JP2007143479A - スキゾキトリウム属の微生物を用いた長鎖高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】高度不飽和脂肪酸含有リン脂質生産能を有するスキゾキトリウム属の微生物を培養することにより、高度不飽和脂肪酸含有リン脂質、特にPC-DHA及びこれを含む組成物、PC-DHAである新規化合物を得ることができる。本発明は、そのような高度不飽和脂肪酸含有リン脂質、特にPC-DHA、新規化合物、及びそれらを含む組成物も提供する。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は、式I:
式Iに示すように、本発明の化合物(1-Pentadecanoyl-2-docosahexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: 通称 Pentadecanoyl-docosahexanoyl-lecithine)は、PCのグリセロールの1位にC15:0の脂肪酸が、2位にC22:6の脂肪酸がそれぞれエステル結合した化合物であり、以下に詳しく説明するPC-DHAの一種である。
本発明はまた、スキゾキトリウム属F26-b株の微生物(FERM AP-20727)又は、18S rRNAの配列が配列番号:1と99.3%以上相同であって、請求項1に記載の化合物の生産能を有する、その変異体を提供する。
本発明の微生物は、例えば次のような、非特許文献2に記載のフィルター法により、天然海水中から容易に単離することができる。すなわち、沿岸から堆積物や落葉、海藻などと共に採取した沿岸海水を濾紙(例えば平均孔径25μm)で濾過することにより大きな浮遊物等を除去し、次いでメンブランフィルター(例えば孔径0.8μm)で濾過し、目的の微生物を含む粒径0.8〜25μmの粒子をメンブランフィルター上に捕捉する。このフィルターを、培地(例えばペニシリンG及びストレプトマイシンをそれぞれ800及び365u/mL含有するPDA培地)上にのせて培養する。フィルター上に多数出現したコロニーの中から、例えば色、艶、形状、そして顕微鏡観察により所望の微生物のコロニーを選別し、培地(例えばGY平板培地)上に接種する。培地上で増殖の認められる株をスラント等に保存すると共に、当業者に公知の手法を用いて液体培養して脂質含量と脂肪酸組成を分析し、例えば培養液の光学密度(OD610)、乾燥細胞中のDHA含有率等を指標に、増殖性及びDHA生産性の良好な株を選抜することが出来る。菌株の分離及び/又は保存には、例えばポテト−デキストロース寒天培地を50%人工海水で調製し、必要に応じスラントあるいは滅菌シャーレ中に平板培地として使用することができる。
本発明の微生物の培養は、海水及び/又は人工海水を用いて調製した適当な培地に微生物を接種し、当業者に公知の手法を用いて行うことが出来る。
培地には、例えば液体培地及び/又は寒天培地を用いることができる。より具体的には、例えば、3%グルコースと1%酵母エキスとを含むGY培地を50%人工海水で調製し、液体培地又は1.5%寒天で平板培地として使用することができる。
培地を調製した後、適当な酸又は塩基を用いて、pHを4.0〜9.5、好ましくは6.0〜7.0の範囲に調製し、オートクレーブ等を用いて滅菌することができる。
微生物の培養は、培養温度10℃〜45℃、好ましくは25〜28℃にて、通常3〜14日間(特に培養量が多い場合には14日程度)、振とう培養、静地培養、タンク中での工業的培養、寒天培地等の固形培地での培養等により、培地中で微生物を増殖させることができる。例えば、pHを6.0に調整後、28℃のインキュベータ内で、寒天平板培地で4〜5日、液体培地では110strokes/分で振とうしながら3日間行うことができる。大量培養には、例えば10L容ジャーファーメンター中に6LのGY培地を0.1%のシリコン系消泡剤と共に入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した後、GY培地中で定常期に達した100mLの培養液を接種し、28℃、0.5vvmの空気通気、攪拌速度400rpmで5日間培養することができる。
上記の微生物は天然から採取したものでもよく、また、本発明の化合物、長鎖高度不飽和脂肪酸含有リン脂質、PC-DHA生産能を有するよう設計された変異体及び/又は組換え体も、本発明の範囲内に含まれる。このような変異体及び/又は組換え体は、同組成の培地を用いて培養したときに野性株と比べてこれらの生産能が高くなるよう意図して設計されたものが含まれる。上記化合物の「生産能を有する」とは、有効な条件で培養したときに上記の化合物を生産することをいう。有効な条件は、当業者であれば適宜決定できる。
本発明はまた、上記の微生物又は変異体を用いることを特徴とする、上記の化合物の製造方法を提供する。製造方法は、下記に詳しく述べる。
