JP2006521361A - 長時間作用生物活性コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はアルブミンなどのタンパク質と反応させて共有結合複合体を形成させるために用い得る生物活性化合物に関し、得られた複合体はイン・ビボ(in vivo)において所望の生物活性を示す。より詳しくは、これらの複合体は、架橋基と共有結合している生物活性部分とタンパク質とを含んでなる単離された複合体である。一実施形態では、このタンパク質はアルブミン、またはHSAなどの血液タンパク質である。もう1つの実施形態では、このタンパク質は組換えHSAである。これらの複合体は、生物活性部分、例えばレニン阻害剤またはウイルス融合阻害剤ペプチドと、精製および単離タンパク質とをコンジュゲートさせることにより製造される。これらの複合体は非コンジュゲート分子に比べて血流中での寿命が長く、非コンジュゲート分子に比べて長時間生物活性を示す。所望により、本発明の化合物および複合体は単離および精製される。本発明はまた、イン・ビボにおいて所望の生物作用を達成する方法であって、哺乳類宿主の血流中に本発明の新規な単離された複合体を投与することを含んでなる方法を提供する。
哺乳類宿主への投与に有用なある種の活性ペプチドおよびタンパク質治療薬は薬物動態特性が不十分であり、そのペプチドまたはタンパク質が特定の標的と結合できる前に、哺乳類系により迅速に代謝および排除されてしまうことが多い。一般に、生物学的に活性な薬剤は、投与すると、酵素分解およびクリアランスを受けやすい。結果として、ある種の活性剤は頻繁に投与しなければならず、その結果、その薬剤の血漿レベルに望ましくない大きな変動が生じ、種々の有害な副作用および/または効力の低下を招くことがある。有効な治療のためには、活性剤はその活性部位に運搬されなければならないか、または生物活性の有意な損失なく標的部位に直接投与しなければならない。
後天性免疫不全症候群(AIDS)はHIV−1の感染によって引き起こされる致死的な疾病である。2002年の終わりまでに、世界中で4,200万人がHIV−1に感染し、2,000万人を超える人がHIV/AIDSで死に至るであろう。薬剤耐性株のHIVも患者集団に広まっている。現在の推計では、薬物処置されたHIV感染患者の最大50%が薬剤耐性株のHIVを保菌していると見られる。薬剤耐性HIVの伝染率は米国だけで10〜15%の間である。近い将来、報告症例は劇的に増え続けると見られている。よって、AIDSの治療に有効な薬物およびワクチンの開発が大いに求められる。
HIVは、サル免疫不全ウイルス(SIV)、および哺乳類において免疫不全疾患を引き起こす他の多くのレトロウイルスを含む、レトロウイルスのレンチウイルスファミリーのメンバーである。これまでにHIVの異なる2つのタイプ、すなわち、HIV−1とHIV−2が述べられているが、世界中ではHIV−1感染のほうが多い。頭字語HIVは本明細書では、特に断りのない限り、包括的に総てのHIV−1ウイルスをさして用いる。HIV−1はさらに、major(M)、outlier(O)、およびnew(N)の3つの群に分類される。これまでのほとんどのHIV−1単離物はM群の、異なる10のクレード、またはサブタイプのうちの1つに属する。このM群サブタイプは文字A〜Jで表される。サブタイプBは米国およびヨーロッパで最も多い。しかしながら、サブタイプCが世界のHIVの50%近くを占め、アフリカでは最も多い。アフリカには総てのサブタイプが存在し、Cクレード以外は明瞭な地理的地域にクラスターをなす傾向にある。サブタイプの同定は通常、env遺伝子の配列決定、およびサブタイプに「フィンガープリント」を与えているgp41配列の比較により行われる。
HIVは主としてCD4担持ヘルパー/インデューサーT細胞に感染し、また、膜表面にCD4糖タンパク質を発現する他の細胞にも感染できる。最近の証拠は、細胞表面における特定のケモカイン受容体の同時局在が効率的なウイルス感染に不可欠であることを示した。HIVはCD4+リンパ球に対して細胞変性作用を有し、それらの数は一定年数の間に着実に減少し、免疫系が著しく損なわれることとなる。また、HIV感染は神経機能の低下および痴呆を招くこともある。効果的な化学療法で処置しなければ、HIV感染はほぼ常に致死的であり、日和見感染、癌または神経変性性疾患から死を招く。
抗レトロウイルス化学療法の分野は、レトロウイルス、特にHIVに対して効果的な薬剤の必要に応じて発達した。2002年の終わりまでに、16の抗レトロウイルス薬がFDAによりHIV/AIDSの処置のために認可された。多くの方法論があるが、基本的には、薬剤は抗レトロウイルス活性を示し、これらの薬剤は総て、ウイルスの逆転写酵素か、またはウイルスのプロテアーゼのいずれかを阻害する。高活性抗レトロウイルス療法(HAART)は、ウイルス複製を強く抑制し、AIDSの発症を予防または遅延することができる、種々の薬物「カクテル」、または3種以上の抗レトロウイルス薬の組合せをさす(Mitsuya, H. , and J. Erickson. 1999. Discovery and development of antiretroviral therapeutics for HIV infection. , p. 751-780. In T. C. Merigan and J. G. Bartlet and D. Bolognesi(ed.) Textbook of AIDS Medicine. Williams & Wilkins, Baltimore)。しかしながら、HIV−1感染に対して効果的な長期抗レトロウイルス療法を提供するその能力は、当初は検出できないレベルにまで好適なウイルス抑制を達成した者のうち40〜50%が最終的には処置の失敗を被ることから、部分的な奏功でしかなかった(Grabar et al., 2000. Factors associated with clinical and virological failure in patients receiving a triple therapy including a protease inhibitor. Aids.14:141-9; Wit et al., 1999. Outcome and predictors of failure of highly active antiretroviral therapy: one-year follow-up of a cohort of human immunodeficiency virus type 1- infected persons. J Infect Dis. 179:790-8)。さらに、HIV−1に感染し、抗ウイルス療法を受けたことがない個体の10〜40%がHAART下で持続的なウイルス複製(血漿HIV RNA>500コピー/ml)を示し(Gulick et al., 1997. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy. N Engl J Med. 337:734-9; Hammer et al. 1997. A controlled trial of two nucleoside analohues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less. AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team. N Engl J Med. 337:725-33; Staszewski et al., 1999. Efavirenz plus zidovudine and lamivudine, efavirenz plus indinavir, and indinavir plus zidovudine and lamivudine in the treatment of HIV-1 infection in adults. Study 006 Team. N Engl J Med. 341:1865-73)、これはおそらく薬剤耐性HIV−1変異体の伝播によるものである(Wainberg, M. A., and G. Friedland. 1998. Public health implications of antiretroviral therapy and HIV drug resistance. JAMA. 279:1977-83)。さらにまた、HIV−1感染が進行した患者においては、これらの抗HIV薬により部分的な免疫再構成が獲得されているに過ぎないことが明らかである。
HIVの薬剤耐性突然変異株の急速な出現および拡散が現行の薬剤を無効とし、処置の失敗の主な原因の1つとなっている。最近の推計では、北アメリカの薬物投与を受けた患者の75%を超える者が、多剤「カクテル」で用いられた16のFDA認可抗レトロウイルス薬の1以上に対して耐性のあるHIVを保菌していると見られる。薬剤耐性HIVは新たな感染の最大12%を占める。薬剤耐性HIV株は、HIV野生株に感染し、至適用量より低い1以上の抗レトロウイルス薬に曝された個体において出現する(Burger, et al, Antivir. Ther., 1998)。主要な3つのクラスの抗レトロウイルス薬、すなわち、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)、およびプロテアーゼ阻害剤(PI)が存在する。選択される最初の薬剤耐性HIV株は特定の薬物投与計画に依存し、多くの場合、ある薬物を同じクラスの別のものに置き換える必要がある。しかしながら、複数の突然変異を有する新しい株の選択を続けていくと、多くの場合、クラス特異的薬剤耐性、さらについには完全な処置の失敗に至る。同じクラスの薬剤の交差耐性は警くほど高速で拡がっている(Erickson, et al, AIDS, 13:S 189, (1999); Gulnik, et al, Vitam. Horm., 58:213 (2000); Menendez-Arias, et al, Trends Pharmacol. Sci., 23:381 (2002))。
薬剤耐性は至適レベルより低い薬剤の存在下における低レベルでの複製の結果として出現するという十分認知されている理論に基づき、カクテル中の薬剤ごとの最大許容量を定めることが抗レトロウイルス治療の慣例となっている。HIVは慢性かつ不治の感染であるので、最大用量での抗レトロウイルス薬カクテルの日々の投与が要求されることから、極めて高いピークの薬剤レベルがもたらされる。この実践は、これらの多くの薬剤の慢性毒性による、警くべき高速の、生命をおびやかす副作用を招いている(総説としては、Tozser, et al, Ann. NY Acad. Sci. 946: 145 (2001)参照)。HAART毒性に関連するより重篤な副作用のいくつかとして、肝臓障害、心疾患および脂肪異栄養症が挙げられる(Chen, et al, J. Clin. Endocrinol. Metab., 87:4845(2002); Holstein, et al, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 109:389 (2001))。耐性と副作用が組み合わさる結果、薬剤投与計画の遵守が難しくなり、最終的には処置の失敗率が40〜45%の間となる(Wit, et al, J. Infect. Dis. 179:790 (1999); Fatkenheuer, et al, AIDS 11:F113 (1997); Lucas, et al, Ann. Intern. Med. 131:81 (1999); Chen, et al, 41st Intl Conf Antimicrob. Agents Chemother., Abstract I-1914 (2001))。このように、現在HAARTを受けている実質的な数の患者が間もなく治療の選択肢を使い果たしてしまう。
薬剤耐性問題に対する魅力的な対策の1つは、現在市場に出ているものとは異なる作用機序を備えた薬剤を開発することである。基本的に、薬剤が細胞培養物中で抗レトロウイルス活性を示し得る方法は複数ある。新規な作用機序を備えたHIVの阻害剤が、DeClerq, Curr Med Chem. 8:1543-72 (2001)に概説されている。これらの化合物のうち、HIV融合のポリペプチド阻害剤(「抗融合性ペプチド」)はヒト臨床試験で有効であることが示されている。HIVはヒトリンパ球および膜結合CD4糖タンパク質とケモカイン受容体を有する他の細胞種に感染する。CD4担持細胞のHIV感染の最初の段階は、ウイルス膜結合HIV gp41エンベロープタンパク質を介して、ウイルス膜と非共有結合的に結合しているHIV gp120エンベロープタンパク質によるCD4受容体の認識である。gp41タンパク質、または「融合タンパク質」は、融合ペプチドおよび2つの自己会合型ヘリックス形成セグメント(「N−ヘリックス」および「C−ヘリックス」)を含むいくつかの「融合性」ドメインを含む。
