JP2006296916A - 癒着防止材 - Google Patents

Abstract

【課題】滞留性に優れた癒着防止材、さらに好ましくは取扱い性に優れた癒着防止材を提供する。
【解決手段】下記式（１）

（Ｒは下記式（１）−ａ

で表される基、−ＯＨまたは−ＯＮａ。）で表される癒着防止材。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンの反応生成物であるヒアルロン酸化合物からなる癒着防止材に関する。

術後癒着は、損傷を受けた臓器表面の腹膜が再生する際に、他の組織の腹膜と結合する事により発生し、イレウス、疼痛、不妊症などを引き起こすこともあるため、有効な防止法が求められている。腹膜再生の過程は、損傷組織表面への多核白血球の浸潤に始まり、中皮細胞により損傷部分が全面的に覆われる７〜８日後にほぼ終了することが知られている。従ってこの期間中、損傷を受けた組織と周辺組織との接触を物理的に遮断すれば、癒着の形成を防ぐことが期待できると考えられている。

このような中、ポリマーを用いた癒着防止材の開発が世界中で行われている。特に有望なポリマーの一つは、人体のいたるところに認められる細胞外マトリックスの成分、ヒアルロン酸である。ヒアルロン酸溶液は、腹部手術（非特許文献１）と整形外科手術（非特許文献２）など動物モデルで術後癒着形成を軽減することが示されている。しかし、ヒアルロン酸そのものは極めて迅速な吸収時間を特徴とし、これは癒着を予防するのに必要な滞留時間とは相容れない。実際に臨床試験において統計学的に有意な効果は示されていない（非特許文献３）。

そこで、より癒着形成軽減効果を強くするため、滞留時間を改善したヒアルロン酸の開発が行われている。例えば、ビスエポキシド架橋ヒアルロン酸（特許文献１）、ジビニルスルフォン架橋ヒアルロン酸（特許文献２，３）、ホルムアルデヒド架橋ヒアルロン酸（特許文献４）などが挙げられる。しかし、いずれの場合も架橋剤が非生体吸収性物質であるため安全性が懸念されており、安全性に優れた癒着防止材が求められている。また実際に、脂質を結合させたグリコサミノグリカンが上皮細胞の伸展を抑制することが示されているが（特許文献５）、生体での癒着防止効果は明らかとなっていない。

安全性に優れた癒着防止材として、セプラフィルム（科研製薬、Ｇｅｎｚｙｍｅ）が既に臨床で使用され、癒着の低減に有効であることが示唆されている（非特許文献４，５）。セプラフィルムは、貼布後２４時間から４８時間でゲル状となり、およそ７日間貼布部位に貯留して、損傷を受けた組織とその周囲の組織を物理的に隔離することで、癒着防止効果を発揮する。また、セプラフィルムは貼布後２８日以内に体外へ排出されるため、外科的除去は不要である点がメリットである。しかし、問題点として、乾燥状態では柔軟性がないため、使用部位が複雑な形状であると使用できず、また腹腔鏡下での手術時には適さないという問題点が挙げられている。

特開平７−９７４０１号公報 米国特許第４５８２８６５号明細書 米国特許第４６０５６９１号明細書 特開昭６０−１３０６０１号公報 特開２００３−１６０４９８号公報 Fertil Steril. 56, 563-567(1991) J Hand Surg [Am]. 17, 935-941(1992) J Hand Surg [Am]. 17, 132-136(1992) Fertil Steril. 66, 904-910(1996) J Am Coll Surg. 183, 297-306(1996)

本発明の目的は生体適合性、滞留性に優れた癒着防止材を提供することにある。さらに好ましくは取扱い性に優れた癒着防止材を提供することにある。

本発明の発明者らは、ヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンの反応生成物であるヒアルロン酸化合物が癒着防止材として有用であることを見出し本発明に到達した。