本発明はまた、上記の微生物又は変異体を培地で培養し;得られた培養物から、長鎖高度不飽和脂肪酸(好ましくは炭素数16以上で不飽和結合2以上の脂肪酸、より好ましくは炭素数20以上で不飽和結合2以上の脂肪酸、さらに好ましくはDHA)含有リン脂質(好ましくはホスファチジルコリン(PC))を採取することを含む、PC-DHAを含有する食品又は医薬用組成物の製造方法を提供する。このような製造方法で得られた組成物は、海水等に由来する不純物をほとんど含まないものになるため、食品や医薬品用に特に適する。
本明細書中において、リン脂質とは、グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質を指し、特にグリセロリン脂質を指す。更に特定すれば、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルコリン(PC)、リゾホスファチジルコリン(LPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)及びホスファチジルイノシトール(PI)を指す。グリセロールの1位及び/又は2位にエステル結合した脂肪酸の少なくとも1つが長鎖高度不飽和脂肪酸である場合、該化合物を特に長鎖高度不飽和脂肪酸含有リン脂質という。エステル結合した脂肪酸の少なくとも1つが長鎖高度不飽和脂肪酸であれば、他の脂肪酸の炭素数及び不飽和度に関わらず、該化合物を長鎖高度不飽和脂肪酸含有リン脂質という。
本発明はまた、前記組成物中において、前記培養物由来である全脂質についてGCを用いて各脂肪酸を定量した場合、全脂質の15%以上(好ましくは30%以上、より好ましくは35%以上)がC15:0であり、全脂質の15%以上(好ましくは30%以上、より好ましくは33%以上)がDHAである、前記の製造方法を提供する。本発明はまた、前記組成物中において、前記培養物由来である全リン脂質についてGCを用いて各脂肪酸を定量した場合、脂肪酸のの10%以上(好ましくは15%以上、より好ましくは20%以上)がC15:0であり、脂肪酸の30%以上(好ましくは40%以上、より好ましくは50%以上)がDHAである、前記の製造方法を提供する。本発明はまた、前記組成物中において、前記培養物由来である脂肪酸含有PCについてGCを用いて1位の脂肪酸を定量した場合に脂肪酸の35%以上(好ましくは45%以上、より好ましくは50%以上)がC15:0である、前記の製造方法を提供する。本発明はまた、前記培養物由来である脂肪酸含有PCについてGCを用いて2位の脂肪酸を定量した場合に脂肪酸の40%以上(好ましくは50%以上、より好ましくは55%以上)がDHAである、前記の製造方法を提供する。
前記のように微生物から抽出した高度不飽和脂肪酸含有リン脂質を含む組成物について、例えば以下の実施例に記載するような当業者に公知の分析手法を用いて、全脂質、中性脂質、糖脂質、リン脂質等を分画し、各画分を定量することができる。また、分画した各脂質についても、例えば以下の実施例に記載するような当業者に公知の手法を用いて、それぞれ脂肪酸組成を調べることができる。
本発明はまた、上記の化合物を含む、食品又は医薬用組成物を提供する。
本発明はまた、癌又はレム睡眠に関連した疾患又は状態を処置するための、上記の組成物を提供する。
F26-b株における全脂肪酸の組成分析 (Qiu X, Hong H, MacKenzie SL. J Biol Chem. (2001) 276, 31561の手法に従って行った)
(1.菌体の培養と回収)
ラビリンチュラ目に属するF26-b株の菌体(林雅弘先生(宮崎大学)より御分与頂いた。FERM AP-20727)をGY培地(pH 6.0、グルコース 3.18g、酵母エキス 1.06g、ストレプトマイシン 0.05g、50%人工海水 100ml) 300ml中で4日間、25℃、150rpmで培養した。3,000rpmで10分遠心し、上清を除去した。0.9% NaClを適当量加え、よく懸濁し、次いで3,000rpmで10分遠心し、上清を除去する作業を繰り返した。超純水を適当量加え、よく懸濁し、3,000rpmで10分遠心し、上清を除去した後、回収した菌体を凍結乾燥した(1.0g)。
1の工程で回収した菌体に20mlのクロロホルム/メタノール混液(2/1)を加え、超音波処理で菌体を破壊した。3,000rpmで15分間遠心し、上清を回収した。沈殿に20mlのクロロホルム/メタノール混液(2/1)を加え、再度脂質を抽出した。上清を遠心で集め、先の上清合わせ、分液ロートに移した。8mlの2% KCl溶液を加え、二層分配した。下層を回収し、エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物を10mlのクロロホルム/メタノール混液(2/1)に溶解し、適当量を試験管に移しメチル化後、脂肪酸の分析を行った。
