JP2007159479A - オオムギ条性遺伝子とその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】オオムギの条性や穂の形態の決定に関与する遺伝子の染色体上の位置および遺伝子の構造が提供された。Vrs1遺伝子をオオムギに導入し、発現を制御することによって、オオムギの条性や穂の形態を改変し得る可能性が見出された。また、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させうる可能性が見出された。これにより、オオムギの条性や穂の形態を効率的に改変することによって、望みの用途に見合う形質を有するオオムギの作出が可能となった。
【選択図】なし
Description
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Congfen He, et.al. Genome 47: 1122-1129 (2004) Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrs1) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)
〔1〕以下(a)〜(e)のいずれかに記載のDNA;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
(e)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA。
〔2〕以下(a)〜(d)のいずれかに記載のDNA;
(a)〔1〕に記載のDNAの転写産物と相補的なRNAを発現するDNA、
(b)〔1〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを発現するDNA、
(c)〔1〕に記載のDNAの発現を共抑制効果により阻害するRNAを発現するDNA、
(d)〔1〕に記載のDNAの転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAを発現するDNA。
〔3〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAを含むベクター。
〔4〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
〔5〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAが導入された形質転換オオムギ細胞。
〔6〕〔5〕に記載の形質転換オオムギ細胞を含む形質転換オオムギ。
〔7〕〔6〕に記載の形質転換オオムギの子孫またはクローンである、形質転換オオムギ。
〔8〕〔6〕または〔7〕に記載の形質転換オオムギの繁殖材料。
〔9〕〔6〕または〔7〕に記載の形質転換オオムギの製造方法であって、〔1〕または〔2〕に記載のDNAをオオムギ細胞に導入し、該オオムギ細胞からオオムギを再生させる工程を含む方法。
〔10〕〔1〕(a)、(b)または(e)に記載のDNAを二条性ではないオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔11〕〔1〕(c)または(d)に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔12〕〔2〕に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔13〕〔1〕または〔2〕に記載のDNAをオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギに赤かび病抵抗性を付与する方法。
〔14〕〔1〕または〔2〕に記載のDNA、または〔3〕に記載のベクターのいずれか1つを含む、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させる薬剤。
〔15〕〔1〕に記載のDNAの部分配列からなるDNA。
〔16〕配列番号:4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
〔17〕〔1〕に記載のDNAの全部または一部を増幅するプライマーセット。
〔18〕以下(a)〜(r)のいずれかに示す、少なくとも1つのプライマーセット;
(a)配列番号:30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号:32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:33に記載の塩基配列からなるDNA、
(c)配列番号:34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:35に記載の塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号:36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:37に記載の塩基配列からなるDNA、
(e)配列番号:38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:39に記載の塩基配列からなるDNA、
(f)配列番号:40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:41に記載の塩基配列からなるDNA、
(g)配列番号:42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:43に記載の塩基配列からなるDNA、
(h)配列番号:44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:45に記載の塩基配列からなるDNA、
(i)配列番号:46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:47に記載の塩基配列からなるDNA、
(j)配列番号:48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:49に記載の塩基配列からなるDNA、
(k)配列番号:50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:51に記載の塩基配列からなるDNA、
(l)配列番号:52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:53に記載の塩基配列からなるDNA、
(m)配列番号:54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:55に記載の塩基配列からなるDNA、
(n)配列番号:56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:57に記載の塩基配列からなるDNA、
(o)配列番号:58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:59に記載の塩基配列からなるDNA、
(p)配列番号:60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:61に記載の塩基配列からなるDNA、
(q)配列番号:62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:63に記載の塩基配列からなるDNA、
(r)配列番号:64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:65に記載の塩基配列からなるDNA。
〔19〕〔1〕に記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むDNA。
