JP2007051081A

JP2007051081A - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: JP2007051081A
Application number: JP2005236456A
Authority: JP
Inventors: Masakuni Tako; 正邦田幸
Original assignee: University of the Ryukyus NUC
Current assignee: University of the Ryukyus NUC
Priority date: 2005-08-17
Filing date: 2005-08-17
Publication date: 2007-03-01

Abstract

【課題】アセチルフコイダンの新規用途を提供すること。
【解決手段】アセチルフコイダンまたは前記アセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とする抗腫瘍剤。硫酸化はアセチルフコイダンをＤＭＦに分散させ、三酸化イオウ−トリメチルアミンを作用させてえられる。また、原料のアセチルフコイダンはオキナワモズクを塩酸処理後、水酸化ナトリウムで中和後、エタノール抽出し、アンバーライトＩＲ−１２０で陽イオン交換、中和、透析、凍結乾燥してＮａ型の精製アセチルフコイダンを得た。
【選択図】なし

Description

本発明は、アセチルフコイダンまたは硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とする抗腫瘍剤に関する。

フコイダンは、モズク、コンブ、ワカメ、ヒジキ等に多く含まれている多糖類の１種である。このフコイダンはＬ−フコースに加え、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルクロン酸を構成糖とし、更にエステル結合した硫酸基を持つ硫酸化多糖の総称である。

これまでフコイダンには、抗コレステロ−ル作用、抗血液凝固作用等の効果が見出されており、健康補助食品の素材としてすでに利用開発され、市場で販売されている。

ところで、本発明者は、オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）から分子量が５００,０００で、Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.２、０.５〜１.０、０.８〜１.２であるアセチルフコイダンを見出し、先に特許を取得した（特許文献１）。

しかしながら、このアセチルフコイダンについての用途等については他のフコイダン程には研究されていなかったのが実情であった。
特許第３３７１１２４号

従って、本発明はアセチルフコイダンや、これから導かれる化合物の新規用途を見出すことをその課題とするものである。

本発明者はアセチルフコイダンの新たなる用途を探索すべく鋭意研究を行ったところ、アセチルフコイダンに優れた抗腫瘍活性があることを見出した。また、アセチルフコイダンの抗腫瘍活性は、アセチルフコイダンを硫酸化することで、より高められることを見出した。更に、これらアセチルフコイダンや硫酸化したアセチルフコイダンを、従来から使用されている他の抗腫瘍剤と併用することによってさらに抗腫瘍活性を高められることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はアセチルフコイダンまたはアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とする抗腫瘍剤を提供するものである。

また、本発明は上記抗腫瘍剤を含有することを特徴とする飲食品を提供するものである。

更に、本発明はアセチルフコイダンに三酸化イオウ−トリメチルアミンを作用させることにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを提供するものである。

本発明のアセチルフコイダンまたはこのアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とする抗腫瘍剤は、優れた抗腫瘍活性を有するものである。しかも、これら抗腫瘍剤と、従来から使用されてきた他の抗腫瘍剤と組み合わせることにより相乗的に抗腫瘍活性を高めることができる。

従って、本発明の抗腫瘍剤は優れた抗腫瘍活性を有するので腫瘍の治療に用いることができるとともに、日常的に飲食品として摂取することにより、腫瘍の予防を行うこともできる。

本発明の抗腫瘍剤は、アセチルフコイダンまたはアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダン（以下、これらを「アセチルフコイダン類」という）を有効成分とするものである。

本発明の抗腫瘍剤の有効成分であるアセチルフコイダンとは、酢酸基を含むフコイダンのことであり、概ね酢酸基を３.９〜８.０質量％含有するものである。また、このアセチルフコイダンの組成の一例を挙げれば、概ねＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.２、０.５〜１.０および０.８〜１.２のものである。このアセチルフコイダンはモズク等の褐藻類、好ましくはオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）から得られるものである。これら褐藻類からアセチルフコイダンを得る方法は特には限定されないが、例えば、本発明者の特許３３７１１２４号に記載の方法が挙げられる。また、このアセチルフコイダンは陽イオン交換樹脂等により陽イオン交換されたものであっても良い。