ドキソルビシン−アルブミンコンジュゲートは抗新生物プロドラッグ薬として開示されている(F. Kratz et al, J. Med. Chem. 2000, 43, 1253-1256)。しかしながら、このコンジュゲートは、腫瘍細胞のリソソームおよびインドソーム中に存在する、薬物を低pH値で放出させる酸感受性リンカーを用いて調製されたものである。このコンジュゲートの調製法は、コストがかかると考えられていた薬剤アルブミンコンジュゲートのエクス・ビボ(ex vivo)合成および同定を回避するためにデザインされたものである。
本発明は、タンパク質と反応して共有結合複合体(ここで、得られる複合体はイン・ビボにおいて所望の生物活性を示すことが分かっている)を形成するために用いられ得る生物活性化合物に関する。より具体的には、これらの複合体は抗ウイルス化合物などの化合物と架橋基とを含んでなる単離された複合体であり、この血液成分はアルブミンなどのタンパク質である。本発明はまた、抗ウイルス活性などの所望のイン・ビボ活性を達成する方法であって、哺乳類宿主の血流中に本発明の新規な単離された複合体を投与することを含んでなる方法も提供する。
特に断りのない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いられる次の用語は本願の目的のために次の意味を有す。
(1)疾病の素因を持っている可能性があるが、疾病の病理または症候をまだ持っていない、または示していない動物において、その疾病の発生を予防すること、
(2)疾病の病理および症候を持っている、または示している動物において疾病を阻害すること(すなわち、病理または症候のさらなる進行を停止すること)、または
(3)疾病の病理および症候を持っている、または示している動物において疾病を改善すること(すなわち、病理および症候を逆転させること)
を含む。
本発明は、優れた薬理特性を有し、哺乳類被験体に投与した際に持続的な生物活性を生じる、生物活性または薬理活性部分と高分子とのコンジュゲート(精製コンジュゲートを含む)を提供する。特に、本発明は、薬理活性部分が薬理上不活性な高分子担体と共有結合しており、薬理活性部分と担体との架橋がイン・ビボにおいて安定であり、完全な化合物が薬理活性部分の薬理活性を実質的に保持し、かつ、哺乳類に投与した際の化合物の有効半減期が非コンジュゲート薬理活性部分の少なくとも約2倍であるような単離された化合物を提供する。この担体は有利にはHSAであり、これらのコンジュゲートはヒトの治療および予防の方法に用いられる。
本発明は、本明細書の記載の方法を用いて「覆い隠す」ことができる多様な生物および/または薬理活性部分のを包含する。下記に例示されるレニン阻害剤およびウイルス融合阻害剤の他、薬理特性の上昇および特に持続的活性が望まれる実質的にいずれの分子を覆い隠してもよい。覆い隠すことができる基の例としてはペプチドおよび非ペプチド分子が挙げられる。特定の例としては、コレステロール低下および血圧降下化合物などの代謝作用を有する化合物、創傷治癒薬、抗生物質(抗感染薬を含む)、抗酸化剤、化学療法薬、抗癌薬剤、抗炎症薬、および抗増殖性薬をはじめとする神経疾患の処置用の化合物(このコンジュゲートは所望によりCNSに直接投与することができる)が挙げられる。これらの分子の例は当技術分野で周知のものであり、単に例示としては以下のものが挙げられる。
本発明はまた、ウイルス病の処置に関して長期または持続的な活性を有する抗ウイルス化合物も提供する。本発明はまた、これらの化合物を用いたウイルス病の処置方法も提供する。本発明の化合物は高いイン・ビボ安定性と、例えばペプチダーゼまたはプロテアーゼ分解による低い分解感受性を有する。結果として、本発明の化合物は現在利用できる抗ウイルス化合物よりも投与頻度が少なくなり得る。これらの化合物は例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPV)、麻疹ウイルス(MeV)およびサル免疫不全ウイルス(SIV)をはじめとする多くのウイルスの感染予防薬および/または治療薬として使用できる。
本発明の化合物は抗ウイルス活性の有意な損失なく血液成分とコンジュゲート可能な抗ウイルス活性を有する化合物を含む。本発明のこの文脈では、抗ウイルス活性の有意な損失とは、化合物の用量が、コンジュゲートされた化合物の抗ウイルス活性が好適なイン・ビボ活性を得るために、モル数で少なくとも10倍高められなければならない程度にまで低下している状態をさす。
ヌクレオシド類似体、例えばシトシン−アラビノシド、アデニン−アラビノシド、ヨードキシウリジンおよびアシクロビルなど、
ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(NRTI)、例えば、AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、アムドキソビル、dOTC、およびd4TMP、
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)、例えば、ネビラピン、デラビリジン、エファビレンズ、チオカルボキシアニリドUC−781、カプラビリン、SJ−3366、DPC083、およびTMC125/R165335、
プロテアーゼ阻害剤(PI)、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アムプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、モゼナビル、トリプラナビル、およびTMC−114を含む、
ウイルス吸着阻害剤、例えばコサラン誘導体、およびシアノビリン−N共受容体拮抗薬(例えば、TAK−779およびAMD3100など)、ウイルス融合阻害剤(ペンタフシドT−20、ベツリン酸、R170591、VP−14637、およびNMS03など、
およびウイルス脱殻阻害剤、例えばアゾジカルボンアミド
が挙げられる。
が挙げられる。
ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp120(ポリスルフェート、ポリスルホネート、ポリカルボキシレート、ポリオキソメタレート、ポリヌクレオチド、および負電荷を持つアルブミン)との結合によりウイルス吸着を阻害する;
ウイルス共受容体CXCR4(すなわち、ビシクラム(AMD3100)誘導体)およびCCR5(すなわち、TAK−779誘導体)の遮断によりウイルス侵入を阻害する;
ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp41(T−20、T−1249)との結合によるウイルス細胞融合を阻害する;
NCp7ジンクフィンガー標的化薬(2,2’−ジチオビスベンズアミド(DIBA)、アザジカルボンアミド(ADA)によりウイルスの組み立ておよび分解を阻害する;
4−アリール−2,4−ジオキソブタン酸誘導体などのインテグラーゼ阻害剤によりプロウイルスDNAの組み込みを阻害する;および
転写(トランス活性化)プロセスの阻害剤(フラボピリドール、フルオロキノロン)によりウイルスmRNAの転写を阻害する
化合物が使用できる。
血液成分と抗ウイルス薬とを架橋させるには、種々の異なるリンカーまたは架橋基L1およびL2を使用できる。これらの架橋基は二価であっても多価であってもよい。例えば、式Iの複合体において、L1は、Prと付着させる場合にはn価、また、AVと付着させる場合にはm価であってよく、ここで、mおよびnは上記で定義した整数である。同様に、式IIの複合体では、L2はPrと付着させる場合にはo価、また、AVと付着させる場合にはp価であってよく、ここでoおよびpは上記で定義した通りである。架橋基中に存在し得る官能基の非排他的な例としては、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドなどのヒドロキシル基を有する化合物、ならびにマレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、イソシアネート、チオエステル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、無水物またはエステルなどの他の化合物が挙げられる。
本発明の単離された複合体を作製するには、種々の血液成分が使用できる。天然の血液成分としては血液タンパク質を含み、これには赤血球、および免疫グロブリン(IgMおよびIgGなど)、血清アルブミン、トランスフェリン、p90およびp38が含まれる。好ましい実施形態では、血液成分または血液タンパク質はアルブミンである。より好ましくは、アルブミンはタンパク質ヒト血清アルブミン(HSA)である。
一実施形態では、本発明の架橋化合物AV−L1またはAV−L2を製造し、さらなる精製および/または単離なく、アルブミンとのコンジュゲーションに用いることができる。架橋化合物の純度はリンカーの性質、AVの性質、ならびにAVとリンカーとの付着に用いる反応の種類および反応条件によって異なる。もう1つの特定の実施形態では、非精製架橋化合物を製造し、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは少なくとも98%の純度で得られる。
本発明での使用に好適な血液成分は当技術分野で公知である。ヒト血清アルブミン(「HSA」)はヒト血液の主成分であり、本発明での使用に特に適している。特に、HSAは、 抗ウイルス化合物とこのタンパク質との共有結合のための反応性チオール部分を提供する露出した表面システイン残基を有する。チオールとの架橋に特に適した活性化リンカーとしては、マレイミドなどの不飽和環状イミド、α−ヨード−およびα−ブロモアセテートなどのα−ハロエステル、ならびにビニルピリジン誘導体が挙げられる。好適な活性化リンカーは例えばPierce Chemical(Rockford,IL)から市販されている。HSAと架橋させるための好適な活性化化合物を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第5,612,034号参照。
本発明の特定の適用に関して、Prで表される化合物はアルブミンであってもよく、さらなる精製または単離なく、商業ソースから得たまま用いて架橋化合物Pr−L1およびPr−L2を製造することができる。特定の実施形態では、PrはHSAである。もう1つの実施形態では、アルブミンは本明細書で開示されているように、当技術分野で公知の種々の方法を用いてさらに精製してもよい。
一実施形態では、式Iまたは式IIの複合体は、リンカーが存在しない場合、AV−L1またはAV−L2とPrとのコンジュゲーション、Pr−L1またはPr−L2とAVとのコンジュゲーション、またはAVとPrとのコンジュゲーションにより複合体を形成することで製造することができる。
一実施形態では、本発明の単離された複合体の投与はボーラスを用いて達成することができるが、定量流などを用いた輸液により時間をかけてゆっくり導入してもよい。
本発明の一実施形態において、
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6
[ここで、
この配列はこのペプチドのN末端、C末端または内部の位置に存在し;
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、S およびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E,RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチドが提供される。
配列:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチドが提供される。
配列:
Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−X11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチドが提供される。
配列:
Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