本発明は以下の通りである。
１．下記式（１）

ここでは、Ｒは下記式（１）−ａ

で表される基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ^１は炭素数１０〜２８のアルキル基またはアルケニル基でありそしてｎは５０〜５０，０００の数である、但しＲの１０〜１００％が上記式（１）−ａで表される基であるものとする、で表される癒着防止材。
２．ｎが１，０００〜１０，０００である上記に記載の癒着防止材。
３．Ｒが１０〜５０％である上記に記載の癒着防止材。
４．Ｒが３０〜５０％である上記に記載の癒着防止材。
５．式（１）−ａにおける２つの基Ｒ^１ＣＯ−がいずれもオレオイル基である上記に記載の癒着防止材。

本発明の癒着防止材は、体内での安全性および滞留性に優れ、優れた癒着防止効果を示す。特にヒアルロン酸化合物がペースト状のゲルである場合、十分な柔軟性を有することから取扱い性に優れ、複雑な形状の部位にも適用でき、内視鏡を用いた手術にも適用可能である。

以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。

本発明のヒアルロン酸化合物は、下記式（１）

で表される。上記式（１）中、Ｒは下記式（１）−ａ

で表されるホスファチジルエタノールアミノ基であるか、−ＯＨまたは−ＯＮａである。但し、Ｒの１０〜１００％がホスファチジルエタノールアミノ基である必要がある。ホスファチジルエタノールアミノ基の割合がＲの１０％未満であると、所望の癒着防止効果が達成されない。

本発明の癒着防止材が不定形なペースト状のゲルである場合はその形状を容易に変えることができるので、本発明の癒着防止材は取扱い性の観点からゲル状であることが好ましい。Ｒにおけるホスファチジルエタノールアミノ基の割合は５０％を超えるとペースト状のゲルを形成しなくなるので、ゲル状の癒着防止材を形成する目的では、Ｒにおけるホスファチジルエタノールアミノ基の割合は１０〜５０％であることが好ましい。

Ｒにおけるホスファチジルエタノールアミノ基の割合が高くなるにつれ滞留性が向上して、癒着防止効果を長期にわたって発揮することができる。この点でＲにおけるホスファチジルエタノールアミノ基の割合は３０％以上であることが好ましい。

すなわち本発明の癒着防止材において、Ｒにおけるホスファチジルエタノールアミノ基の割合は３０〜５０％であることが好ましい。

Ｒは炭素数１０〜２８、好ましくは炭素数１４〜２０のアルキル基またはアルケニル基であり、そしてｎは５０〜５０，０００、好ましくは３００〜３０，０００、さらに好ましくは１，０００〜１０，０００である。Ｒの炭素数１０〜２８のアルキル基としては、例えばデシル、ウンデシル、ラウリル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、ステアリル、エイコサニルを挙げることができる。

また、炭素数１０〜２８のアルケニル基としては、例示した上記アルキル基に対応する。１〜３個の炭素−炭素不飽和結合を有するアルケニル基例えばオレイル基を挙げることができる。上記式（１）で表される化合物として、式（１）−ａ中の２つの基Ｒ^１ＣＯ−がいずれもオレオイル基であるものが好ましい。

上記式（１）で表されるヒアルロン酸化合物は、例えばヒアルロン酸とホスファチジルエタノールアミンとを反応させることによって製造することができる。

本発明で使用されているヒアルロン酸は、動物組織から抽出したもの、または発酵法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用する菌株はストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産能を有する微生物が好ましく、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（特開昭６３−１２３３９２号公報）、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（特開平２−２３４６８９号公報）が挙げられる。これらの変異株を用いて培養、精製されたものを用いる。またヒアルロン酸の分子量は、約１×１０^５〜１×１０^７のものが好ましい。なお本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する。

本発明で使用されているホスファチジルエタノールアミンとしては、動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。ホスファチジルエタノールアミン及びその誘導体として以下のものが挙げられる。ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリグノセロイルホスファチジルエタノールアミン、ジセロチオイルホスファチジルエタノールアミン、ジモンタノイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジネルボノイルホスファチジルエタノールアミン、ジキメノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヒラゴノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。その中でも、溶解性の面からジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが好ましい。

