WO2007069677A1 - オオムギ条性遺伝子とその利用 - Google Patents

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WO2007069677A1
WO2007069677A1 PCT/JP2006/324911 JP2006324911W WO2007069677A1 WO 2007069677 A1 WO2007069677 A1 WO 2007069677A1 JP 2006324911 W JP2006324911 W JP 2006324911W WO 2007069677 A1 WO2007069677 A1 WO 2007069677A1
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barley
vrsl
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PCT/JP2006/324911
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Takao Komatsuda
Masahiro Yano
Takashi Matsumoto
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National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to a barley streak gene Vrsl and a variant thereof, and a method for altering barley streak and ear morphology using the gene.
  • Hexatrophy is a trait governed by a single recessive gene, vrsl, and the dominant gene V rsl of Nijo barley has been shown to suppress lateral spikelet development (Fig. 1).
  • the gene product has not been clarified at all.
  • the genome structure ie, the sequence of homologous genes
  • the existence of genes homologous to the streak gene is not known, and what if it exists? The power of having such a function was unknown.
  • Non-patent literature l Congfen He, et.al. Genome 47: 1122-1129 (2004)
  • Non-Patent Document 2 Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrsl) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)
  • Patent Document 1 JP 2004-313062 Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved by the present invention is to isolate and identify barley streak genes, and to use these genes. It is to provide a method for modifying barley streak and panicle morphology.
  • the present invention provides genes relating to the determination of barley streak.
  • Six-row sex is a trait governed by the single recessive gene vrsl, and the dominant gene Vrsl in Nijo barley is known to suppress the development of lateral spikelets.
  • the gene product was completely unclear. The present inventors have clarified the region of existence and attempted to isolate it as a single gene.
  • the present inventors first created a linkage map of the streak gene vrsl. Then, an aligned BAC covering the striatal gene region was created by screening a BAC library using a PCR marker linked to the target gene and chromosomal walking using one PCR marker. As a result, it was found that the streak gene vrsl is likely to be linked to a marker from AFLP1 to M053F18-T7.
  • the present inventors investigated the deletion of a gene candidate region that controls the streak by using a mutant of a double streak variety. Comparing the nucleotide sequence of the gene candidate region that controls the striation between the original cultivar and the mutant, the original cultivar showed no nucleotide sequence variation, whereas the mutant had no amino acid synonym. Many base substitutions leading to substitution and termination codon formation were observed. This proves that the candidate region is the target gene.
  • the present invention relates to genes involved in determining barley streak, and specifically provides the following inventions.
  • DNA derived from a barley that is hybridized under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, and equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • a method for modifying the barley streak or ear morphology comprising the step of expressing the DNA according to (c) or (d) in a cell of a bipartite barley;
  • [12] comprising a step of expressing the DNA according to [2] in a cell of a two-rowed barley
  • a method for imparting resistance to head blight on barley comprising the step of expressing the DNA of [1] or [2] in a barley cell,
  • a drug that increases the resistance to head blight of barley comprising any one of the DNA according to [1] or [2] or the vector according to [3],
  • DNA comprising at least 15 consecutive bases complementary to the DNA of [1] or its complementary sequence
  • a method comprising the following steps (a) to (c), wherein when the molecular weight or the base sequence matches, the barley is judged to be double-stretched;
  • a method comprising the following steps (a) to (d), wherein when the mobility on the gel matches, the barley is determined to be double-stretched;
  • a method comprising the following steps (a) to (e), wherein when the mobility on the gel is consistent, it is determined that the barley is double-stretched;
  • a method comprising the following steps (a) to (d), wherein when the mobility on the gel matches, the barley is judged to be double-stretched;
  • a method for selecting a two-rowed barley comprising the following steps (a) and (b):
  • step (b) a step of determining whether or not the barley produced in step (a) is double-stretched by the method according to any one of [20] to [23],
  • a screening method for a test compound comprising the following steps (a) to (c);
  • test compound selected a test compound that binds to the transcription product of the DNA according to [1], [26]
  • a screening method for a test compound comprising the following steps (a) to (c):
  • a screening method for a test compound comprising the following steps (a) to (d):
  • FIG. 1 Photographs showing barley spikes of two-row (a) and six-row (b). Two-row ears are flat, but six-row ears are three-dimensional. It is a photograph showing three spikelets of barley having two stripes (c) and six stripes (d).
  • the inner and outer pods, male pods and female pods are separated but are not fully developed. In particular, the female pods are completely degenerated and have no fertility. In six-rowed ears, it also bears fruit with Sankoho.
  • FIG. 2 A diagram showing the creation of a barley BAC container containing the streak gene vrsl.
  • the molecular linkage map of rice (upper) and barley (middle) is high and shows homology.
  • the barley BAC contig is shown below.
  • a candidate gene for vrsl was predicted (bottom center, short arrow).
  • FIG. 3-1 is a diagram showing PCR analysis results (detection of defects) of mutants.
  • FIG. 3-2 This is a continuation of Fig. 3-1.
  • FIG. 4-1 is a diagram showing a correlation between a phenotype and a genotype using a mutant.
  • FS Frameshift. How to read this figure is as follows. For example, in the mutant of hex-v.42, it explains that 107th Arg is replaced by Leu. It also explains that the base is replaced from “cgc” to “ctc”. Furthermore, this replacement explains what happens in the Exo2 Homeodomain. The same applies to other mutants.
  • FIG. 4-2 This is a continuation of Fig. 4-1.
  • FIG. 4-4 This is a continuation of Fig. 4-3.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of expression analysis of the vrsl gene. Expression is seen in young panicles, but not in leaves. Transcripts are observed in both Nijo varieties ( ⁇ , B) and Rojo varieties (A), but there is a shift in the reading frame for Rojo varieties. H is a hexagonal mutant made from two varieties (B), and there is a large-scale deletion in the region containing the gene, so no transcript is observed at all. The two-row varieties have a functional gene Vrsl, and no mutations are observed between the two-row varieties at the amino acid sequence level.
  • the present invention relates to a Vrsl gene that imparts a streak trait to barley, a Vrsl gene mutant that imparts a streak trait, a Vrsl gene mutant that imparts a hexastral trait, and Provides Vrsl gene mutants that confer stratiform and hexagonal traits (Table 1)
  • Vrsl genetic line Natsuda i kon Mug, Morex, AZ, Soren Oomugi 193 Hexasexual mutant 29, Caveda, D i ssa, Hayak i so 2, Ar l i ngton Awn l ess.
  • the Vrsl gene of the present invention includes
  • a variant of the Vrsl gene that imparts a streak trait to barley hereinafter referred to as “a variant of the Vrsl gene that is a streak” in this specification
  • DNA derived from a barley that is hybridized under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, and equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the trait trait (hereinafter, sometimes simply referred to as “streaky” in the present specification) refers to a trait of a spike having a spike that does not develop side row spikelets. . Specific examples include the varieties Bonus, Foma, and Kristina in FIG. 31 (all of which include the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1).
  • the gene may exhibit a double-stripe trait.
  • examples of barley exhibiting such traits include Debre Zeit and OUH602 described in Table 3 and FIG.
  • Debre Zeit has a strandedness determining gene in which the 694th A is mutated to G, the 873th T is mutated to G, and the 1446th A is mutated to G.
  • a DNA encoding a protein having a function equivalent to that of the other protein is also included in the gene involved in the double-stripe trait.
  • the “equivalent function” includes not only the same function as Vrsl but also a similar function of the Vrsl gene.
  • the present invention also provides a variant of the Vrsl gene that confers hexagonal traits to barley (hereinafter referred to as "mutant of the hexagonal Vrsl gene" in this specification). Provide. Such mutants include:
  • Mutants of the Vrsl gene that give the barley a hexagonal trait include, for example, hex-v.3, hex-v.10, hex-v.ll, hex in Table 2 and Fig. 4. -As shown as ⁇ .18, hex-v.35, hex-v.4 1, in the base sequence of SEQ ID NO: 1, the base sequence in which the 2147th base is deleted from the 1st base The gene which has is mentioned.
  • the 32 mutant lines described as hex-v in Figure 4 and cultivars such as Natsudaikon Mugi, Morex, AZ, Soren Oomu gi 19329, Caveda ⁇ Dissa ⁇ Hayakiso 2, Arlington Awnless, etc. It has the traits of Barley with mutants beginning with hex-v tends to have a high degree of development in all traits such as cocoon elongation, internal and external hypertrophy, and seed fertilization. In these mutants, mutations in the respective DNA are reflected in changes in the amino acid sequence, resulting in a change to a hexagonal trait.
  • the sexiform trait hereinafter, sometimes referred to simply as “hexaline” in the present specification
  • hexaline refers to a trait of a spike that has developed side row spikelets in the same manner as main row spikelets.
  • the present invention also relates to a variant of the Vrsl gene that gives the barley an intermediate trait between two and six-rows (hereinafter referred to as "mutant of the intermediate Vrsl gene"). Provided).
  • mutants include:
  • an intermediate trait between the streak and the six streak means that the side row spikelet is partially developed and is It is a trait with an intermediate head between sex and hexagonal.
  • the intermediate trait between the double streak and the six streak includes the following traits.
  • the side row spikelets do not grow at all, whereas the mutants created from the two-rowed (mutants with a trait between two-rowed and six-rowed)
  • the ridges on the side row are extended. The extent of this extension is from the one that hangs like a splinter at the tip and hardly stretches, but it stretches well to reach the same level as the main row, and the appearance of the ear is inferior to that of a normal hexagonal variety Until then, it shows continuous mutation.
  • the inner and outer gills of the side row spikelet are not enlarged compared to the main row spikelet, whereas the mutants created from the two row spikelet
  • the inner and outer buds of the spikelet are enlarged.
  • the extent of this enlargement is very slight, that is, very close to double streak, to well developed and inferior to the usual six streak varieties.
  • Side row spikelets of double-row varieties do not have seed fertility at all, whereas side rows of mutants produced from double-row varieties (mutants having intermediate traits between double-row and hexa-row-rows)
  • the spikelet has a continuous mutation, even if it has no seed fertility, and some dozens of seeds bear fruit.
  • typical traits that are affected by mutation include pod elongation in side row spikelets, hypertrophication of inner and outer pods, and seed fertilization.
  • typical traits that are affected by mutation include pod elongation in side row spikelets, hypertrophication of inner and outer pods, and seed fertilization.
  • streak gene of the present application controls the size of the fine organs of the side spikelet as a whole, the traits affected by the mutation are not limited to these.
  • Vrsl gene mutants that are bi-striated, Vrss that are hexa-striated A variant of one gene, a variant of the Vrsl gene that is intermediate between two and six-rowed, is collectively referred to as a “Vrsl gene variant”.
  • the Event at DNA is "1049 G to A” because, in the mutant "lnt-d.12", the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Means that the 2nd base is substituted from G to A ”.
  • the 1049th base of the base sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to the 406th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the 85th Arg force isis of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is substituted.
  • the event at DNA of, for example, Mutant hex-v.42 in Table 2 is “1115 G to T” because in the mutant “hex-v.42”, 1115 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the second base sequence is replaced with G force T ”.
  • the 1115th base of the base sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to the 472th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the 107th Arg in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is replaced with Leu.
  • Table 3 as in Table 2, the mutation site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the corresponding amino acid substitution are described for each variant.
  • the Vrsl gene mutant of the present invention is a mutant in which various sequence changes have occurred in the Vrsl gene, such as base deletion, frameshift, and appearance of a stop codon.
  • Barley is distributed as ikebana. Therefore, barley modified to two-row, barley modified to six-row, and barley modified to the middle of two-row and six-row can be used for ikebana. Useful. In particular, barley that has been modified to be intermediate between two and six is highly valuable as a variant.
  • Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene of the present invention By using the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene of the present invention and arranging the balance of the main row and the side row of the ear, it is possible to produce a shape suitable for the purpose.
  • Vrsl gene of the present invention is not particularly limited as long as it can encode “Vrsl protein”.
  • Vrsl gene includes not only cDNA but also genomic DNA or chemically synthesized DNA. Included.
  • the Vrsl gene includes DNA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code as long as it encodes the Vrsl protein.
  • the mutant of the Vrsl gene of the present invention also includes genomic DNA, chemically synthesized DNA, etc. in addition to cDNA, as long as it can encode proteins.
  • Genomic DNA for example, is extracted from plant power and genomic libraries (plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used as vectors) and expanded to create Vrsl genes (for example, The DNA can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the Vrsl gene variant). is there. It is also possible to prepare a primer specific for the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene and perform PCR using this primer.
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from plant power, inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library, developed, and colony-high as described above. It can be prepared by performing a hybridization or a plaque hybridization, or by performing a PCR.
  • Vrsl gene or Vrsl gene variants include hybridization techniques (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK, et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, vol.239, 487-491,1988 ). That is, for those skilled in the art, for example, a DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 or a part thereof is used as a probe, and a DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is specifically used. However, it is usually possible to isolate Vrsl gene or a variant of Vrsl gene using a hybridizing oligonucleotide as a primer.
  • a normalization reaction is usually carried out under stringent conditions.
  • stringent conditions Those skilled in the art can appropriately select stringent and hybridization conditions for isolating the DNA encoding the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • stringent and hybridization conditions for isolating the DNA encoding the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions 4 X SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 X Denhardt's solution, 20 g / ml denatured salmon sperm DNA, 42 ° After pre-hybridization at C, add the labeled probe and incubate at 42 ° C for incubation.
  • the homology of the isolated DNA is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) in the entire amino acid sequence. And the like). Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and B LASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol, 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. ing.
  • the species of barley is not particularly limited and may be any species as long as it is included in the genus Barley. Further, it may be a hybrid of a cultivar and a wild barley. Wild barley is not limited to this, For example, Hordeum vukgare ssp. Spontaneum. The cultivated species is not limited to this, but for example, Hordeum vukgare ssp. Vulgare.
  • the present invention also relates to DNA used to suppress the expression of endogenous Vrsl gene or mutant of Vrsl gene in barley,
  • a desired barley that has a particularly modified ear shape can be used.
  • “suppressing expression of Vrsl gene or Vrsl gene mutant” includes suppression of gene transcription and suppression of protein translation. It also includes a decrease in expression as well as a complete cessation of DNA expression.
  • DNA used to suppress the expression of a Vrsl gene or a variant of Vrsl gene is a DNA encoding an antisense RNA complementary to the Vrsl gene or a variant of Vrsl gene .
  • the anti-sense effect in plant cells is that anti-sense RNA introduced by electroporation using a temporary gene expression method is introduced into plants! For the first time (Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986). Subsequently, tobacco and petunia have also been reported to decrease the expression of target genes due to the expression of antisense RNA (Krol et. Al, Nature 333: 866, 1988), and currently suppress gene expression in plants. Established as a means to
  • an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. That is, transcription initiation inhibition by triplex formation, transcription inhibition by hybridization with a site where an open loop structure has been locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron Suppression by splicing at the junction with the exon, suppression of splicing by hybridization with the spliceosome formation site, nuclear force by hybridization with mRNA, suppression of cytoplasmic transition, capping site and poly (A ) Suppression of splicing by hybridization with an additional site, suppression of translation initiation by hybridization with a translation initiation factor binding site, suppression of translation by hybridization with a ribosome binding site near the initiation codon, translation region of mRNA and polysome binding site By hybridization These include inhibition of peptide chain elongation and suppression of gene expression by hybridization between nucleic acid and protein interaction sites.
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of a gene would be effective for inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is linked downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • Antisense DNA is, for example, based on the sequence information of DNA set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988) can be used.
  • the prepared DNA can be transformed into a desired plant by a known method.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably complementary to the endogenous gene transcript of the plant to be transformed, but may not be completely complementary as long as it can effectively inhibit gene expression. Also good.
  • the transcribed RNA is preferably 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) complementary to the target gene transcript.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb!
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Although some ribozymes have various activities, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type, and some have a size of 400 nucleotides or more, such as M1RNA contained in RNaseP. Some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. Yes (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves on the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9, and position 15 Has been shown to be cleaved by A or U in addition to C (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988).
  • the substrate binding part of the ribozyme is designed to be complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the sequence UC, UU, or UA in the target RNA can be created.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot wingless satellite RNA. (Buzayan, Nature 323: 349,1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 1 9: 6751, 1992, and Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992) .
  • Ribozymes designed to cleave the target are linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells.
  • ribozyme activity may be lost if extra sequences are added to the 5 'or 3' end of the transcribed RNA.
  • another trimming ribozyme that acts as a cis for trimming is provided on the 5 ′ side or 3 ′ side of the ribozyme part.
  • Such structural units can be arranged in tandem so that multiple sites in the target gene can be cleaved, thereby further enhancing the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992).
  • Such a ribozyme can be used to specifically cleave the transcript of the gene targeted in the present invention, thereby suppressing the expression of the gene.
  • Suppression of endogenous gene expression can also be achieved by “co-suppression” induced by transformation of DNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence.
  • “Co-suppression” is a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as a target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is suppressed. That means. Details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6: 810, 1 996).
  • a DNA having the same or similar sequence as the Vrsl gene or the mutant of the Vrsl gene can be expressed.
  • the prepared vector DNA is transformed into a target plant, and a plant having a trait in which the function of Vrsl or a Vrsl mutant is suppressed is selected from the obtained plant.
  • the gene used for co-suppression must be exactly the same as the target gene.
  • the sequence identity is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more).
  • suppression of endogenous gene expression in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant negative trait of the target gene into a plant.
  • a gene having a dominant negative trait is a gene having a function of eliminating or reducing the activity of an endogenous wild type gene inherent in a plant by expressing the gene.
  • DNA used to suppress the expression of a Vrsl gene or a variant of Vrsl gene is a dsRNA complementary to a transcription product of an endogenous Vrsl gene or a variant of Vrsl gene ( DNA encoding double-stranded RNA).
  • dsRNA complementary to a transcription product of an endogenous Vrsl gene or a variant of Vrsl gene ( DNA encoding double-stranded RNA).
  • siRNA short interference RNA
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA.
  • RsRP RNA-dependent RNA polymerase
  • RNAi was originally discovered in nematodes (Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806 -811, 1998), It has been observed not only in nematodes but also in various organisms such as plants, linear animals, fruit flies, and protozoa (Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999) , Sharp, PA RNA interference 2001. Genes Dev.
  • RNAi RNA i has attracted a great deal of attention as a technology applicable to mammalian cells such as humans.
  • the DNA of the present invention comprises an antisense-encoding DNA encoding an antisense RNA for a region of the target gene transcript (mRNA), and a sense RNA in any region of the mRNA.
  • the antisense RNA and the sense RNA can be expressed from the antisense code DNA and the sense code DNA. DsRNA can also be produced from these antisense RNAs and sense RNAs.
  • the target sequence in the present invention is not particularly limited as long as the expression of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is suppressed as a result of introducing dsRNA having the same or similar sequence to the target sequence into the cell.
  • An example of a target sequence is the 3 ′ untranslated region sequence of V rsl gene or a variant of Vrsl gene.
  • the antisense RNA and sense RNA are expressed differently from the case where antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, respectively. May be expressed.
  • antisense RNA and sense RNA can be expressed from the same vector.
  • Antisense RNA expression in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of the antisense code DNA and sense code DNA.
  • a cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • RNA code DNA double-stranded DNA
  • antisense RNA and sense RNA Promoters are provided opposite to each other so that they can be expressed.
  • a terminator is added to the 3 'end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand).
  • This terminator a sequence in which four or more A (adenine) bases are contiguous can be used.
  • it is preferable that the two promoter types are different! /.
  • a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA, respectively.
  • An antisense RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.
  • the siRNA to be expressed is transcribed and the length of the final double-stranded RNA portion is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. can do.
  • an appropriate sequence preferably an intron sequence
  • a double-stranded RNA having a hairpin structure preferably an intron sequence
  • hpRNA self-complementary 'hairpin' RNA
  • the DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but at least 70 % Or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more).
  • the sequence identity can be determined by the method described above.
  • the part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA paired with each other is not limited to a perfect pair, but includes mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (corresponds to one strand)
  • the unpaired part may be contained, for example.
  • both bulges and mismatches may be contained in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
  • the present invention also provides a vector, a transformed cell, and a transformed barley cell containing any one of the Vrsl gene, a variant of the Vrsl gene, or DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene. .
  • the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities using Escherichia coli (for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue) and the like.
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue
  • a selection gene for transformed E. coli for example, any drug (drug resistance gene that can be distinguished by ampicillin, tetracycline, kanamycin, chlorambu-chol)
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • pGEM-T for the purpose of cDNA subcloning and excision, in addition to the above-mentioned vectors, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • An expression vector is particularly useful when the vector is used for the purpose of producing a protein produced from the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • the host is a large intestine such as JM109, DH5a, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli for example, 1 acZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-24 27), It is essential to have the araB promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043) or the T7 promoter.