W−X−X−W−X−X−X−I−X−X−X−T−X−X−I−X−X−L−I−X−X−X−Q−X−Q−Q−X−X−N
[ここで、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
配列:
W−X1−X2−W−X3−X4−X5−I−X6−X7−X8−T−X9−X10−I−X11−X12−L−I−X13−X14−X15−Q−X16−Q−Q−X17−X18−N−X19−X20−X21−X22−X23
[ここで、
X1はM、L、I、Q、T、RおよびKからなる群から選択され;
X2はE、D、QおよびKのいずれかであり;
X3はE、DおよびKからなる群から選択され;
X4はK、R、E、Q、NおよびTからなる群から選択され;
X5はE、L、R、KおよびQからなる群から選択され;
X6はN、D、S、E、Q、K、R、H、T、IおよびGからなる群から選択され;
X7はN、Q、D、E、K、S、TおよびYからなる群から選択され;
X8はY、F、H、I、VおよびSからなる群から選択され;
X9はG、K、R、H、D、E、S、T、NおよびQからなる群から選択され;
X10はK、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、FおよびPからなる群から選択され;
X11はH、K、E、YおよびFからなる群から選択され;
X12はT、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、AおよびMからなる群から選択され;
X13はD、E、Q、T、K、R、A、VおよびGからなる群から選択され;
X14はD、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、AおよびGからなる群から選択され;
X15はS、Aおよび(P)からなる群から選択され;
X16はN、K、S、T、D、E、Y、IおよびVからなる群から選択され;
X17はE、D、N、K、GおよびVからなる群から選択され;
X18はK、R、H、D、E、N、Q、T、M、IおよびYからなる群から選択され;
X19はE、V、Q、M、L、JおよびGからなる群から選択され;
X20はQ、N、E、K、R、H、LおよびFからなる群から選択され;
X21はE、D、N、S、K、AおよびGからなる群から選択され;
X22はL、IおよびYからなる群から選択され;かつ、
X23はI、L、M、Q、SおよびYからなる群から選択される]
を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
式Iまたは式II:
mは1〜5の整数であり;
nは1〜100の整数であり;
oは1〜5の整数であり;
pは1〜100の整数であり;
AVは抗ウイルス化合物であり;
L1およびL2はAVとPrを共有結合する多価リンカーであるか、またはL1およびL2は存在せず;
Prはタンパク質であり;かつ、
この複合体はイン・ビボにおいて抗ウイルス活性を有する]
の単離された複合体が提供される。
ペプチドT−1249
[ここで、
X1はM、L、I、Q、T、RおよびKからなる群から選択され;
X2はE、D、QおよびKのいずれかであり;
X3はE、DおよびKからなる群から選択され;
X4はK、R、E、Q、NおよびTからなる群から選択され;
X5はE、L、R、KおよびQからなる群から選択され;
X6はN、D、S、E、Q、K、R、H、T、IおよびGからなる群から選択され;
X7はN、Q、D、E、K、S、TおよびYからなる群から選択され;
X8はY、F、H、I、VおよびSからなる群から選択され;
X9はG、K、R、H、D、E、S、T、NおよびQからなる群から選択され;
X10はK、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、FおよびPからなる群から選択され;
X11はH、K、E、YおよびFからなる群から選択され;
X12はT、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、AおよびMからなる群から選択され;
X13はD、E、Q、T、K、R、A、VおよびGからなる群から選択され;
X14はD、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、AおよびGからなる群から選択され;
X15は S、Aおよび(P)からなる群から選択され;
X16はN、K、S、T、D、E、Y、IおよびVからなる群から選択され;
X17はE、D、N、K、GおよびVからなる群から選択され;
X18はK、R、H、D、E、N、Q、T、M、IおよびYからなる群から選択され;
X19はE、V、Q、M、L、JおよびGからなる群から選択され;
X20はQ、N、E、K、R、H、LおよびFからなる群から選択され;
X21はE、D、N、S、K、AおよびGからなる群から選択され;
X22はL、IおよびYからなる群から選択され;かつ、
X23はI、L、M、Q、SおよびYからなる群から選択される]
からなる群から選択される配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなる。
哺乳類宿主の血流中に上記実施形態および変形の単離されたコンジュゲート複合体を投与することを含み、この複合体は、抗ウイルス化合物と、そのタンパク質と反応して安定な共有結合を形成する少なくとも1つの反応性官能基を有するリンカーとを付着させることにより形成され、かつ、
この単離されたコンジュゲート複合体は、非コンジュゲート抗ウイルス化合物に比べて長時間血流中で有効な治療効果を維持する量で投与される。
哺乳類宿主の血流中に上記実施形態および変形の複合体を抗ウイルス活性に有効な量を提供するに十分な量で投与することを含み、
それにより、その複合体が非結合抗ウイルス化合物の寿命に比べて長時間血流中で維持される方法が提供される。
a)化合物AV−L1またはAV−L2(ここで、AVは分子量60kD未満のペプチド抗ウイルス化合物であり、L1またはL2はAVと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、この化合物AV−L1またはAV−L2を、単離されたタンパク質で、化合物AV−L1またはAV−L2がそのタンパク質と共有結合して上記実施形態および変形のタンパク質複合体を形成するに十分な時間処理すること;および
c)処理したタンパク質複合体を宿主に投与すること
を含む方法が提供される。
a)化合物AV−L1またはAV−L2(ここで、AVは分子量60kD未満の抗ウイルス化合物ペプチドであり、L1またはL2はAVと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、化合物AV−L1またはAV−L2を、単離された1以上のタンパク質Prで、化合物AV−L1またはAV−L2が1以上の単離されたタンパク質と共有結合して、上記実施形態および変形の1以上の修飾タンパク質複合体を形成するのに十分な時間処理すること;および
c)その修飾タンパク質を宿主に投与すること
を含む方法を提供する。
本発明は既存の抗ウイルス薬の特性を利用する。本発明の化合物によって阻害され得るウイルスとしては、限定されるものではないが、例えば米国特許第6,013,263号および米国特許第6,017,536号の中の表V〜VIIおよびIX〜XIVに一覧化されている全ウイルス株が挙げられる。これらのウイルスとしては、例えば、HIV−1、HIV−2、およびヒトTリンパ球ウイルス(HTLV−IおよびHTLV−II)をはじめとするヒトレトロウイルス、ならびにウシ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス(SIV)、サル肉腫ウイルス、サル白血病、およびヒツジ進行性肺炎ウイルスをはじめとする非ヒトレトロウイルスが挙げられる。例えば、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、イヌジステンバーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPIV)、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス(MeV)、エプスタイン−バーウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサルメイソン−ファイザーウイルスなどの非レトロウイルスも本発明の化合物により阻害可能である。非エンベロープウイルスも阻害可能であり、限定されるものではないが、ポリオウイルスなどのピコルナウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、パピローマウイルスなどのパポーバウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、およびレオウイルスが挙げられる。
推定されるHIV融合阻害剤ペプチドの配列はgp41三量体らせん融合性複合体の結晶構造を用いてモデル化されたものである(Jiang et al, 2002に総説)。ペプチド配列は、融合性複合体のN末端三重らせんコアによって形成される溝に適合するらせんセグメントを形成するようにモデル化された。モデル化されたらせんペプチドの内部結合および外部露出面の評価を用い、モデルペプチドのアミノ酸の配列および組成を決定した。モデルペプチドの溶解度およびその他の物理化学特性を改良するため、複合体形成後に露出側鎖を有するアミノ酸を変更する。N末端三重らせんコアと結合するアミノ酸は結合親和性および抗ウイルス活性の決定因子である。
1.脱保護−25%ピペリジン/DMF(5+25分)
2.洗浄−DMF(6×1分)
3.カップリング−ネガティブカイザー試験では、3当量のFmoc−アミノ酸+3当量のTCTU+6当量のDIEA(約1時間);Asn31およびLys33では3時間
4.洗浄−DMF(5×1分)
5.末端アセチル化−無水酢酸/DIEA
樹脂からの切断:
TFA−m−クレゾール−チオアニソール−トリイソプロピルシラン(85:5:5:5)2時間、RT
真空蒸発
エーテルにより沈殿(粗収率〜80%)
精製:
Biosphere C−18カラムを用いたHPLC
移動相−A:水/0.1%TFA B:アセトニトリル/0.1%TFA
勾配−10〜20%B/10分、20〜40%B/90分
検出−UV220nm
95%を超える画分を回収および凍結乾燥した。
HPLC:カラム−Luna C18
移動相−A:水/0.04%H3PO4 B:アセトニトリル/0.04%H3PO4
勾配−5〜65%B/30分
検出−UV220nm
MS[MH]+
TCTU=O−(1H−6−クロロベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
これらのペプチドの抗ウイルス効力を、従前に記載されているもの(参照文献1〜3)に微修正を施し、MT4細胞による細胞傷害性アッセイを用い、HIV−1 HXB2またはNL4−3株に対して分析した。MT−4細胞(1.5×104/ml)を、96穴マイクロタイタープレート中、種々の濃度の試験化合物の存在下で、200 50%組織培養感染用量(TCID50)のウイルスに曝し、5日間37℃でインキュベートした。HIVの細胞傷害性は、各穴に終濃度0.75mg/mlとなるように3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)溶液を加え、1時間37℃でインキュベートすることで測定した。インキュベーション後、細胞をイソプロパノール/Triton−X100/HCl(1000:50:25)溶液に溶解した。マイクロプレートリーダー(Spectramax, Molecular Devices)にて540nmおよび690nmで吸光度をモニタリングした。MT−4細胞はAIDS Research and Reference Reagent Program (ARRRP, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 の Dr. D. Richman)から入手した。細胞を、10%ウシ胎児血清、50Uのペニシリンおよび50μgのストレプトマイシン/ml(Invitrogen, Carlsbad CA)を添加したRPMI 1640増殖培地で増殖させた。全供試化合物のIC50値は表1に示されている。
ペプチド2および7の類似体は、様々な配列のペプチドの薬物動態活性を増強するための手順の一般適用を示す。SPI−30014およびSPI−70038(下表2参照)は上記のような固相合成技術を用いて製造した。N末端をアセチル化する代わりにFmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸、TCTU、DIEAと3時間反応させ、上記のように洗浄した後、3−マレイミドプロピオン酸、TCTU、DIEAと3時間反応させた。切断および精製は上記の通りとした。