〔20〕以下の(a)〜(c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から〔1〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、〔1〕(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔21〕以下の(a)〜(d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から〔1〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、〔1〕(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔22〕以下の(a)〜(e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から〔1〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、〔1〕(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔23〕以下の(a)〜(d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から〔1〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、〔1〕(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔24〕以下の(a)および(b)の工程を含む、二条性オオムギを選抜する方法;
(a)二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配されたオオムギを作製する工程、
(b)〔20〕〜〔23〕のいずれかに記載の方法により、工程(a)で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程。
〔25〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)〔1〕に記載のDNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
(b)〔1〕に記載のDNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)〔1〕に記載のDNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程。
〔26〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
(b)〔1〕に記載のDNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
〔27〕以下の(a)〜(d)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)〔1〕に記載のDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
〔28〕被検ゲノム断片が〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するか否かを判定する方法であって、以下の(a)および(b)の工程を含み、〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質が、被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴とする方法;
(a)細胞または細胞抽出液において、〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程、
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程。
〔29〕被検ゲノム断片が〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の(a)および(b)の工程を含み、〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特徴とする方法;
(a)細胞または細胞抽出液において、〔1〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、被検ゲノム断片を含むDNAを接触させる工程、
(b)被検ゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程。
〔30〕〔25〕〜〔29〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
が含まれる。
また、オオムギに二条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体(以下、本明細書において、「二条性であるVrs1遺伝子の変異体」と表記する場合あり)には、
(e)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
が含まれる。
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
が含まれる。
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
が含まれる。
(a)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA、
(b)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
(c)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA、
(d)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAをコードするDNA、
を提供する。
Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAの植物細胞への導入は、上記の方法によって行うことが可能である。
本発明において「赤かび病菌」とは、Fusarium属に含まれる菌を意味する。もっとも重要な種の一例としては、Fusarium graminearum菌があるが、これらに限定されるものではなく、上記の属に含まれる全ての菌が、本発明における赤かび病菌に含まれる。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法(米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法(Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ)、ヒスチジンタグを付加して調製する方法(Novagen社のpETシリーズ)などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法(Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, Vol.53, 158-162,(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, Vol.166, 557-580,(1983))を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
(a)配列番号:30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:4に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(b)配列番号:32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:33に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:5に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(c)配列番号:34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:35に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:6に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(d)配列番号:36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:37に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:7に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