また、ホスファチジルエタノールアミンの使用量は、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し、１０〜１００当量であることが好ましく、また１０〜５０当量がより好ましく、さらには３０〜５０当量であることが好ましい。
ヒアルロン酸化合物が固体である場合は、柔軟性を付与する目的で生体適合性のある可塑剤を添加することも好ましい。

以下の実施例により本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例に使用したヒアルロン酸ナトリウム、テトラヒドロフラン、０．１Ｍ ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ、1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodi-imide（ＥＤＣ）、1-Hydroxybenzotriazole（ＨＯＢｔ）は、和光純薬工業（株）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＥ−８１８１）は日本油脂（株）、消毒用エタノール（和光純薬工業）、ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、大日本製薬(株)）、イソジン消毒液（明治製菓）、生理食塩水（大塚製薬）、ラット（日本チャールス・リバー株式会社）のものを使用した。

［実施例１］
（化合物調整）
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２２０ｍｇ（０．００００６６ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し２０当量）を、テトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）２００ｍｌに溶解した。この溶液に、ヒアルロン酸ナトリウム５００ｍｇを加え、０．１Ｍ ＨＣｌ／０．１Ｍ ＮａＯＨを添加し、ｐＨ６．８に調整した。1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide（ＥＤＣ） ６０ｍｇ（０．００００６６ｍｏｌ）、1-hydroxybenzotriazole（ＨＯＢｔ）５０ｍｇ（０．００００６６ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水＝１／１の水溶液１０ｍｌに溶解し反応系に添加し、終夜攪拌を行った。攪拌後、透析精製を行い凍結乾燥し目的物を得た。確認は^１ＨＮＭＲ（日本電子 ＪＮＭ−ａｌｐｈａ４００）により行い、目的物の生成を確認した。
凍結乾燥品１０ｍｇを生理食塩水９９０ｍｇに溶解し、濃度１ｗｔ％のハイドロゲルを調整した。

（動物評価）
腹腔内癒着モデル作製日にラットの体重を測定し、体重の重い個体（２３０．９ ｇ以上）及び軽い個体（２００．６ ｇ以下）を除外し４０匹を選抜し、各試験群の平均体重がほぼ均等になるように群分けした。Ｔａｐａｒｉａら及びＳａｃｈｄｅｖａらの方法１， ２）を参考にして腹腔内癒着モデルを作製した(1) Sushil Taparia, Ravindra Sharma, Suresh Narain Mathur and Ved Prakash Sharma: Intraperitoneal aprotinin (Antagosan) in the prevention of postoperative adhesions -An experimental study in rats-, Asian Med. J. 28 (1), 58-64 (1985)、2) H. S. Sachdeva, L. V. Gutierrez and A. G. Cox: Silicone fluid and steroids in the prevention of adhesions., Br. J. Surg., 58 (5), 382-384 (1971))。すなわち、ラットをペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与麻酔下で背位に固定し、腹部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。さらにイソジン消毒液で手術領域を消毒した後、腹部正中線に沿って３〜４ｃｍ切開して盲腸を露出させた。露出させた盲腸の一定の面積（１〜２ｃｍ^２）について、滅菌ガーゼを用いて点状出血が生じるまで擦過した。盲腸を腹腔内に戻した後、ヒアルロン酸ハイドロゲル（１ｍＬ）を擦過部位に塗布し、さらに切開部の筋層は連続縫合した後、皮膚は４〜５針縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。モデル作製２８日後に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で開腹し、腹腔内癒着の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従ってスコア化した。

（グレード分類）
グレード０（スコア０） ：癒着が認められない状態
グレード１（スコア１） ：細くて容易に分離できる程度の癒着
グレード２（スコア２） ：狭い範囲ではあるが、軽度の牽引に耐えられ得る程度
の弱い癒着
グレード３（スコア３） ：かなりしっかりとした癒着あるいは少なくとも２箇所に癒着が認められる状態
グレード４（スコア４） ：３箇所以上に癒着が認められる状態