SPI−30014 MH+4545
SPI−70038 MH+4673
非反応性対照を生成するため、マレイミド含有ペプチドを過剰量のβ−メルカプトエタノールを用いてクエンチした。得られたクエンチ型のペプチド(SPI−30014QおよびSPI−70038Q)はHSAと共有結合を形成することができない。これらのクエンチ型誘導体は次のようにして製造した。
1mgのSPI−30014を22.0μlのDMSOに溶解した。この溶液10μlを90μlの25%HSA(Seracare)に加え、37℃で5時間インキュベートした。最終反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は約1:4であり、ペプチドの終濃度は0.9mMであった。
マレイミド含有ペプチド、クエンチ型非コンジュゲートペプチド、およびペプチド−HSAコンジュゲートの抗ウイルス効力を、実施例2に記載のようにMT4細胞による細胞傷害性アッセイを用い、HXB2 HIV−1に対して分析した。これらの化合物のIC50値は表2に示されている。反応型およびクエンチ型のペプチドの活性は同等である。各HSA−ペプチドコンジュゲートの抗ウイルス活性は約3〜4倍低下している。
ペプチド−HSAコンジュゲート(SPI−30014HSAおよびSPI−70038HSA)およびクエンチ型非コンジュゲートペプチド(SPI−30014QおよびSPI−70038Q)を体重400〜500gのSprague−Dawleyラットに静脈投与した。試験化合物をDMSO(ペプチド)またはリン酸緩衝生理食塩水(HSA−ペプチドコンジュゲート)で調製し、0.5〜0.6μmol/kgの一回量を静脈投与した(注入速度は2.0ml/分、総注入時間は約20秒とした)。血清サンプルを投与後5分、30分、1、2、8、24、48および72時間で回収した。ラット血漿中の抗ウイルスペプチドおよびコンジュゲートの濃度を、細胞に基づく抗ウイルス生物検定を用いて分析した。各時点で、血清サンプルをまず増殖培地で1:10希釈した後、これを複数の一連の希釈液に用い、MT4細胞および上記のHIV−1 HXB2ウイルスを用いた標準的な抗ウイルスアッセイで分析した。IC50値を求め、HIV−1 HXB2の細胞傷害活性の50%を阻害するのに必要なサンプル血清の%として表した。対応する動物の投与前血清を培地で10倍希釈したものを含む参照サンプルを調製した。この希釈サンプルにDMSO水溶液中、所定の濃度のペプチドまたはペプチド−HSAコンジュゲートを加えた。次にこのサンプルを試験時点のサンプルと同様に、抗ウイルスアッセイで分析した。このIC50参照値を求め、ペプチドまたはペプチド−HSAコンジュゲートの濃度として表した。次に、各試験時点の血清サンプル中のペプチドまたはペプチド−HSAコンジュゲートの濃度を、対応する動物からの血清中の参照サンプルで得られたIC50値を基に算出した。
ラット血漿における試験化合物の、時間に対する濃度の特性が図2および3に示されている(ラット2〜3個体の平均)。非コンジュゲート(対照)ペプチドは迅速なクリアランス特性を示し、8時間までに80%のペプチドが失われる。これに対し、2つのHSA−ペプチドコンジュゲートの最終半減期は12〜14時間の範囲であった。HSA−ペプチドコンジュゲートの半減期は、齧歯類で報告されているHSA単独の半減期(15.8時間)と同等である(1).1. M.Gaizutis, Pesce A. J., Pollak V. E. 1975. Renal clearace of human and rat alumins in the rat. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148(4): 947-952。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化抗ウイルスペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4であった。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存した。
DMSO中、トランス−4−(マレイミジルメチル)シクロヘキサン−1−カルボニル誘導体化抗ウイルスペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、N−(3−{2−[2−(3−アミノ−プロポキシ)−エトキシ]−エトキシ}−エトキシ)−プロピル)−2−ブロモアセトアミド誘導体化抗ウイルスペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化抗ウイルスペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:1である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化抗ウイルスペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は10:1である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
実施例12:HIV融合のペプチジル阻害剤に関する結合実験
HIV融合のコンジュゲート阻害剤の結合親和性は、N末端におけるGCN4のセグメントおよびC末端におけるHIV−1 GP41の最初の7回反復領域に由来する17残基を含むキメラペプチド(IQN17)を用いて測定する(Cell 99, 103-115)。GP41(C28)の第二の7回反復領域由来の28残基のペプチドを、そのカルボキシル末端において蛍光分子Alexa−430(Molecular Probs)で標識する。この結合を、標識C28をIQN17で滴定することにより測定する。結合および非結合C28の濃度をキャピラリーゾーン電気泳動により測定する。3μMのC28および8μmのIQN17において、約80%のC28がIQN17と結合する。非標識ペプチドに関して、IQN17と50%C28を競合する量がそのIC50値を示す。
本発明は、タンパク質と反応させて共有結合複合体を形成させるために用い得る生物活性化合物に関し、得られた複合体はイン・ビボでレニン阻害活性を示すことが分かっている。より詳しくは、これらの複合体は、レニン阻害剤と架橋基とを含んでなる単離された複合体であり、この血液成分はアルブミンなどのタンパク質である。本発明はまた、イン・ビボにおいてレニン活性を阻害する方法であって、哺乳類宿主の血流中に本発明の新規な単離された複合体を投与することを含む方法も提供する。
mは1〜5の整数であり;
nは1〜100の整数であり;
oは1〜5の整数であり;
pは1〜100の整数であり;
Ihはレニン阻害剤であり;
L1およびL2はIhとPrを共有結合する多価リンカーであるか、またはL1およびL2は存在せず;
Prはタンパク質であり;かつ、
この複合体はイン・ビボレニン阻害活性を有する]
の単離された複合体を提供する。
哺乳類宿主の血流中に式Iまたは式IIの単離されたコンジュゲート複合体を投与することを含み、この複合体は、レニン阻害剤と、そのタンパク質と反応して安定な共有結合を形成する少なくとも1つの反応性官能基を有するリンカーとを付着させることにより形成され、かつ、
この単離されたコンジュゲート複合体は、非コンジュゲートレニン阻害剤に比べて長時間血流中で有効な治療効果を維持する量で投与される。
哺乳類宿主の血流中に式Iまたは式IIの複合体をレニン阻害に有効な量を提供するに十分な量で投与することを含み、
それにより、その複合体が非結合レニン阻害剤の寿命に比べて長時間血流中で維持される方法を提供する。
a)化合物Ih−L1またはIh−L2(ここで、Ihは分子量60kD未満のレニン阻害剤ペプチドであり、L1またはL2はIhと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、この化合物Ih−L1またはIh−L2を単離されたタンパク質で、化合物Ih−L1またはIh−L2がそのタンパク質と共有結合して式Iまたは式IIのタンパク質複合体を形成するに十分な時間処理すること;および
c)処理したタンパク質複合体を宿主に投与すること
を含む方法が提供される。
a)化合物Ih−L1またはIh−L2(ここで、Ihは分子量60kD未満のレニン阻害ペプチドであり、L1またはL2はIhと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、化合物Ih−L1またはIh−L2を単離された1以上のタンパク質Prで、化合物Ih−L1またはIh−L2が1以上の単離されたタンパク質と共有結合して、式Iまたは式IIの1以上の修飾タンパク質複合体を形成するのに十分な時間処理すること;および
c)その修飾タンパク質を宿主に投与すること
を含む方法を提供する。
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R’は、各々置換型または非置換の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、(C1−10)アルコキシカルボニル、(C1−10)アルキルアミノカルボニル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、(C1−10)アルキルホスホネートおよび(C1−10)アルキルホスホニルからなる群から選択される]
の化合物である。
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、ヘテロ(C8−12)ビシクロアリール、アミノスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、ホスホネート、(C1−10)アルキルホスホニル、スルホニル基およびスルフィニル基からなる群から選択される]
の化合物である。
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、ヘテロ(C8−12)ビシクロアリール、アミノスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、ホスホネート、(C1−10)アルキルホスホニル、スルホニル基およびスルフィニル基からなる群から選択される]
の化合物である。
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、およびヘテロ(C8−12)ビシクロアリールからなる群から選択される]
の化合物である。
[(Ih)m−L1]nPr I
の複合体を形成し得る複数の異なる官能基を有する。
Ih−[L2−(Pr)o]p II
[式中、Ihは生物活性剤であり、L1およびL2はIhとPrを架橋し得る架橋基であり、Prは血液成分であり、mおよびoは1〜5の整数であり、かつ、nおよびpは1〜100の整数である]
の複合体を形成し得る複数の異なる官能基を有する。
生物活性剤Ihは、哺乳類宿主に投与した場合に所望の生物応答を惹起し、かつ、最小限の免疫応答しか誘導しない、酵素阻害剤などのいずれの化合物であってもよい。好ましくは、この生物活性剤はレニン阻害剤である。より好ましくは、この薬剤はペプチドまたはペプチド類似体レニン阻害剤である。本発明では多様なレニン阻害剤が使用できる。ペプチドまたはペプチド類似体レニン阻害剤の非排他的な例を表に示す。好ましくは、このレニン阻害剤は分子量約60kDA未満、より好ましくは約10kDA未満、最も好ましくは約1000DA未満のペプチド類似体である。
血液成分とレニン阻害剤とを架橋させるには、種々の異なるリンカーまたは架橋基L1およびL2を使用できる。これらの架橋基は二価であっても多価であってもよい。例えば、式Iの化合物において、L1は、Prと付着させる場合にはn価、また、Ihと付着させる場合にはm価であってよく、ここで、mおよびnは上記で定義した整数である。同様に、式IIの複合体では、L2はPrと付着させる場合にはo価、また、Ihと付着させる場合にはp価であってよく、ここでoおよびpは上記で定義した通りである。架橋基中に存在し得る官能基の非排他的な例としては、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドなどのヒドロキシル基を有する化合物、ならびにマレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、イソシアネート、チオエステル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、無水物またはエステルなどの他の化合物が挙げられる。