(e)配列番号:38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:39に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:8に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(f)配列番号:40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:41に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:9に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(g)配列番号:42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:43に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:10に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(h)配列番号:44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:45に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:11に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(i)配列番号:46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:47に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:12に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(j)配列番号:48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:49に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:13に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(k)配列番号:50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:51に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:14〜18に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(l)配列番号:52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:53に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:19〜23に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(m)配列番号:54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:55に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:24に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(n)配列番号:56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:57に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:25に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(o)配列番号:58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:59に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:26に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(p)配列番号:60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:61に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:27に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(q)配列番号:62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:63に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:28に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
(r)配列番号:64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:65に記載の塩基配列からなるDNA(配列番号:29に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット)、
を例示することが出来る。これらのプライマーセットによって増幅されるDNA配列によって特徴付けられる情報を、本発明の分子マーカーと比較することによって、被検オオムギが二条性または六条性であることを判定することが可能である。
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
本発明の上記DNA試料の調製(抽出)は、当業者においては、公知の方法によって行うことができる。好ましい調製方法として、例えば、CTAB法を用いてDNAを抽出する方法を挙げることができる。
また、本発明の判定方法に供されるDNA試料は特に制限されるものではないが、通常、被検植物であるオオムギから抽出するゲノムDNAを用いる。また、ゲノムDNAの採取源としては特に限定されるものではなく、オオムギのいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等から抽出することができる。
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体それと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出されたDNA断片の大きさを、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出されたDNA断片の大きさを、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
(d)DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出されたDNA断片の大きさを、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程
(b)該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
(a)二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程(a)で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程
(a)六条性オオムギと、六条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程(a)で作製されたオオムギが六条性であるか否かを判定する工程
(a)二条性と六条性の中間性であるオオムギと、二条性と六条性の中間性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程(a)で作製されたオオムギが二条性と六条性の中間性であるか否かを判定する工程
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の(a)〜(c)の工程を含む、被験化合物のスクリーニング方法が挙げられる。