  • such vectors include pGEX-5X-1 (Falmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pE Examples thereof include GFP and pET.
  • the vector also includes a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out by using, for example, the calcium chloride method or the electopore position method.
  • vectors for producing a protein produced from the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene include, for example, mammalian-derived expression vectors (eg, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)).
  • mammalian-derived expression vectors eg, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)
  • insect cell-derived expression vectors for example, “Bac-to- BAC bacul ovairus expression system” (Gibco BRL) PBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived of the origination expression vector (e.g., "pi c hi a expression Kit” (Invitrogen), pNVll, SP-Q01; ), expression vectors derived from Bacillus subtilis (e.g., P PL608, pKTH50), and the like.
  • Bacillus subtilis e.g., P PL608, pKTH50
  • a promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc. are essential, and are selected for transformation into cells. It is more preferable to have a gene for this purpose (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.)).
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • Introduction of the DNA of the present invention into cells can be carried out by those skilled in the art by a known method such as electroporation (elect mouth polarization method).
  • the present invention relates to a transformed barley into which a Vrsl gene, a mutant of the Vrsl gene, or a DNA that suppresses expression of the Vrsl gene is introduced, a descendant or clone of the transformed barley, Provide breeding material for transformed barley. Also, A method for producing the transformed barley and its propagation material is provided. As a result of the introduction of the above-mentioned genes, transformed barley having a two-row trait is useful for beer brewing, for example. In addition, transformed barley having a hexagonal character is useful as a feed.
  • transformed barley having two-row, six-row, or intermediate between two-row and six-row properties can be used for, for example, ikebana, and is useful in the field of ornamental plants.
  • the Vrsl gene, the mutant of the Vrsl gene, or the DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene is as described above.
  • Vrsl gene a mutant of Vrsl gene, or DNA that suppresses expression of Vrsl gene can be introduced into plant cells by the above-described method.
  • Regeneration of barley can be performed by methods known to those skilled in the art (Toki et. Al, Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995).
  • a method for producing transformed plants is a method of regenerating plants by introducing genes into protoplasts using polyethylene glycol (Datta et. Ai., Inuene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.)).
  • PP66-74, 1995 gene transfer to protoplasts by electric pulses to regenerate plants
  • Toki et. Al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992 gene to cells by particle gun method To directly regenerate plants and regenerate plants (Christou et.
  • the recombinant vector is transformed into agrobacterium, and the transformed agrobacterium is then introduced into the cell by a known method such as the leaf disk method.
  • the vector contains an expression promoter so that, for example, after being introduced into a plant, the Vrsl gene of the present invention, a variant of the Vrsl gene, or a DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene is expressed in the plant.
  • the Vrsl gene of the present invention, a variant of the Vrsl gene or a DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene is located downstream of the promoter, and a terminator is located downstream of the DNA.
  • the recombinant vector used for this purpose is appropriately selected by those skilled in the art depending on the method of introduction into a plant or the type of plant.
  • the promoter include CaMV35S derived from cauliflower mosaic virus, maize ubiquitin promoter (Japanese Patent Publication No. 2-79983), and the like.
  • the terminator can be exemplified by a cauliflower mosaic winoles-derived terminator, a terminator derived from a nopaline synthase gene, or the like, but if it is a promoter or terminator that functions in a plant body, It is not limited to these.
  • the Vrsl gene of the present invention may be explants. It may be prepared and introduced into the obtained cultured cells.
  • the “barley cells” of the present invention include, for example, plant cells such as leaves, roots, stems, flowers (especially pollen microspores) and scutellum in immature 'mature seeds, callus, suspension culture cells and the like. .
  • the above recombinant vector is It is preferably introduced into barley cells together with a plasmid vector containing an appropriate selection marker gene or containing a selection marker gene.
  • Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotic noygromycin, the neomycin phosphotransferase that is resistant to kanamycin or gentamicin, and the herbicide phosphinothricin.
  • a certain acetyltransferase gene and the like can be mentioned.
  • Cells into which a recombinant vector has been introduced are placed on a known selection medium containing an appropriate selection agent according to the type of the introduced selection marker gene and cultured. As a result, transformed plant cultured cells can be obtained.
  • Plants regenerated from the transformed cells are cultured in an acclimation medium in the next step. Thereafter, when the acclimatized regenerated plant body is cultivated under normal cultivation conditions, the plant body can be obtained and matured and fruited to obtain seeds.
  • the introduced foreign DNA in the transformed plant body regenerated and cultivated in this way.
  • the presence of can be confirmed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of DNA in a plant body.
  • DNA can be extracted from the transformant according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • the DNA extracted from the regenerated plant body strength as described above is increased as a cocoon type. Perform breadth reaction.
  • an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which the DNA of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA modified according to the present invention is used as a primer. Can also be done.
  • amplification reaction amplification of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention can be obtained by repeating DNA denaturation, annealing, and extension reactions several tens of times.
  • the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, various amplified DNA fragments are fractionated and it can be confirmed that the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention.
  • the present invention includes a plant cell into which a Vrsl gene, a mutant of the Vrsl gene, or a DNA that suppresses expression of the Vrsl gene is introduced, a plant body containing the cell, progeny and clones of the plant body, and the plant The body, its offspring, and clonal propagation material are included.
  • These plant cells, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, their progeny, and clones are intended to modify the morphology of the ears of plants (eg barley). It is possible to use.
  • the present invention further provides a method for altering barley streak or ear morphology, comprising the step of expressing the Vrsl gene in non-streaked barley cells.
  • the present invention also provides a method for altering barley streak or panicle morphology, comprising the step of expressing a mutant of the Vrsl gene in a cell of a bipartite barley.
  • the present invention further provides Vrsl genetics Provided is a method for altering barley streak or ear morphology, which comprises the step of expressing DNA that suppresses offspring expression in cells of bipartite barley.
  • the barley transformed into double-stripe is useful for beer brewing, for example.
  • barley transformed into hexagonal form is useful as a feed.
  • transformed barley transformed into two-row, six-row, or intermediate between two-row and six-row is useful in the field of ornamental plants because it can be used for, for example, ikebana.
  • the above method is used to introduce into the barley cells a vector containing a Vrsl gene, a variant of the Vrsl gene, and a DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene. It is possible by playing this.
  • the term "modify” means, for example, that a hexagonal barley is completely changed to a two-rowed barley (or a hexagonal barley ear is completely changed to a two-rowed barley ear.
  • a hexagonal barley ear is completely changed to a two-rowed barley ear.
  • the hexagonal barley that is changed to the double streak includes not only barley that has a hexagonal character in all of its individuals, but also barley that has a hexagonal character in only a part of the individual.
  • the above-mentioned definition of “modify” includes the step of expressing a mutant of the Vrsl gene in cells of a double streak barley.
  • a method of modifying the shape of the ear or a method of modifying the shape of the barley or the shape of the ear including the step of expressing DNA that suppresses the expression of the Vrsl gene in the cells of the two-rowed barley. The same applies, for example, by exchanging the wording of two-row and six-row.
  • the present invention provides a method for conferring resistance to head blight of barley, which comprises the step of expressing the Vrsl gene in barley cells. It is possible to confer resistance to Fusarium head blight on barley by introducing a vector that can express the Vrsl gene into barley cells using the method described above and regenerating it.
  • redhead fungus means a fungus contained in the genus Fusarium.
  • An example of the most important species is Fusarium graminearum, which is not limited to these. All fungi included in the above genus are included in the Fusarium head blight fungus in the present invention.
  • the present invention also provides a protein produced from the Vrsl gene of the present invention or a variant of the Vrsl gene, a method for producing the protein, and a recombinant protein that provides an antibody that binds to the protein.
  • a DNA encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate cell, and the transformed protein is cultured to purify the expressed protein.
  • the recombinant protein can also be expressed as a fusion protein with other proteins for the purpose of facilitating purification. For example, a method of preparing a fusion protein with maltose binding protein using E.
  • coli as a host (vector pMAL series released by New England BioLabs, USA), a method of preparing a fusion protein with dartathione-S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Vector pGEX series released by Biotech) and methods prepared by caloring with a histidine tag (Novagen pET series) can be used.
  • GST dartathione-S-transferase
  • GST dartathione-S-transferase
  • methods prepared by caloring with a histidine tag Novagen pET series
  • yeast yeast, various animal and plant cells, insect cells and the like can be used.
  • Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce a vector into a host cell. For example, for introduction into E.
  • the recombinant protein expressed in the host cell is the host cell or its It can be purified and recovered from the culture supernatant by methods known to those skilled in the art.
  • the recombinant protein is expressed as a fusion protein with the above-described maltose binding protein, etc., it is possible to easily purify the facility.
  • an antibody that binds to the protein can be prepared.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows.
  • Vrsl protein protein produced from Vrsl gene
  • a monoclonal antibody for example, a protein produced from a Vrsl protein or a mutant of the Vrsl gene or a partial peptide thereof is immunized to a small animal such as a mouse, and the spleen is excised from the mouse, The cells are separated by grinding, and the cells are fused with mouse myeloma cells using a reagent such as polyethylene dallicol.
  • the Vrsl protein or Vrsl gene mutant strength also select clones that produce antibodies that bind to the protein produced.
  • the obtained noci / hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is collected from the mouse, and the resulting monoclonal antibody is purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, It can be prepared by purifying with a protein column or the like, which is a protein or synthetic peptide produced from a Vrsl protein or a mutant of the Vrsl gene.
  • the antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention.
  • the present invention includes antibodies that bind to the proteins of the present invention.
  • the present invention provides use of a Vrsl gene and a vector containing the gene. That is, the present invention relates to a drug for enhancing the resistance to head blight of barley, which contains any one of the Vrsl gene and a vector containing the gene as an active ingredient. The present invention also relates to the production of a medicament for enhancing the resistance to head blight of barley! , Vrsl gene, and the use of vectors containing the gene.
  • oligonucleotide in addition to the oligonucleotide that is an effective component, for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, Solubilizing agents, buffering agents, preservatives and the like may be mixed as necessary.
  • the present invention also provides a molecular marker linked to the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • the “molecular marker” in the present invention refers to a DNA region that is genetically linked to a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene and is distinguishable from other DNA regions.
  • a molecular marker is more useful because the shorter the map distance, expressed in units of cM, is located near the gene and is inherited at the same time as the gene.
  • the primer set of the present invention includes a marker containing all or part of the base sequence described in SEQ ID NOs: 4 to 29.
  • the molecular marker of the present invention include STS (Sequence Tagged Site) marker, AFLP marker, RFLP marker, SNP marker, SSR marker and the like.
  • An STS marker refers to a DNA region that can be used to determine the presence or absence of a polymorphism in a sequence tag site (STS) on DNA, and STS refers to a sequence site specific to a specific position on DNA.
  • the polymorphism of STS is the presence or absence of the band and the difference in position by amplifying the DNA region containing the specific sequence site by a nucleic acid amplification method such as PCR and subjecting the amplified product to agarose or polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the AFLP method is a method in which differences in the length of DNA fragments cleaved with restriction enzymes are selectively amplified by PCR and detected.
  • An RFLP marker is a DNA region that can be used to determine the presence or absence of a restriction fragment length polymorphism (RFLP) in a chromosomal DNA sequence.
  • RFLP refers to genetic mutations (substitution mutations, insertion mutations, deletion mutations, etc.) found by differences in the length of DNA fragments obtained by treatment with restriction enzymes. Separation is based on the length of the fragments by electrophoresis, and the difference in migration distance can be detected and detected by Southern blotting.
  • SSR Makoto is an abbreviation for Simple Sequence Repeats and is synonymous with microsatellite marker.
  • the SSR marker is a DNA marker that uses the difference in the number of repeats of a repeat sequence in which a unit of 2 or 3 bases present in the base sequence repeats several times or several hundred times as a DNA polymorphism. It is a car.
  • the nucleotide sequence of the repetitive portion is amplified by PCR, and the resulting amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis or a DNA sequencer to detect DNA polymorphism as a difference in band position or number of nucleotide sequences.
  • SNP is a DNA polymorphism generated by substitution of one base in the DNA base sequence, and this is used as a DNA marker.
  • a single nucleotide polymorphism part and the base sequence adjacent to it are amplified by PCR, and the type of base incorporated into the single nucleotide polymorphism part in the obtained amplification product is detected by analyzing with a polarization fluorescence analyzer. It is possible.
  • the primer is a pair of primer sets for amplifying the base sequence that is specifically present in barley and designed to sandwich the base sequence linked to the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene. It is.
  • test barley is bi- or hexagonal. It is.
  • primers described above those skilled in the art will also know the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2, or the DNA having the base sequence capability described in SEQ ID NO: 1 or 2 and stringent. It is possible to create a primer set having the same function using barley-derived DNA that hybridizes under various conditions. Such primers are also included in the primers of the present invention.
  • the PCR primer of the present invention can be prepared by those skilled in the art using, for example, an automatic oligonucleotide synthesizer. Those skilled in the art can also carry out the method of the present invention by well-known polymorphism detection methods, such as the PCR-SSCP method described later using the above PCR primers.
  • the molecular marker of the present invention when the molecular marker of the present invention is present in an exon of genomic DNA, RT-PCR using mRNA as a saddle can be used.
  • a Taqman (quantitative PCR detection) system Roche
  • the presence or absence of amplification products can be detected by fluorescence. According to this system, it is possible to perform the identification method of the present invention in a short time since the labor of electrophoresis can be saved.
  • the present invention also provides an oligonucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides complementary to Vrsl gene or a DNA comprising a Vrsl gene variant or a complementary strand thereof.
  • complementary strand refers to the other strand with respect to one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs. Point to.
  • “complementary” is not limited to the case where the sequence is completely complementary in at least 15 consecutive nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably. Should have at least 95% sequence homology! As an algorithm for determining homology, those known to those skilled in the art may be used.
  • the oligonucleotide of the present invention is hybridized under stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. Probes used for detection and amplification of DNA derived from barley can be used as primers. Moreover, the oligonucleotide of the present invention can be used in the form of a substrate of a DNA array.
  • the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify at least part of the DNA of the present invention or its complementary strand.
  • the 3 ′ region can be complementary, and a 5 ′ end can be labeled with a restriction enzyme recognition sequence or tag.
  • the probe specifically hybridizes to DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 or at least a part of its complementary strand, There is no particular limitation as long as it specifically hybridizes to at least a part of DNA derived from barley that hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 under stringent conditions or its complementary strand.
  • the probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • a labeling method T4 polynucleotide kinase is used and an oligonucleotide is used.
  • a method of incorporating a substrate base labeled with piotin or the like can be exemplified.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the present invention provides a method comprising the following steps (a) to (c), wherein the barley is determined to be double-striated when the molecular weight or the base sequence matches. .
  • the DNA sample used in the determination method of the present invention is not particularly limited, but usually genomic DNA that also extracts barley moss as a test plant is used.
  • the collection source of genomic DNA is not particularly limited, and any tissue power of barley can be extracted. For example, ear, leaf, root, stem, seed, endosperm part, bran, embryo, etc. can be extracted.
  • a nucleic acid amplification reaction for example, PCR method
  • PCR method for example, PCR method
  • the amplified DNA fragment is cleaved with a restriction enzyme, and the size of the cleaved DNA fragment is compared between a test barley and a two-rowed barley by electrophoresis or the like.
  • the test barley is determined to be a two-row barley. Examples of “striped barley” include, but are not limited to, barley listed in Table 1.
  • the electrophoretic analysis may be performed according to a conventional method. For example, agarose or po Electrophoresis is performed in a reacrylamide gel by applying voltage, and the separated DNA pattern is analyzed.
  • the Vrsl gene is not limited to DNA containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2. Even if the DNA containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 has a mutation, as long as the barley having the gene has a trait trait, the SEQ ID NO: 1 Alternatively, DNA having a mutation in the base sequence described in 2 is included in the Vrsl gene of the present invention.
  • the present invention also provides a method comprising the following steps (a) to (c), wherein the barley is determined to be hexagonal when the molecular weight or the base sequence matches. .
  • the present invention is a method including the following steps (a) to (c), and when the molecular weight or the base sequence is identical, it is determined that the barley is intermediate between two-row and six-row. Provide a method.
  • the six-row property, the two-row property and the intermediate property between the six-row properties are as described above.
  • the amplified DNA fragment is cleaved with a restriction enzyme, and the size of the cleaved DNA fragment is determined by electrophoresis or the like between the test barley and the hexagonal barley by electrophoresis or the like.
  • the test barley is determined to be hexagonal.
  • the amplified DNA fragment is cleaved with a restriction enzyme, and the size of the cleaved DNA fragment is determined by electrophoresis or the like.
  • the test barley is determined to be intermediate between the two-row and six-row.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (d), wherein the mobility on the gel is Provide a method by which barley is determined to be double-striated when matched.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (d), wherein the barley is determined to be hexagonal when the mobility on the gel matches. provide.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (d), wherein the barley has an intermediate property between two and six when the mobility on the gel matches. Provide a method to be determined to be.
  • the present invention is a method including the following steps (a) to (e), wherein the barley is judged to be double-striated when the mobility on the gel matches. provide.
  • the present invention also provides a method comprising the following steps (a) to (e), wherein the barley is determined to be hexagonal when the mobility on the gel matches. .
  • the present invention is a method including the following steps (a) to (e), wherein when the mobility on the gel is coincident, the barley is intermediate between the two-row property and the six-row property.
  • Such a method includes the PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (single-strand conformation ion polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome). 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumor s by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6 (8 ): 1313- 1318., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling. PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-28 2.).
  • This method is particularly suitable for screening a large number of DNA samples because it is relatively easy to operate and has the advantage of requiring a small amount of sample.
  • the principle is as follows. When double-stranded DNA fragments are dissociated into single strands, Forms a unique higher order structure depending on the base sequence. When this dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel without a modifying agent, single-stranded DNA of the same complementary strand length moves to a different position depending on the difference in each higher-order structure. . The higher-order structure of this single-stranded DNA is changed by the substitution of a single base, and shows different mobility in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting this change in mobility, it is possible to detect the presence of mutations due to point mutations, deletions or insertions in DNA fragments.
  • a region containing the target site of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is amplified by PCR or the like.
  • the amplification range is preferably about 100 to 600 bp.
  • isotopes such as 32 P, or primers labeled with fluorescent dyes or piotin, or there are isotopes such as 3 2 P in the PCR reaction solution!
  • a DNA fragment synthesized by labeling the substrate base labeled by (1) and performing PCR is labeled.
  • labeling can also be carried out by adding a substrate base labeled with 32 P or the like isotope using a tale nou enzyme or the like or a fluorescent dye or piotin after the PCR reaction to the synthesized DNA fragment.
  • the DNA fragment obtained in this way is double-stranded and electrophoresed on a polyacrylamide gel that does not contain a denaturing agent such as urea.
  • a DNA fragment may be denatured by applying heat or the like, and then subjected to electrophoresis using a polyacrylamide gel that does not contain a denaturing agent such as urea.
  • the conditions for separating DNA fragments can be improved by adding an appropriate amount (approximately 5 to 10%) of glycerol to the polyacrylamide gel.
  • Electrophoretic conditions vary depending on the nature of each DNA fragment, but are usually performed at room temperature (20 to 25 ° C), and optimal mobility can be achieved at temperatures from 4 to 30 ° C when favorable separation cannot be obtained. Examine the temperature to be applied. After electrophoresis, the mobility of DNA fragments is detected and analyzed by autoradiography using X-ray film or a scanner that detects fluorescence. If a band with a difference in mobility is detected, this band can be excised directly from the gel, amplified again by PCR, and sequenced directly to confirm the presence of the mutation. Even when labeled DNA is not used, the gel after electrophoresis can be stained by ethidium bromide or silver staining. Thus, the band can be detected.
  • the present invention is a method including the following steps (a) to (e), wherein the barley is determined to be double-stripe when the sizes of the detected DNA fragments match. Provide a method.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (e), wherein the barley is determined to be hexagonal when the sizes of the detected DNA fragments match. I will provide a.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (e), wherein the barley is intermediate between the two- and six-rows when the sizes of the detected DNA fragments match. Provides a method to be determined to be.
  • Examples of such methods include RFLP methods and PCR-RFLP methods using restriction fragment length polymorphism (RFLP).
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • Cleave DNA As the enzyme to be used, a restriction enzyme is usually used. Specifically, if there are base additions or deletions at the restriction enzyme recognition site, or if there are base insertions or deletions in the DNA fragment produced by the restriction enzyme treatment, the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment V rsl gene, a variant of the Vrsl gene that is striated, a variant of the Vrsl gene that is a six-strain, and a variant of the Vrsl gene that is intermediate between the two and the six-striated .
