JP2006501836A5 - - Google Patents
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Claims (42)
- (a)標的核酸配列を含有していると思われる試料に、前記標的配列に対して特異的な蛍光標識されたプローブと、該プローブ上の前記蛍光標識から生じる蛍光エネルギーを吸収することができるが可視光を発しないDNA二重鎖結合物質とを添加すること、
(b)このようにして形成された混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
(c)前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
(d)前記試料から得られる蛍光をモニターすること、
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法。 - 前記DNA二重鎖結合物質が縮合共役環系を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA二重鎖結合物質が、ミトキサントロン(1,4−ジヒドロキシ5,8−ビス[[2−[(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エチル]アミノ]−9,10−アントラセンジオン)又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン(2R−(2α,3β,4α,5β,6α,11β,13α,14α)]−11−[6−デオキシ−3−C−メチル−2,3,4−トリ−O−メチル−α−L−マンノピラノシル)オキシ]−4−(ジメチルアミノ)−3,4,5,6,9,11,12,13,14,16−デカヒドロ−3,5,8,10,13−ペンタヒドロキシ−6,13−ジメチル−9,16−ジオキソ−2,6−エポキシ−2H−ナフタセノ[1,2−b]オキソシン−14−カルボン酸メチルエステル)である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記DNA結合物質がミトキサントロンである請求項3に記載の方法。
- 前記DNA結合物質が式(I)
の化合物である、請求項1または2に記載の方法。 - 工程(c)におけるプローブへのハイブリダイゼーションに先立って前記標的核酸が一本鎖にされる、請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である、請求項1から6の何れか1項に記載の方法。
- 前記増幅反応のすべてのサイクル中に前記プローブが前記標的核酸とハイブリダイズする、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 前記増幅反応全体を通して前記試料から生じた蛍光がモニターされる、請求項8に記載の方法。
- 生成された蛍光データがプローブハイブリダイゼーションの割合を測定するために使用される、請求項9に記載の方法。
- 前記蛍光データが前記試料中に存在する標的核酸の量を定量するために使用される、請求項8から10の何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光標識がローダミン色素、Cy5、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体である、請求項1から11の何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光標識が前記プローブの末端領域に結合されている、請求項1から12の何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光標識が前記プローブの3’末端に結合されており、ポリメラーゼによるプローブの伸長を防止する、請求項13に記載の方法。
- 前記プローブが伸長段階以外の増幅工程の段階の間に前記標的配列から無傷の状態で放出されるように、前記プローブが設計されている、請求項1から14の何れか1項に記載の方法。
- 前記プローブが、増幅工程の伸長段階の間に、前記ポリメラーゼの作用によって前記標的配列から無傷の状態で放出され、前記増幅反応が5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼを用いて行われる、請求項1から14の何れか1項に記載の方法。
- (a)核酸ポリメラーゼと、(b)標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズできる少なくとも一つのプライマーと、(c)前記標的ポリヌクレオチド配列に結合でき、蛍光標識を含有するオリゴヌクレオチドプローブと、(d)前記蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収することができ且つスペクトルの可視域で光を発しないDNA二重鎖結合物質と、の存在下において、標的ポリヌクレオチドに対して核酸増幅を実施すること、及び増幅反応中の蛍光の変化をモニターすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 1対の増幅プライマーを使用して前記増幅が好適に実施される、請求項17に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼである、請求項17又は18に記載の方法。
- さらなる工程において、ハイブリダイゼーションアッセイが実施され、前記配列に特有のハイブリダイゼーション条件が測定される、請求項1から19の何れか1項に記載の方法。
- 前記条件が温度、電気化学的ポテンシャル又は酵素若しくは化学物質との反応である、請求項20に記載の方法。
- 前記条件が温度である、請求項21に記載の方法。
- 標的配列中の対立遺伝子変異又は多型を検出するために使用される、請求項22に記載の方法。
- a)配列を含有すると思われる試料に、標的配列に対して特異的な蛍光標識プローブと、該プローブ上の蛍光標識から生じる蛍光を吸収することができるがスペクトルの可視域において放射を発しないDNA二重鎖結合物質とを添加すること、