(a)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物に被検化合物を接触させる工程
(b)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と被検化合物の結合を検出する工程
(c)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と結合する被検化合物を選択する工程
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
(a)オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程
(a)Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子(GUS)およびGFP遺伝子等を挙げることができる。
(a)細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程
(a)細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片を有するDNAを接触させる工程
(b)任意のゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程
〔実施例1〕条性遺伝子vrs1の連鎖地図作成
二条性を示すオオムギ品種「DebreZeit29」と六条性を示す突然変異体「New GoldenM13」を交配し、464個体からなるF2集団を作成して連鎖地図を作成し、さらに二条性を示すオオムギ品種「Golden Promise」と六条性を示すオオムギ品種「アズマムギ」を交配して1106 個体からなるF2集団を作成して連鎖地図を作成した(Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrs1) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)。また、二条性を示すオオムギ品種「Golden Promise」と六条性を示すオオムギ品種「アズマムギ」を交配して新たに1781のF2集団を分析に加え、高精度連鎖地図を作成した。
2.1 材料と方法
2.1.1 BACライブラリーのPCRスクリーニング
オオムギ品種Morexで作成されたBACライブラリーのDNAを使って、PCRスクリーニングを行った。スクリーニングは、合計816枚の384穴プレート、すなわち313344個のBACクローンから出発した。まず、プレート毎に培養した細胞を収集して一つにまとめ、BACのプールDNAを標準アルカリ法で抽出した。次に、プールDNAを10プレート分ずつまとめてスーパープールDNAを都合82本作成した。
変性反応:94℃にて30秒、
再会合反応:マーカーによって50℃〜68.5℃で30秒、
伸長反応:72℃で、マーカーによって0.5〜 2分、
最後に、72℃で7分間の反応を行った。増幅DNA は、0.5X TBE緩衝液[1X TBE: 89 mM Tris-borate、2mM EDTA(pH 8.0)]中にて、1-1.5% のアガロースゲル(Agarose ME、Iwai Kagaku、Tokyo、Japan)上で電気泳動により分離し、エチジウムブロミドで染色して観察した。
一つのPCRマーカーで選択された複数のBACのDNAをHindIIIで切断し、1%アガロースゲルで電気泳動してフィンガープリントを行ない、整列させた。この整列を確かめる目的で、BACの塩基配列をもとに作成されたPCRマーカーで増幅DNAの有無を確認した。ここで使用したPCRマーカーが第2染色体に座乗することは、オオムギーコムギ染色体添加系統並びに高密度連鎖地図解析によってあらかじめ確かめられた。
条性遺伝子領域をカバーする整列化BACを作成するため、オオムギの染色体歩行を行った。染色体歩行は条性遺伝子vrs1と組み換えないPCRマーカーであるAFLP2と、vrs1と1個体のみ組み換えるマーカーであるAFLP1から同時に開始した。AFLP1ではBACクローンM102J11(I.D.以下同様)が単離された(以下では、単一のPCRマーカーで複数のBACがスクリーニングされても、BAC整列化に最低限必要なBACについてのみ記述する)。AFLP2ではM111L15とM351N10が単離された。M351N10 BACのT7側末端の塩基配列を決定してSTSマーカー(351N10-T7)を作成し、他のBACのDNAに対してPCR増幅を試みたところ、M102J11およびM111L15において共通に増幅が認められ、M102J11およびM111L15が部分的に重複していることが明らかになった。同時に連鎖地図との比較によってM102J11が染色体動原体側、M111L15が末端側に向いている事が明らかになり、vrs1はM102J11を起点に末端方向に存在すると判断された。そこでM111L15から末端方向に向けて染色体歩行を継続した。
3.1 材料と方法
3.1.1 BAC塩基配列決定
各BACクローンからQIAGEN Large-Construct Kit(QIAGEN GmbH, Hilden Germany)でBAC DNAを抽出した。DNAは超音波処理によってランダムに分断し、電気泳動でサイズを選択し、pUC18ベクターにライゲートした。大腸菌DH10B株をプラスミドで形質転換し、ショットガンライブラリーを作成した。平均挿入サイズが2kbと5kb二種類のショットガンライブラリーを作成した。ライブラリーあたり1000個のクローンの両側末端配列をDye-terminator法で決定しキャピラリーシーケンサーで解析した。合計4000個のショットガンシーケンスのベースコールを行い、Phred/phrap プログラム (http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html)でアッセンブルした。アッセンブルされた塩基配列は、BACのクローニングサイトの塩基配列およびブリッジクローンの両末端塩基配列を用いて正しく順序付けして並べた。ギャップはブリッジクローン全体の塩基配列をプライマーウオーキングあるいはトランスポゾンシーケンシングで読むことによって解消した。
得られたDNA塩基配列をGraingenes Blast against Triticeae repeat database (http://wheat.pw.usda.gov/GG2/blast.shtml)で解析した。反復配列領域を除いたDNA塩基配列をTIGR plant repeat and checked against Grameneae repeat database(http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=plant.repeats)で解析した。以上の配列解析で既知の反復配列とヒットしない領域について、NCBI nucleotide-nucleotide blast (blastn) against ESTs database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)で解析した。
3.2.1 BAC塩基配列決定
4個のBAC(M102J11、M111L15、M045M08、M185K11)の全塩基配列のうち重複部分を除き、406,323bpのバーチャルゲノムコンティグを得た。102J11の小さなギャップは解消しなかった。理由は、vrs1はこのギャップには存在せず、406,323bpのバーチャルゲノムコンティグに存在することが、後述するマーカー解析で明らかになったためである。重複部分において、双方の塩基配列が一致しない部分が5カ所だけあった。すなわち、3箇所の1塩基置換と1カ所の挿入・欠失(29 base)、および1カ所のTA反復配列の反復回数の違いである。後述するvrs1候補遺伝子領域ではこのような不一致は存在しなかった。
Blastn解析から406,323 bpの配列が麦類の19のESTs塩基配列と類似することが明らかになった。このうち4個のESTは406,323 bpの配列中での反復が確認された。残る15のESTのうち、12は反復配列であることがオオムギーコムギ染色体添加系統を使った解析で明らかになったが、それ以外の3 EST(E18、E30、E42)はユニークな配列であっため、これらを遺伝マーカー化した。すなわち、GeneMark.hmmを用いてE18、E30、E42の検索を試みたところ、44個の遺伝子が予測された。このうちの大多数はゲノムの高度反復配列であり、形態形成との関連を明確に示唆する遺伝子はhomeobox遺伝子(本発明者らが仮に命名)一個だけであった(領域は164217-165109)。
