JP2006204256A - ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 - Google Patents
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006204256A JP2006204256A JP2005023975A JP2005023975A JP2006204256A JP 2006204256 A JP2006204256 A JP 2006204256A JP 2005023975 A JP2005023975 A JP 2005023975A JP 2005023975 A JP2005023975 A JP 2005023975A JP 2006204256 A JP2006204256 A JP 2006204256A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polyhydroxyalkanoate
- dna
- gene
- degrading enzyme
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 title claims abstract description 135
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 title claims abstract description 135
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 41
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 135
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 90
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 71
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 claims description 58
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 23
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 19
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 11
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 11
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 claims description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 58
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 description 41
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- BYHDDXPKOZIZRV-UHFFFAOYSA-N 5-phenylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC1=CC=CC=C1 BYHDDXPKOZIZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 241001508466 Pseudomonas cichorii Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N D-ribopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 241001300822 Pseudomonas jessenii Species 0.000 description 3
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 3
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N noncarboxylic acid Natural products CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 4-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)CCC(O)=O JOOXCMJARBKPKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 2
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- WWNNZCOKKKDOPX-UHFFFAOYSA-N N-methylnicotinate Chemical compound C[N+]1=CC=CC(C([O-])=O)=C1 WWNNZCOKKKDOPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OCC DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940008406 diethyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 2
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 2
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-N sebacic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCC(O)=O CXMXRPHRNRROMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N triacetin Chemical compound CC(=O)OCC(OC(C)=O)COC(C)=O URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAWZDTNXLSGCEK-WYWMIBKRSA-N (-)-quinic acid Chemical compound O[C@@H]1C[C@](O)(C(O)=O)C[C@@H](O)[C@H]1O AAWZDTNXLSGCEK-WYWMIBKRSA-N 0.000 description 1
- IMMRMPAXYUIDLR-UHFFFAOYSA-N (R)-3-Hydroxy-5-phenylpentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)CCC1=CC=CC=C1 IMMRMPAXYUIDLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N -2,3-Dihydroxypropanoic acid Natural products OCC(O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WAHBMDYPOIEGOQ-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxyphenyl)pentanoic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)C1=CC=CC(O)=C1 WAHBMDYPOIEGOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 241000607516 Aeromonas caviae Species 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 241000190857 Allochromatium vinosum Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQBQBRBAJDVVOH-UHFFFAOYSA-N CCNC(C)C(C)C Chemical compound CCNC(C)C(C)C FQBQBRBAJDVVOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- AAWZDTNXLSGCEK-UHFFFAOYSA-N Cordycepinsaeure Natural products OC1CC(O)(C(O)=O)CC(O)C1O AAWZDTNXLSGCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252867 Cupriavidus metallidurans Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N D-Cellobiose Natural products OCC1OC(OC2C(O)C(O)C(O)OC2CO)C(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- YTBSYETUWUMLBZ-UHFFFAOYSA-N D-Erythrose Natural products OCC(O)C(O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- YTBSYETUWUMLBZ-IUYQGCFVSA-N D-erythrose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 1
- DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N D-glucaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N D-glyceric acid Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191004 Ectothiorhodospira shaposhnikovii Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010056474 Erythrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N N-methylaminoacetic acid Natural products C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005643 Pelargonic acid Substances 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589755 Pseudomonas mendocina Species 0.000 description 1
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 description 1
- 101100463818 Pseudomonas oleovorans phaC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100463820 Pseudomonas oleovorans phaC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000520900 Pseudomonas resinovorans Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002933 cyclohexyloxy group Chemical group C1(CCCCC1)O* 0.000 description 1
