として含有する抗バベシア剤。
   

   

   ［式中、ＲはＣＨ₃またはＣＨ₂ＯＨである。］
5. 一般式(2)において、ＲがＣＨ₃である請求項4に記載の抗バベシア剤。
6. 一般式(2)において、ＲがＣＨ₂ＯＨである請求項4に記載の抗バベシア剤。
7. 請求項1〜6のいずれか１項に記載の化合物の少なくとも1種を含む植物(Brucea javanica)の種子の抽出物を含む抗バベシア剤。
8. バベシアの予防及び/又は治療剤として用いられる請求項1〜7のいずれか１項に記載の抗バベシア剤。
9. 一般式(1)で示される化合物。
   

   

   ［式中、Ｒ₁はＣＯ₂Ｈであり、Ｒ₂は下記（e）または（ｆ）である。］
   

   

Images