本発明の単離された複合体を作製するには、種々の血液成分が使用できる。天然の血液成分としては血液タンパク質を含み、これには赤血球、および免疫グロブリン(IgMおよびIgGなど)、血清アルブミン、トランスフェリン、p90およびp38が含まれる。好ましい実施形態では、血液成分または血液タンパク質はアルブミンである。より好ましくは、アルブミンはタンパク質ヒト血清アルブミン(HSA)である。
一実施形態では、本発明の架橋化合物Ih−L1またはIh−L2を製造し、さらなる精製および/または単離なく、アルブミンとのコンジュゲーションに用いることができる。架橋化合物の純度はリンカーの性質、Ihの性質、ならびにIhとリンカーとの付着に用いる反応の種類および反応条件によって異なる。もう1つの特定の実施形態では、非精製架橋化合物を製造し、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは少なくとも98%の純度で得られる。
本発明の特定の適用に関して、Prで表される化合物はアルブミンであってよく、さらなる精製または単離なく、商業ソースから得たまま用いて架橋化合物Pr−L1およびPr−L2を製造することができる。特定の実施形態では、PrはHSAである。もう1つの実施形態では、アルブミンは本明細書で開示されているように、当技術分野で公知の種々の方法を用いてさらに精製してもよい。
一実施形態では、式Iまたは式IIの複合体は、リンカーが存在しない場合、Ih−L1またはIh−L2とPrとのコンジュゲーション、Pr−L1またはPr−L2とIhとのコンジュゲーション、またはIhとPrとのコンジュゲーションにより複合体を形成することで製造することができる。
一実施形態では、本発明の単離された複合体の投与はボーラスを用いて達成することができるが、定量流などを用いた輸液により時間をかけてゆっくり導入してもよい。
本発明の式Iおよび式IIの複合体はレニン阻害剤としても使用できる。レニンは血圧の制御に重要な役割を果たし得るエンドペプチダーゼである。レニンアンギオテンション系は、レニンがタンパク質基質アンギオテンシノーゲンを切断してアンギオテンシンIを得る多調節タンパク質分解カスケードである。アンギオテンシン変換酵素(ACE)はデカペプチドであるアンギオテンシンIから末端のジペプチドを除去して、強力な昇圧活性を示すアンギオテンシンIIの形成を触媒する。レニンは高い基質特異性を有するアスパルチルプロテアーゼであり、血圧の制御に関与するレニン−アンギオテンシン系の最初のタンパク質分解段階である。レニン阻害剤は霊長類[J. Hypertension, 1, 399 (1983), J. Hypertension 1 (suppl 2), 189 (1983)]およびヒト[Lancet II, 1486 (1983), Trans. Assoc. Am. Physicians, 96,365 (1983),J. Hypertension, 3, 653 (1985)]において血圧を降下させることが示されていることから、高血圧症の制御に有用である可能性がある。
本発明はまた、一般に皮下、筋肉内または静脈内のいずれかへの注射を特徴とする非経口投与により本発明のレニン阻害剤を投与するためにデザインされた組成物を対象とする。注射製剤は通常のいずれかの慣用形態、例えば、溶液もしくは懸濁液、注射前に液体で溶液または懸濁液とするのに好適な固体、またはエマルションとして調製することができる。
使用できる乳化剤の例としては、ポリソルベート80(TWEEN80)が挙げられる。金属イオンの隔離剤またはキレート剤としては、EDTAが挙げられる。
レニン阻害剤コンジュゲート複合体の製造
本発明の化合物を合成するために、種々の方法が開発され得る。これらの化合物を合成するための代表的な方法は実施例に示されている。しかしながら、本発明の化合物はまた、他者が考案し得る他の合成経路によって合成することもできることを述べておく。
本発明のレニン阻害剤は種々の反応スキームに従って合成することができる。本明細書では実施例として、いくつかの例示的スキームを示す。当業者ならば他の反応スキームも容易に考案できる。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化ペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4であった。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存した。
DMSO中、トランス−4−(マレイミジルメチル)シクロヘキサン−1−カルボニル誘導体化ペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、N−(3−{2−[2−(3−アミノ−プロポキシ)−エトキシ]−エトキシ}−エトキシ)−プロピル)−2−ブロモアセトアミド誘導体化ペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:4である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化ペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は1:1である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
DMSO中、マレイミドプロピオニルアミノエトキシエトキシアセチル誘導体化ペプチドの10mM溶液を、HSAの25%水溶液に加えた。この反応混合物における最終ペプチド濃度は1mMであり、反応混合物中のペプチド:HSAのモル比は10:1である。この溶液を37℃で5時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、コンジュゲートを4℃で保存する。
レニン阻害活性を測定するための種々のアッセイがCartledge, et al. Ann. Clin. Biochem. 262-278 (2000)に記載されている。
レニン阻害活性の蛍光測定
レニン酵素活性を測定する1つの方法では、蛍光に基づくマイクロプレートリーダーにおける合成ペプチド基質の切断を用いる。レニンに対するペプチド基質の一方の末端に蛍光団(5−(アミノエチル)アミノナフタレンスルホネート,EDANS)を、他方の末端に非蛍光発色団(4’−ジメチルアミノアゾベンゼン−4−カルボキシレート,DABCYL)を結合させる。レニンによる切断後、生成物(ペプチド−EDANS)が明るい蛍光を発する。レニン基質の500μM原液は、1mgの基質に877μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えることにより調製できる。この原液をアッセイバッファーに加えて終濃度2μMとする。少量(最終量の3%未満)のレニン含有溶液をアッセイバッファーで希釈する。蛍光基質の切断の初速度は、37℃で5〜8分、490nmにて蛍光シグナルの上昇をモニタリングすることにより測定される。発明者らのコンジュゲートはこのアッセイにおいてナノモル下〜高いマイクロモルまでの活性を示す。
1. J Protein Chem 10, 553 (1991)
2. Anal Biochem 210, 351 (1993)
3. Science 247, 954 (1990)
4. J Protein Chem 9, 663 (1990)
血漿レニン活性をHaber et al. (1)によって最初に記載された方法に基づいて測定する。要するに、血漿サンプルを2つのアリコートに分ける。一方のアリコートを37℃で3〜18時間インキュベートし、もう一方のアリコートは氷上で維持する。そのアンギオテンシンI濃度を、製造業者のプロトコールに従い、RIAまたはELISA形式の市販のキットを用いて測定する。0〜4℃に維持したアリコートのアンギオテンシンI濃度を、37℃のアリコートで得られたものから差し引き、レニン活性の数値を求める。
2. Gulnik S., Erickson, J. W., Yu, B. Protease assay for therapeutic drug monitoring. 2003, W003040390
3. Wang GT, Chung CC, Holzman TF, Krafft GA. A continuous fluorescence assay of renin activity. Anal Biochem. 1993, 210(2):351-9
コンジュゲートをラットに静脈投与する。アルブミンとコンジュゲートされていない阻害剤を対照群に投与する。血清サンプルを投与後5分、30分、1時間、2時間、8時間、24時間、48時間および72時間で採取する。レニン阻害活性を上記の方法の1つにより測定する。ペプチドまたはペプチド−HSAコンジュゲートの血清濃度を較正曲線から算出した。これらの実験の結果に基づけば、以下の結論が導き出せる。
Bohlender, et al. Hypertension 428-434 (1997)
Allan, et al. JPET 283:661-665, (1997)
上記に示した情報は明らかに、Ih−L−Pr複合体上のビオチン環がアビジンとの結合に関して関与可能であることを示している。次の一連の実験は、その可溶性遊離酸型でIC50値が約50nMであるIh−L−Pr複合体が標的タンパク質とコンジュゲーションした後もなお生物活性を有するかどうかに取り組むように計画されている。
Claims (145)
- 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6
[ここで、
この配列は該ペプチドのN末端、C末端または内部の位置に存在し;
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、S およびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる、最大51個のアミノ酸のペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる、最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E,RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸のペプチド:
Y1−X−X−Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y1はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y2−X−X−X−Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y2はW、Y、F、H、L、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y3−X−X−X−Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−X11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y3はI、V、L、A、SおよびTからなる群から選択され;
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y4−X−X−Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y4はT、S、I、K、N、H、R、Q、EおよびDからなる群から選択され;
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y5−X−X−Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y5はI、V、T、K、L、N、Q、D、E、RおよびHからなる群から選択され;
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
Y6−Y7−X−X−X−Y8−X−Y9−Y10−X−X−Y11−Y12−X−X−Y13−Y14
[ここで、
Y6はP、GおよびC以外の任意のアミノ酸からなる群から選択され;
Y7はI、L、V、N、Q、K、R、H、EおよびDからなる群から選択され;