  • polymorphic sites can be detected as the difference in mobility of the band after electrophoresis by amplifying the portion containing this mutation site by PCR and treating with each restriction enzyme.
  • polymorphic sites can be detected by treating chromosomal DNA with these restriction enzymes, electrophoresis, and then performing Southern blotting using the probe DNA.
  • the restriction enzyme to be used can be appropriately selected according to each mutation site.
  • RNA prepared from test barley can be converted to cDNA using reverse transcriptase, which can then be cleaved with restriction enzymes and then subjected to Southern blotting.
  • this cDNA can be used as a saddle to amplify part or all of the Vrsl gene or Vrsl gene mutant by PCR, cleave it with restriction enzymes, and examine the difference in mobility.
  • the present invention is a method comprising the following steps (a) to (d), wherein the barley is judged to be double-striated when the mobility on the gel matches: I will provide a.
  • the present invention also provides a method comprising the following steps (a) to (d), wherein the barley is determined to be hexagonal when the mobility on the gel matches. To do.
  • the present invention is a method including the following steps (a) to (d), wherein the form is intermediate between the two-row and six-row properties when the mobility on the gel matches. Provide a method to be determined.
  • Examples of such a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE).
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene that is a double streak, a variant of the Vrsl gene that is a streak, a region including the target site of a variant of the Vrs 1 gene that is intermediate between the streak and the hexagonal form of the present invention Amplified by a PCR method using the above primers, etc., and this is electrophoresed in a polyacrylamide gel that gradually increases as the concentration of denaturing agents such as urea moves, and compared with healthy individuals.
  • the DNA fragment becomes single-stranded at a lower denaturant concentration position, and the movement speed becomes extremely slow, so the presence of a polymorphism can be detected by detecting this mobility difference. Can be detected.
  • an allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used.
  • ASO allele specific oligonucleotide hybridization method
  • an oligonucleotide containing a base sequence that is considered to have a polymorphism is prepared and subjected to hybridization with the sample DNA, it is present in the sample DNA that hybridizes with the polymorphic base force different from that of the oligonucleotide. In this case, the efficiency of hybridization is reduced. This can be detected by Southern blotting or a method that uses the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the hybrid gap.
  • Detection by the ribonuclease A mismatch cleavage method is also possible. Specifically, a region containing the target site of the MHC S gene, SEEK1 gene or HCR gene is amplified by PCR, etc. Perform hybridization with labeled RNA prepared in the same manner. Since the hybrid has a single-stranded structure in the part where a different base from the normal type exists, this part is cleaved with ribonuclease A and detected by autoradiography. The presence of a type can be detected.
  • the determination method of the present invention it becomes possible to quickly select a barley that is bi-row, hexa-row, or intermediate between bi-row and hexa-row. That is, the present invention provides a method for selecting two-rowed barley, comprising the steps described in the following (a) and (b).
  • step (b) A step of determining whether or not the barley produced in step (a) is double-stretched by the method described in this specification.
  • the present invention provides a method for selecting hexagonal barley, which includes the following steps (a) and (b).
  • step (b) A step of determining whether or not the barley produced in step (a) is hexagonal by the method described in this specification.
  • the present invention provides a method for selecting barley that is intermediate between two and six strips, comprising the steps described in the following (a) and (b).
  • step (b) A step of determining whether or not the barley produced in step (a) is intermediate between two-row and six-row by the method described in this specification.
  • Non-stripy means “six-striped” or “intermediate”
  • Non-six-striped means “striped or intermediate”
  • Non-intermediate means double or hexagonal.
  • the present invention is a barley identified as two-row, barley identified as six-row, Or, provide a method for early selection of barley that is identified as intermediate between two-row and six-row.
  • “early” refers to a state before heading, for example, preferably a state immediately after germination.
  • barley is fertilized twice, so it is possible to determine the gene using DNA extracted by cutting off a portion of the endosperm before sowing. If the barley is double-rowed, it can be determined by the above-mentioned method to determine whether it is double-rowed, hexagonal, or intermediate between double-rowed and six-rowed.
  • the present invention also relates to a method for screening a test compound.
  • screening method for a test compound including the following steps ( a ) to (c).
  • Vrsl gene or Vr si gene variant transcript in the screening method of the present invention includes a transcript of a Vrsl gene or Vrsl gene variant and a translation product translated from the transcript.
  • the Vrsl gene variant includes a variant of the Vrsl gene that is a double-strand, a variant of the Vrsl gene that is a hexa-strand, and a variant of the Vrsl gene that is intermediate between the streak and the six-step. .
  • test compound in the method of the present invention is not particularly limited, for example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins, peptides, etc., compound libraries, gene live Rally expression product, cell extract, cell culture supernatant, fermentation microorganism product, marine organism extract, plant extract, prokaryotic cell extract, eukaryotic single cell extraction Examples include extracts or animal cell extracts.
  • the above test compound can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • “contact” is performed as follows.
  • the transcript of the Vrsl gene or the mutant of the Vrsl gene has been purified, it can be carried out by adding a test compound to the purified preparation.
  • it if it is a state expressed in a cell or a state expressed in a cell extract, it can be carried out by adding a test compound to the cell culture solution or the cell extract, respectively.
  • the cell in the present invention is not particularly limited, but a plant-derived cell containing barley is preferable.
  • test compound is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell expressing or expressing a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene, or the vector is introduced into the Vrsl gene.
  • it can be performed by adding to a cell extract in which a mutant of the Vrsl gene is expressed.
  • a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the binding between the Vrsl gene or the transcript of the Vrsl gene mutant and the test compound is then detected.
  • the means for detecting or measuring the binding between proteins can be performed, for example, by using a label attached to the protein.
  • the label type include a fluorescent label and a radiolabel.
  • it can also be measured by a known method such as an enzyme two-hybrid method or a measurement method using BIACORE.
  • a test compound that binds to the transcript of the rsl gene or the mutant of the Vrsl gene is then selected.
  • the test compounds selected are compounds for modifying the morphology of barley spikes.
  • a test compound that binds to a transcript of a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene that is double-striated is considered useful for altering the streak-type or spike morphology of a bi-striated barley.
  • the test compound that binds to the transcript of the Vrsl gene variant, which is intermediate between the Vrsl gene variant, which is hexagonal, and the intermediate product of the Vrsl gene It is thought to be useful for modifying the morphology of intermediate barley spikes and increasing resistance to head blight. Barley with modified streak and ear shape can be used for ikebana, for example. It is useful in the field of industrial plants. Alternatively, use the selected test compound as the test compound for the following screening.
  • a screening method for a test compound which comprises the following steps (a) to (c).
  • test compound is brought into contact with cells from which barley has been collected.
  • collected cells refers to any barley cells that are clearly known to have a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • test compound and contact is as described above.
  • the expression level of the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is then measured.
  • the expression level of the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA encoding a transcript of a Vrsl gene or a mutant of the Vrsl gene is extracted according to a standard method, and the Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA as a cage is performed. Measurement of gene transcription levels can be performed. Furthermore, it is also possible to measure the expression level of the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene using DNA array technology.
  • fractions containing transcripts of the Vrsl gene or Vrsl gene variant were collected according to a standard method, and the expression of the transcript of the Vrsl gene or Vrsl gene variant was subjected to electrophoresis such as SDS-PAGE.
  • the level of gene translation can also be measured by detecting by the method.
  • Western blotting is performed using an antibody against the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene, and the expression of the transcript of the Vrsl gene or the variant of the Vrsl gene is detected, thereby translating the gene. It is also possible to measure the level.
  • the antibody used for detecting the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is not particularly limited as long as it is a detectable antibody.
  • a monoclonal antibody and a polyclonal antibody may be used. it can.
  • the antibody can be prepared by methods known to those skilled in the art as described above.
  • the test compound when the expression level of the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene changes compared to when the test compound is not contacted, the test compound is As a compound for modifying the form of Specifically, when the test compound increases the expression of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene that is striated, the test compound strongly suppresses the development of lateral spikelets. If the expression of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene that is striated is reduced, it is considered useful for further development of the lateral spikelet. Barley with a modified form of streak ears can be used, for example, for ikebana and is useful in the field of ornamental plants.
  • a third aspect of the screening method of the present invention is a screening method for a test compound, which includes the following steps (a) to (d).
  • a cell or a cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of the promoter region of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is provided.
  • “functionally linked” means that the expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene. Promoter region of mutant of Vrsl gene The region and the reporter gene are linked. Therefore, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor must bind to the promoter region of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene. Thus, any expression that induces expression of the fusion protein is included in the meaning of “functionally linked”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression is detectable.
  • a CAT gene a lacZ gene, a luciferase gene, a / 3-darc mouth-dase gene commonly used by those skilled in the art. (GUS) and GFP gene.
  • test compound is brought into contact with the cells or the cell extract in the next step.
  • expression level of the reporter gene in the cells or the cell extract is measured.
  • test compound and “contact” is as described above.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the chloramphee-chol acetylene by the gene product.
  • the reporter gene is a lacZ gene
  • the reporter gene by detecting the color development of the pigment compound by the catalytic action of the gene expression product, and when the reporter gene is a luciferase gene, by the catalytic action of the gene expression product
  • the fluorescence of the fluorescent compound and in the case of the ⁇ -darc mouth-dase gene (GUS)
  • the luminescence of Glucuron (ICN) by the catalytic action of the gene expression product or 5-bromo-4-
  • X-Gluc black mouth-3 indolyl-13-Darc mouth
  • the reporter The gene expression level can be measured.
  • the test compound that changes in comparison with the expression level of the reporter gene when the test compound is not contacted is selected.
  • the test compound is downstream of the promoter region of the Vrsl gene or the Vrsl gene that is double-striated.
  • the test compound is considered to be useful for more strongly suppressing the development of side row spikelets.
  • the test compound decreases the expression of the reporter gene bound downstream of the promoter region of the Vrs 1 gene or the Vrsl gene, which is striated, the development of the lateral spikelet becomes larger. It is considered useful. Barley with a modified form of streak ears can be used for ikebana, for example, and is useful in the field of ornamental plants.
  • the present invention is also a method for determining whether or not a test genomic fragment has a target sequence of a protein encoded by a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene, comprising the following (a) and In the case where the protein encoded by the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene expresses a reporter gene that is functionally linked to any test genomic fragment, including the step (b) Provided is a method characterized in that a genomic fragment is determined to be a genomic fragment having a target sequence of a protein encoded by Vrsl gene or a variant of Vrsl gene.
  • a reporter operably linked to a protein encoded by Vrsl gene or a variant of Vrsl gene and an arbitrary genomic fragment contact DNA with gene.
  • “functionally coupled” is as described above. There are no restrictions on the base sequence and length of the genomic fragment.
  • “contact” means that, for example, if the transcript of a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene has been purified, the purified sample and a reporter gene operably linked to an arbitrary genomic fragment are connected. It can be carried out by mixing the contained DNA in a cell extract.
  • reporter gene that is functionally linked to any genomic fragment, as long as the transcript of the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is expressed in the cell or contained in the cell extract. It is also possible to mix DNA.
  • a reporter gene functionally linked to an arbitrary genomic fragment The DNA that you have is one that has been incorporated into a vector that has it expressed.
  • the presence or absence of expression of the reporter gene is measured by the following.
  • the expression of a single reporter gene can also be measured by the method described above depending on the type of the reporter gene.
  • the arbitrary genomic fragment Is a genomic fragment having a target sequence (including but not limited to a promoter sequence, enhancer sequence, etc.) of a protein encoded by the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • a method for determining whether or not a test genomic fragment has a gene whose expression is controlled by a protein encoded by Vrsl gene or a variant of Vrsl gene including the steps of a) and (b), when a gene encoded by a Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene is expressed in a gene present on any test genomic fragment
  • a protein encoded by a Vrsl gene or a Vrsl gene variant is brought into contact with DNA having an arbitrary genomic fragment.
  • contact is as described above.
  • a gene expressed from a genome fragment is a gene whose expression is controlled by a protein encoded by the Vrsl gene or a variant of the Vrsl gene.
  • the present invention also relates to a kit for use in the screening method described above.
  • a kit may include those used in the detection process and measurement process of the screening method described above.
  • a Vrsl gene or a mutant of the Vrsl gene, a probe, a primer, an antibody, a staining solution, etc. required for measuring the expression level of any genomic fragment can be mentioned.
  • distilled water, salt, buffer solution, protein stabilizer, preservative and the like may be contained.
  • a double barley variety, DebreZeit29, and a hexagonal mutant, New Golden M13, are crossed to create a linkage map by creating an F2 population of 464 individuals.
  • “Golden Promise” was crossed with “Azumamugi”, a barley variety that exhibits six-row characteristics, and an F2 population of 1106 individuals was created to create a linkage map ( Komatsuda ⁇ , K. fanno (2004) Comparative hign resolution map of the six -rowed spike locus 1 (vrsl) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73).
  • PCR ⁇ tallying was performed using DNA from the BAC library created with the barley variety Morex.
  • the screening started with a total of 816 384-well plates, ie 313344 BAC clones. First, the cells cultured for each plate were collected and combined, and the BAC pool DNA was extracted by the standard alkaline method. Next, 82 pools of super pool DNA were prepared by collecting 10 pools of pool DNA.
  • a script of the superpool DNA was used. I tried one Jung. That is, 10 pool DNAs constituting the PCR were screened only for the super pool DNA amplified with the DNA as a PCR marker. Each of the E. coli cells in the corresponding 384-well plate was directly screened as a PCR template. E. coli with amplified DNA as a PCR marker was cultured at 37 ° C in LB medium containing 12.5 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • PCR reaction solution (10 ⁇ 1), 0.25 units ExTaq polymerase (Takara, Tokyo, Japan), 0.3 ⁇ M each primer, 200 ⁇ M each dNTPs, 1-4 mM MgCl, and lx PCR buffer [
  • Takara IX Contains 25 mM TAPS (pH 9.3, 25.C), 50 mM KC1, 1 mM 2-mercaptoethanol]. PCR conditions were as follows: first heat at 94 ° C for 3 minutes, then repeat the following reaction 30 times:
  • Reassociation reaction 30 seconds at 50 ° C to 68.5 ° C, depending on the marker
  • BAC DNAs selected with one PCR marker were cleaved with Hindlll, electrophoresed on a 1% agarose gel, fingerprinted and aligned. In order to confirm this alignment, the presence or absence of amplified DNA was confirmed using a PCR marker prepared based on the BAC base sequence. The fact that the PCR marker used here sits on chromosome 2 has been confirmed by the use of a wheat chromosome addition line and high-density linkage map analysis.
  • AFLP1 Barley chromosome walking was performed to create an aligned BAC covering the striatal gene region. Chromosome walking was started simultaneously with AFLP2, a PCR marker that recombined with the streak gene vrsl, and AFLP1, a marker that recombined with vrsl alone. AFLP1 isolated the BAC clone M102J11 GD and below). Even if multiple BACs are screened at once, only the minimum BAC required for BAC alignment is described. In AFLP2, M111L15 and M351N10 were isolated.
  • the base sequence of the M351N10 BAC T7 terminal was determined to create an STS marker (351N10-T7), and when PCR amplification was attempted on other BAC DNA, M102J11 and Ml 11L15! /, Amplification was observed in common, and it became clear that M102J11 and M111L15 partially overlapped.
  • comparison with the linkage map revealed that M102J11 was oriented toward the chromosome centromere and M111L15 was directed toward the terminal side, and vrsl was determined to exist in the terminal direction starting from M102J11. Therefore, chromosomal walking was continued from M111L15 toward the end.
  • the HindI fragment (lllL15-fl-F) of MlllL15 was converted into an STS marker, and M669N11 was isolated by PCR ⁇ cleaning.
  • An STS marker (M669N11-T7) was prepared based on the M669N11 T7 terminal base sequence, and M045M08 and M572D24 were isolated by PCR ⁇ cleaning.
  • the Hindlll fragment (M572D24-fC-R) of M572D24 was converted to an STS marker, and M185K11 was isolated by PCR ⁇ cleaning.
  • the full-length DNA base sequence of M185K11 was determined, an STS marker (E18) was prepared based on the sequence, and M053F18 was isolated by PCR ⁇ cleaning.
  • BAC DNA was extracted from each BAC clone with QIAGEN Large-Construct Kit (QIAGEN GmbH, Hilden Germany). DNA was randomly divided by sonication, size selected by electrophoresis, and ligated into the pUC18 vector. Escherichia coli DH10B And transformed into a shotgun library. Two types of shotgun libraries with average insertion size of S2kb and 5kb were prepared. The end sequences of both ends of 1000 clones per library were determined by the dye-terminator method and analyzed with a single sequencer. A total of 400000 shotgun sequence base calls were made and assembled using the Phred / phrap program (http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html).
  • the assembled base sequences were arranged in the correct order using the base sequence of the BAC cloning site and the base sequences of both ends of the bridge clone.
  • the gap was eliminated by reading the base sequence of the entire bridge clone by primer walking or transposon sequencing.
  • ⁇ 3 ⁇ 4_ sequence was analyzed with Graingenes Blast against Triticeae repeat dataoase (http: ⁇ wheat.Dw.usda.gov/GG2/blast.shtml).
  • the region that does not hit a known repetitive sequence is NCBI nucleotide-nucleotide blast (blastn) against ESTs database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Dlast/ )
  • RiceGAAS http://ncegaas.dna.affix.go.jp/) and GeneMark.hmm (nttp: //opal.biology. gatech.edu/GeneMark/eukhmm.cgi). RiceGAAS simultaneously performs gene prediction and BLASTX search using multiple programs such as GENSCAN, RiceHM M, and MZEF. GeneMark.hmm can predict several eukaryotic ORFs including barley. A similarity search with the predicted protein amino acid sequence was performed by Blastp search.
  • a virtual genome contig of 406,323 bp was obtained by removing the overlapping portion from the entire base sequence of four BACs (M102J11, M111L15, M045M08, M185K11).
  • the small gap of 102J11 did not go away.
  • the reason is that vrsl doesn't exist in this gap and the 406,323 bp bar This is because it is clarified by marker analysis described later that it exists in the Chal Genome Container.
  • the 406,323 bp sequence was found to be similar to the 19 ESTs nucleotide sequence of wheat. Of these, 4 ESTs were confirmed to repeat in the 406,323 bp sequence. Of the remaining 15 ESTs, 12 were repetitive sequences and the power revealed by analysis using the chromosome wheat strains. The other 3 ESTs (E18, E30, E42) are unique sequences. Therefore, these were made genetic markers. That is, when searching for E18, E30, and E42 using GeneMark.hmm, 44 genes were predicted. The majority of these are highly repetitive genomic sequences, and there was only one homeobox gene (tentatively named by the present inventors) that clearly suggested an association with morphogenesis (region 164217-165109). .
  • hex-v and Int-d mutants Forty-one hexastichon (hex-v) and 16 intermedium spike-d (Int-d) mutants induced by 'Bonus', 'Foma' and 'Kristina' force were used.
  • the hex-v mutant has well-developed spikelets in the ears, elongated cocoons, and is very close to the ears of normal hexagonal varieties.
  • Int-d mutants have an intermediate level of spikelet development between the middle and the sixth, and the length of the cocoon varies depending on the mutant strain and is also affected by the environment.
  • Hex-v and Int -d both are vrs 1 alleles.
  • M111L15F84204 (5-GAAAGATGATTGCCAACTACC-3 ') (SEQ ID NO: 68) M111L15R84648 (5-ATAGGGCTTCAAGATCGGCAG -3') (SEQ ID NO: 69) M111L15F84603 (5-ATAGAGGCGACTTTTCCGGAG -3 ') (SEQ ID NO: 70) M111LACGAGA 203 -3 ') (SEQ ID NO: 71) M111L15F85106 (5-CCAGTGTGAGTGTATGCGAGC -3') (SEQ ID NO: 72) M111L15R85696 (5-TCACGATCCCTTCTTTCCCTC -3 ') (SEQ ID NO: 73) M111L15F85545 (5-CCGGTGAAACTGAAGCTACTG -3') SEQ ID NO: 74) M111L15R86124 (5-TCCGAATGAAATGAACTCTGC -3 ') (SEQ ID NO: 75) M111L15
  • deletion region spanned 81 kb (83226-164320) between 351N10-T7 (203-392) force E42 at maximum. This includes the 3 'untranslated region of the homeobox gene.
  • the homeobox gene is the causative gene of the locus that controls streak. It strongly suggests. These deficient mutants are all induced by neutrons, X-rays and gamma rays. On the other hand, as for the Int-d mutant, no defective mutant was found as far as the PCR analysis results were seen.