2で得た濃縮乾固したサンプルに2mlの3N methanolic HClを添加し、80℃で、一晩インキュベートした。室温まで冷まし、1mlの0.9% NaClを添加した。2mlのn-ヘキサンを加えてボルテックスし、次いで3,000rpmで10分遠心し、上層(ヘキサン層)を回収する作業を繰り返した。無水硫酸ナトリウムを少量添加した後、ろ過によって無水硫酸ナトリウムを除去し、ろ液を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルを200μlのn-ヘキサンで溶解した。
3で得た試料を以下の条件で分析した。使用機材:Shimazu GC-14A (Shimazu Co., Japan)、カラム:HR-SS-10, 30 m x 0.25 mm i.d. (Shinwa Chemical Ind. Ltd., Japan) 、カラム温度: 150℃から220℃に昇温(2℃/分)。各ピークの同定はPUFA 3 standard mixture(Matreya)を使用した。
図2は、F26-b株の菌体からn-ヘキサンで抽出した全脂肪酸の組成をGCを用いて分析した結果である。保持時間23分台のピークがマーカーのDHAメチルエステル(SIGMA)の保持時間と一致することが確認されたので、さらにこのピークについてGC/MS解析を行った(図3)。その結果、標品のDHAとフラグメントが一致したので23分台のメジャーなピークはDHAであることが同定された。GC AREAをもとに算出したF26-b株の菌体の全脂質の脂肪酸組成を、表2中に示す。
この結果、F26-b株の菌体において全脂肪酸の約33%がDHAであることがわかった。また興味深いことに、飽和脂肪酸、特に哺乳動物には存在しない奇数飽和脂肪酸(C13:0、C15:0)、特にC15:0が非常に多く含まれていることが分かった。
F26-b株における中性脂質、糖脂質、リン脂質の脂肪酸分析
(全脂質の中性脂質、糖脂質、リン脂質への分離)
Sep-Pak Silica (Waters)を30mlのクロロホルムで平衡化した。濃縮乾固した全脂質を、2mlのクロロホルムに溶解し、サンプルを全量、カラムに負荷した。溶出は次の溶媒を用いて行った:クロロホルム30ml(中性脂質)、アセトン50ml(糖脂質)、メタノール20ml(リン脂質)。この順で溶出し、5mlずつのフラクションを回収した。以下の条件で、TLCによって各脂質が回収できていることを確認した。展開溶媒:n-ヘキサン/ジエチルエーテル/酢酸=80:20:1(v/v/v)(中性脂質)、クロロホルム/メタノール/水=65:25:4 (v/v/v) (糖脂質、リン脂質)。発色試薬:50%硫酸 (中性脂質)、オルシノール硫酸 (糖脂質)、Dittmer 試薬(リン脂質)。各フラクションをエバポレーターで濃縮した。FAの抽出、FAのメチル化、GCによるFA分析については、実施例1と同様の手法を用いて行った。
表1は、抽出に用いた菌体の乾燥重量と抽出した脂質重量を示す。
F26-b株におけるDHA含有リン脂質の分子種の同定(Mawatari S, Murakami K. Analytical Biochemistry. (1998) 264, 118の手法を用いて行った)
(1.HPLCを用いたリン脂質画分のクラス分離)
実施例2で回収したリン脂質画分をエバポレーターで濃縮し、200μlのn-ヘキサン/イソプロパノール=3:1(v/v)に溶解した。次の条件で分離を行った。カラム:wakosil 5 NH2 Column, 250 x 4.6 mm (和光純薬)、移動相:アセトニトリル/メタノール/0.2%トリエチルアミン=67:22:11(v/v/v)(0.2%トリエチルアミンはリン酸でpH4.0に調整)、流速:1ml/分、カラム温度:40℃、検出波長:210nm。
PC (Avanyi Polar Lipids)、PE(SIGMA)、PS (DOOSAN Serdary Research Laboratories)、PI (DOOSAN Serdary Research Laboratories)、LPC (1-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Matreya)(各1μg/μl)をマーカーとして20μlを負荷し、F26-b株由来のリン脂質画分を20μl負荷した。マーカーの保持時間に従って、クラスごとに試験管に回収した。エバポレーターで回収したサンプルを濃縮し、2mlのクロロホルム/メタノール=2:1(v/v)を加え、400μlの2%KCl溶液を添加した。よくボルテックスし、3,000rpmで5分遠心をかけ、上層を除き、残った下層を窒素ガスで濃縮乾固した。