Y8はQ、H、R、N、E、D、KおよびPからなる群から選択され;
Y9はQ、H、N、E、D、K、R、LおよびPからなる群から選択され;
Y10はQ、H、N、E、D、KおよびRからなる群から選択され;
Y11はN、S、T、V、AおよびDからなる群から選択され;
Y12はE、V、K、G、R、Q、D、N、H、TおよびSからなる群から選択され;
Y13はL、I、V、KおよびRからなる群から選択され;
Y14はL、S、M、Y、N、Q、E、D、KおよびRからなる群から選択され;かつ、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
W−X−X−W−X−X−X−I−X−X−X−T−X−X−I−X−X−L−I−X−X−X−Q−X−Q−Q−X−X−N
[ここで、
Xは各々独立に任意のアミノ酸である]。 - 下記の配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなるペプチド:
W−X1−X2−W−X3−X4−X5−I−X6−X7−X8−T−X9−X10−I−X11−X12−L−I−X13−X14−X15−Q−X16−Q−Q−X17−X18−N−X19−X20−X21−X22−X23
[ここで、
X1はM、L、I、Q、T、RおよびKからなる群から選択され;
X2はE、D、QおよびKのいずれかであり;
X3はE、DおよびKからなる群から選択され;
X4はK、R、E、Q、NおよびTからなる群から選択され;
X5はE、L、R、KおよびQからなる群から選択され;
X6はN、D、S、E、Q、K、R、H、T、IおよびGからなる群から選択され;
X7はN、Q、D、E、K、S、TおよびYからなる群から選択され;
X8はY、F、H、I、VおよびSからなる群から選択され;
X9はG、K、R、H、D、E、S、T、NおよびQからなる群から選択され;
X10はK、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、FおよびPからなる群から選択され;
X11はH、K、E、YおよびFからなる群から選択され;
X12はT、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、AおよびMからなる群から選択され;
X13はD、E、Q、T、K、R、A、VおよびGからなる群から選択され;
X14はD、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、AおよびGからなる群から選択され;
X15はS、Aおよび(P)からなる群から選択され;
X16はN、K、S、T、D、E、Y、IおよびVからなる群から選択され;
X17はE、D、N、K、GおよびVからなる群から選択され;
X18はK、R、H、D、E、N、Q、T、M、IおよびYからなる群から選択され;
X19はE、V、Q、M、L、JおよびGからなる群から選択され;
X20はQ、N、E、K、R、H、LおよびFからなる群から選択され;
X21はE、D、N、S、K、AおよびGからなる群から選択され;
X22はL、IおよびYからなる群から選択され;かつ、
X23はI、L、M、Q、SおよびYからなる群から選択される]。 - 図1で示される配列からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項16に記載のペプチド。
- 前記抗ウイルス化合物がペプチドである、請求項18に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約100kDA未満である、請求項19に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約30kDA未満である、請求項19に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約10kD未満である、請求項19に記載の複合体。
- 前記ペプチドがペプチド類似体である、請求項19に記載の複合体。
- 前記ペプチドが
ペプチドT−1249
[ここで、
X1はM、L、I、Q、T、RおよびKからなる群から選択され;
X2はE、D、QおよびKのいずれかであり;
X3はE、DおよびKからなる群から選択され;
X4はK、R、E、Q、NおよびTからなる群から選択され;
X5はE、L、R、KおよびQからなる群から選択され;
X6はN、D、S、E、Q、K、R、H、T、IおよびGからなる群から選択され;
X7はN、Q、D、E、K、S、TおよびYからなる群から選択され;
X8はY、F、H、I、VおよびSからなる群から選択され;
X9はG、K、R、H、D、E、S、T、NおよびQからなる群から選択され;
X10はK、H、E、Q、T、V、I、L、M、A、Y、FおよびPからなる群から選択され;
X11はH、K、E、YおよびFからなる群から選択され;
X12はT、S、Q、N、E、D、R、K、H、W、G、AおよびMからなる群から選択され;
X13はD、E、Q、T、K、R、A、VおよびGからなる群から選択され;
X14はD、E、K、H、Q、N、S、I、L、V、AおよびGからなる群から選択され;
X15は S、Aおよび(P)からなる群から選択され;
X16はN、K、S、T、D、E、Y、IおよびVからなる群から選択され;
X17はE、D、N、K、GおよびVからなる群から選択され;
X18はK、R、H、D、E、N、Q、T、M、IおよびYからなる群から選択され;
X19はE、V、Q、M、L、JおよびGからなる群から選択され;
X20はQ、N、E、K、R、H、LおよびFからなる群から選択され;
X21はE、D、N、S、K、AおよびGからなる群から選択され;
X22はL、IおよびYからなる群から選択され;かつ、
X23はI、L、M、Q、SおよびYからなる群から選択される]
からなる群から選択される配列を含んでなる最大51個のアミノ酸からなる、請求項19に記載の複合体。 - 前記タンパク質が血液成分である、請求項24に記載の複合体。
- 前記血液成分が赤血球、免疫グロブリン、IgM、IhG、血清アルブミン、トランスフェリン、P90およびP38、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、チロキシン結合タンパク質、およびα−2−マクログロブリンからなる群から選択される、請求項25に記載の複合体。
- 前記血液成分がヒト血清アルブミンであり、リンカーがペプチドリンカーである、請求項25に記載の複合体。
- 前記血液成分がヒト血清アルブミンであり、リンカーが非ペプチドリンカーである、請求項25に記載の複合体。
- 前記複合体が融合タンパク質である、請求項27に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2がイン・ビボにおいて加水分解切断に対して安定な非変性リンカーである、請求項18に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、AVとPrとを共有結合させる少なくとも2つの官能基を含んでなる、請求項18に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、ヒト血清中において長時間加水分解上安定である、請求項18に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、ヒト血清中において8時間〜30日の半減期の間安定である、請求項18に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、アシルオキシメチルケトン、アジリジン、ジアゾメチルケトン、エポキシド、ヨード−、ブロモ−またはクロロアセトアミド、α−ハロエステル、α−ハロケトン、スルホニウム、クロロエチルスルフィド、O−アルキルイソ尿素、アルキルハリド、ビニルスルホン、アクリルアミド、アクリレート、ビニルピリジン、有機金属化合物、アリールジスルフィド、チオスルホネート、アルデヒド、ニトリル,α−ジケトン、α−ケトアミド、α−ケトエステル、ジアミノケトン、セミカルバゾン、およびジヒドラジドからなる群から選択される化合物の誘導体である、請求項18に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、アジドベンゾイルヒドラジド、N−[4−(p−アジドサリチルアミノ)ブチル]−3’−(2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジルタルトレート、N−y−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−4−アジドベンゾエート、N−スクシンイミジル[4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオネート、N−スクシンイミジル[4−ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、イソシアネート、チオエステル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、無水物および炭酸エステルからなる群から選択される化合物の誘導体である、請求項18に記載の複合体。
- 前記タンパク質がアルブミンである、請求項25に記載の複合体。
- 前記アルブミンが、乾物ベースで少なくとも10%の純度であるHSAまたは組換えHSAである、請求項36に記載の複合体。
- 前記結合がヒトアルブミンのCys−34に対するものである、請求項36に記載の複合体。
- 前記結合がヒトアルブミンのリジンに対するものである、請求項36に記載の複合体。
- mが1であり、nが1であり、かつ、タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項18に記載の複合体。
- nが1であり、タンパク質がHSAまたは組換えHSAであり、かつ、複合体が少なくとも30%の純度までさらに精製される、請求項18に記載の複合体。
- mが1であり、nが2であり、かつ、タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項18に記載の複合体。
- 化学量論比の(AV)m−L1とPr、または化学量論比のAVとL2−(Pr)oを合わせることにより製造される、請求項18に記載の複合体。
- 少なくとも約1.3:1の比率のPrと(AV)m−L1の混合物を合わせることにより製造される、請求項18に記載の複合体。
- L1およびL2が存在せず、AVの活性化中間体を形成した後に、その活性化AV中間体とPrを縮合させることにより製造される、請求項18に記載の複合体。
- AVの活性化中間体が混合無水物またはN,N’−カルボニルジイミダゾール試薬から製造される、請求項45に記載の複合体。
- 少なくとも約30%の純度までさらに精製される、請求項43〜46のいずれか一項に記載の複合体。
- 血液成分に共有結合されている非ペプチド抗ウイルス化合物を含んでなる、抗ウイルス組成物。
- 請求項18に記載の複合体と生理学上許容される担体とを含んでなる、組成物。
- 生理食塩水を用いて処方された、または生理食塩水を用いずに処方された、請求項49に記載の組成物。
- 非経口投与用に処方された、請求項50に記載の組成物。
- 溶液、使用前に溶媒と合わせる乾燥製品、懸濁液、エマルション、および液体濃縮物からなる群から選択される、請求項51に記載の組成物。
- イン・ビボにおいてHIV gp41およびHIVの活性を阻害する方法であって、
哺乳類宿主の血流中に請求項18に記載の単離されたコンジュゲート複合体を投与することを含んでなり、この複合体は、抗ウイルス化合物と、そのタンパク質と反応して安定な共有結合を形成する少なくとも1つの反応性官能基を有するリンカーとを付着させることにより形成され、かつ、
この単離されたコンジュゲート複合体が、非コンジュゲート抗ウイルス化合物に比べて長時間血流中で有効な治療効果を維持する量で投与される、方法。 - 前記複合体が請求項26に記載の複合体である、請求項53に記載の方法。
- 前記タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項53に記載の方法。
- 反応性官能基を含んでなるリンカーが、アシルオキシメチルケトン、アジリジン、ジアゾメチルケトン、エポキシド、ヨード−、ブロモ−またはクロロアセトアミド、α−ハロエステル、α−ハロケトン、スルホニウム、クロロエチルスルフィド、O−アルキルイソ尿素、アルキルハリド、ビニルスルホン、アクリルアミド、アクリレート、ビニルピリジン、有機金属化合物、アリールジスルフィド、チオスルホネート、アルデヒド、ニトリル、α−ジケトン、α−ケトアミド、α−ケトエステル、ジアミノケトン、セミカルバゾン、およびジヒドラジドからなる群から選択される化合物である、請求項53に記載の方法。