具体的に、オキナワモズクからアセチルフコイダンを得る方法を示せば次の通りである。まず、オキナワモズクの乾燥体を粉砕した後、塩酸等の酸を加えて攪拌する。次に、これを濾過し、ろ液を水酸化ナトリウム等のアルカリで中和した後、セライト５４５層（ナカライテスク製）等のカラムに通して、濃縮を行い、更にエタノールを添加し、沈殿させる。この沈殿物にエタノール等のアルコールで脱水を数回行い、更に減圧乾燥を行い粗アセチルフコイダンを得る。この粗アセチルフコイダンを塩化カルシウム等の塩水溶液に溶解し、ろ過後、ろ液をセライト５４５層等のカラムに通して一晩透析を行い、さらに凍結乾燥を行ってアセチルフコイダンを得ることができる。また、このアセチルフコイダンをアンバーライトＩＲ−１２０（Rohm & Haas社製）等の陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換を行った後、水酸化ナトリウム等のアルカリで中和、透析、凍結乾燥を行い、Ｎａ型のアセチルフコイダンを得ることができる。

また、本発明の抗腫瘍剤のもう一方の有効成分である硫酸化アセチルフコイダンは、上記アセチルフコイダンを硫酸化することにより得ることができるものであり、概ね硫酸含量が１３〜３３質量％、好ましくは１５〜３３質量％含有するものである。また、この硫酸化アセチルフコイダンの組成の一例を挙げれば、概ねＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸および硫酸の構成比がそれぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.３、０.５〜１.０および０.８〜３.６である。

この硫酸化アセチルフコイダンを得るための硫酸化の方法としては、多糖の水酸基をスルホン化可能な公知の方法であれば特に限定されないが、例えば、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、ジシクロヘキシルカルノジイミド−硫酸、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド−三酸化イオウ−トリメチルアミン等を用いる方法等が挙げられる。これらの方法の中でも、アセチルフコイダンにＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド中、三酸化イオウ−トリメチルアミンを用いた方法が好ましい。

具体的に、アセチルフコイダンに三酸化イオウ−トリメチルアミンを作用させて硫酸化アセチルフコイダンを得る方法の例を示せば次の通りである。まず、アセチルフコイダンをＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に分散させ、これに三酸化イオウ−トリメチルアミンを加えて静置する。静置後、酢酸ナトリウム等の酢酸塩を加えてエタノールで沈殿させる。この沈殿物をエタノールで洗浄後、蒸留水に溶解し、アンバーライトＩＲ−１２０（Rohm & Haas社製）等の陽イオン交換樹脂を充填したカラムを通して脱塩する。最後に水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液で中和を行い、透析後、凍結乾燥することにより硫酸化アセチルフコイダンを得ることができる。

本発明の抗腫瘍剤は、アセチルフコイダン類をそのままあるいは公知の適当な医薬担体と組み合わせ、製剤化することにより製造される。本発明の抗腫瘍剤におけるアセチルフコイダン類の含有量は、抗腫瘍活性が発揮される量であれば特に制限されないが、例えばアセチルフコイダン類の合計で２０〜８０質量％、好ましくは５０〜８０質量％である。

本発明の抗腫瘍剤は、白血病、リンパ腫、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳ガン等の腫瘍に対して有効であり、これらの腫瘍に応じた投与方法、例えば、経口投与、局所投与等の投与方法を選択することができる。また、これら抗腫瘍剤の剤形も特に制限されず、上記投与方法に応じて、錠剤、粒剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤等の経口剤や、注射剤、点滴用剤等の非経口剤等とすることができる。更に、投与量や投与回数は通常の抗腫瘍剤に準じて定めればよい。