4.1 材料と方法
4.1.1二条性品種の突然変異体系統
二条品種の'Bonus'、'Foma'、'Kristina'から誘発した41系統のhexastichon(hex-v)と16系統のIntermedium spike-d(Int-d)突然変異体を利用した。hex-v突然変異体は穂の側列小穂がよく発達し、芒が伸長し、通常の六条性品種の穂ときわめて近い形態を示す。Int-d突然変異体は穂の側列小穂の発達程度が二条性と六条性の中間で、芒の長さは変異体系統によって様々であり、環境による影響も受ける。hex-vとInt-dはいずれもvrs1の対立遺伝子である。
SDS法により、突然変異体およびその原品種からゲノムDNAを抽出した。条性を支配する遺伝子の欠損を調べる目的でvrs1遺伝子と密に連鎖する16の分子マーカーを使用してPCR解析を行った。
突然変異体および原品種のゲノムDNAからオリゴヌクレオチドプライマーM111L15F84204(5'- GAAAGATGATTGCCAACTACC -3')(配列番号:66)および M111L15R86329(5'- GTCATAACTCGGCAAACATAG -3')(配列番号:67)を用いて条性を支配する遺伝子を増幅した。増幅断片のプラス・マイナス鎖は以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて塩基配列の決定を行った。ABI3130 automated DNA sequencerを使用した。
M111L15F84204(5'- GAAAGATGATTGCCAACTACC -3')(配列番号:68)
M111L15R84648(5'- ATAGGGCTTCAAGATCGGCAG -3')(配列番号:69)
M111L15F84603(5'- ATAGAGGCGACTTTTCCGGAG -3')(配列番号:70)
M111L15R85203(5'- ACAAGAACAAGACGCTCGAGG -3')(配列番号:71)
M111L15F85106(5'- CCAGTGTGAGTGTATGCGAGC -3')(配列番号:72)
M111L15R85696(5'- TCACGATCCCTTCTTTCCCTC -3')(配列番号:73)
M111L15F85545(5'- CCGGTGAAACTGAAGCTACTG -3')(配列番号:74)
M111L15R86124(5'- TCCGAATGAAATGAACTCTGC -3')(配列番号:75)
M111L15F86010(5'- CCACATTAGCATTGACCTGAG -3')(配列番号:76)
M111L15R86329(5'- GTCATAACTCGGCAAACATAG -3')(配列番号:77)
4.2.1 突然変異体に見られるゲノム一部欠損による遺伝子の絞り込み
原品種には欠損が全く見つからなかったのに対し、6系統のhex-v突然変異体(hex-v.3、hex-v.10、hex-v.11、hex-v.18、hex-v.35、hex-v.41)においては明らかなゲノムの一部分の欠損が見つかった(図3)。これらの欠損は突然変異体における表現型の変化の原因と考えられる。共通の欠損領域は最大E30と669N11-T7の間であり、これは253kbにわたり(8998-262406)、この領域には前述のhomeobox遺伝子が含まれる。さらに、一個の欠損突然変異体(hex-v.33)において、欠損領域が最大351N10-T7(203-392)からE42の間の81kb(83226-164320)にわたった。これはhomeobox遺伝子の3'非翻訳領域を含む。
homeobox遺伝子を含むゲノム塩基配列を原品種と突然変異体の間で比較した(図4)。原品種(3品種)のhomeobox遺伝子には塩基配列変異が全く認められなかった。これに対し、突然変異体においては、上記6欠損系統(hex-v.3、hex-v.10、hex-v.11、hex-v.18、hex-v.35、hex-v.41)のhomeobox遺伝子欠損を別にすれば、アミノ酸非同義置換や終止コドン形成をもたらす塩基置換が最も多く認められ、次に、読み枠シフトをもたらす小数塩基の欠失が多く認められた。さらに、mRNAスプライシングの修飾をもたらすと考えられる塩基置換も認められた。以上のことから、homeobox遺伝子が条性を支配する遺伝子座の原因遺伝子であることが証明された。
5.1 材料と方法
屋外で播種後約5ヶ月のオオムギ植物から葉身および幼穂(1-50mm)を実体顕微鏡下で摘出した。RNAをTrizol method (Invitrogene)で抽出した。First strand cDNAはSuperscript II キット(Invitrogene)を用いて合成した。RT-PCRによる増幅DNAはアガロースゲルで電気泳動して観察した。
homeobox遺伝子の発現は幼穂組織で観察され、葉身では観察されなかった(図5)。幼穂では1〜5 mm の長さのdouble ridge stage からawn primordium stageで特に活発な発現が認められ、発達段階が進むにつれて発現量は低下した。対照として用いたアクチン遺伝子は組織、発達段階の別なく一定量の発現が観察された。このようにhomeobox遺伝子は確かに転写活性を持ち、オオムギの条性が決定される以前から穂において発現することから、条性遺伝子vrs1の原因遺伝子であると証明された。
Claims (30)
- 以下(a)〜(e)のいずれかに記載のDNA;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
(e)配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下(a)〜(d)のいずれかに記載のDNA;
(a)請求項1に記載のDNAの転写産物と相補的なRNAを発現するDNA、
(b)請求項1に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを発現するDNA、
(c)請求項1に記載のDNAの発現を共抑制効果により阻害するRNAを発現するDNA、
(d)請求項1に記載のDNAの転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAを発現するDNA。 - 請求項1または2に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項1または2に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
- 請求項1または2に記載のDNAが導入された形質転換オオムギ細胞。
- 請求項5に記載の形質転換オオムギ細胞を含む形質転換オオムギ。
- 請求項6に記載の形質転換オオムギの子孫またはクローンである、形質転換オオムギ。
- 請求項6または7に記載の形質転換オオムギの繁殖材料。
- 請求項6または7に記載の形質転換オオムギの製造方法であって、請求項1または2に記載のDNAをオオムギ細胞に導入し、該オオムギ細胞からオオムギを再生させる工程を含む方法。
- 請求項1(a)、(b)または(e)に記載のDNAを二条性ではないオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
- 請求項1(c)または(d)に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
- 請求項2に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
- 請求項1または2に記載のDNAをオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギに赤かび病抵抗性を付与する方法。
- 請求項1または2に記載のDNA、または請求項3に記載のベクターのいずれか1つを含む、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させる薬剤。
- 請求項1に記載のDNAの部分配列からなるDNA。
- 配列番号:4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
- 請求項1に記載のDNAの全部または一部を増幅するプライマーセット。
- 以下(a)〜(r)のいずれかに示す、少なくとも1つのプライマーセット;