濃縮乾固したサンプルに2mlのジエチルエーテルを加え、よく懸濁した。酵素液(200 mM Tris-HCl buffer (pH9.0)、6 mM CaCl2、PLA2(ホスホリパーゼA2、Naja mossambica mossambica由来; SIGMA))を調整し、5Unitを100μl加え、2分ボルテックスした。37℃で2時間インキュベートした。窒素ガスでジエチルエーテルを除き、2mlのクロロホルム/メタノール=2:1(v/v)を加え、400μlの2%KCl溶液を添加した。よくボルテックスし、3,000rpmで5分遠心した。下層を回収し、残った上層に1mlのクロロホルムを添加した。よくボルテックスし、3,000rpmで5分遠心した。下層を回収し、先に回収した分と合わせ、300μlを分取し、以下の条件でTLCによって反応産物を確認した。展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=65:25:4(v/v/v)、発色試薬:50%硫酸、Dittmer試薬。残りは窒素ガスで濃縮乾固した。
Sep-Pak Silica (Waters)を30mlのクロロホルムで平衡化し、濃縮乾固したサンプルを、2mlのクロロホルムに溶解した。サンプルを全量、カラムに負荷し、次の溶媒で溶出した:クロロホルム30ml(遊離脂肪酸)、アセトン10ml、メタノール20ml(リゾリン脂質)。この順で溶出し、溶媒ごとにフラクションを回収した。以下の条件で、TLCによって脂肪酸が精製できていることを確認した。展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=65:25:4(v/v/v)、発色試薬:50%硫酸(遊離脂肪酸)、Dittmer試薬(リゾリン脂質)。クロロホルム画分とアセトン画分を合わせて、濃縮乾固し、sn-2位の脂肪酸組成を分析した。さらに、メタノール画分も濃縮乾固し、sn-1位の脂肪酸組成を分析した(PLA2によって遊離する脂肪酸を2位、残りの脂肪酸(リゾリン脂質の脂肪酸)を1位の脂肪酸とする)。
FAのメチル化、GCによるFA分析については、実施例1と同様の手法を用いて行った。
F26-b株から抽出したリン脂質画分を、HPLCを用いてPC、LPC、PE、PI、PSの各種リン脂質クラスに分離した(図4)。HPLCのクロマトグラムから5分台にPC、10分台にLPC、13分台にPE、18分台にPI、25分台にPSが溶出することがわかった。
表3は、HPLCのAREA比から算出した各リン脂質クラスの割合を示す。
新規PC-DHAの構造決定
(1.HPLCを用いたPC画分の脂肪酸種による分離)
F26-b株に最も多く含まれる、DHA含有PCの構造を決定するため、さらに含有する脂肪酸種によるPCの分離を行った。分離にはMalissa Smith and Firoze B. Jungalwala. 1981. J. Lipid Res. 22: 697-704 中に記載の手法を参照した。
分離条件は以下の通りである。カラム:Inertsil ODS-3 (4.0×250 mm)、移動相:メタノール/1 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.4)=9.5:0.5、検出波長:205 nm、流速:1 ml/min、温度:30℃。
実施例3で回収したPC画分を窒素で乾固し、クロロホルム(適当量、約100〜200μl)に溶解した。10μlを上記の条件でHPLCに負荷した。各ピークを回収し、エバポレーターで濃縮した。HPLCのチャートを図5に示す。
HPLCによって分離した各PC画分において最も占有率の高かった、図5中3番のピークについて、GCを用いて、脂肪酸組成を分析した。GCのチャートを図6に示す。
GC分析により図5中3番ピークにおける脂肪酸組成が、C15:0及びDHAを含むPCであることが確認されたので(図6)、FAB-MS及びNMR測定を行い、構造決定を行った。図7はFAB-MS(negative)、図8はFAB-MS(positive)の結果を示す。また、図9は1H NMR、図10は2次元NMRの結果である。その結果、図11に示すような構造を持つ化合物であることがわかった。測定に際し、Nancy J. Jensen, Kenneth B. Tomer and Michael L. Gross. 1986. Lipids. 21: 580-581及び Holly C. Gaede, Ruth E. Stark. 2001. J. Chem. EduC. 78: 1248-1250を参照した。
今回決定された、2位にDHA、1位にC15:0の奇数の脂肪酸が結合しているPCは世界で最初の発見である。また哺乳類の脳の場合、PLA2の働きでリン脂質から遊離したDHAは核内レセプターのリガンドとして、転写を調節するシグナル分子の働きをもつことが報告されている(de Urquiza AM, Liu S, Sjoberg M, Zetterstrom RH, Griffiths W, Sjovall J, Perlmann T. Science. (2000) 290, 2140)。ラビリンチュラ目の微生物においてホスホリパーゼによってDHAが遊離する場合、哺乳類と同様に原生生物であるラビリンチュラ目の微生物においても、DHAがシグナル分子として働く可能性が示唆される。