  • the Int-d mutation is considered to be a mutation that retains some function rather than a complete loss of function because of its phenotype and genetic mode. The results of this experiment are in good agreement with previous findings.
  • the genomic nucleotide sequence including the homeobox gene was compared between the original variety and the mutant (FIGS. 41 to 411).
  • the homeobox gene of the original varieties (three varieties) was strong enough to show no nucleotide sequence variation.
  • the mutant the above 6-deficient lines (hex-v.3, hex- ⁇ .10, hex-vl l, hex- ⁇ .18, hex-v.35, hex-v.41)
  • the homeobox gene deficiency Apart from the homeobox gene deficiency, the most common base substitutions resulting in non-synonymous amino acid substitutions and termination codon formation were observed, followed by many minor base deletions resulting in reading frame shifts. In addition, base substitutions that were thought to result in modification of mRN pricing were also observed. From the above, it was proved that the homeobox gene is the causative gene of the locus that controls the streak.
  • the expression of the homeobox gene was observed in young panicle tissues, but not in the leaf blades (Fig. 5). In the young panicle, 7 lingual expression was observed especially in the awn primordium stage, such as a double ridge stage force of 1 to 5 mm, and the expression level decreased as the developmental stage progressed. A constant amount of the actin gene used as a control was observed regardless of tissue and developmental stage. Thus, the homeobox gene certainly has transcriptional activity and was expressed in the ears before the barley streak was determined, thus demonstrating that it is the causative gene for the streak gene vrs1.
  • Industrial applicability There are two types of barley varieties known as barley varieties and hexagonal varieties.
  • the striation has a great effect on the determination of the number of grains, grain shape and grain size, and directly affects the yield.
  • six-rowed wheat has a high yield because the number of grains is three times that of two-rowed wheat. Therefore, Rokujo barley is useful for feed.
  • Nijo barley has a good grain size and is therefore excellent in germination uniformity in malt production.
  • Nijoomgi today has good production efficiency and is useful for brewing beer exclusively in Japan and Europe. In this way, Rokujoomgi and Nijoomgi have useful uses according to their suitability, economic efficiency, difficulty in obtaining, and the like.
  • the chromosomal location and gene structure of genes involved in the determination of barley streak and ear morphology were provided.
  • the present inventors have found the possibility that the morphology of barley spikes in barley can be altered by introducing the Vrsl gene provided in the present invention or a mutant thereof into barley and controlling its expression. .
  • the shape of the main row and the side row of the ears can be arranged to create a shape suitable for the purpose.
  • the possibility of increasing the resistance to head blight of barley has been found.
  • Barley is distributed as ikebana. Therefore, barley modified to two-rowed, barley modified to six-rowed, and barley modified to intermediate between two-rowed and six-rowed can be used for flower arrangement. Useful as a plant. In particular, barley modified to a trait between two-row and six-row is valuable and useful as a variety.

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Abstract

　本発明によって、オオムギの条性や穂の形態の決定に関与する遺伝子の染色体上の位置および遺伝子の構造が提供された。本発明において提供されるVrs1遺伝子をオオムギに導入し、発現を制御することによって、オオムギの条性や穂の形態を改変し得る可能性が見出された。また、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させうる可能性が見出された。これにより、オオムギの条性や穂の形態を効率的に改変することによって、望みの用途に見合う形質を有するオオムギの作出が可能となった。

Description

明 細 書
ォォムギ条性遺伝子とその利用
技術分野
[0001] 本発明は、ォォムギ条性遺伝子 Vrslおよびその変異体、ならびに該遺伝子を利用 したォォムギの条性および穂の形態を改変する方法に関する。
背景技術
[0002] 世界の重要穀物であるイネやコムギ、ォォムギ、トウモロコシなどはいずれも、その 種子 (胚及び胚乳)を食用とする作物である。このうちォォムギには、ニ条性と六条性 の品種が存在する（図 1)。一つの穂軸に対し 3個の一花小穂を形成し、この 3個の小 穂が全て種子を形成するものを六条ォォムギ、中央の 1個の小穂のみが種子を形成 するものを二条ォォムギと総称されて 、る。六条性とニ条性の違 ヽ（以下「条性」 )は 粒数、粒形、粒大の決定に大きな作用を及ぼすため、収量を直接的に左右する。ま た条性は麦芽生産、醸造、精麦、飼料などォォムギの利用形態を左右する重要形質 である。さらに、条性は赤かび病抵抗性と深く関連することが遺伝的研究により明らか にされている。
[0003] 六条性は単一劣性遺伝子 vrslに支配される形質で、二条ォォムギの優性遺伝子 V rslは側列小穂の発達を抑制する事が明らかになつている（図 1)。し力しその遺伝子 産物については全く明らかにされていない。また異なる穀物種間においては、ゲノム 構造 (すなわち相同な遺伝子の並び）は高度に保存されているものの、条性遺伝子と 相同的な遺伝子の存在は知られておらず、存在するとすればどのような機能を持つ の力も未知であった。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 l : Congfen He, et.al. Genome 47: 1122-1129 (2004)
非特許文献 2： Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of th e six-rowed spike locus 1 (vrsl) in several populations of barley, Hordeum vulgare L . Hereditas 141: 68-73)
特許文献 1：特開 2004-313062 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課 題は、ォォムギの条性遺伝子を単離 ·同定すること、ならびに該遺伝子を利用したォ ォムギの条性および穂の形態を改変する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、ォォムギの条性決定に関する遺伝子を提供する。六条性は単一劣性遺 伝子 vrslに支配される形質で、二条ォォムギの優性遺伝子 Vrslは側列小穂の発達 を抑制することが知られている。し力しその遺伝子産物については全く明らかにされ ていなカゝつた。本発明者らは、その存在領域を解明し、単一の遺伝子として単離する ことを試みた。
[0006] 本発明者らはまず、条性遺伝子 vrslの連鎖地図の作成を行った。そして、目的遺 伝子と連鎖する PCRマーカーを用いた BACライブラリーのスクリーニング、 PCRマーカ 一を用いた染色体歩行によって、条性遺伝子領域をカバーする整列化 BACを作成 した。結果、条性遺伝子 vrslは、 AFLP1から M053F18-T7に渡るマーカーと連鎖して V、る可能性が高 、ことが突き止められた。
[0007] 次に本発明者らは、ニ条性品種の突然変異体を利用し、条性を支配する遺伝子候 補領域の欠損を調べた。条性を支配する遺伝子候補領域の塩基配列を、原品種と 突然変異体の間で比較したところ、原品種には塩基配列の変異が全く認められなか つたのに対し、突然変異体ではアミノ酸非同義置換や終止コドン形成をもたらす塩基 置換が多数認められた。このことから、候補領域が目的遺伝子であることが証明され た。すなわち、本発明は、ォォムギの条性決定に関与する遺伝子に関し、具体的に は以下の発明を提供するものである。
〔1〕以下（a)〜（e)のいずれかに記載の DNA;
(a)配列番号: 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA、
(b)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA、
(c)配列番号： 3に記載のアミノ酸配列にお 、て 1もしくは複数のアミノ酸が人工的に 置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする DNA、
(d)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNA、
(e)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNAであって、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNA、
〔2〕以下（a)〜（d)の!、ずれかに記載の DNA;
(a)〔1〕に記載の DNAの転写産物と相補的な RNAを発現する DNA、
(b)〔1〕に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA を発現する DNA、
(c)〔1〕に記載の DNAの発現を共抑制効果により阻害する RNAを発現する DNA、
(d)〔1〕に記載の DNAの転写産物を特異的に切断する RNAi活性を有する RNAを発 現する DNA、
〔3〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAを含むベクター、
〔4〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞、
〔5〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAが導入された形質転換ォォムギ細胞、
〔6〕 [5]に記載の形質転換ォォムギ細胞を含む形質転換ォォムギ、
〔7〕〔6〕に記載の形質転換ォォムギの子孫またはクローンである、形質転換ォォムギ
〔8〕〔6〕または〔7〕に記載の形質転換ォォムギの繁殖材料、
〔9〕〔6〕または〔7〕に記載の形質転換ォォムギの製造方法であって、〔1〕または〔2〕 に記載の DNAをォォムギ細胞に導入し、該ォォムギ細胞力 ォォムギを再生させる 工程を含む方法、
〔10〕〔1〕（a)、（b)または (e)に記載の DNAをニ条性ではないォォムギの細胞内で発 現させる工程を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法、
〔11〕〔1〕（c)または (d)に記載の DNAを二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程 を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法、
〔12〕〔2〕に記載の DNAを二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォ ムギの条性または穂の形態を改変する方法、
〔13〕〔1〕または〔2〕に記載の DNAをォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォ ォムギに赤かび病抵抗性を付与する方法、
〔14〕〔1〕または〔2〕に記載の DNA、または〔3〕に記載のベクターのいずれ力 1つを含 む、ォォムギの赤かび病抵抗性を増カロさせる薬剤、
〔15〕〔1〕に記載の DNAの部分配列からなる DNA、
〔 16〕配列番号: 4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
〔17〕〔1〕に記載の DNAの全部または一部を増幅するプライマーセット、
〔18〕以下（a)〜（r)のいずれかに示す、少なくとも 1つのプライマーセット；
(a)配列番号： 30に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 31に記載の塩基 配列からなる DNA、
(b)配列番号： 32に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 33に記載の塩基 配列からなる DNA、
(c)配列番号： 34に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 35に記載の塩基 配列からなる DNA、
(d)配列番号： 36に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 37に記載の塩基 配列からなる DNA、
(e)配列番号： 38に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 39に記載の塩基 配列からなる DNA、
(f)配列番号： 40に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 41に記載の塩基 配列からなる DNA、
(g)配列番号： 42に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 43に記載の塩基 配列からなる DNA、
(h)配列番号： 44に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 45に記載の塩基 配列からなる DNA、
(i)配列番号： 46に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 47に記載の塩基 配列からなる DNA、
(j)配列番号： 48に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 49に記載の塩基 配列からなる DNA、
(k)配列番号： 50に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 51に記載の塩基 配列からなる DNA、
(1)配列番号： 52に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 53に記載の塩基 配列からなる DNA、
(m)配列番号： 54に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 55に記載の塩基 配列からなる DNA、
(n)配列番号： 56に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 57に記載の塩基 配列からなる DNA、
(o)配列番号： 58に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 59に記載の塩基 配列からなる DNA、
(P)配列番号： 60に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 61に記載の塩基 配列からなる DNA、
(q)配列番号： 62に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 63に記載の塩基 配列からなる DNA、
(r)配列番号： 64に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 65に記載の塩基 配列からなる DNA、
〔19〕〔1〕に記載の DNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも 15の連続する塩 基を含む DNA、
〔20〕以下の（a)〜（c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致す るときに、ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から〔1〕に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNA断片の分子量または塩基配列を、〔1〕（a)、（b)または (e)に記載の DNAのそれと比較する工程、
〔21〕以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致すると きに、ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、 (b)該 DNA試料から〔1〕に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した二本鎖の DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(d)分離した二本鎖 DNAのゲル上での移動度を、〔1〕（a)、（b)または (e)に記載の D NAのそれと比較する工程、
[22]以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致すると きに、ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から〔1〕に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e)分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を、〔1〕（a)、（b)または（e)に記載の D NAのそれと比較する工程、
〔23〕以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致すると きに、ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から〔1〕に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
(d)分離した DNAのゲル上での移動度と、〔1〕（a)、（b)または（e)に記載の DNAのそ れと比較する工程、
〔24〕以下の (a)および (b)の工程を含む、二条性ォォムギを選抜する方法；
(a)二条性ォォムギと、ニ条性ではないまたは条性が不明であるォォムギとが交配さ れたォォムギを作製する工程、
(b)〔20〕〜〔23〕のいずれかに記載の方法により、工程 (a)で作製されたォォムギが ニ条性であるか否かを判定する工程、
〔25〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)〔1〕に記載の DNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
(b)〔1〕に記載の DNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)〔1〕に記載の DNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程、 〔26〕以下の（a)〜（c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)ォォムギカゝら採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
(b)〔1〕に記載の DNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを 変化させた被検化合物を選択する工程、
[27]以下の（a)〜（d)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)〔1〕に記載の DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結 合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程、
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを変化させた被検化合物を選択する工程、
〔28〕被検ゲノム断片が〔1〕に記載の DNAによりコードされるタンパク質の標的配列を 有する力否かを判定する方法であって、以下の（a)および (b)の工程を含み、〔1〕に 記載の DNAによりコードされるタンパク質力 被検ゲノム断片と機能的に結合したレポ 一ター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔1〕に記載の DNAによりコ ードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴と する方法；
(a)細胞または細胞抽出液において、〔1〕に記載の DNAによりコードされるタンパク 質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有する DNAを接触させるェ 程、
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程、
〔29〕被検ゲノム断片が〔1〕に記載の DNAによりコードされるタンパク質によって発現 制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の（a)および (b)の 工程を含み、〔1〕に記載の DNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片上に 存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔1〕に記載の DNAにより コードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特 徴とする方法；
(a)細胞または細胞抽出液において、〔1〕に記載の DNAによりコードされるタンパク 質と、被検ゲノム断片を含む DNAを接触させる工程、
(b)被検ゲノム断片力ゝらの遺伝子発現の有無を測定する工程、
〔30〕〔25〕〜〔29〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 図面の簡単な説明
[図 1]ニ条性 (a)および六条性 (b)のォォムギの穂を示す写真である。ニ条性の穂は 平面的だが六条性の穂は立体的である。ニ条性 (c)および六条性 (d)のォォムギの 三小穂を示す写真である。ニ条性の側列小穂において内'外穎、雄蕊、雌蕊は分ィ匕 するが十分発達せず、とくに雌蕊は完全に退ィ匕するため稔性を持たない。六条性の 穂では三小穂とも稔実する。
[図 2]条性遺伝子 vrslをふくむォォムギ BACコンテイダ作成を示す図である。イネ（上 段）とォォムギ（中段）の分子連鎖地図は高!、相同性を示す。ォォムギ BACコンティ グを下段に示す。 vrslの候補遺伝子が予測された (下段中央部、短い矢印)。
[図 3-1]突然変異体の PCR解析結果 (欠損の検出)を示す図である。
[図 3- 2]図 3— 1の続きを示す図である。
[図 4-1]突然変異体を使用した表現型と遺伝子型との相関を示す図である。 (a) Comp lete deletion^ (b) Deletion 616-823 witn a segmental 26 bp duplication and inversion 、 (c) One nucleotide after Exon 1、 (d) Two nucleotide before start of Exon 2、 (e) Six nucleotide before start of Exon 3、 FS: Frameshift。本図の見方は以下の通りである。 例えば hex-v.42の変異体においては、 107番目の Argが Leuに置換されていることを 説明している。またこの時、塩基が「cgc」から「ctc」に置換されていることを説明してい る。さらに、この置換は、 Exon2の Homeodomainにおいて起こっていることを説明して いる。他の変異体につても同様である。
[図 4- 2]図 4 1の続きを示す図である。
[図 4- 3]図 4 2の続きを示す図である。
[図 4- 4]図 4 - 3の続きを示す図である。
[図 4- 5]図 4 4の続きを示す図である。 [図 4- 6]図 4 5の続きを示す図である。
[図 4- 7]図 4 6の続きを示す図である。
[図 4- 8]図 4 7の続きを示す図である。
[図 4- 9]図 4 8の続きを示す図である。
[図 4- 10]図 4 - 9の続きを示す図である。
[図 4- 11]図 4— 10の続きを示す図である。
[図 5]vrsl遺伝子の発現解析結果を示す写真である。幼穂では発現が見られるが、 葉では発現しない。ニ条品種 (Κ, B)、六条品種 (A)いずれにも転写産物が認めら れるが、六条品種には読み枠にずれが生じている。 Hはニ条品種 (B)から作成した 六条性突然変異体で、遺伝子を含む領域に大規模な欠損があるため、転写産物は 全く認められない。ニ条品種は機能のある遺伝子 Vrslを持ち、ニ条品種間にはァミノ 酸配列レベルで変異が全く認められな 、。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明は、ォォムギにニ条性の形質を付与する Vrsl遺伝子、ニ条性の形質を付与 する Vrsl遺伝子の変異体、六条性の形質を付与する Vrsl遺伝子の変異体、および、 ニ条性と六条性の中間性の形質を付与する Vrsl遺伝子の変異体を提供する (表 1)
[0010] [表 1] 遺伝子の本明細書 左記の植物 左記の遺伝子を有する植物名
における名称 の形質
Vrsl遺伝子 Bonus, Foma, Kr i st i na
ニ条性の形質に関
ニ条性 与する Vrsl 遺伝 Debre Ze i t、 0UH602
子の変異体
六条性の形質に関 表 1、 3において hex-vとして記載された 32個の突然変異
与する Vrsl 遺伝 系統、 Natsuda i kon Mugに Morex、 AZ、 Soren Oomugi 193 六条性 子の変異体 29、 Caveda、 D i ssa、 Hayak i so 2、 Ar l i ngton Awn l ess.