- イン・ビボにおいて抗ウイルス活性を惹起する方法であって、
哺乳類宿主の血流中に請求項18に記載の複合体を抗ウイルス活性に有効な量を提供するに十分な量で投与すること、
それにより、その化合物が非結合抗ウイルス化合物の寿命に比べて長時間血流中で維持されることを含んでなる、方法。 - 宿主において抗ウイルス活性を惹起する方法であって、
a)化合物AV−L1またはAV−L2(ここで、AVは分子量60kD未満のペプチド抗ウイルス化合物であり、L1またはL2はAVと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、この化合物AV−L1またはAV−L2を単離されたタンパク質で、化合物AV−L1またはAV−L2がそのタンパク質と共有結合して請求項18に記載のタンパク質複合体を形成するに十分な時間処理すること;および
c)処理したタンパク質複合体を宿主に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記タンパク質がアルブミンである、請求項58に記載の方法。
- 前記アルブミンがHSAまたは組換えHSAである、請求項59に記載の方法。
- 前記アルブミンが、アルブミンを化合物AV−L1またはAV−L2で処理する前に血液から採取、精製および単離される、請求項59に記載の方法。
- 前記アルブミンが乾物ベースで少なくとも10%の純度まで精製される、請求項61に記載の方法。
- 前記アルブミンが95%を超える純度まで精製される、請求項61に記載の方法。
- 宿主において抗ウイルス活性を惹起する方法であって、
a)化合物AV−L1またはAV−L2(ここで、AVは分子量60kD未満の抗ウイルス化合物ペプチドであり、L1またはL2はAVと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、化合物AV−L1またはAV−L2を単離された1以上のタンパク質Prで、化合物AV−L1またはAV−L2が1以上の単離されたタンパク質と共有結合して、請求項18に記載の1以上の修飾タンパク質複合体を形成するのに十分な時間処理すること;および
c)その修飾タンパク質を宿主に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記タンパク質がアルブミンである、請求項64に記載の方法。
- 前記アルブミンが、化合物AV−L1またはAV−L2で処理する前に血液から採取、精製および単離される、請求項65に記載の方法。
- 前記アルブミンがHSAまたは組換えHSAである、請求項65に記載の方法。
- 治療上有効な量の請求項18に記載の複合体、またはその生理学上許容される塩と、薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる、医薬組成物。
- HIVウイルスの活動を阻害する方法であって、そのような処置が必要であると思われる宿主に、有効量の請求項18に記載の複合体、またはその薬学上許容される塩を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染を被っている被験体を処置する方法であって、そのような被験体に有効量の請求項49に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染を被っている被験体を処置する方法であって、そのような被験体に有効量の請求項50に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染を被っている被験体を処置する方法であって、そのような被験体に有効量の請求項51に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染を被っている被験体を処置する方法であって、そのような被験体に有効量の請求項52に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 前記被験体がHIV感染を被っている、請求項70に記載の方法。
- 前記被験体がHIV感染を被っている、請求項71に記載の方法。
- ウイルス感染に曝されている疑いのある患者の予防方法であって、そのような被験体に有効量の請求項49に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染に曝されている疑いのある患者の予防方法であって、そのような被験体に有効量の請求項50に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染に曝されている疑いのある患者の予防方法であって、そのような被験体に有効量の請求項51に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染に曝されている疑いのある患者の予防方法であって、そのような被験体に有効量の請求項52に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- ウイルス感染に曝されている疑いのある患者の予防方法であって、そのような被験体に有効量の請求項53に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 前記レニン阻害剤がペプチドである、請求項81に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約60kDA未満である、請求項82に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約10kDA未満である、請求項82に記載の複合体。
- 前記ペプチドの分子量が約1000DA未満である、請求項82に記載の複合体。
- 前記ペプチドがペプチド類似体である、請求項82〜85のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ペプチド類似体がC末端における遷移状態類似体である、請求項66に記載の複合体。
- 前記遷移状態類似体が下記式の化合物である、請求項87に記載の複合体:
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R’は、各々置換型または非置換の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、(C1−10)アルコキシカルボニル、(C1−10)アルキルアミノカルボニル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、(C1−10)アルキルホスホネートおよび(C1−10)アルキルホスホニルからなる群から選択される]。 - 前記遷移状態類似体が下記式の化合物である、請求項87に記載の複合体:
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、ヘテロ(C8−12)ビシクロアリール、アミノスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、ホスホネート、(C1−10)アルキルホスホニル、スルホニル基およびスルフィニル基からなる群から選択される]。 - 前記遷移状態類似体が下記式の化合物である、請求項87に記載の複合体:
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、ヘテロ(C8−12)ビシクロアリール、アミノスルホニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニル(C1−10)アルキル、アリールスルホニル、アリールスルホニル(C1−10)アルキル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル(C1−10)アルキル、ホスホネート、(C1−10)アルキルホスホニル、スルホニル基およびスルフィニル基からなる群から選択される]。 - 前記遷移状態類似体が下記式の化合物である、請求項87に記載の複合体:
Rは、各々置換型または非置換型の(C1−10)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキルからなる群から選択され;かつ、
R”は、各々置換型または非置換の(C1−4)アルキル、(C6−12)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ビシクロアルキル、カルボニル(C1−10)アルキル、チオカルボニル(C1−3)アルキル、スルホニル(C1−3)アルキル、スルフィニル(C1−3)アルキル、アミノ、イミノ(C1−3)アルキル、(C1−10)アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(C2−12)アルケニル、(C2−12)アルキニル、アリール、アリール(C1−10)アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール(C1−10)アルキル、(C9−12)ビシクロアリール、およびヘテロ(C8−12)ビシクロアリールからなる群から選択される]。 - IhがIva-Val-Val-Sta-Ala-Sta, Boc-Phe-His-Sta-Ile-AMP, Boc-Phe- His-Sta-Ala-Sta-OMe, Boc-Phe-His-Sta-Leu-NHCH2Ph, Boc-Phe-His-ACHPA- Leu-AMB, Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB, Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-AMP, Iva-Phe- Nle-Sta-Ala-Sta, Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta, Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Leu-Phe-NH2, Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2, Ac-His-Pro-Phe-His-ACHPA-Leu-Phe-NH2, Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2, Ac-(HCO-Trp)-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2, Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys, Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-Phe- NH2, Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe, Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys, His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH, Pro-His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH) Val-Ile-His-Lys(H-142), Boc-Phe-His-Cha-(CH2NH)Val-NH2(S)-Me(Bu), Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH, Boc-His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH(H-261)およびPEC-Phe-His-ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3からなる群から選択されるレニン阻害剤ペプチドである、請求項81に記載の複合体。