F26-b株の18S rDNA解析
F26-b株の分子系統解析を行った。菌体から分離、精製した全ゲノムDNAをもとに、PCRで18S rRNA遺伝子(18S rDNA)を増幅した。このPCR産物をシークエンサーで全塩基配列を解析した。得られたF26-b株の18S rDNAの全塩基配列(1755bp、配列番号:1)をもとに、データベース(NCBI blast)で検索したところ、Schizochytrium sp. FJU-512と高い同一性(1744/1757 x100= 99.2601%)を持つことが分かり、また、その分裂様式についても、顕微鏡下の観察で二分裂することが確認されたので、F26-b株はスキゾキトリウム属の菌体であると結論した。図12は、18S rRNA遺伝子について、F26-b株(上段)と、FJU-512(下段)とを比較した図である。また、18S rRNA遺伝子の解析に基づく系統樹を、図13に示す。
Claims (6)
- 式I:
- スキゾキトリウム属F26-b株の微生物(FERM AP-20727)又は、18S rRNAの配列が配列番号:1と99.3%以上相同であって、請求項1に記載の化合物の生産能を有する、その変異体。
- 請求項2の微生物又は変異体を用いることを特徴とする、式Iの化合物の製造方法。
- 請求項2の微生物又は変異体を培地で培養し;
得られた培養物から、長鎖高度不飽和脂肪酸(好ましくは炭素数16以上で不飽和結合2以上の脂肪酸、より好ましくは炭素数20以上で不飽和結合2以上の脂肪酸、さらに好ましくはDHA)含有リン脂質(好ましくはホスファチジルコリン(PC))を採取することを含む、
PC-DHAを含有する食品又は医薬用組成物の製造方法。 - 請求項1に記載の化合物を含む、食品又は医薬用組成物。
- 癌又はレム睡眠に関連した疾患又は状態を処置するための、請求項5に記載の組成物。
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Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010060722A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Nestec S.A. | A nutritional composition comprising probiotics and improving sleep patterns |
WO2011037207A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 国立大学法人九州大学 | ストラメノパイルの形質転換方法 |
KR101185596B1 (ko) | 2010-02-10 | 2012-09-24 | 주식회사 지니스 | Dha 생산성을 향상시킨 스키조키트리움 속 jbf-06 균주와 이를 이용한 dha 생산방법 |
KR20140032939A (ko) | 2010-10-01 | 2014-03-17 | 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 | 스트라메노파일의 형질 전환 방법 |
JP2014522635A (ja) * | 2011-06-23 | 2014-09-08 | ロケット フレール | シゾキトリウム属(Schizochytriumsp.)の突然変異誘導の方法及びそれから産生された変異体 |
WO2015152144A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 日本水産株式会社 | 脂質の分画方法 |
JP2016053156A (ja) * | 2014-09-02 | 2016-04-14 | 日清ファルマ株式会社 | 高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法 |
WO2019135386A1 (ja) * | 2018-01-04 | 2019-07-11 | 備前化成株式会社 | 重水素化リン脂質およびその製造方法 |
EP3559206A4 (en) * | 2016-12-22 | 2020-12-30 | Mara Renewables Corporation | PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF BIOMASS RICH IN DHA, PALMITIC ACID AND PROTEIN USING A MICRO-ORGANISM EUKARYOTE |