- 229960001270 d- tartaric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 description 1
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960002598 fumaric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001087 glyceryl triacetate Substances 0.000 description 1
- 235000013773 glyceryl triacetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229920001580 isotactic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000010128 melt processing Methods 0.000 description 1
- HNEGQIOMVPPMNR-NSCUHMNNSA-N mesaconic acid Chemical compound OC(=O)C(/C)=C/C(O)=O HNEGQIOMVPPMNR-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- HNEGQIOMVPPMNR-UHFFFAOYSA-N methylfumaric acid Natural products OC(=O)C(C)=CC(O)=O HNEGQIOMVPPMNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 101150053431 phaZ gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 125000004436 sodium atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960002622 triacetin Drugs 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】生産性の向上したポリヒドロキシアルカノエート生産菌株の提供すること。
【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊して、ポリヒドロキシアルカノエート生産効率が向上したポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得る。
【選択図】 なし
【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊して、ポリヒドロキシアルカノエート生産効率が向上したポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得る。
【選択図】 なし
Description
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌および該生産菌を用いたポリヒドロキシアルカノエートの生産方法に関する。またポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊するための遺伝子ターゲティングベクターおよび該遺伝子ターゲティングベクターを用いたポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊方法に関する。
これまで、多くの微生物がポリ-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)あるいはその他のポリ-3-ヒドロキシアルカノエート(PHA)を生産し、菌体内に蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,P178-197(1995))。これらのポリマーは従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で微生物により完全分解されるという利を有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
特に最近、微生物産生PHAのより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮して、アルキル基以外の置換基を側鎖に導入したPHA「unusual PHA」が極めて有用であることが期待されている。このような置換基の例としては、芳香環を含むもの(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基等)や、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド、チオエーテルなどが挙げられる。
微生物産生PHAは、その生産に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、様々な組成や構造のものとなり得ることが知られており、このようなPHAを産生する微生物については様々な研究が成され、PHAの生合成経路は比較的よく調べられてきた。
これまでのところポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はその基質特異性とサブユニット構成により、3つのクラスに分類されている。
「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はRalstonia eutrophaやAeromonas punctataなどに見出されるもので、炭素数3から5の短い鎖長の3−ヒドロキシアルカン酸と、補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
「第2のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はPseudomonas oleovolansやPseudomonas aeruginosaなどに見出されるもので、炭素数6から14の中鎖長3−ヒドロキシアルカン酸のほか様々な「unusual」な3−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を基質として利用する。
第1、第2のクラスともに、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は分子量61から73kDaの単一のサブユニットから構成されている。
「第3のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素はAllochromatium vinosumやEctothiorhodospira shaposhnikoviiなどに見出され、約40kDaの相異なる2種類のサブユニットから構成される。基質特異性は、第1のクラスのポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に似て、炭素数3から5の短い鎖長の3−ヒドロキシアルカン酸と補酵素CoAとのチオエステル体を利用する。
一方PHAの分解経路については不明な点が多い。The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)には上記「第2のクラス」に属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するPseudomonas oleovolansに対する化学変異原処理によって細胞内PHAを分解できない変異株を取得し、これを利用してPHA分解活性を相補する遺伝子をクローニングしたことが開示されている。これによれば、PHA合成酵素遺伝子(phaC1, phaC2)とPHA分解酵素遺伝子(phaZ)はクラスターを形成し、phaC1-phaZ-phaC2という構成をとっている。その後、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas sp.61-3、Pseudomonas resinovolans、Pseudomonas putida U、Pseudomonas mendocinaなど、Pseudomonas oleovolansと同じ第2のクラスに属する基質特異性を有するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する他の細菌においても、同じphaC1-phaZ-phaC2という遺伝子構成をとっていることが明らかになっている。
ところで、これらの研究の過程でPHA分解酵素遺伝子の機能しない変異株が単離されたものの、PHA分解酵素活性と細胞内PHAの蓄積量との関係についてはわかっていない。
一方、特開平11−113574号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・ユートロファスから単離されたポリ-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)の分解酵素が提示されている。また、特開平9−191887号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するアルカリゲネス・フェリカスから単離されたポリ-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)の分解酵素が提示されている。さらに、特開平6−086681号公報には「第1のクラス」に属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するズーグロエア・ラミゲラから単離されたポリ-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)の分解酵素が提示されている。
特開平11−113574号公報
特開平9−191887号公報
特開平6−086681号公報
「生分解性プラスチックハンドブック」,生分解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,P178-197(1995)
The Journal of Biological Chemistry 266, 2191(1991)
機能性ポリマーとして期待されているPHAを、安価にかつ大量に安定的に得るためにはその生産性を向上させることが必要である。このためには、単にPHAを産生する微生物の生合成効率を高めるのみでなく、その分解を抑えることが重要であると考えられる。従来知られていた第1のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物から単離されたポリ-3-ヒドロキシ酪酸(PHB)の分解酵素は、炭素数3から5の短い鎖長の3−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするPHAの分解に関与するものであるので、機能性ポリマーとして期待されているPHA(特にunusual PHA)を、安価にかつ大量に安定的に得るためには、利用できない。本発明の解決しようとする課題の第1は、第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有する微生物のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊(gene-disruption)することにより、生産能の向上したunusual PHA産生微生物の同質遺伝子系統を提供することである。