ニ条性と六条性の
ニ条性と六 中間性の形質に関 表 2、 3において I nt- dとして記載された 15個の突然変異
条性の中間 与する Vrsl 遺伝 系統、 P 1284755、 0UH743
性 子の変異体 [0011] 本発明の Vrsl遺伝子には、
(a)配列番号: 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA、
(b)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA、
が含まれる。
また、ォォムギにニ条性の形質を付与する Vrsl遺伝子の変異体 (以下、本明細書 において、「ニ条性である Vrsl遺伝子の変異体」と表記する場合あり）には、
(e)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNAであって、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNA、
が含まれる。
[0012] 本発明においてニ条性の形質 (以下、本明細書において、単に「ニ条性」と表記す る場合あり）とは、側列小穂が発達しない穂を持つ穂の形質をいう。具体例として図 3 1の品種 Bonus、 Foma、 Kristina (いずれも配列番号： 1に記載の塩基配列を含む） が該当する。
[0013] 本発明においては、遺伝子が配列番号： 1または 2に記載の塩基配列と完全には同 一ではな!/ヽ塩基配列を有する場合でも、同一ではな!/ヽ程度がその遺伝子の機能を 大きく変えるものでない場合には、該遺伝子がニ条性の形質をあらわす場合がある。 例えば、このような形質をあらわすォォムギの一例としては、表 3および図 4に記載の Debre Zeitや OUH602が挙げられる。 Debre Zeitが有する条性決定遺伝子は、配列 番号： 1に記載の塩基配列において、 694番目の Aが Gに、 873番目の Tが Gに、 1446 番目の Aが Gに変異している。このように本発明においては、配列番号： 1または 2に記 載の塩基配列力もなる DNAとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするォォムギ由 来の DNAであって、配列番号: 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機 能を有するタンパク質をコードする DNAもまた、ニ条性の形質に関与する遺伝子に 含まれる。なお本発明においては、上記「同等の機能」には、 Vrslと同一の機能に加 えて Vrsl遺伝子の類似の機能も含まれる。
[0014] また本発明は、ォォムギに六条性の形質を付与する Vrsl遺伝子の変異体 (以下、 本明細書において、「六条性である Vrsl遺伝子の変異体」と表記する場合あり）を提 供する。このような変異体としては、
(c)配列番号： 3に記載のアミノ酸配列にお 、て 1もしくは複数のアミノ酸が人工的に 置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする DNA、
(d)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNA、
が含まれる。
[0015] 上記ォォムギに六条性の形質を付与する Vrsl遺伝子の変異体としては、表 2およ び図 4において、例えば hex- v.3、 hex- ν.10、 hex- v. l l、 hex- ν.18、 hex- v.35、 hex- v.4 1として示されているように、配列番号： 1の塩基配列において、 1番目の塩基から 2147 番目の塩基が欠失した塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、図 4の hex-vと して記載された 32個の突然変異系統や Natsudaikon Mugi、 Morex、 AZ、 Soren Oomu gi 19329、 Cavedaゝ Dissaゝ Hayakiso 2、 Arlington Awnless、などの品種も、六条性の 形質を有する。 hex-vで始まる変異体を有するォォムギは、芒伸長、内穎外穎肥大、 種子稔実等いずれの形質も発達程度が高い傾向を有する。これらの変異体におい ては、それぞれの DNAの変異がアミノ酸配列の変化にも反映され、六条性の形質へ の変化をもたらす。本発明において六条性の形質 (以下、本明細書において、単に「 六条性」と表記する場合あり）とは、側列小穂を主列小穂並に発達させた穂の形質を いう。
[0016] また本発明は、ォォムギにニ条性と六条性の中間性の形質を付与する Vrsl遺伝子 の変異体 (以下、本明細書において、「中間性である Vrsl遺伝子の変異体」と表記す る場合あり)提供する。このような変異体としては、
(c)配列番号： 3に記載のアミノ酸配列にお 、て 1もしくは複数のアミノ酸が人工的に 置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする DNA、
(d)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNA、
が含まれる。 [0017] 上記ォォムギにニ条性と六条性の中間性の形質を付与する Vrslの変異体としては 、表 2および図 4に示されている変異体のうち Int-dとして記載された 15個の突然変異 系統が挙げられる。 Int-dで始まる変異体は、芒伸長、内穎外穎肥大、種子稔実等い ずれの形質も発達程度が低い傾向を有する。また、図 4に記載された PI284755、 OU H743などの自然に存在する系統もまた、ォォムギにニ条性と六条性の中間性の形 質を付与する Vrslの変異体に該当する。これらの変異体においては、それぞれの D NA変異がアミノ酸配列の変化にも反映され、条性の変化をもたらす。本発明におい てニ条性と六条性の中間性の形質 (以下、本明細書において、単に「中間性」と表記 する場合あり）とは、側列小穂を部分的に発達させてニ条性と六条性の中間性の穂 を持つ形質をいう。
[0018] ニ条性と六条性の中間性の形質とは、さらに具体的には以下の形質を含む。すな わち、二条性ォォムギにおいては側列小穂が芒が全く伸長しないのに対し、ニ条性 から作出された変異体 (ニ条性と六条性の中間性の形質を有する変異体）にお 、て は、側列外穎の芒が伸長する。この伸長の程度は、先端がトゲのようにとんがるだけ でほとんど伸長しないものから、よく伸長して主列と同等程度にまで達し、穂の外見 上通常の六条性品種と遜色ないものまで、いわば連続的な変異を示す。また、ニ条 性の側列小穂の内穎外穎は肥大せず主列小穂に比べて著しく小さいのに対して、 ニ条性から作出された変異体 (ニ条性と六条性の中間性の形質を有する変異体)の 小穂の内穎外穎が肥大する。この肥大の程度は、ごくわずかなもの、すなわちニ条 性にきわめて近いものから、よく発達して通常の六条性品種と遜色ないものまで、い わば連続的な変異を示す。ニ条性品種の側列小穂は全く種子稔性を持たないのに 対し、ニ条性から作出された変異体 (ニ条性と六条性の中間性の形質を有する変異 体)の側列小穂は、全く種子稔性を持たないもの力 数十パーセントの種子が稔実 するものまで、連続的な変異を示す。このように、変異による影響を受ける代表的な 形質としては、側列小穂における芒伸長、内穎外穎肥大、種子稔実などが挙げられ る。しかし本願の条性遺伝子は側列小穂の微細な器官のサイズを全体的に制御する ため、変異によって影響を受ける形質はこれらに限られない。
[0019] なお、本明細書にお!、ては、ニ条性である Vrsl遺伝子の変異体、六条性である Vrs 1遺伝子の変異体、ニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝子の変異体を「Vrsl遺 伝子の変異体」と総称する。
[表 2]
Figure imgf000015_0001
表 3]
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0003
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[0022] 表 2の例えば Mutant lnt- d.12において、 Event at DNAが「1049 G to A」とあるのは 、「lnt- d.12という変異体では、配列番号： 1の塩基配列の 1049番目の塩基が Gから A に置換されている」ことを意味する。ここで、配列番号： 1の塩基配列の 1049番目の塩 基は、配列番号: 2の塩基配列の 406番目の塩基に相当する。また、この塩基の変異 の結果、配列番号: 3のアミノ酸配列の 85番目の Arg力 ¾isに置換される。同様に、表 2 の例えば Mutant hex-v.42の Event at DNAが「1115 G to T」とあるのは、「hex-v.42と いう変異体では、配列番号： 1の塩基配列の 1115番目の塩基配列が G力 Tに置換さ れている」ことを意味する。ここで、配列番号： 1の塩基配列の 1115番目の塩基は、配 列番号: 2の塩基配列の 472番目の塩基に相当する。また、この塩基の変異の結果、 配列番号： 3のアミノ酸配列の 107番目の Argが Leuに置換される。表 3についても、表 2 と同様に、各変異体について、配列番号： 1の塩基配列における変異部位とそれに対 応するアミノ酸の置換が記載されている。当業者であれば、これらの表を適宜参酌す ることによって、望みの変異体を作出することが可能である。なお、本発明の Vrsl遺 伝子の変異体は、 Vrsl遺伝子において塩基の欠失、フレームシフト、終止コドンの出 現等様々な配列変化が生じた変異体である。
[0023] ォォムギは生け花として流通している。従って、ニ条性に改変されたォォムギ、六 条性に改変されたォォムギ、ニ条性と六条性の中間性に改変されたォォムギは生け 花に供することが可能であり、観賞用の植物として有用である。特に、ニ条性と六条 性の中間性に改変されたォォムギは変種としての価値が高い。本発明の Vrsl遺伝子 または Vrsl遺伝子の変異体を利用し穂の主列 '側列のバランスをアレンジすることに よって、目的にあった形を作り出すことが可能である。
[0024] 本発明の「Vrsl遺伝子」は、「Vrslタンパク質」をコードしうるものであれば、その形 態に特に制限はなぐ「Vrsl遺伝子」には cDNAの他、ゲノム DNA、化学合成 DNAな ども含まれる。また Vrsl遺伝子は、 Vrslタンパク質をコードするものであれば、遺伝暗 号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。一方、本発明の Vrsl遺 伝子の変異体もまた、タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限は なぐ cDNAの他、ゲノム DNA、化学合成 DNAなども含まれる。
[0025] ゲノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが 可能である。ゲノム DNAは、例えば、植物力もゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラ リー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用できる） を作成し、これを展開して、 Vrsl遺伝子 (例えば、配列番号： 1または 2に記載の DNA) または Vrsl遺伝子の変異体を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼ ーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製することが可能 である。また、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体に特異的なプライマーを作成 し、これを利用した PCRを行うことによって調製することも可能である。また、 cDNAは、 例えば、植物力も抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ZAP等のベクター に挿入して cDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイ ブリダィゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより、また、 PC Rを行うことにより調製することが可能である。
[0026] Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体を単離するための当業者によく知られた方 法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biolo gy, Vol. 98, 503, 1975)やポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術（Saiki, R. K., et al. Scie nce, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988) が挙げられる。即ち、当業者にとっては、例えば、配列番号：1または 2に記載の塩基 配列を含む DNAもしくはその一部をプローブとして、また配列番号： 1または 2に記載 の塩基配列を含む DNAに特異的にノ、イブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライマ 一として、ォォムギカゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体を単離することは通 常行いうることである。
[0027] このような Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体をコードする DNAを単離するため には、通常ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィゼーシヨン反応を行なう。 Vrsl遺伝 子または Vrsl遺伝子の変異体をコードする DNAを単離するためのストリンジ ントな ノ、イブリダィゼーシヨン条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を 示せば、 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50%ホルムアミド、 4 X SSC、 50mM He pes pH7.0、 10 Xデンハルト溶液、 20 g/ml変性サケ精子 DNAを含むハイブリダィゼ ーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、標識したプロ一 ブを添カ卩し、 42°Cでー晚保温することによりハイブリダィゼーシヨンを行う。その後の 洗浄における洗浄液および温度条件は、「lxSSC、 0.1% SDS、 37°C」程度で、より厳し い条件としては「0.5xSSC、 0.1% SDS、 42°C」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xS SC、 0.1% SDS、 65°C」程度で実施することができる。このようにハイブリダィゼーシヨン の洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有する DNAの単離を期 待しうる。但し、上記 SSC、 SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業 者であれば、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーを決定する上記若しくは他 の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダィゼーシヨン反応時間な ど）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジエンシーを実現することが 可能である。単離された DNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上 、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、 95%、 96%、 97%、 98% 、 99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、 BLASTN (核酸レベル）や B LASTX (アミノ酸レベル）のプログラム (Altschul et al. J. Mol. Biol, 215: 403-410, 19 90)を利用して決定することができる。該プログラムは、 Karlin及び Altschulによるアル ゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993)に基づいている。 BLASTNによって塩基配列を解 析する場合には、パラメータ一は例えば score = 100、 wordlength =12とする。また、 B LASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score = 50 、 wordlength = 3とする。また、 Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解 析する場合は、 Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)に記載されてい るように行うことができる。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プ ログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公 知である。
[0028] また、本発明においては、野生のォォムギに中性子線、 X線、ガンマ線等の電磁波 を照射し Vrsl遺伝子に突然変異を誘発することによって、 Vrsl遺伝子の変異体を得 ることち可會である。
[0029] 本発明においてォォムギの種は特に限定されるものではなぐォォムギ属に含まれ るものであればどのような種であってもよい。また、栽培品種と野生ォォムギの交配' 交雑品種であってもよい。野生ォォムギとしては、これに限定されるものではないが、 例えば Hordeum vukgare ssp. Spontaneumが挙げられる。また栽培種としては、これ に限定されるものではないが、例えば Hordeum vukgare ssp. Vulgareが挙げられる。
[0030] また本発明は、ォォムギの内因性の Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発 現を抑制するために用いる DNAであって、
(a) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と相補的な RNAをコードする DNA、
(b) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物を特異的に開裂するリボザィ ム活性を有する RNAをコードする DNA、
(c) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発現を共抑制効果により阻害する RN Aをコードする DNA、
(d) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物を特異的に切断する RNAi活 性を有する RNAをコードする DNA、
を提供する。
[0031] これらの DNAにより、ォォムギの条性または穂の形態を改変することが可能である。
一例としては、二条性ォォムギの内因性の Vrs 1遺伝子の発現を抑制することによつ て、該ォォムギのニ条性としての形質や穂の形態を改変することが可能である。ォォ ムギの条性ゃ穂の形態を改変することは、望みの形質を有するォォムギを作出する 際に有用である。条性ゃ穂の形態が改変されたォォムギは、たとえば生け花などに 供することが出来るため、観賞用植物の分野において有用である。
[0032] Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発現を抑制するォォムギには特に制限 はなぐ穂の形態を改変させた 、所望のォォムギを用いることができる。
[0033] 本明細書における「Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発現を抑制」には、 遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発 現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
[0034] 「Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発現を抑制するために用いる DNA」の 一つの態様は、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体と相補的なアンチセンス RN Aをコードする DNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発 現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物にお!、てアンチセン ス効果を発揮することにより、初めて実証された (Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンス RNAの 発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており (Krol et. al, Natur e 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立 している。
[0035] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数 の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼに よって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑 制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェキ ソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成 部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリッド形成によ る核力 細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド 形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による 翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻 訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド 鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成によ る遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を 阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する (平島および井上「新生化学実験講座 2核 酸 IV遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編,東京化学同人， pp.319-347, 1993)。
[0036] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発 現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域 に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。 しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このよう に、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DN Aも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DN Aは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを 含む配列が連結される。
[0037] アンチセンス DNAは、例えば、配列番号： 1または 2に記載の DNAの配列情報を基 にホスホロチォネート法（Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988)などにより 調製することが可能である。調製された DNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質 転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の 転写産物と相補的な配列であることが好ま 、が、遺伝子の発現を有効に阻害でき る限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする遺伝子の転写 産物に対して好ましくは 90%以上（例えば、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%以上）の相補性 を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには 、アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上 であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの 長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2.5kbよりも短!、。
[0038] 内因性の Vrsl遺伝子の発現の抑制は、リボザィムをコードする DNAを利用して行う ことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザィム には種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィ ムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設計が可能とな つた。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのように 4 00ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれ る 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある (小泉誠および大塚栄子、蛋 白質核酸酵素， 35: 2191, 1990)。
[0039] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位 の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている (Koizumi et. al.， FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA配列と相補 的になるように設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制 限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である (Koizumi et. al., FEBS L ett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990、 Koiz umi et. al, Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。
[0040] また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボ ザィムは、例えばタバコリングスポットゥイノレスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出さ れる (Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断を 起こすように設計できることが示されている (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 1 9: 6751, 1992,及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。
[0041] 標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリ フラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配 列に連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が 付加されていると、リボザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写 されたリボザィムを含む RNA力 リボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザ ィム部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを 配置させることも可能である（Taira et. al.， Protein Eng. 3: 733, 1990、 Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、 Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、 Taira et. al, Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。
[0042] また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断で きるようにして、より効果を高めることもできる (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺伝 子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
[0043] 内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配 列を有する DNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」〖こよっても達成されうる。「 共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝 子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両 方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、 植物においてはしばしば観察される (Curr. Biol. 7: R793, 1997、 Curr. Biol. 6: 810, 1 996)。
[0044] 例えば、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体が共抑制された植物体を得るため には、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体と同一若しくはこれらと類似した配列を 有する DNAを発現できるように作製したベクター DNAを目的の植物へ形質転換し、 得られた植物体から Vrslまたは Vrslの変異体の機能が抑制された形質を有する植 物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必 要はないが、少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上（ 例えば、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%以上）の配列の同一性を有する。
[0045] さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネ ガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによつても達成することが できる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させること によって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させ る機能を有する遺伝子のことを ヽぅ。
[0046] 「Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の発現を抑制するために用いる DNA」の 他の一つの態様は、内因性の Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と 相補的な dsRNA (二重鎖 RNA)をコードする DNAである。標的遺伝子配列と同一もし くは類似した配列を有する dsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝 子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、 RNAi (RNA干渉、 RNA in terference)と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約 40〜数百塩基対の d sRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー (Dicer)と呼ばれる RNaselll様 のヌクレアーゼカ SATP存在下で、 dsRNAを 3'末端力 約 21〜23塩基対ずつ切り出し、 siRNA (short interference RNA)を生じる。この siRNAに特異的なタンパク質が結合し て、ヌクレアーゼ複合体（RISC : RNA- induced silencing complex)が形成される。この 複合体は siRNAと同じ配列を認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNA の中央部で標的遺伝子の転写産物 (mRNA)を切断する。また、この経路とは別に siR NAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ (RsRP)のプライ マーとして作用し、 dsRNAが合成される。この dsRNAが再びダイサ一の基質となって、 新たな siRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられて 、る。
[0047] RNAiは当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genet ic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806 -811, 1998)、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジヨウバエ、原生 動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silenc ing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、 Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、 Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Po st— transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 1 10-119 (2001)、 Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. N at Struct Biol. 8, 746-750 (2001))。これら生物では、実際に外来より dsRNAを導入 することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さら〖こはノックアウト個 体を創生する方法としても利用されつつある。
[0048] RNAiの登場当初は、 dsRNAはある程度の長さ (40塩基)以上でなければ効果がない と考えられて 、たが、米ロックフェラ一大の Tuschlらは 21塩基対前後の単鎖 dsRNA(si RNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞にお!、ても PKRによる抗ウィルス反応を起 こさず、 RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001))、 RNA iは分ィ匕したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めること になった。
[0049] 本発明の DNAは、標的遺伝子の転写産物（mRNA)の!、ずれかの領域に対するァ ンチセンス RNAをコードしたアンチセンスコード DNAと、前記 mRNAの!ヽずれかの領 域のセンス RNAをコードしたセンスコード DNAを含み、前記アンチセンスコード DNA および前記センスコード DNAより前記アンチセンス RNAおよび前記センス RNAを発現 させることができる。また、これらのアンチセンス RNAおよびセンス RNAより dsRNAを作 成することもできる。本発明における標的配列は、標的配列と同一もしくは類似した 配列を有する dsRNAを細胞内に導入した結果 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異 体の発現が抑制されるものであれば特に制限されない。標的配列の一例としては、 V rsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の 3'非翻訳領域配列が挙げられる。
[0050] 本発明の dsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同 一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクター 力 それぞれアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同一 のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、アンチセン スコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNAを 発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現 カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿 人すること〖こより構成することができる。 [0051] また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスコード DNAとセンスコード DNAとを 逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖 DNA (siRNAコード D NA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンス RNA、センス RNAとを発 現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センス RNA、アンチ センス RNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖 (ァ ンチセンス RNAコード鎖、センス RNAコード鎖）の 3'末端にターミネータ一をそれぞれ 備えることが好ましい。このターミネータ一は、 A (アデニン)塩基を 4つ以上連続させ た配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムで は、二つのプロモータの種類は異なって!/、ることが好まし!/、。
[0052] また、異なるベクター力もアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、 例えば、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系 のような短い RNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット 、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持さ せること〖こより構成することができる。