KR20220123222A (ko) | 2019-12-26 | 2022-09-06 | 마루하 니치로 가부시키가이샤 | 다가 불포화 지방산이 결합한 인지질을 포함하는 어란 지질 조성물 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1072590A (ja) * | 1995-09-14 | 1998-03-17 | Agency Of Ind Science & Technol | (n−6)系ドコサペンタエン酸含有油脂ならびに該油脂の製造方法および用途 |
WO2003011873A2 (en) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Neptune Technologies & Bioressources Inc. | Natural marine source phospholipids comprising flavonoids, polyunsaturated fatty acids and their applications |
JP2003052357A (ja) * | 2001-08-10 | 2003-02-25 | Japan Science & Technology Corp | 海洋性微生物と、この微生物を用いたカロテノイド系色素および/または高度不飽和脂肪酸の製造方法 |
JP2004536059A (ja) * | 2001-05-14 | 2004-12-02 | マーテック バイオサイエンシズ ボールダー コーポレーション | 微生物、遺伝的に改変された植物種子および海洋生物由来のω−3および/またはω−6高度不飽和脂肪酸を含有する極性脂質の豊富な画分の生成および使用 |
-
2005
- 2005-11-28 JP JP2005342182A patent/JP4344827B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH1072590A (ja) * | 1995-09-14 | 1998-03-17 | Agency Of Ind Science & Technol | (n−6)系ドコサペンタエン酸含有油脂ならびに該油脂の製造方法および用途 |
JP2004536059A (ja) * | 2001-05-14 | 2004-12-02 | マーテック バイオサイエンシズ ボールダー コーポレーション | 微生物、遺伝的に改変された植物種子および海洋生物由来のω−3および/またはω−6高度不飽和脂肪酸を含有する極性脂質の豊富な画分の生成および使用 |
WO2003011873A2 (en) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Neptune Technologies & Bioressources Inc. | Natural marine source phospholipids comprising flavonoids, polyunsaturated fatty acids and their applications |
JP2003052357A (ja) * | 2001-08-10 | 2003-02-25 | Japan Science & Technology Corp | 海洋性微生物と、この微生物を用いたカロテノイド系色素および/または高度不飽和脂肪酸の製造方法 |
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9034314B2 (en) | 2008-11-03 | 2015-05-19 | Nestec S.A. | Nutritional composition comprising probiotics and improving sleep patterns |
WO2010060722A1 (en) * | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Nestec S.A. | A nutritional composition comprising probiotics and improving sleep patterns |
EP2438821A1 (en) * | 2008-11-03 | 2012-04-11 | Nestec S.A. | A nutritional composition comprising probiotics and improving sleep patterns |
EP2966169A1 (en) | 2009-09-24 | 2016-01-13 | Kyushu University | Method for transforming stramenopiles |