更に、本発明の抗腫瘍剤においては、更にその他の抗腫瘍剤を併用することで、より抗腫瘍活性を高めることができる。このような併用可能な他の抗腫瘍剤としては、一般名が、シタラビン、メルファラン、シクロホスファミド、メクロレタミン、カルムスチン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アドリアマイシン、イダルビシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタクセル、ドセタクセル、シグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、フルオロウラシル、アセグラトン、アクラルビシン、ファドロゾール、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルモフール、カルボコン、カルボプラチン、シタラビンオクホシファート、ダカルバジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、エピルビシン、エピチオスタノール、エトポシド、フルタミド、ゴセレリン、ヒドロキシカルバミド、メドロキシプロゲステロン、イリノテカン、イフォスファミド、クレスチン、リュープロレリン、メルファラン、メピチオスタン、メスタノロン、ミトキサントロン、ミトタン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、ニムスチン、ナイトロジェン・マスタード、オキシメトロン、ピシバニール、ペントスタチン、ペプレオマイシン、ピラルビシン、プロカルバジン、ラニムスチン、ゾブゾキサン、タモキシフェン、チオテパ、テガフール、トレチノイン、トレミフェン、ベスタチン、テガフール・ウラシル、ビンデシン、ジノスタチン、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のものが挙げられる。このうち、アドリアマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ビンデシン、シクロホスファミド、シタラビン等と組み合わせた場合に、特に優れた効果を得ることができる。

なお、本発明の抗腫瘍剤は、通常の飲食品に含有せしめ、日常的に摂取することができる。この飲食品の製造方法は本発明の抗腫瘍剤を飲食品の原料素材等に有効量添加する以外は、通常の飲食品の製造方法に準じればよい。

これら飲食品の例としては茶飲料、栄養補助飲料等の飲料、カプセル状、錠剤状、粉末状等の栄養補助食品等の食品が挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらの実施例に限定されるものではない。

参考例１
アセチルフコイダンの製造（１）：
新鮮な養殖オキナワモズク（沖縄県知念漁業共同組合産）の乾燥体１００ｇをミキサーで５分間粉砕した。この粉砕物に全量が５００ｍｌとなるように０.０５Ｍの塩酸を加え、室温で３時間撹拌した。次にこれを吸引ろ過し、ろ液を０.０５Ｍの水酸化ナトリウムで中和した後、セライト５４５層に通して、濃縮を行い、さらに２倍量のエタノールを添加し、沈殿させた。沈殿物にエタノール脱水を数回行い、更に減圧乾燥を行い粗アセチルフコイダンを得た。この粗アセチルフコイダンを０.１Ｍの塩化カルシウム水溶液に溶解し、吸引ろ過後、ろ液をセライト５４５層に通して一晩透析を行い、さらに凍結乾燥を行って精製アセチルフコイダンを得た。

この精製アセチルフコイダンを陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０）に通し、陽イオン交換を行った後、０.０５Ｍの水酸化ナトリウムで中和、透析、凍結乾燥を行い、Ｎａ型の精製アセチルフコイダン（以下、単に「アセチルフコイダン」という）を１.４ｇ得た。

上記で得られたアセチルフコイダンの組成はＤ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸の構成比がそれぞれ４.０、０.２、１.１および０.８であった。また、バリウム沈殿法によりアセチルフコイダンの硫酸含量を測定したところ１３.５質量％であった。

実施例１
硫酸化アセチルフコイダンの製造：
参考例１で製造したアセチルフコイダン２００ｍｇをＮ,Ｎ’−ジメチルホルムアミド２０ｍｌに分散させ、三酸化イオウ６６７ｍｇを含有するトリメチルアミン複合体を加えて５０℃で２４時間静置した。静置後、酢酸ナトリウム３ｍｌを加えて冷エタノール（４℃）で沈殿させた。この沈殿物をエタノールで洗浄後、蒸留水に溶解し、陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０）を充填したカラムを通して脱塩した。次に、０.０５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で中和を行い、４℃で４８時間透析後、凍結乾燥により硫酸化アセチルフコイダン１１８ｍｇを得た。