[0053] RNAiにお!/、ては、 dsRNAとして siRNAが使用されたものであってもよ!、。「siRNA」は 、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖力もなる二重鎖 RNAを意味し、 Tuschlら（前掲 )により報告された全長 21〜23塩基対に限定されるものではなぐ毒性を示さない範 囲の長さであれば特に限定はなぐ例えば、 15〜49塩基対と、好適には 15〜35塩基 対と、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現される siRNA が転写され最終的な二重鎖 RNA部分の長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 1 5〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。
[0054] 本発明の DNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列 (イン トロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランド RNA(self-comp lementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A., et al. Natur e, 407: 319, 2000、 Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001、 Piccin, A. et al. Nucl eic Acids Res. 29:E55, 2001)を用いることもできる。
[0055] RNAiに用いる DNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70 %以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上（例えば、 95%、 96%、 97%、 98 %、 99%以上）の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決 定できる。
[0056] dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているも のに限らず、ミスマッチ (対応する塩基が相補的でない）、バルジ (一方の鎖に対応す る塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、 dsR NAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両 方が含まれていてもよい。
[0057] また本発明は、 Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑 制する DNAのいずれか 1つを含むベクター、形質転換細胞、ならびに形質転換ォォ ムギ細胞を提供する。
[0058] 上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（ 例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue)等で大量に増幅させ大量調製するため に、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺 伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラ ムフヱ-コールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限はない
。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pC R-Script等が挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場合 、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7等が挙げられる。 Vrsl遺 伝子または Vrsl遺伝子の変異体から生成されるタンパク質を生産する目的において ベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとし ては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅される ような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blue等の大腸 菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 1 acZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544-546； FASEB J. (1992) 6, 2422-24 27)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041- 1043 )、または T7プロモ 一ター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクター の他に pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製）、「QIAexpress system] (キアゲン社製）、 pE GFP、または pET等が挙げられる。
[0059] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0060] 大腸菌以外にも、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体から生成されるタンパク 質を製造するためのベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例え ば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF— BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p 5322)、 pEF、 pCDM8 )、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac- to- BAC bacul ovairus expression system」（ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現べクタ 一（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw )、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発 現ベクター（例えば、「pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、 pNVll、 SP-Q01 ；)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 PPL608、 pKTH50)等が挙げられる。
[0061] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーター等を持っていること が不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオマ イシン、 G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい 。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOP13等が挙げられる。本発明の DNAの細胞への導入は、当業者 においては、公知の方法、例えば電気穿孔法 (エレクト口ポーレーシヨン法)などによ り実施することができる。
[0062] さらに本発明は、 Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を 抑制する DNAが導入された形質転換ォォムギ、該形質転換ォォムギの子孫またはク ローンである形質転換ォォムギ、該形質転換ォォムギの繁殖材料を提供する。また、 上記形質転換ォォムギとその繁殖材料の製造方法を提供する。上記の遺伝子が導 入された結果、ニ条性の形質を有する形質転換ォォムギは、例えばビール醸造に有 用である。また、六条性の形質を有する形質転換ォォムギは飼料として有用である。 さらに、ニ条性、六条性、またはニ条性と六条性の中間性の形質を有する形質転換 ォォムギは、たとえば生け花などに供することが出来、観賞用植物の分野において 有用である。ここで、 Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現 を抑制する DNAとは、上述の通りである。
Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑制する DNAの 植物細胞への導入は、上記の方法によって行うことが可能である。
[0063] ォォムギの再生は、当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et. al, Plan t Physiol. 100: 1503-1507, 1995)。例えば、形質転換植物体を作出する手法につい ては、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させ る方法 (Datta et. ai., In uene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) PP66-74, 1995)、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生さ せる方法（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992)、パーティクルガン法に より細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法 (Christou et. al, Bio/tec hnology, 9: 957-962, 1991)およびァグロバタテリゥムを介して遺伝子を導入し、植物 体を再生させる方法（Hiei et. al., Plant J. 6: 271-282, 1994)など、いくつかの技術が 既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては 、これらの方法を好適に用いることができる。
[0064] 上記ァグロバタテリゥム法を用いる場合、例えば Nagelらの方法（Microbiol. Lett. 67:
325, 1990)が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをァグロバタテリゥム 細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたァグロパクテリゥムを、リーフディスク 法等の公知の方法により細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入し た後、本発明の Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑 制する DNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロ モーターの下流には本発明の Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体または Vrsl遺伝子 の発現を抑制する DNAが位置し、さらに該 DNAの下流にはターミネータ一が位置す る。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種 類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフ ラヮーモザイクウィルス由来の CaMV35S、トウモロコシのュビキチンプロモーター（特 開平 2-79983号公報)等を挙げることができる。
[0065] また、上記ターミネータ一は、カリフラワーモザイクウイノレス由来のターミネータ一、 あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネータ一等を例示することができるが 、植物体中で機能するプロモーターやターミネータ一であれば、これらに限定されな い。
[0066] また、本発明の Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑 制する DNAを導入するォォムギは、外植片であってもよぐこれらの植物力 培養細 胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「ォォムギ細胞」は、例え ば葉、根、茎、花（とくに花粉小胞子)および未熟'成熟種子中の胚盤等の植物の細 胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
[0067] また、本発明の Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑 制する DNAの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、上記組み換 えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を 含むプラスミドベクターと共にォォムギ細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使 用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ノヽィグロマイシンに耐性であるハ ィグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに 耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに 耐性であるァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
[0068] 組み換えベクターを導入した細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従 つて適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質 転換された植物培養細胞を得ることができる。
[0069] 形質転換細胞から再生させた植物体は、次!ヽで順化用培地で培養する。その後、 順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して 結実して種子を得ることができる。
[0070] なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来 DNA の存在は、公知の PCR法やサザンハイブリダィゼーシヨン法によって、または植物体 中の DNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質 転 物体からの DNAの抽出は、公知の J.Sambrookらの方法（Molecular Cloning, 第 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に準じて実施することができる。
[0071] 再生させた植物体中に存在する本発明の DNAよりなる外来遺伝子を、 PCR法を用 いて解析する場合には、上記のように再生植物体力ゝら抽出した DNAを铸型として増 幅反応を行う。また、本発明の DNA、あるいは本発明により改変された DNAの塩基配 列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマ 一として用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増 幅反応においては、 DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発 明の DNA配列を含む DNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む 反応液を例えばァガロース電気泳動にかけると、増幅された各種の DNA断片が分画 されて、その DNA断片が本発明の DNAに対応することを確認することが可能である。
[0072] ー且、染色体内に本発明の Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝 子の発現を抑制する DNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体か ら有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やそ の子孫あるいはクローン力 繁殖材料 (例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、 カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である 。本発明には、 Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、または Vrsl遺伝子の発現を抑制 する DNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクロ ーン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。これらの 植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体 、その子孫、およびクローンの繁殖材料は、植物（例えばォォムギ）の穂の形態を改 変することに使用することが可能である。
[0073] 本発明はさらに、 Vrsl遺伝子をニ条性ではないォォムギの細胞内で発現させるェ 程を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。本発明はま た、 Vrsl遺伝子の変異体を二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォ ムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。本発明はさらに、 Vrsl遺伝 子の発現を抑制する DNAを二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォ ムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。ニ条性に形質転換されたォ ォムギは、例えばビール醸造に有用である。また、六条性に形質転換されたォォムギ は飼料として有用である。さらに、ニ条性、六条性、またはニ条性と六条性の中間性 に形質転換された形質転換ォォムギは、たとえば生け花などに供することが出来るた め、観賞用植物の分野において有用である。ォォムギの条性または穂の形態を改変 することは、上述の方法を用いて Vrsl遺伝子、 Vrsl遺伝子の変異体、 Vrsl遺伝子の 発現を抑制する DNAを発現可能に含むベクターをォォムギの細胞に導入し、これを 再生することにより可能である。
[0074] 本明細書にぉ 、て「改変する」とは、例えば、六条性ォォムギを二条性ォォムギに 完全に改変する（または六条性ォォムギの穂の形態を二条性ォォムギの穂の形態に 完全に改変する）ことのみならず、六条性ォォムギの形質の一部を二条性ォォムギ のそれに改変する（または六条性ォォムギの穂の形態の一部を二条性ォォムギの穂 の形態に改変する）ことも意味する。また、ニ条性に改変される六条性ォォムギには、 その個体の全てに六条性の形質を有するォォムギのみならず、その個体の一部の みに六条性の形質を有するォォムギも含まれる。本発明における条性または穂の形 態を改変する方法においては、上述の「改変する」の定義は、 Vrsl遺伝子の変異体 を二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォムギの条性または穂の形 態を改変する方法や、 Vrsl遺伝子の発現を抑制する DNAを二条性ォォムギの細胞 内で発現させる工程を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法にぉ 、 ても、ニ条性と六条性の文言を読み替えることなどによって、同様に適用される。
[0075] 二条ォォムギは六条ォォムギに比べて赤かび病抵抗性が大き!/、傾向にあることが 報告 れて ヽる (K. Ta eda (1990) selection response and parent— offspring correiati on of the resistance to Fusarium Head Blight in barley. Japanese Journal of Breeding 40: 91-101.)。従って本発明は、 Vrsl遺伝子をォォムギの細胞内で発現させる工程 を含む、ォォムギに赤かび病抵抗性を付与する方法を提供する。ォォムギに赤かび 病抵抗性を付与することは、上述の方法を用いて、 Vrsl遺伝子を発現可能に含むベ クタ一をォォムギの細胞に導入し、これを再生することにより可能である。 [0076] 赤かび病はコムギ、ォォムギ、ェン麦等多くのムギ科作物を侵し、おもに穂に発生 する。赤かび病菌に感染したォォムギでは、出穂力も乳熟期にかけて、穂の一部ある いは全部が褐色になり、穎の合わせ目に鮭肉色のかび (分生胞子)ができる。赤かび 病菌に感染した子実は稔実が悪ぐ多発の際の減収は 60〜70%にも及ぶ。また、被 害麦を食用、飼料にすると中毒症状をおこすことがある。
本発明において「赤かび病菌」とは、 Fusarium属に含まれる菌を意味する。もっとも 重要な種の一例としては、 Fusarium graminearum菌がある力 これらに限定されるも のではなぐ上記の属に含まれる全ての菌カ 本発明における赤かび病菌に含まれ る。
[0077] 本発明はまた、本発明の Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体から生成されるタ ンパク質、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質に結合する抗体を提供する 組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードする DNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換 細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容 易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可 能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質 として調製する方法（米国 New England BioLabs社発売のベクター pMALシリーズ）、 ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質として調製する方法 (Am ersham Pharmacia Biotech社発売のベクター pGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付カロし て調製する方法 (Novagen社の pETシリーズ)などを利用することが可能である。宿主 細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなぐ上 記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが 可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用い ることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導 入方法（Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, Vol.53, 158-162,(1970 )、 Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, Vol.166, 557- 580,(1983))を用いること ができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその 培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み 換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発 現させた場合には、容易にァフィユティー精製を行うことが可能である。
[0078] 得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができ る。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。 Vrsl タンパク質 (Vrsl遺伝子から生成されるタンパク質)または Vrsl遺伝子の変異体から 生成されるタンパク質、ある 、はこれらと GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微 生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはそれらの部分ペプチドをゥ サギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロ ティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 Vrslタンパク質または Vrsl遺伝 子の変異体力も生成されるタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたァフィ-ティ 一力ラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例 えば、 Vrslタンパク質または Vrsl遺伝子の変異体から生成されるタンパク質またはそ れらの部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、 これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレンダリ コール等の試薬を用 、て融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の中 から、 Vrslタンパク質または Vrsl遺伝子の変異体力も生成されるタンパク質に結合す る抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたノ、イブリドーマをマウス腹腔 内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫 安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 Vrsl タンパク質または Vrsl遺伝子の変異体カゝら生成されるタンパク質や合成ペプチドを力 ップリングしたァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能であ る。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用するこ とが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
[0079] さらに本発明は、 Vrsl遺伝子、該遺伝子を含むベクターの用途を提供するものであ る。すなわち本発明は、 Vrsl遺伝子、該遺伝子を含むベクターのいずれか 1つを有 効成分として含む、ォォムギの赤かび病抵抗性を増力!]させるための薬剤に関する。 また本発明は、ォォムギの赤かび病抵抗性を増力!]させるための薬剤の製造における 、 Vrsl遺伝子、該遺伝子を含むベクターの使用に関する。
[0080] 本発明のォォムギの赤かび病抵抗性を増加させるための薬剤においては、有効成 分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活 性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
[0081] 本発明はまた、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体に連鎖する分子マーカー を提供する。本発明における「分子マーカー」とは、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の 変異体と遺伝的に連鎖する DNA領域であって、他の DNA領域と識別可能な DNA領 域をいう。
[0082] 一般に分子マーカーとは、単位 cMで表す地図距離が短いほどその遺伝子の近傍 に位置し、その遺伝子と同時に遺伝するため、有用性が高い。具体的には、本発明 のプライマーセットとしては、配列番号: 4〜29に記載の塩基配列の全部または一部 を含むマーカーが挙げられる。本発明の分子マーカーとしては、 STS (Sequence Tagg ed Site)マーカー、 AFLPマーカー、 RFLPマーカー、 SNPマーカー、 SSRマーカーなど を挙げることが出来る。
[0083] STSマーカーとは、 DNA上の配列タグ部位（STS)の多型の有無の判定に利用でき る DNA領域をいい、 STSとは、 DNA上の特定位置に特異的な配列部位をいう。 STSの 多型は、該特定配列部位を含む DNA領域を PCR法等の核酸増幅法により増幅し、 該増幅産物をァガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、バ ンドの有無や位置の違いとして検出することができる。また、 AFLP法とは、制限酵素 で切断された DNA断片の長さの違いを PCRにより選択的に増幅させて検出する方法 を言う。 RFLPマーカーとは、染色体 DNA配列の制限酵素断片長多型 (RFLP)の存在 の有無の判定に利用できる DNA領域を言う。 RFLPとは、制限酵素で処理して得られ る DNA断片の長さの違いによって見出される遺伝的変異 (置換変異、挿入変異及び 欠失変異等)を言い、この変異は、 DNA断片をァガロース電気泳動により断片長の長 さに基づき分離し、泳動距離の差をサザンブロットにより検出して確認できる。 SSRマ 一力一とは、 Simple Sequence Repeatsの略で、マイクロサテライトマーカーと同義であ る。 SSRマーカーは、塩基配列中に存在する 2あるいは 3塩基の単位が数回力も数百 回反復する繰り返し配列の繰り返し回数の違いを DNA多型として利用した DNAマー カーである。繰り返し部分の塩基配列を PCRで増幅し、得られた増幅産物をァガロー スゲル電気泳動あるいは DNAシーケンサーにかけることによって、 DNA多型をバンド の位置の違いあるいは塩基配列数の違いとして検出する。また、 SNPとは DNAの塩基 配列中の塩基 1個の置換によって生ずる DNA多型であり、これを DNAマーカーとして 利用したものが SNPマーカーである。一塩基多型部分およびそれに隣接する塩基配 列を PCRで増幅し、得られた増幅産物中の一塩基多型部分に取り込まれた塩基の種 類を偏光蛍光分析器で解析することによって検出することが可能である。
[0084] 当業者においては、各種分子マーカー（例えば上述のマーカー）についての配列 情報を考慮して、最適なプライマーを適宜設計することが可能である。通常、上記プ ライマーとは、ォォムギに特異的に存在し、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体 と連鎖する塩基配列を挟み込むように設計された、該塩基配列を増幅するための一 対のプライマーセットである。
[0085] 具体的には、本発明のプライマーセットとしては、
(a)配列番号： 30に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 31に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 4に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(b)配列番号： 32に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 33に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号: 5に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(c)配列番号： 34に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 35に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 6に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(d)配列番号： 36に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 37に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 7に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(e)配列番号： 38に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 39に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 8に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、 (f)配列番号： 40に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 41に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 9に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(g)配列番号： 42に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 43に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 10に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(h)配列番号： 44に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 45に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 11に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(i)配列番号： 46に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 47に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 12に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(j)配列番号： 48に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 49に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 13に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(k)配列番号： 50に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 51に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 14〜18に記載の塩基配列の全部または一部を含むマ 一力一を検出するプライマーセット）、
(1)配列番号： 52に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 53に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 19〜23に記載の塩基配列の全部または一部を含むマ 一力一を検出するプライマーセット）、
(m)配列番号： 54に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 55に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 24に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(n)配列番号： 56に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 57に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号: 25に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(o)配列番号： 58に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 59に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 26に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(P)配列番号： 60に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 61に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号: 27に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(q)配列番号： 62に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 63に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 28に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
(r)配列番号： 64に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 65に記載の塩基 配列からなる DNA (配列番号： 29に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカ 一を検出するプライマーセット）、
を例示することが出来る。これらのプライマーセットによって増幅される DNA配列によ つて特徴付けられる情報を、本発明の分子マーカーと比較することによって、被検ォ ォムギがニ条性または六条性であることを判定することが可能である。
[0086] また上記のプライマー以外にも、当業者であれば、配列番号： 1または 2に記載の塩 基配列、または、配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件でハイブリダィズするォォムギ由来の DNAを利用して、同様の機能を有する プライマーセットを作成することが可能である。本発明のプライマーには、このようなプ ライマーもまた含まれる。
[0087] 本発明の PCRプライマーは、当業者においては、例えば、自動オリゴヌクレオチド合 成機等を利用して作製することができる。また、当業者においては周知の多型検出 方法、例えば、上記 PCRプライマーを用いた後述の PCR-SSCP法等によっても本発 明の方法を実施することが可能である。
[0088] また、本発明の分子マーカーがゲノム DNAのェクソン中に存在する場合には、 mRN Aを铸型とした RT-PCRを利用することも可能である。また、 Taqman (量的 PCR検出） システム (Roche社)を利用すれば、蛍光により増幅産物の有無を検出することが可能 である。このシステムによれば、電気泳動の手間も省けるため短時間で本発明の識 別方法を行うことが可能である。 [0089] 本発明はまた、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体カゝらなる DNAまたはその相 補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供す る。