WO2011037207A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 国立大学法人九州大学 | ストラメノパイルの形質転換方法 |
KR101185596B1 (ko) | 2010-02-10 | 2012-09-24 | 주식회사 지니스 | Dha 생산성을 향상시킨 스키조키트리움 속 jbf-06 균주와 이를 이용한 dha 생산방법 |
KR20140032939A (ko) | 2010-10-01 | 2014-03-17 | 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 | 스트라메노파일의 형질 전환 방법 |
US9062315B2 (en) | 2010-10-01 | 2015-06-23 | Kyushu University, National University Corporation | Method for transformation of stramenopile |
US11203763B2 (en) | 2010-10-01 | 2021-12-21 | Kyushu University, National University Corporation | Microbial oil containing fatty acids obtained from stramenopile and method of producing the same |
JP2014522635A (ja) * | 2011-06-23 | 2014-09-08 | ロケット フレール | シゾキトリウム属(Schizochytriumsp.)の突然変異誘導の方法及びそれから産生された変異体 |
WO2015152144A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 日本水産株式会社 | 脂質の分画方法 |
US10870814B2 (en) | 2014-03-31 | 2020-12-22 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Methods for fractionating lipids |
JPWO2015152144A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2017-04-13 | 日本水産株式会社 | 脂質の分画方法 |
JP2016053156A (ja) * | 2014-09-02 | 2016-04-14 | 日清ファルマ株式会社 | 高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法 |
EP3559206A4 (en) * | 2016-12-22 | 2020-12-30 | Mara Renewables Corporation | PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF BIOMASS RICH IN DHA, PALMITIC ACID AND PROTEIN USING A MICRO-ORGANISM EUKARYOTE |
US11198891B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-12-14 | MARA Renewables Corporation | Methods for producing biomass rich in DHA, palmitic acid and protein using a eukaryotic microorganism |
JPWO2019135386A1 (ja) * | 2018-01-04 | 2021-01-07 | 備前化成株式会社 | 重水素化リン脂質およびその製造方法 |
WO2019135386A1 (ja) * | 2018-01-04 | 2019-07-11 | 備前化成株式会社 | 重水素化リン脂質およびその製造方法 |
JP7279941B2 (ja) | 2018-01-04 | 2023-05-23 | 備前化成株式会社 | 重水素化リン脂質およびその製造方法 |
KR20220123222A (ko) | 2019-12-26 | 2022-09-06 | 마루하 니치로 가부시키가이샤 | 다가 불포화 지방산이 결합한 인지질을 포함하는 어란 지질 조성물 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JP4344827B2 (ja) | 2009-10-14 |
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