(b)前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
(c)前記試料から生じる蛍光をモニターし、前記プローブの前記試料へのハイブリダイゼーションの結果として又は前記プローブと前記標的核酸配列との間で形成された前記二重鎖の不安定化の結果として蛍光が変化する、前記配列に特有の反応条件を決定すること、
を含む、配列の特徴を決定する方法。 - 前記配列に特有の前記反応条件が、温度、電気化学的ポテンシャル又は酵素若しくは化学物質との反応である、請求項24に記載の方法。
- 前記条件が温度である、請求項25に記載の方法。
- 2個の配列から得られた結果が、その間の多型又は変異の存在を決定するために比較される、請求項24から26の何れか1項に記載の方法。
- 前記DNA二重鎖結合物質が、ミトキサントロン(1,4−ジヒドロキシ5,8−ビス[[2−[(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エチル]アミノ]−9,10−アントラセンジオン)又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン(2R−(2α,3β,4α,5β,6α,11β,13α,14α))−11−[6−デオキシ−3−C−メチル−2,3,4−トリ−O−メチル−α−L−マンノピラノシル]オキシ]−4−(ジメチルアミノ)−3,4,5,6,9,11,12,13,14,16−デカヒドロ−3,5,8,10,13−ペンタヒドロキシ−6,13−ジメチル−9,16−ジオキソ−2,6−エポキシ−2H−ナフタセノ[1,2−b]オキソシン−14−カルボン酸メチルエステル)である、請求項24から27の何れか1項に記載の方法。
- 前記DNA二重鎖結合物質が請求項5に定義した式(IA)の化合物である、請求項24から27の何れか1項に記載の方法。
- (i)蛍光エネルギーを吸収することができるがスペクトラムの可視域で放射を発しないDNA二重鎖結合物質と、(ii)標的ヌクレオチド配列に特異的な蛍光標識プローブ又は(iii)増幅反応を実施するのに必要な1若しくは複数の試薬のうち何れかと、を備えた、請求項1から29の何れか1項に記載の方法で使用するためのキット。
- (iii)を含有し、前記試薬がプライマー、DNAポリメラーゼ、緩衝液、又はPCRを改良することが知られた補助剤から選択される、請求項30に記載のキット。
- 前記DNA二重鎖結合物質が、ミトキサントロン(1,4−ジヒドロキシ5,8−ビス[[2−[(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エチル]アミノ]−9,10−アントラセンジオン)又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン(2R−(2α,3β,4α,5β,6α,11β,13α,14α)]−11−[6−デオキシ−3−C−メチル−2,3,4−トリ−O−メチル−α−L−マンノピラノシル)オキシ]−4−(ジメチルアミノ)−3,4,5,6,9,11,12,13,14,16−デカヒドロ−3,5,8,10,13−ペンタヒドロキシ−6,13−ジメチル−9,16−ジオキソ−2,6−エポキシ−2H−ナフタセノ[1,2−b]オキソシン−14−カルボン酸メチルエステル)である、請求項30又は31に記載のキット。
- 前記DNA二重鎖結合物質が請求項5に定義した式(IA)の化合物である、請求項30又は31に記載のキット。
- (i)及び(ii)の両方を備えた、請求項30から33の何れか1項に記載のキット。
- 標的核酸を増幅することによって試料中の標的核酸配列の存在を検出するための方法における、蛍光エネルギーを吸収できるが可視光を発しないDNA二重鎖結合物質の使用。
- 前記DNA二重鎖結合物質が共役芳香環系を含む、請求項35に記載の使用。
- 前記DNA二重鎖結合物質がアントラサイクリン又はアントラキノンを含む、請求項36に記載の使用。
- 前記DNA二重鎖結合物質が、ミトキサントロン(1,4−ジヒドロキシ5,8−ビス[[2−[(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エチル]アミノ]−9,10−アントラセンジオン)又は塩酸塩若しくは二塩酸塩等のその塩類、又はノガラマイシン(2R−(2α,3β,4α,5β,6α,11β,13α,14α))−11−[6−デオキシ−3−C−メチル−2,3,4−トリ−O−メチル−α−L−マンノピラノシル]オキシ]−4−(ジメチルアミノ)−3,4,5,6,9,11,12,13,14,16−デカヒドロ−3,5,8,10,13−ペンタヒドロキシ−6,13−ジメチル−9,16−ジオキソ−2,6−エポキシ−2H−ナフタセノ[1,2−b]オキソシン−14−カルボン酸メチルエステル)である、請求項35から38の何れか1項に記載の使用。
- 前記DNA二重鎖結合物質が請求項5に定義した式(IA)の化合物である、請求項35から38の何れか1項に記載の使用。
- 前記DNA二重鎖結合物質がミトキサントロンである、請求項39に記載の使用。
- (a)標的核酸配列を含有していると思われる試料に、前記標的配列に対して特異的な蛍光標識されたプローブと、ダウノマイシン(8S,−シス)−8−アセチル−10−[3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−α−L−lyxo−ヘキソピラノシル)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−1−メトキシ−5,12−ナフタセンジオンとを添加すること、
(b)このようにして形成された混合物を、標的核酸が増幅される増幅反応に供すること、
(c)前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズする条件に前記試料を供すること、
(d)前記試料から得られる蛍光をモニターすること、
を含む、試料中の標的核酸配列の存在を検出する方法。
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