[0090] 本発明にお 、て「相補鎖」とは、 A:T (ただし RNAの場合は U)、 G:Cの塩基対からな る 2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも 1 5個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくと も 70%、好ましくは少なくとも 80%、より好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%以上の塩基 配列上の相同性を有すればよ!、。相同性を決定するためのアルゴリズムは当業者に 周知のものを使用すればよい。
[0091] 本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DN A、または、配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条 件でハイブリダィズするォォムギ由来の DNAの検出や増幅に用いるプローブゃプラ イマ一として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、 DNAアレイ の基板の形態で使用することができる。
[0092] 該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常 15bp〜100bp であり、好ましくは 17bp〜30bpである。プライマーは、本発明の DNAまたはその相補 鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーと して用いる場合、 3'側の領域は相補的とし、 5'側には制限酵素認識配列やタグなどを 付カロすることができる。
[0093] また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、配列 番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖の少なくとも一部 に特異的にハイブリダィズするものや、配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からな る DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズするォォムギ由来の DNAまたはその 相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダィズするものであれば、特に制限され ない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよぐ通常少なくとも 15bp以上 の鎖長を有する。
[0094] 本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いるこ とが好ましい。標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌ クレオチドの 5'端を32 Pでリン酸ィ匕することにより標識する方法、およびタレノウ酵素等 の DNAポリメラーゼを用い、ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとし て32 P等のアイソトープ、蛍光色素、またはピオチン等によって標識された基質塩基を 取り込ませる方法 (ランダムプライム法等)を例示することができる。
[0095] 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製 することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖 DNA断片 として作製することちできる。
[0096] さらに本発明は、以下の（a)〜（c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基 配列が一致するときにォォムギがニ条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNA断片の分子量または塩基配列を、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrs 1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
本発明の上記 DNA試料の調製 (抽出）は、当業者においては、公知の方法によつ て行うことができる。好ましい調製方法として、例えば、 CTAB法を用いて DNAを抽出 する方法を挙げることがでさる。
また、本発明の判定方法に供される DNA試料は特に制限されるものではな 、が、 通常、被検植物であるォォムギカも抽出するゲノム DNAを用いる。また、ゲノム DNA の採取源としては特に限定されるものではなぐォォムギのいずれの組織力もも抽出 できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等力 抽出することができ る。
[0097] 本発明の方法では、次に、調製した DNAを铸型として、プライマー DNAを用いて核 酸増幅反応 (例えば、 PCR法)を行う。増幅した DNA断片を制限酵素で切断し、切断 された DNA断片の大きさを、電気泳動等により被検ォォムギと二条性ォォムギとの間 で比較し、分子量または塩基配列が一致する場合に、該被検ォォムギはニ条性ォォ ムギであると判定される。「ニ条性ォォムギ」としては、表 1に記載のォォムギが挙げら れるが、これに限定されない。
[0098] 上記電気泳動分析は、常法にしたがって行えばよい。例えば、ァガロースまたはポ リアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離した DNAパターンを分析 する。なお本発明の判定方法においては、上述したように、 Vrsl遺伝子は配列番号： 1または 2に記載の塩基配列を含む DNAに限定されない。配列番号： 1または 2に記載 の塩基配列を含む DNAに変異を有するものであっても、その遺伝子を有するォォム ギがニ条性の形質を有するものでありさえすれば、該配列番号： 1または 2に記載の 塩基配列において変異を有する DNAは、本発明の Vrsl遺伝子に含まれる。
[0099] また本発明は、以下の（a)〜（c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配 列が一致するときにォォムギが六条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNA断片の分子量または塩基配列を、六条性である Vrsl遺伝子の変異 体のそれと比較する工程
[0100] さらに本発明は、以下の（a)〜（c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基 配列が一致するときにォォムギがニ条性と六条性の中間性であると判定される方法 を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNA断片の分子量または塩基配列を、ニ条性と六条性の中間性である Vrs 1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
[0101] 本発明の方法において六条性、ニ条性と六条性の中間性とは上述の通りである。
本発明の方法においては、増幅した DNA断片を制限酵素で切断し、電気泳動等に より、切断された DNA断片の大きさを、電気泳動等により被検ォォムギと六条性ォォ ムギとの間で比較し、分子量または塩基配列が一致する場合に、該被検ォォムギは 六条性であると判定される。または、増幅した DNA断片を制限酵素で切断し、電気泳 動等により、切断された DNA断片の大きさを、電気泳動等により被検ォォムギとニ条 性と六条性の中間性であるォォムギとの間で比較し、分子量または塩基配列が一致 する場合に、該被検ォォムギはニ条性と六条性の中間性であると判定される。
[0102] また本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときにォォムギがニ条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖の DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖 DNAのゲル上での移動度を、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vr si遺伝子の変異体のそれと比較する工程
[0103] さらに本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度 がー致するときにォォムギが六条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖の DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖 DNAのゲル上での移動度を、六条性である Vrsl遺伝子の変異 体のそれと比較する工程
[0104] さらに本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度 がー致するときにォォムギがニ条性と六条性の中間性であると判定される方法を提 供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した二本鎖の DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(d)分離した二本鎖 DNAのゲル上での移動度を、ニ条性と六条性の中間性である Vr si遺伝子の変異体のそれと比較する工程
[0105] また本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときにォォムギがニ条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vr sl遺伝子の変異体のそれと比較する工程
[0106] また本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときォォムギが六条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を、六条性である Vrsl遺伝子の変異 体それと比較する工程
[0107] また本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときォォムギがニ条性と六条性の中間性である判定される方法を提供する
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程
(d)解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程
(e)分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を、ニ条性と六条性の中間性である Vr sl遺伝子の変異体のそれと比較する工程
[0108] このような方法として、 PCR-SSCP(single- strand conformation polymorphism,一本 鎖尚次構造多型)法 (し loning and polymerase chain reaction-single-strand conformat ion polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139- 146.、 Detection of p53 gene mutations in human brain tumor s by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313- 1318.、 Multiple fluorescence-based P CR-SSCP analysis with postlabeling.ゝ PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275—28 2.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくて済む などの利点を有するため、特に多数の DNAサンプルをスクリーニングするのに好適で ある。その原理は以下の如くである。二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖 はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離した DNA鎖を変 性剤を含まな 、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の 差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置 換によってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することにより DNA 断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入などによる変異が存在することを検出する ことができる。
具体的には、まず、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の標的部位を含む領 域を PCR法などによって増幅する。増幅される範囲としては、 100〜600bp程度の長さ が好ましい。 PCRによる遺伝子断片増幅の際、 32Pなどのアイソトープ、あるいは蛍光 色素やピオチンなどによって標識したプライマーを用いる力、あるいは PCR反応液に3 2Pなどのアイソトープ、ある!/、は蛍光色素やピオチンなどによって標識した基質塩基 をカロえて PCRを行うことによって合成される DNA断片を標識する。あるいは PCR反応 後にタレノウ酵素などを用いて32 Pなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やピオチン などによって標識した基質塩基を合成された DNA断片に付加することによつても標識 を行うことができる。このようにして得られた DNA断片を 2本鎖のまま、尿素などの変性 剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。もしくは、このような DNA 断片に熱を加えることなどにより変性させてから、尿素などの変性剤を含まないポリア クリルアミドゲルによって電気泳動を行ってもよい。この際、ポリアクリルアミドゲルに適 量 (5から 10%程度）のグリセロールを添加することにより、 DNA断片の分離の条件を 改善することができる。また、泳動条件は各 DNA断片の性質により変動するが、通常 、室温 (20から 25°C)で行い、好ましい分離が得られないときには 4から 30°Cまでの温 度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、 DNA断片の移動度を、 X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナ一等で検出 し、解析する。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルか ら切り出し、 PCRによって再度増幅し、それを直接シークェンシングすることにより、変 異の存在を確認することができる。また、標識した DNAを使わない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブロマイドや銀染色法などによって染色することによ つて、バンドを検出することができる。
[0110] さらに本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、検出された DNA断 片の大きさが一致するときにォォムギがニ条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製した DNA試料を制限酵素により切断する工程
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出された DNA断片の大きさを、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子の 変異体のそれと比較する工程
[0111] また本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、検出された DNA断片 の大きさが一致するときにォォムギが六条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製した DNA試料を制限酵素により切断する工程
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出された DNA断片の大きさを、六条性である Vrsl遺伝子の変異体のそれと比 較する工程
[0112] また本発明は、以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、検出された DNA断片 の大きさが一致するときにォォムギがニ条性と六条性の中間性であると判定される方 法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
(c)調製した DNA試料を制限酵素により切断する工程
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
(e)検出された DNA断片の大きさを、ニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝子の 変異体のそれと比較する工程
[0113] このような方法としては、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polym orphism/RFLP)を利用した RFLP法や PCR-RFLP法などが挙げられる。 DNAを切断 する酵素としては、通常、制限酵素を用いる。具体的には、制限酵素の認識部位に 塩基の付加、欠失が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じる DNA断片 内に塩基挿入、または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが、 V rsl遺伝子、ニ条性である Vrsl遺伝子の変異体、六条性である Vrsl遺伝子の変異体 、ニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝子の変異体との間で変化する。この変異 部位を含む部分を PCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによ つて、これらの多型部位を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することがで きる。あるいは、染色体 DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、 プローブ DNAを用いてサザンブロッテイングを行うことにより、多型部位を検出するこ とができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異部位に応じて適宜選択すること ができる。この方法では、ゲノム DNA以外にも被験ォォムギカ 調製した RNAを逆転 写酵素で cDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後サザンブロッテイングを行 うこともできる。また、この cDNAを铸型として PCRで Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の 変異体の一部、あるいは全部を増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差 を調べることちでさる。
[0114] さらに本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度 がー致するときにォォムギがニ条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrs 1遺伝子または Vrs 1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離した DNAのゲル上での移動度と、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝 子の変異体のそれと比較する工程
[0115] また本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときにォォォムギが六条性であると判定される方法を提供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrs 1遺伝子または Vrs 1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離した DNAのゲル上での移動度と、六条性である Vrsl遺伝子の変異体のそれ と比較する工程
[0116] また本発明は、以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が 一致するときにォォォムギがニ条性と六条性の中間性であると判定される方法を提 供する。
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程
(b)該 DNA試料カゝら Vrs 1遺伝子または Vrs 1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
(c)増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
(d)分離した DNAのゲル上での移動度と、ニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝 子の変異体のそれと比較する工程
[0117] このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（denaturant gradient gel electrophoresis : DGGE)が挙げられる。 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子 の変異体、六条性である Vrsl遺伝子の変異体、ニ条性と六条性の中間性である Vrs 1遺伝子の変異体の標的部位を含む領域を本発明のプライマーなどを用いた PCR法 などによって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高く なっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在す る DNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置で DNA断片が一本鎖になり、極端に移 動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより多型の存在を検出する ことができる。
[0118] これら方法以外にも、アレル特異的オリゴヌクレオチド (Allele Specific Oligonucleoti de/ASO)ハイブリダィゼーシヨン法が利用できる。多型が存在すると考えられる塩基 配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料 DNAでノ、イブリダィゼーシヨンを 行わせると、該オリゴヌクレオチドと異なる多型塩基力 ハイブリダィズする試料 DNA に存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特 殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーシヨンすることにより消光する 性質を利用した方法などにより検出できる。
[0119] また、リボヌクレアーゼ Aミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、 M HC S遺伝子、 SEEK1遺伝子あるいは HCR遺伝子の標的部位を含む領域を PCR法な どによって増幅し、これに対し、プラスミドベクター等に組み込んだ健常者型の cDNA 等カゝら調製した標識 RNAとハイブリダィゼーシヨンを行わしめる。健常者型と異なる塩 基が存在する部分にぉ 、てはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボ ヌクレアーゼ Aによって切断し、これをオートラジオグラフィーなどで検出することによ つて多型の存在を検出することができる。
[0120] 本発明の判定方法を利用すれば、ニ条性、六条性、またはニ条性と六条性の中間 性であるォォムギを早期に選抜することが可能となる。すなわち本発明は、以下の（a )および (b)に記載の工程を含む、二条性ォォムギを選抜する方法を提供する。
(a)二条性ォォムギと、ニ条性ではないまたは条性が不明であるォォムギとが交配さ れた品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程 (a)で作製されたォォムギがニ条性であるか 否かを判定する工程
[0121] さらに本発明は、以下の（a)および (b)に記載の工程を含む、六条性ォォムギを選 抜する方法を提供する。
(a)六条性ォォムギと、六条性ではないまたは条性が不明であるォォムギとが交配さ れた品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程 (a)で作製されたォォムギが六条性であるか 否かを判定する工程
[0122] さらに本発明は、以下の（a)および (b)に記載の工程を含む、ニ条性と六条性の中 間性であるォォムギを選抜する方法を提供する。
(a)ニ条性と六条性の中間性であるォォムギと、ニ条性と六条性の中間性ではな!/、 または条性が不明であるォォムギとが交配された品種を作製する工程
(b)本明細書に記載の方法により、工程 (a)で作製されたォォムギがニ条性と六条性 の中間性であるカゝ否かを判定する工程
[0123] 上記選抜方法において、ニ条性、六条性、中間性とは、上述の通りである。また、「 ニ条性ではない」とは六条性であるまたは中間性であることを意味し、「六条性ではな い」とはニ条性であるまたは中間性であることを意味し、「中間性ではない」とはニ条 性であるまたは六条性であることを意味する。
[0124] このように本発明は、ニ条性と識別されるォォムギ、六条性と識別されるォォムギ、 またはニ条性と六条性の中間性と識別されるォォムギを、早期に選抜する方法を提 供する。ここでいう「早期」とは、例えば出穂より前の状態を指し、好ましくは発芽直後 の状態を指す。またォォムギは重複受精するため、播種前に胚乳の一部を切り取つ て抽出した DNAで遺伝子判定を行うことが可能である。ォォムギがニ条性であると!/、 う判定、六条性であるという判定、またはニ条性と六条性の中間性であるという判定 は、上述の方法によって行うことが可能である。また、本発明の選抜方法を利用すれ ば、ニ条性の形質を有する品種、六条性の形質を有する品種、またはニ条性と六条 性の中間性の形質を有する品種の育成を、従来よりも短期間で成し遂げることが可 能となる。
[0125] 本発明はまた、被験化合物のスクリーニング方法に関する。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の（a)〜（c)の工程を含 む、被験化合物のスクリーニング方法が挙げられる。
(a) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物に被検化合物を接触させる 工程
(b) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と被検化合物の結合を検出 する工程
(c) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と結合する被検化合物を選 択する工程
[0126] 第一の態様では、まず、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物に被 検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法における「Vrsl遺伝子または Vr si遺伝子の変異体の転写産物」としては、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の 転写産物および該転写産物より翻訳される翻訳産物が含まれる。ここで Vrsl遺伝子 の変異体とは、ニ条性である Vrsl遺伝子の変異体、六条性である Vrsl遺伝子の変 異体、ニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝子の変異体が含まれる。
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然ィ匕 合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化 合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発 酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽 出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応 じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等 を挙げることができる。
[0127] 本発明において「接触」は、以下のようにして行う。例えば、 Vrsl遺伝子または Vrsl 遺伝子の変異体の転写産物が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を 添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液 内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検 化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制 限されないが、ォォムギを含む植物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク 質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 Vrsl遺伝 子または Vrsl遺伝子の変異体が発現して ヽる細胞へ導入する、または該ベクターを Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体が発現している細胞抽出液に添加すること で行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド 法を利用することも可能である。
[0128] 第一の態様では、次いで、上記 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産 物と被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段 は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種 類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や 、 BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法 においては、ついで、上記 rsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と結合 した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、ォォムギの穂の形態 を改変するための化合物が含まれる。例えば、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl 遺伝子の変異体の転写産物と結合した被検化合物は、二条性ォォムギの条性また は穂の形態の改変に有用であると考えられる。一方、六条性である Vrsl遺伝子の変 異体ゃニ条性と六条性の中間性である Vrsl遺伝子の変異体の転写産物と結合した 被検化合物は、六条性ォォムギゃニ条性と六条性の中間性ォォムギの穂の形態を 改変することや、赤かび病抵抗性を増加させるために有用であると考えられる。条性 や穂の形態が改変されたォォムギは、たとえば生け花などに供することが出来、観賞 用植物の分野において有用である。また、選択された被検化合物を、以下のスクリー ユングの被検化合物として用いてもょ 、。
[0129] また、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、以下の（a)〜（c)の工程を 含む、被検化合物のスクリーニング方法を提供する。
(a)ォォムギカゝら採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルを測定するェ 程
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを 変化させた被検化合物を選択する工程
[0130] 第二の態様では、まず、ォォムギカも採取した細胞に被検化合物を接触させる。こ こで「ォォムギカゝら採取した細胞」は、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体を有す ることが明らかな任意のォォムギ細胞である。「被検化合物」、「接触」の記載に関して は上記の説明の通りである。
[0131] 第二の態様では、次いで、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の 発現レベルを測定する。 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の発現 レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、 Vrsl遺伝 子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物をコードする mRNAを定法に従って抽出し 、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、または RT-PCR法を実施 することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、 DNAァレ ィ技術を用いて、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の発現レベル を測定することも可能である。
[0132] また、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物を含む画分を定法に従 つて回収し、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の発現を SDS-PAG E等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともでき る。また、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物に対する抗体を用いて 、ウェスタンブロッテイング法を実施し、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転 写産物の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能で ある。 [0133] Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産物の検出に用いる抗体としては、 検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、または ポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、上述のように、当業者 に公知の方法により調製することが可能である。
[0134] 第二の態様においては、ついで、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写 産物の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ変化する場合に、被検 化合物を、ォォムギの穂の形態を改変するための化合物として選択する。具体的に は、被検化合物が Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子の変異体の発現を増 加させた場合には、該被検化合物は側列小穂の発達をより強く抑制することに有用 であると考え、 Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子の変異体の発現を減少さ せた場合には側列小穂の発達をより大きく発達させることに有用であると考えられる。 条性ゃ穂の形態が改変されたォォムギは、たとえば生け花などに供することが出来、 観賞用植物の分野において有用である。
[0135] 本発明のスクリーニング方法の第三の態様は、以下の（a)〜（d)の工程を含む、被 検化合物のスクリーニング方法である。
(a) Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体のプロモーター領域の下流にレポーター 遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを変化させた被検化合物を選択する工程
[0136] 第三の態様では、まず、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体のプロモーター領 域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽 出液を提供する。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の 変異体のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の 発現が誘導されるように、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体のプロモーター領 域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の 遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であって も、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体のプロモーター領域に転写因子が結合 すること〖こよって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的 に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限さ れず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシ フェラーゼ遺伝子、 /3 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)および GFP遺伝子等を挙げる ことができる。
[0137] 第三の態様では、次!、で、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触 させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現 レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通 りである。
[0138] レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、 当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を検 出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポ一 ター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色 素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、 該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、 β -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用 による Glucuron (ICN社）の発光や 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- 13 -ダルク口-ド（ X-Gluc)の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 GFPタン ノ ク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定する ことができる。