- IhがIva-Val-Val-Sta-Ala-Sta, Boc-Phe-His-Sta-Ile-AMP, Boc-Phe- His-Sta-Ala-Sta-OMe, Boc-Phe-His-Sta-Leu-NHCH2Ph, Boc-Phe-His-ACHPA- Leu-AMB, Boc-Phe-His-Sta-Leu-AMB, Boc-Pro-Phe-His-Sta-Ile-AMP, Iva-Phe- Nle-Sta-Ala-Sta, Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Ala-Sta, Iva-His-Pro-Phe-His-Sta-Leu-Phe-NH2, Ac-His-Pro-Phe-Val-Sta-Leu-Phe-NH2, Ac-His-Pro-Phe-His-ACHPA-Leu-Phe-NH2, Ac-Trp-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2, Ac-(HCO-Trp)-Pro-Phe-His-Sta-Ile-NH2, Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-D-Lys, Pro-His-Pro-Phe-His-Sta-Ile-Phe- NH2, Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Boc)-OMe, Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys, His-Pro-Phe-His-Leu-D-Leu-Val-Tyr-OH, Pro-His-Pro-Phe-His-Leu(CH2NH) Val-Ile-His-Lys(H-142), Boc-Phe-His-Cha-(CH2NH)Val-NH2(S)-Me(Bu), Pro-His-Pro-Phe-His-Leu-Phe-Val-Tyr-OH, Boc-His-Pro-Phe-His-Leu(CH(OH)CH2)Val-Ile-His-OH(H-261)およびPEC-Phe-His-ACHPA-ILeNHC(CH2OH)2CH3からなる群から選択されるレニン阻害剤ペプチドであり、Prがアルブミンである、請求項81に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、IhとPrとを共有結合させる少なくとも2つの官能基を含んでなる、請求項81に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、ヒト血清中で長時間加水分解上安定である、請求項81に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、ヒト血清中で8時間〜30日の半減期の間安定である、請求項81に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、アシルオキシメチルケトン、アジリジン、ジアゾメチルケトン、エポキシド、ヨード−、ブロモ−またはクロロアセトアミド、α−ハロエステル、α−ハロケトン、スルホニウム、クロロエチルスルフィド、O−アルキルイソ尿素、アルキルハリド、ビニルスルホン、アクリルアミド、アクリレート、ビニルピリジン、有機金属化合物、アリールジスルフィド、チオスルホネート、アルデヒド、ニトリル、α−ジケトン、α−ケトアミド、α−ケトエステル、ジアミノケトン、セミカルバゾン、およびジヒドラジドからなる群から選択される化合物の誘導体である、請求項81に記載の複合体。
- 前記リンカーL1またはL2が、アジドベンゾイルヒドラジド、N−[4−(p−アジドサリチルアミノ)ブチル]−3’−(2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジルタルトレート、N−y−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−4−アジドベンゾエート、N−スクシンイミジル[4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオネート、N−スクシンイミジル[4−ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、イソシアネート、チオエステル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、無水物および炭酸エステルからなる群から選択される化合物の誘導体である、請求項81に記載の複合体。
- 前記タンパク質が赤血球、ならびにIgMおよびIgGなどの免疫グロブリン、血清アルブミン、トランスフェリン、p90およびp38からなる群から選択される、請求項81に記載の複合体。
- 前記タンパク質がアルブミンである、請求項100に記載の複合体。
- 前記アルブミンが、乾物ベースで少なくとも10%の純度であるHSAまたは組換えHSAである、請求項101に記載の複合体。
- 前記結合がヒトアルブミンのCys−34に対するものである、請求項101に記載の複合体。
- 前記結合がヒトアルブミンのリジンに対するものである、請求項101に記載の複合体。
- mが1であり、nが1または2であり、かつ、タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項81に記載の複合体。
- nが1であり、タンパク質がHSAまたは組換えHSAであり、かつ、複合体が少なくとも30%の純度までさらに精製される、請求項81に記載の複合体。
- mが1であり、nが2であり、かつ、タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項81に記載の複合体。
- 化学量論比の(Ih)m−L1とPr、または化学量論比のIhとL2−(Pr)oを合わせることにより製造される、請求項81に記載の複合体。
- 少なくとも約1.3:1の比率のPrと(Ih)m−L1の混合物を合わせることにより製造される、請求項81に記載の複合体。
- L1およびL2が存在せず、Ihの活性化中間体を形成した後に、その活性化Ih中間体とPrを縮合させることにより製造される、請求項81に記載の複合体。
- Ihの活性化中間体が混合無水物またはN,N’−カルボニルジイミダゾール試薬から製造される、請求項110に記載の複合体。
- 少なくとも約30%の純度までさらに精製される、請求項108〜11のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記レニン阻害剤が分子量約1000DA未満のペプチド類似体である、請求項108に記載の複合体。
- 請求項81に記載の複合体と生理学上許容される担体とを含んでなる組成物。
- 非経口投与用に処方された、請求項114に記載の組成物。
- 溶液、使用前に溶媒と合わせる乾燥製品、懸濁液、エマルション、および液体濃縮物からなる群から選択される、請求項115に記載の組成物。
- イン・ビボにおいてレニン活性を阻害する方法であって、
哺乳類宿主の血流中に請求項81に記載の単離されたコンジュゲート複合体を投与することを含んでなり、この複合体は、レニン阻害剤と、そのタンパク質と反応して安定な共有結合を形成する少なくとも1つの反応性官能基を有するリンカーとを付着させることにより形成され、かつ、
この単離されたコンジュゲート複合体が、非コンジュゲートレニン阻害剤に比べて長時間血流中で有効な治療効果を維持する量で投与される、方法。 - 前記組成物が請求項100に記載の複合体である、請求項117に記載の方法。
- 前記タンパク質がHSAまたは組換えHSAである、請求項117に記載の方法。
- 反応性官能基を含んでなるリンカーが、アシルオキシメチルケトン、アジリジン、ジアゾメチルケトン、エポキシド、ヨード−、ブロモ−またはクロロアセトアミド、α−ハロエステル、α−ハロケトン、スルホニウム、クロロエチルスルフィド、O−アルキルイソ尿素、アルキルハリド、ビニルスルホン、アクリルアミド、アクリレート、ビニルピリジン、有機金属化合物、アリールジスルフィド、チオスルホネート、アルデヒド、ニトリル、α−ジケトン、α−ケトアミド、α−ケトエステル、ジアミノケトン、セミカルバゾン、およびジヒドラジドからなる群から選択される化合物である、請求項117に記載の方法。
- イン・ビボにおいてレニン活性を阻害する方法であって、
哺乳類宿主の血流中に請求項81に記載の複合体を、レニン阻害に有効な量を提供するに十分な量で投与すること;
それにより、その化合物が非結合レニン阻害剤の寿命に比べて長時間血流中で維持されることを含んでなる、方法。 - 宿主においてレニン活性を阻害する方法であって、
a)化合物Ih−L1またはIh−L2(ここで、Ihは分子量60kD未満のレニン阻害剤ペプチドであり、L1またはL2はIhと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)化合物Ih−L1またはIh−L2を単離されたタンパク質を、エクス・ビボにおいて、化合物Ih−L1またはIh−L2がそのタンパク質と共有結合して請求項81に記載のタンパク質複合体を形成するに十分な時間処理すること、および
c)処理したタンパク質複合体を宿主に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記タンパク質がアルブミンである、請求項122に記載の方法。
- 前記アルブミンがHSAまたは組換えHSAである、請求項123に記載の方法。
- 前記アルブミンが、アルブミンを化合物Ih−L1またはIh−L2で処理する前に、血液から採取、精製および単離される、請求項123に記載の方法。
- 前記アルブミンが乾物ベースで少なくとも10%の純度まで精製される、請求項125に記載の方法。
- 前記アルブミンが95%を超える純度レベルまで精製される、請求項125に記載の方法。
- 宿主においてレニン活性を阻害する方法であって、
a)化合物Ih−L1またはIh−L2(ここで、Ihは分子量60kD未満のレニン阻害剤ペプチドであり、L1またはL2はIhと共有結合しているリンカーである)を製造すること;
b)エクス・ビボにおいて、化合物Ih−L1またはIh−L2を単離された1以上のタンパク質Prで、化合物Ih−L1またはIh−L2が1以上の単離されたタンパク質と共有結合して、請求項81に記載の1以上の修飾タンパク質複合体を形成するのに十分な時間処理すること;および
c)その修飾タンパク質を宿主に投与すること
を含んでなる、方法。 - 前記タンパク質がアルブミンである、請求項128に記載の方法。
- 前記アルブミンが、化合物Ih−L1またはIh−L2で処理する前に、血液から採取、精製および単離される、請求項129に記載の方法。
- 前記アルブミンがHSAまたは組換えHSAである、請求項129に記載の方法。
- 治療上有効な量の請求項81に記載の複合体、またはその生理学上許容される塩と、薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
- 被験体の血圧を降下させる方法であって、その被験体に治療上有効な量の請求項132に記載の組成物を投与することを含んでなる、方法。
- 前記患者が高血圧症である、請求項133に記載の方法。
- 前記患者が軽度、中度または重度高血圧症である、請求項134に記載の方法。
- 高分子担体と共有結合している薬理活性部分を含んでなり、
前記担体が薬理学的に不活性であり、
前記薬理活性部分と担体の間の架橋がイン・ビボにおいて安定であり、
完全な化合物が前記薬理活性部分の薬理活性を実質的に保持し、かつ、
哺乳類に投与した際に前記化合物の有効半減期が前記薬理活性部分の少なくとも約2倍である、
単離された化合物。 - 前記高分子担体がタンパク質である、請求項136に記載の化合物。
- 前記高分子担体が前記哺乳類と同じ起源のアルブミンである、請求項136に記載の化合物。
- 前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項138に記載の化合物。
- 前記薬理活性部分がリンカー部分を介して前記担体とコンジュゲートされている、請求項136に記載の化合物。
- 前記薬理活性部分が前記担体と直接架橋されている、請求項136に記載の化合物。
- 少なくとも2つの薬理活性部分分子が前記担体とコンジュゲートされている、請求項136に記載の化合物。
- 前記担体との架橋が前記担体上のリジン側鎖を介するものである、請求項137に記載の化合物。
- 前記担体との架橋が前記担体上のシステイン側鎖を介するものである、請求項137に記載の化合物。
- 前記担体がHSAであり、前記架橋がHSAのC34を介するものである、請求項136に記載の化合物。
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