上記で得られた硫酸化アセチルフコイダンの組成は、Ｄ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸および酢酸の構成比がそれぞれ４.０、０.２、１.１および０.８であった。また、この硫酸化アセチルフコイダンの硫酸含量をバリウム沈殿法により測定したところ、３２.５質量％であった。更に、硫酸化アセチルフコイダンの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した（図１）。この結果、硫酸化アセチルフコイダンの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの５.４２、５.３５および５.０８ｐｐｍの化学シフトは、それぞれ２,４−ジ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノース（2,4-di-O-sulfo-L-fucopyranose）、２−モノ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノース（2-mono-O-sulfo-L-fucopyranose）および４−モノ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノース（4-mono-O-sulfo-L-fucopyranos）のアノメリックプロトンの化学シフトの文献記載（Ribeiro A.-H., et al., Carbohyd. Res., 255, 225-240, (1994).およびMulloy B., et al., J. Biol. Chem., 269, 22113-22123 (1994).）の値とよく一致していた。また、４.５８および４.５３ｐｐｍの化学シフトは２,４−ジ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノースおよび４−モノ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノースのＨ−２の化学シフトの前記文献記載の値とよく一致していた。さらに、４.８９および４.８０ｐｐｍの化学シフトは２,４−ジ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノースおよび４−モノ−Ｏ−スルフォ−Ｌ−フコピラノースのＨ−４の化学シフトの前記文献記載の値とよく一致していた。これらの結果からアセチルフコイダンはＬ−フコピラノース（L-fucopyranos）のＯ−２およびＯ−４に硫酸基が結合しているものと推測された。

実施例２
アセチルフコイダンおよび硫酸化アセチルフコイダンの抗腫瘍活性：
（１）Ｕ９３７細胞増殖抑制効果測定
参考例１で製造したアセチルフコイダン（硫酸含量：１３.５％）と、実施例１で製造した硫酸化アセチルフコイダン（硫酸含量：３２.５％）をそれぞれ５,０００μｇ／ｍＬとなるように液体培地（ＲＰＭＩ１,６００＋２％牛胎児血清）に溶解し、０.２２μＭのメンブランフィルタ−で濾過して滅菌したものを供試液とし、これを必要に応じた終濃度になるように希釈して使用した。対照液はアセチルフコイダンを含まないものを使用した。Ｕ９３７（ヒトリンパ腫瘍細胞）は３７℃の５％ＣＯ_２気下で培養し、これを細胞懸濁液とした。９６穴マイクロプレ−トに細胞密度１.０×１０^６／ｍＬになるように細胞懸濁液（９０μＬ）を分注し、３７℃、５％ＣＯ_２気下で１晩培養して培養液とした。その後、培養液にアセチルフコイダンまたは過硫酸アセチルフコイダンを２０μＭ／ｍＬになるように添加（０.５ｍＬ）した。これを４８時間または７２時間、３７℃、５％ＣＯ_２気下で培養を行った後、細胞数測定キット（同仁科学研究所）を用いてＵ９３７細胞数を測定した。

細胞数を測定し、対照の細胞液を１００とした時の相対的な細胞数（％）を表１に示した。アセチルフコイダンを用いた場合には１００μｇ／ｍＬで細胞数が７０％に減少していたが、硫酸化アセチルフコイダンを用いた場合には２０μｇ／ｍＬで細胞数が１８％に減少していた。なお、この結果において細胞の数が１００未満のものは細胞の増殖が抑制された事を示している。