(a)配列番号:30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号:32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:33に記載の塩基配列からなるDNA、
(c)配列番号:34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:35に記載の塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号:36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:37に記載の塩基配列からなるDNA、
(e)配列番号:38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:39に記載の塩基配列からなるDNA、
(f)配列番号:40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:41に記載の塩基配列からなるDNA、
(g)配列番号:42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:43に記載の塩基配列からなるDNA、
(h)配列番号:44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:45に記載の塩基配列からなるDNA、
(i)配列番号:46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:47に記載の塩基配列からなるDNA、
(j)配列番号:48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:49に記載の塩基配列からなるDNA、
(k)配列番号:50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:51に記載の塩基配列からなるDNA、
(l)配列番号:52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:53に記載の塩基配列からなるDNA、
(m)配列番号:54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:55に記載の塩基配列からなるDNA、
(n)配列番号:56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:57に記載の塩基配列からなるDNA、
(o)配列番号:58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:59に記載の塩基配列からなるDNA、
(p)配列番号:60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:61に記載の塩基配列からなるDNA、
(q)配列番号:62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:63に記載の塩基配列からなるDNA、
(r)配列番号:64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:65に記載の塩基配列からなるDNA。 - 請求項1に記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも15の連続する塩基を含むDNA。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から請求項1に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、請求項1(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から請求項1に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(d)分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、請求項1(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。 - 以下の(a)〜(e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から請求項1に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e)分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、請求項1(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法;
(a)オオムギからDNA試料を調製する工程、
(b)該DNA試料から請求項1に記載のDNA領域を増幅する工程、
(c)増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
(d)分離したDNAのゲル上での移動度と、請求項1(a)、(b)または(e)に記載のDNAのそれと比較する工程。 - 以下の(a)および(b)の工程を含む、二条性オオムギを選抜する方法;
(a)二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配されたオオムギを作製する工程、
(b)請求項20〜23のいずれかに記載の方法により、工程(a)で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)請求項1に記載のDNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
(b)請求項1に記載のDNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)請求項1に記載のDNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
(b)請求項1に記載のDNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
(c)被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法;
(a)請求項1に記載のDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(d)被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。 - 被検ゲノム断片が請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するか否かを判定する方法であって、以下の(a)および(b)の工程を含み、請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質が、被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴とする方法;
(a)細胞または細胞抽出液において、請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程、
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程。 - 被検ゲノム断片が請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の(a)および(b)の工程を含み、請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特徴とする方法;
(a)細胞または細胞抽出液において、請求項1に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、被検ゲノム断片を含むDNAを接触させる工程、
(b)被検ゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程。 - 請求項25〜29のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
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