各動物の腹腔内癒着の程度をグレード分類に従ってスコア化し、結果はその平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）で表記した。検定は対照群と被験物質群の２群間検定としてＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行った。なお、統計ソフトはThe SAS System Release 8.2 (TS2M0) for Windows(SAS Institute Inc.)及びその連動システムEXSAS Version 7.10（(株)アーム）を用いた。
ラットの腹腔内癒着モデルに対する被験物質の２８日間適用による効果を検討し、その結果を図１に示す。

［実施例２］
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４４０ｍｇ（０．０００１３２ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し４０当量）、1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide(EDC) 120mg(0.000132mol)、1-hydroxybenzotriazole（ＨＯＢｔ）１００ｍｇ（０．０００１３２ｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同様にハイドロゲルを調製し、ラットの腹腔内癒着評価を行った。結果を図１に示す。

［比較例１］
ラットをペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与麻酔下で背位に固定し、腹部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。さらにイソジン消毒液で手術領域を消毒した後、腹部正中線に沿って３〜４ｃｍ切開して盲腸を露出させた。露出させた盲腸の一定の面積（１〜２ｃｍ^２）について、滅菌ガーゼを用いて点状出血が生じるまで擦過した。盲腸を腹腔内に戻し、切開部の筋層は連続縫合した後、皮膚は４〜５針縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。モデル作製２８日後に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で開腹し、腹腔内癒着の程度を肉眼的に観察しスコア化した。結果を図１に示す。

［比較例２］
Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン５５ｍｇ（０．００００１６５ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し５当量）、1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]-carbodiimide（ＥＤＣ）１５ｍｇ（０．００００１６５ｍｏｌ）、1-hydroxybenzotriazole（ＨＯＢｔ）１２．５ｍｇ（０．００００１６５ｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同様にハイドロゲルを調製し、ラットの腹腔内癒着評価を行った。結果を図１に示す。

図１に示されているとおり、比較例１の平均癒着スコアは、２．７±０．４であった。これに対し、実施例１のヒアルロン酸化合物は１．３±０．５の癒着スコアを示し、比較例１と比較して癒着スコアに統計学的に有意な差はみられないものの、癒着スコアの減少傾向を示した。実施例２のヒアルロン酸化合物は１．２±０．４の癒着スコアを示し、比較例１と比較して癒着スコアの統計学的にも有意な減少を示した（Ｐ＜０．０５）。それに対し、比較例２のヒアルロン酸化合物での平均癒着スコアは２．４±０．３を示し、比較例１と比較して癒着スコアに有意な差はみられなかった。

以上の結果より、実施例１，２のヒアルロン酸化合物は２８日間適用において癒着スコアの減少を示すことから、癒着防止効果が示唆された。

本発明の癒着防止材は体内での優れた滞留安定性を有し、癒着防止材として有用である。とくに癒着防止材がゲル状の場合は、複雑な形状の部位にも適用でき、内視鏡を用いた手術にも適用可能である。

実施例１、２、比較例１、２における癒着スコア評価。

Claims (5)

1. 下記式（１）
   

   

   ここでは、Ｒは下記式（１）−ａ
   

   

   で表される基、−ＯＨまたは−ＯＮａであり、Ｒ^１は炭素数１０〜２８のアルキル基またはアルケニル基でありそしてｎは５０〜５０，０００の数である、但しＲの１０〜１００％が上記式（１）−ａで表される基であるものとする、
   で表される癒着防止材。
2. ｎが１，０００〜１０，０００である請求項１に記載の癒着防止材。
3. Ｒが１０〜５０％である請求項１または２に記載の癒着防止材。
4. Ｒが３０〜５０％である請求項３に記載の癒着防止材。
5. 式（１）−ａにおける２つの基Ｒ^１ＣＯ−がいずれもオレオイル基である請求項１〜３のいずれかに記載の癒着防止材。

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