（２）アポト−シス誘導効果測定
アポト−シスの誘導効果を以下の方法で調べた。まず、６０ｍｍディッシュに細胞密度１.０×１０^５細胞／ｍＬになるように上記（１）で調製したＵ９３７細胞懸濁液（４.５ｍＬ）を分注し、３７℃、５％ＣＯ_２気下で２４時間前培養を行い培養液とした。その後、アセチルフコイダンまたは硫酸化アセチルフコイダンを２０μｇ／ｍＬになるように培養液（０.５ｍＬ）に添加した。４８時間培養後、アポト−シス細胞の膜構造変化を指標としたアポト−シス細胞測定キット（APO Percentage Apotosis assay：Biocolor Ltd.）を用いてアポト−シス細胞数を測定した。測定結果を表２に示した。

表２より、硫酸化アセチルフコイダンの添加濃度に比例してアポト−シス細胞が増加している。これは、硫酸化アセチルフコイダンがＵ９３７細胞のアポト−シスを誘導することを示した。

実施例３
硫酸化アセチルフコイダンと他の抗腫瘍剤との併用効果測定：
９６穴マイクロプレ−トに細胞密度１．０×１０^６細胞／ｍＬになるように実施例２（１）で調製したＵ９３７細胞懸濁液（９０μＬ）を分注し、３７℃、５％ＣＯ_２気下で１晩前培養を行い培養液とした。その後、この培養液に硫酸化アセチルフコイダンを１μｇ／ｍＬのみ、抗腫瘍剤であるシトシンアラビノシド（一般名：シタラビン）を０.０１μＭ／ｍＬのみ、そして同量の硫酸化アセチルフコイダン１μｇ／ｍＬとシトシンアラビノシド０.０１μＭ／ｍＬとを添加した。これらの溶液を７２時間３７℃、５％ＣＯ_２気下で培養した。培養後、細胞数測定キットを用いてＵ９３７細胞数を測定した。測定結果を表３に示した。

硫酸化アセチルフコイダンとシトシンアラビノシドとを添加した培養液のＵ９３７細胞の数は、単独で用いたものより、Ｕ９３７細胞の数が少なく、且つ低い濃度でＵ９３７細胞の増殖を抑制する効果があることが分かった。

本発明の抗腫瘍剤は優れた抗腫瘍活性を有するものである。しかも、これら抗腫瘍剤と、従来から使用されてきた他の抗腫瘍剤と組み合わせることにより相乗的に抗腫瘍活性を高めることができる。

従って、上記抗腫瘍剤単独であるいは他の抗腫瘍剤と組み合わせて各種飲食品に配合することにより優れた健康食品とすることができる。

図１は、アセチルフコイダンおよび硫酸化アセチルフコイダンの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである（Ａ：アセチルフコイダン、Ｂ：硫酸化アセチルフコイダン）。

Claims

アセチルフコイダンまたはアセチルフコイダンを硫酸化することにより得られる硫酸化アセチルフコイダンを有効成分とする抗腫瘍剤。
アセチルフコイダンの硫酸化が、Ｎ,Ｎ’−ジメチルホルムアミドおよび三酸化イオウ−トリメチルアミンを用いて行われるものである請求項第１項記載の抗腫瘍剤。
更に、他の抗腫瘍剤を含有するものである請求項第１項または第２項記載の抗腫瘍剤。
アセチルフコイダンが、オキナワモズク（Cladosiphon okamuranus TOKIDA）由来のものである請求項第１項ないし第３項の何れかの項に記載の抗腫瘍剤。
請求項第１項ないし第４項の何れかの項に記載の抗腫瘍剤を含有することを特徴とする飲食品。
アセチルフコイダンに三酸化イオウ−トリメチルアミンを作用させることにより得られる硫酸化アセチルフコイダン。
Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸および酢酸の構成比が、それぞれ３.０〜４.０、０.１〜０.３、０.８〜１.２および０.５〜１.０であり、硫酸含量が１３〜３３質量％である請求項６記載の硫酸化アセチルフコイダン。