[0139] 第三の態様にぉ 、ては、っ 、で、上記レポーター遺伝子の発現レベル力 被検化 合物を接触させないときに比べ変化する被検化合物を選択する。具体的には、被検 化合物が Vrsl遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子のプロモーター領域の下流に 結合したレポーター遺伝子の発現を増加させた場合には、該被検化合物は側列小 穂の発達をより強く抑制することに有用であると考えられる。一方、被検化合物が Vrs 1遺伝子またはニ条性である Vrsl遺伝子のプロモーター領域の下流に結合したレポ 一ター遺伝子の発現を減少させた場合には、側列小穂の発達をより大きく発達させ ること〖こ有用であると考えられる。条性ゃ穂の形態が改変されたォォムギは、たとえば 生け花などに供することが出来るため、観賞用植物の分野において有用である。
[0140] 本発明はまた、被検ゲノム断片が Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコ ードされるタンパク質の標的配列を有する力否かを判定する方法であって、以下の（ a)および (b)の工程を含み、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコードさ れるタンパク質が、任意の被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発 現させた場合に、該任意の被検ゲノム断片が Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異 体によりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されるこ とを特徴とする方法を提供する。
(a)細胞または細胞抽出液にお!、て、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体により コードされるタンパク質と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を 有する DNAを接触させる工程
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程
[0141] 本発明のゲノム断片をスクリーニングする方法においてはまず、細胞または細胞抽 出液において、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質 と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有する DNAを接触させ る。ここで「機能的に結合した」とは、上述の通りである。また、ゲノム断片の塩基配列 および長さには制限はない。ここで「接触」は、例えば、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝 子の変異体の転写産物が精製された状態であれば、該精製標品と、任意のゲノム断 片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有する DNAを、細胞抽出液中にて混合す ることにより行うことができる。また、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体の転写産 物が細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に含まれる状態であれば、それと、 任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有する DNAを混合するこ とも可能である。ここで、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を 有する DNAは、それを発現可能に有するベクターの中に組み込まれたものであって ちょい。
[0142] 本方法にお!、ては、次 、で、レポーター遺伝子の発現の有無を測定する。レポータ 一遺伝子の発現もまた、該レポーター遺伝子の種類に応じて、前記の方法により測 定することができる。
[0143] 本方法においては、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコードされるタン パク質が、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場 合に、該任意のゲノム断片が Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコードさ れるタンパク質の標的配列（プロモーター配列、ェンハンサー配列等が挙げられるが 、これらに限定されない）を有するゲノム断片であると判定される。
[0144] さらに本発明においては、被検ゲノム断片が Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異 体によりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判 定する方法であって、以下の（a)および (b)の工程を含み、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺 伝子の変異体によりコードされるタンパク質が任意の被検ゲノム断片上に存在する遺 伝子を発現させた場合に、該任意の被検ゲノム断片が Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝 子の変異体によりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると 判定されることを特徴とする方法を提供する。
(a)細胞または細胞抽出液にお!、て、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体により コードされるタンパク質と、任意のゲノム断片を有する DNAを接触させる工程
(b)任意のゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程
[0145] 本発明の遺伝子のスクリーニング方法においては、まず、細胞または細胞抽出液 において、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、 任意のゲノム断片を有する DNAを接触させる。ここで「接触」は上述の通りである。
[0146] 本発明の遺伝子のスクリーニング方法においては、次に、任意のゲノム断片からの 遺伝子発現の有無を測定する。発現の有無は、上述の方法によって適宜測定するこ とが可能である。ゲノム断片カゝら発現した遺伝子は、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子 の変異体によりコードされるタンパク質によってその発現が制御される遺伝子である。
[0147] 本発明はまた、上記に記載のスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。こ のようなキットには、上記に記載のスクリーニング方法の検出工程や測定工程に使用 されるものを含みうる。例えば、 Vrsl遺伝子または Vrsl遺伝子の変異体、任意のゲノ ム断片の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を 挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含 まれていてもよい。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0148] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕条性遺伝子 vrslの連鎖地図作成
二条性を示すォォムギ品種「DebreZeit29」と六条性を示す突然変異体「New Golden M13」を交配し、 464個体からなる F2集団を作成して連鎖地図を作成し、さらにニ条性 を示すォォムギ品種「Golden Promise]と六条性を示すォォムギ品種「ァズマムギ」を 交配して 1106個体力 なる F2集団を作成して連鎖地図を作成した (Komatsuda Τ, K. fanno (2004) Comparative hign resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrsl ) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)。まに、 二条性を示すォォムギ品種「Golden Promise」と六条性を示すォォムギ品種「ァズマ ムギ」を交配して新たに 1781の F2集団を分析に加え、高精度連鎖地図を作成した。
[0149] 〔実施例 2〕整列化 BAC作成
2.1材料 方法
2.1.1 BACライブラリーの PCRスクリーニング
ォォムギ品種 Morexで作成された BACライブラリーの DNAを使って、 PCR ^タリー- ングを行った。スクリーニングは、合計 816枚の 384穴プレート、すなわち 313344個の B ACクローンから出発した。まず、プレート毎に培養した細胞を収集して一つにまとめ、 BACのプール DNAを標準アルカリ法で抽出した。次に、プール DNAを 10プレート分 ずつまとめてスーパープール DNAを都合 82本作成した。
[0150] 目的遺伝子と連鎖する PCRマーカーを用いて、まず、スーパープール DNAのスクリ 一ユングを試みた。すなわち、 PCRマーカーとしての DNAが増幅されたスーパープー ル DNAについてのみ、構成する 10プール DNAをスクリーニングした。 PCRマーカーと しての DNAが増幅されたプール DNAにつ!/、て、対応する 384穴プレートの各大腸菌 を直接 PCRの铸型としてスクリーニングした。 PCRマーカーとしての DNAが増幅された 大腸菌を 12.5 μ g/mlの chloramphenicolを含む LB培地で 37 °Cで培養した。
[0151] PCR反応液は（10 μ 1)、 0.25 units ExTaq polymerase (Takara, Tokyo, Japan)、 0.3 μ Mの各プライマー、 200 μ Μの各 dNTPs、 1〜4 mM MgCl、および lx PCR緩衝液 [
2
Takara IX: 25 mM TAPS (pH 9.3、 25。C)、 50 mM KC1、 1 mM 2— mercaptoethanol]を 含む。 PCR条件は、はじめに 94°Cで 3分間加熱したのち、以下の反応を 30回繰り返 した：
変性反応: 94°Cにて 30秒、
再会合反応：マーカーによって 50°C〜68.5°Cで 30秒、
伸長反応： 72°Cで、マーカーによって 0.5〜 2分、
最後に、 72°Cで 7分間の反応を行った。増幅 DNAは、 0.5X TBE緩衝液 [IX TBE: 89 mM Tris- borate、 2mM EDTA(pH 8.0) ]中にて、 1-1.5%のァガロースゲル（Agarose ME、 Iwai Kagaku、 Tokyo, Japan)上で電気泳動により分離し、ェチジゥムブロミドで染 色して観察した。
[0152] 2.1.2コンティグの整列化
一つの PCRマーカーで選択された複数の BACの DNAを Hindlllで切断し、 1%ァガロ ースゲルで電気泳動してフィンガープリントを行ない、整列させた。この整列を確かめ る目的で、 BACの塩基配列をもとに作成された PCRマーカーで増幅 DNAの有無を確 認した。ここで使用した PCRマーカーが第 2染色体に座乗することは、ォォムギーコム ギ染色体添加系統並びに高密度連鎖地図解析によってあら力じめ確かめられた。
[0153] 2.2結果と考察
条性遺伝子領域をカバーする整列化 BACを作成するため、ォォムギの染色体歩行 を行った。染色体歩行は条性遺伝子 vrslと組み換えな ヽ PCRマーカーである AFLP2 と、 vrslと 1個体のみ組み換えるマーカーである AFLP1から同時に開始した。 AFLP1 では BACクローン M102J11 G.D.以下同様）が単離された（以下では、単一の PCRマ 一力一で複数の BACがスクリーニングされても、 BAC整列化に最低限必要な BACに ついてのみ記述する）。 AFLP2では M111L15と M351N10が単離された。 M351N10 BA Cの T7側末端の塩基配列を決定して STSマーカー（351N10-T7)を作成し、他の BAC の DNAに対して PCR増幅を試みたところ、 M102J11および Ml 11L15にお!/、て共通に 増幅が認められ、 M102J11および M111L15が部分的に重複していることが明らかにな つた。同時に連鎖地図との比較によって M102J11が染色体動原体側、 M111L15が末 端側に向いている事が明らかになり、 vrslは M102J11を起点に末端方向に存在する と判断された。そこで M111L15から末端方向に向けて染色体歩行を継続した。
[0154] MlllL15のHindΠI断片（lllL15-fl-F)をSTSマーカー化し、 PCR ^クリーニングで M 669N11を単離した。 M669N11の T7末端塩基配をもとに STSマーカー（M669N11- T7) を作成し、 PCR ^クリーニングで M045M08と M572D24を単離した。 M572D24の Hindlll 断片（M572D24- fC- R)を STSマーカー化し、 PCR ^クリーニングで M185K11を単離し た。 M185K11の全長の DNA塩基配列を決定し、その配列をもとに STSマーカー（E18) を作成し、 PCR ^クリーニングで M053F18を単離した。 M053F18の T7末端塩基配をも とに STSマーカー（M053F18-T7)を作成したところ、 vrslと 6個体組み換え、かつ AFL P1とは反対の染色体末端方向にマップされた。以上のことから、条性遺伝子 vrslが M 102J11、 M111L15、 M045M08, M185K11, M053F18のいずれかに存在すると判断さ れた。この 5つの BACで形成されるコンティグは長さが推定 453kbである。このうち AFL P1から E18の距離は 353kbにわずかに 1個体のみ組み換えが観察されたのに対し、 E 18から M053F18-T7の間は 86kbしかないのに 6個体の組み換えが観察され、組み換 え頻度が不均一であることが示唆された。すなわち、 AFLP1から M053F18-T7に渡る マーカーと条性遺伝子 vrslが連鎖して 、る可能性が高 、と示唆された（図 3)。
[0155] 〔実施例 3〕 BACコンテイダの塩基配列解析
3.1材料 方法
3.1.1 BAC塩 §R列決定
各 BACクローンから QIAGEN Large-Construct Kit (QIAGEN GmbH, Hilden Germa ny)で BAC DNAを抽出した。 DNAは超音波処理によってランダムに分断し、電気泳 動でサイズを選択し、 pUC18ベクターにライゲートした。大腸菌 DH10B株をプラスミド で形質転換し、ショットガンライブラリーを作成した。平均挿入サイズ力 S2kbと 5kb二種 類のショットガンライブラリーを作成した。ライブラリーあたり 1000個のクローンの両側 末端配列を Dye-terminator法で決定しキヤビラリ一シーケンサーで解析した。合計 40 00個のショットガンシーケンスのベースコールを行い、 Phred/phrapプログラム（http: //www.phrap.org/phredphrapconsed.html)でアッセンブノレした。アッセンブノレされた 塩基配列は、 BACのクローニングサイトの塩基配列およびブリッジクローンの両末端 塩基配列を用いて正しく順序付けして並べた。ギャップはブリッジクローン全体の塩 基配列をプライマーウォーキングあるいはトランスポゾンシーケンシングで読むことに よって解消した。
[0156] 3.1.2 配,列解析
ネ守られ 7こ Ε)ΝΑ¾_ 配列を Graingenes Blast against Triticeae repeat dataoase (http ：〃 wheat.Dw.usda.gov/GG2/blast.shtml)で解析した。反復配列領域を除いた DNA塩 基酉己列を TIGR plant repeat and checked against Grameneae repeat database (http:/ Aigrblast.tigr.org/ euk— blast/index. cgi?project=plant.repeats)で解析した。以上の酉己 列解析で既知の反復配列とヒットしな 、領域にっ 、て、 NCBI nucleotide-nucleotide blast (blastn) against ESTs database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Dlast/)で解^ f した。
[0157] 一方、得られた DNA塩基配列 406kb上の遺伝子予測をするために RiceGAAS (http ://ncegaas.dna. affix. go. jp/)および GeneMark.hmm (nttp:// opal.biology.gatech.ed u/GeneMark/eukhmm.cgi)による解析を行った。 RiceGAASは GENSCAN、 RiceHM M、 MZEFなど複数のプログラムによる遺伝子予測並びに BLASTX検索を同時に行う 。 GeneMark.hmmはォォムギを含むいくつかの真核生物の ORFsを予測することが出 来る。予測されたタンパク質のアミノ酸配列との類似性検索を Blastp検索で行った。
[0158] 3.2結果と考察
3.2.1 BAC塩 §R列決定
4個の BAC (M102J11, M111L15, M045M08, M185K11)の全塩基配列のうち重複 部分を除き、 406,323bpのバーチャルゲノムコンティグを得た。 102J11の小さなギヤッ プは解消しなかった。理由は、 vrslはこのギャップには存在せず、 406,323bpのバー チャルゲノムコンテイダに存在することが、後述するマーカー解析で明らかになつたた めである。重複部分において、双方の塩基配列が一致しない部分が 5力所だけあつ た。すなわち、 3箇所の 1塩基置換と 1力所の挿入'欠失 (29 base)、および 1力所の T A反復配列の反復回数の違 、である。後述する vrsl候補遺伝子領域ではこのような 不一致は存在しなカゝつた。
[0159] 3.2.2 yrsl候補遣伝子の同定
Blastn解析力 406,323 bpの配列が麦類の 19の ESTs塩基配列と類似することが明 らかになつた。このうち 4個の ESTは 406,323 bpの配列中での反復が確認された。残る 15の ESTのうち、 12は反復配列であることがォォムギーコムギ染色体添カ卩系統を使つ た解析で明らかになった力 それ以外の 3 EST (E18、 E30、 E42)はユニークな配列で あつため、これらを遺伝マーカー化した。すなわち、 GeneMark.hmmを用いて E18、 E3 0、 E42の検索を試みたところ、 44個の遺伝子が予測された。このうちの大多数はゲノ ムの高度反復配列であり、形態形成との関連を明確に示唆する遺伝子は homeobox 遺伝子 (本発明者らが仮に命名）一個だけであった (領域は 164217-165109)。
[0160] 〔実施例 4〕変異体解析
4.1材料 方法
4.1.1二^^ π の
ニ条品種の 'Bonus '、 ' Foma'、 ' Kristina'力ら誘発した 41系統の hexastichon (hex-v) と 16系統の Intermedium spike-d (Int- d)突然変異体を利用した。 hex-v突然変異体は 穂の側列小穂がよく発達し、芒が伸長し、通常の六条性品種の穂ときわめて近い形 態を示す。 Int-d突然変異体は穂の側列小穂の発達程度がニ条性と六条性の中間 で、芒の長さは変異体系統によって様々であり、環境による影響も受ける。 hex-vと Int -d 、ずれも vrs 1の対立遺伝子である。
[0161] 4.1.2突然栾異体系統のマーカー解析による条件を支西 Rする遣伝 領 ¾欠¾系統 の検索
SDS法により、突然変異体およびその原品種力もゲノム DNAを抽出した。条性を支 配する遺伝子の欠損を調べる目的で vrsl遺伝子と密に連鎖する 16の分子マーカー を使用して PCR解析を行った。 [0162] 4.1.3突然栾異体系統の条件を支 §Rする遺伝子の DNA塩某 §R列栾異解析
突然変異体および原品種のゲノム DNA力 オリゴヌクレオチドプライマー Ml 11L15F 84204 (5'- GAAAGATGATTGCCAACTACC -3，）（配列番号： 66)および M111L15R 86329 (5'- GTCATAACTCGGCAAACATAG -3，）（配列番号： 67)を用いて条性を支 配する遺伝子を増幅した。増幅断片のプラス'マイナス鎖は以下のオリゴヌクレオチド プライマーを用いて塩基配列の決定を行った。 ABI3130 automated DNA sequencer を使用した。
M111L15F84204 (5 - GAAAGATGATTGCCAACTACC - 3') (配列番号： 68) M111L15R84648 (5 - ATAGGGCTTCAAGATCGGCAG -3') (配列番号： 69) M111L15F84603 (5 - ATAGAGGCGACTTTTCCGGAG -3') (配列番号： 70) M111L15R85203 (5 - ACAAGAACAAGACGCTCGAGG -3') (配列番号： 71) M111L15F85106 (5 - CCAGTGTGAGTGTATGCGAGC -3') (配列番号： 72) M111L15R85696 (5 - TCACGATCCCTTCTTTCCCTC -3') (配列番号： 73) M111L15F85545 (5 - CCGGTGAAACTGAAGCTACTG -3') (配列番号： 74) M111L15R86124 (5 - TCCGAATGAAATGAACTCTGC -3') (配列番号： 75) M111L15F86010 (5 - CCACATTAGCATTGACCTGAG -3') (配列番号： 76) M111L15R86329 (5 - GTCATAACTCGGCAAACATAG - 3') (配列番号： 77)
[0163] 4.2 ^y^m
4.2.1 然 虽体に靜,られるゲノム一部 指による遣伝早の絞り认み
原品種には欠損が全く見つ力もな力つたのに対し、 6系統の hex-v突然変異体 (hex - v.3、 hex-v.10, hex- v.ll、 hex- ν.18、 hex- v.35、 hex- v.41)においては明らかなゲノ ムの一部分の欠損が見つ力つた（図 3)。これらの欠損は突然変異体における表現型 の変化の原因と考えられる。共通の欠損領域は最大 E30と 669N11-T7の間であり、こ れは 253kbにわたり（8998-262406)、この領域には前述の homeobox遺伝子が含まれ る。さらに、一個の欠損突然変異体 (hex-v.33)において、欠損領域が最大 351N10- T7 (203-392)力 E42の間の 81kb (83226-164320)にわたつた。これは homeobox遺伝 子の 3'非翻訳領域を含む。
[0164] 以上の結果は homeobox遺伝子が条性を支配する遺伝子座の原因遺伝子であるこ とを強く示唆する。これらの欠損突然変異体はいずれも中性子線、 X線、ガンマ線で 誘発されたものである。一方、 Int-d突然変異体には、 PCR解析結果を見る限り欠損 突然変異体は見られなかった。 Int-d突然変異はその表現型や遺伝様式から、完全 な機能欠損ではなく機能を多少保持した突然変異と考えられる。今回の実験結果は 、既往知見とよく一致する。
[0165] 4.2.2突然栾異体系統の条件を支 §Rする遺伝子の DNA塩某 §R列栾¾
homeobox遺伝子を含むゲノム塩基配列を原品種と突然変異体の間で比較した（図 4 1〜図 4 11)。原品種 (3品種)の homeobox遺伝子には塩基配列変異が全く認 められな力つた。これに対し、突然変異体においては、上記 6欠損系統 (hex-v.3、 hex - ν.10、 hex- v.l l、 hex- ν.18、 hex- v.35、 hex- v.41)の homeobox遺伝子欠損を別にす れば、アミノ酸非同義置換や終止コドン形成をもたらす塩基置換が最も多く認められ 、次に、読み枠シフトをもたらす小数塩基の欠失が多く認められた。さらに、 mRN プライシングの修飾をもたらすと考えられる塩基置換も認められた。以上のことから、 h omeobox遺伝子が条性を支配する遺伝子座の原因遺伝子であることが証明された。
[0166] 〔実施例 5〕遺伝子発現解析
5.1材料 方法
屋外で播種後約 5ヶ月のォォムギ植物から葉身および幼穂（l-50mm)を実体顕微 鏡下で摘出した。 RNAを Trizol method (Invitrogene)で抽出した。 First strand cDNA は Superscript IIキット（Invitrogene)を用いて合成した。 RT- PCRによる増幅 DNAはァ ガロースゲルで電気泳動して観察した。
[0167] 5.2結果と考察
homeobox遺伝子の発現は幼穂組織で観察され、葉身では観察されなかった（図 5) 。幼穂では 1〜5 mmの ¾ の double ridge stage力ら awn primordium stageで特に 7舌 発な発現が認められ、発達段階が進むにつれて発現量は低下した。対照として用い たァクチン遺伝子は組織、発達段階の別なく一定量の発現が観察された。このように homeobox遺伝子は確かに転写活性を持ち、ォォムギの条性が決定される以前から 穂において発現することから、条性遺伝子 vrs 1の原因遺伝子であると証明された。 産業上の利用可能性 [0168] ォォムギにはニ条性品種と六条性品種が知られて 、る。そして条性は、粒数、粒形 、粒大の決定に大きな作用を及ぼし、収量を直接的に左右する。例えば、六条ォォ ムギはニ条ォォムギに比べて粒数が 3倍になるため、高収量である。従って、六条ォ ォムギは飼料などに有用である。一方、二条ォォムギは粒大の「揃い」がよぐ従って 麦芽製造における発芽時均一性に優れる。今日ニ条ォォムギは、その製造効率の 良さ力 、日本やヨーロッパにおいてはもっぱらビール醸造に有用である。このように 、六条ォォムギとニ条ォォムギは、それぞれの適正や経済性、入手の困難性等に応 じて、有用な用途を有している。
[0169] 本発明によって、ォォムギの条性や穂の形態の決定に関与する遺伝子の染色体 上の位置および遺伝子の構造が提供された。本発明にお!/、て提供される Vrsl遺伝 子またはその変異体をォォムギに導入し、発現を制御することによって、ォォムギの 条性ゃ穂の形態を改変し得る可能性が見出された。すなわち、本発明の Vrsl遺伝子 またはその変異体を利用し穂の主列 '側列のバランスをアレンジすることにより、目的 にあった形を作り出すことが可能となった。また、ォォムギの赤かび病抵抗性を増加 させうる可能性が見出された。
[0170] ォォムギは生け花として流通している。従って、ニ条性に改変されたォォムギ、六 条性に改変されたォォムギ、ニ条性と六条性の中間性に改変されたォォムギは、生 け花に供することが可能であり、観賞用の植物として有用である。特に、ニ条性と六 条性の中間性の形質に改変されたォォムギは変種としての価値が高ぐ有用である

Claims

請求の範囲
[1] 以下（a)〜（e)のいずれかに記載の DNA;
(a)配列番号: 3に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA、
(b)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA、
(c)配列番号： 3に記載のアミノ酸配列にお 、て 1もしくは複数のアミノ酸が人工的に 置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする DNA、
(d)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNA、
(e)配列番号： 1または 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジ ントな条件でノ、 イブリダィズするォォムギ由来の DNAであって、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする DNA。
[2] 以下（a)〜（d)のいずれかに記載の DNA;
(a)請求項 1に記載の DNAの転写産物と相補的な RNAを発現する DNA、
(b)請求項 1に記載の DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNAを発現する DNA、
(c)請求項 1に記載の DNAの発現を共抑制効果により阻害する RNAを発現する DNA
(d)請求項 1に記載の DNAの転写産物を特異的に切断する RNAi活性を有する RNA を発現する DNA。
[3] 請求項 1または 2に記載の DNAを含むベクター。
[4] 請求項 1または 2に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
[5] 請求項 1または 2に記載の DNAが導入された形質転換ォォムギ細胞。
[6] 請求項 5に記載の形質転換ォォムギ細胞を含む形質転換ォォムギ。
[7] 請求項 6に記載の形質転換ォォムギの子孫またはクローンである、形質転換ォォム ギ。
[8] 請求項 6または 7に記載の形質転換ォォムギの繁殖材料。
[9] 請求項 6または 7に記載の形質転換ォォムギの製造方法であって、請求項 1または 2 に記載の DNAをォォムギ細胞に導入し、該ォォムギ細胞力 ォォムギを再生させる 工程を含む方法。
[10] 請求項 1 (a)、 (b)または（e)に記載の DNAをニ条性ではな ヽォォムギの細胞内で発 現させる工程を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法。
[11] 請求項 1 (c)または (d)に記載の DNAを二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程 を含む、ォォムギの条性または穂の形態を改変する方法。
[12] 請求項 2に記載の DNAを二条性ォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォム ギの条性または穂の形態を改変する方法。
[13] 請求項 1または 2に記載の DNAをォォムギの細胞内で発現させる工程を含む、ォォ ムギに赤かび病抵抗性を付与する方法。
[14] 請求項 1または 2に記載の DNA、または請求項 3に記載のベクターのいずれか 1つを 含む、ォォムギの赤かび病抵抗性を増カロさせる薬剤。
[15] 請求項 1に記載の DNAの部分配列力 なる DNA。
[16] 配列番号: 4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA。
[17] 請求項 1に記載の DNAの全部または一部を増幅するプライマーセット。
[18] 以下（a)〜（r)のいずれかに示す、少なくとも 1つのプライマーセット；
(a)配列番号： 30に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 31に記載の塩基 配列からなる DNA、
(b)配列番号： 32に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 33に記載の塩基 配列からなる DNA、
(c)配列番号： 34に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 35に記載の塩基 配列からなる DNA、
(d)配列番号： 36に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 37に記載の塩基 配列からなる DNA、
(e)配列番号： 38に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 39に記載の塩基 配列からなる DNA、
(f)配列番号： 40に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 41に記載の塩基 配列からなる DNA、 (g)配列番号： 42に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 43に記載の塩基 配列からなる DNA、
(h)配列番号： 44に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 45に記載の塩基 配列からなる DNA、
(i)配列番号： 46に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 47に記載の塩基 配列からなる DNA、
(j)配列番号： 48に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 49に記載の塩基 配列からなる DNA、
(k)配列番号： 50に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 51に記載の塩基 配列からなる DNA、
(1)配列番号： 52に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 53に記載の塩基 配列からなる DNA、
(m)配列番号： 54に記載の塩基配列からなる DNAおよび配列番号： 55に記載の塩基 配列からなる DNA、
(n)配列番号： 56に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 57に記載の塩基 配列からなる DNA、
(o)配列番号： 58に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 59に記載の塩基 配列からなる DNA、
(P)配列番号： 60に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 61に記載の塩基 配列からなる DNA、
(q)配列番号： 62に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 63に記載の塩基 配列からなる DNA、
(r)配列番号： 64に記載の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号： 65に記載の塩基 配列からなる DNA。
[19] 請求項 1に記載の DNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも 15の連続する塩基 を含む DNA。
[20] 以下の（a)〜（c)の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致すると きに、ォォムギがニ条性であると判定する方法； (a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から請求項 1に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNA断片の分子量または塩基配列を、請求項 1 (a)、（b)または ( に 記載の DNAのそれと比較する工程。
[21] 以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、 ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から請求項 1に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した二本鎖の DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(d)分離した二本鎖 DNAのゲル上での移動度を、請求項 1 (a)、 (b)または (e)に記 載の DNAのそれと比較する工程。
[22] 以下の（a)〜（e)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、 ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から請求項 1に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程、
(d)解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e)分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を、請求項 1 (a)、 (b)または（e)に記 載の DNAのそれと比較する工程。
[23] 以下の（a)〜（d)の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、 ォォムギがニ条性であると判定する方法；
(a)ォォムギカも DNA試料を調製する工程、
(b)該 DNA試料から請求項 1に記載の DNA領域を増幅する工程、
(c)増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
(d)分離した DNAのゲル上での移動度と、請求項 1 (a)、 (b)または（e)に記載の DNA のそれと比較する工程。
[24] 以下の（a)および (b)の工程を含む、二条性ォォムギを選抜する方法；
(a)二条性ォォムギと、ニ条性ではないまたは条性が不明であるォォムギとが交配さ れたォォムギを作製する工程、
(b)請求項 20〜23の 、ずれかに記載の方法により、工程 (a)で作製されたォォムギ がニ条性であるカゝ否かを判定する工程。
[25] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)請求項 1に記載の DNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
(b)請求項 1に記載の DNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)請求項 1に記載の DNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程。
[26] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)ォォムギカゝら採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
(b)請求項 1に記載の DNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを 変化させた被検化合物を選択する工程。
[27] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
(a)請求項 1に記載の DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的 に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程、
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
[28] 被検ゲノム断片が請求項 1に記載の DNAによりコードされるタンパク質の標的配列を 有する力否かを判定する方法であって、以下の（a)および (b)の工程を含み、請求項 1に記載の DNAによりコードされるタンパク質力 被検ゲノム断片と機能的に結合した レポーター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項 1に記載の DNA によりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されること を特徴とする方法；
(a)細胞または細胞抽出液において、請求項 1に記載の DNAによりコードされるタン ノ ク質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有する DNAを接触させ る工程、
(b)レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程。
[29] 被検ゲノム断片が請求項 1に記載の DNAによりコードされるタンパク質によって発現 制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の（a)および (b)の 工程を含み、請求項 1に記載の DNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片 上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項 1に記載の D NAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定され ることを特徴とする方法；
(a)細胞または細胞抽出液において、請求項 1に記載の DNAによりコードされるタン パク質と、被検ゲノム断片を含む DNAを接触させる工程、
(b)被検ゲノム断片力ゝらの遺伝子発現の有無を測定する工程。
[30] 請求項 25〜29のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
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