そのような菌株を得る一般的な方法は、ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からスクリーニングするという煩雑な実験操作を要するものであり、簡便なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたunusual PHA産生微生物の取得方法が望まれるところである。本発明の解決しようとする課題の第2は、簡便なポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたunusual PHA産生微生物の取得方法を提供することである。
本発明者らは鋭意研究を行い、unusual PHA産生微生物の一種である、シュードモナス スピーシーズ YN21株よりPHA分解酵素遺伝子を単離するとともに、その遺伝子の塩基配列を利用してポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いることによって、unusual PHA産生微生物の一種であるシュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統であり、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とする菌株を新たに取得することができた。また、構築した遺伝子ターゲティングベクターを用いれば、他の第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート産生微生物のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素も特異的に遺伝子破壊できることを見出した。さらに、新たに取得したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されている菌株を用いると、炭素数6から14の中鎖長3−ヒドロキシアルカン酸のほか様々な「unusual」な3−ヒドロキシアルカン酸を構成単位とするPHAの生産性を従来よりも向上できることを見出し本発明の完成に至った。
すなわち、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌である。本発明にかかるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の一態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21、FERM BP−08569)の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株(Pseudomonas sp. PZ1、FERM BP−08571)である。
本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法である。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を得るためのターゲッティングベクターは、下記(a)または(b)に示す相同組換えのためのDNAと、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部。
本発明のターゲッティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)接合起点遺伝子、及び
(5)ベクター
とを有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)接合起点遺伝子、及び
(5)ベクター
とを有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
本発明のターゲッティングベクターの他の態様は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)該(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部に挿入された外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)感受性遺伝子、
(5)接合起点遺伝子、及び
(6)ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)該(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部に挿入された外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)感受性遺伝子、
(5)接合起点遺伝子、及び
(6)ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターである。
本発明の細胞接合によるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子は破壊のための宿主細胞は、上記の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞である。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項4に記載の遺伝子ターゲティングベクターDNAとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体DNA上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項9から11のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体DNA上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法である。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素が破壊されていることから、合成されたPHAを分解することができないので、通常の生産菌に比べてPHAの生産性が向上すると考えられる。ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21、FERM BP−08569)は、本発明者らによって単離され、様々なunusualPHAを合成することができる。したがってYN21株の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とする本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株(Pseudomonas sp. PZ1、FERM BP−08571)を用いれば、unusual PHAを従来より高い生産性で製造することができる。
また、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするが、従来よりも高い生産能を有する生産菌株を用いることで、より高い生産性でPHAを製造することができる。
さらに、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターは、前記第2のクラスに属するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を効率的に破壊することができる。
またさらに、本発明の、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法は、前記本発明の遺伝子ターゲティングベクターDNAとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体DNA上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を簡便に破壊することが出来る。
本発明に供されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌とは、従来よりポリヒドロキシアルカノエートを生産することの知られている微生物の内、下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
と生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を具備しているものであれば特に限定されない。このような微生物としては、シュードモナス オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)(Makromol.Chem.,191,1957-1965(1990)及びMacromolecules,24,5256-5260(1991))、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)(Can.J.Microbiol.,41,32-43(1995)及び Polymer International,39,205-213(1996))、シュードモナス・レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)(Appl.Environ.Microbiol,58(2),746 (1992))、シュードモナス sp.61-3株(Pseudomonas sp.61-3 strain)(Int.J.Biol.Macromol.,16(3)、119 (1994))、シュードモナス・チコリアイ YN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM BP-7375)、シュードモナス・チコリアイ H45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP-7374)、シュードモナス・ジェッセニイP161株(Pseudomonas jessenii P161、FERM BP-7376)などが挙げられるが、上記相同性を具備するものであれば、これらに限られず、また将来新たに見出されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌も本発明に供することができる。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
と生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を具備しているものであれば特に限定されない。このような微生物としては、シュードモナス オレオボランス(Pseudomonas oleovorans)(Makromol.Chem.,191,1957-1965(1990)及びMacromolecules,24,5256-5260(1991))、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)(Can.J.Microbiol.,41,32-43(1995)及び Polymer International,39,205-213(1996))、シュードモナス・レジノボランス(Pseudomonas resinovorans)(Appl.Environ.Microbiol,58(2),746 (1992))、シュードモナス sp.61-3株(Pseudomonas sp.61-3 strain)(Int.J.Biol.Macromol.,16(3)、119 (1994))、シュードモナス・チコリアイ YN2株(Pseudomonas cichorii YN2;FERM BP-7375)、シュードモナス・チコリアイ H45株(Pseudomonas cichorii H45、FERM BP-7374)、シュードモナス・ジェッセニイP161株(Pseudomonas jessenii P161、FERM BP-7376)などが挙げられるが、上記相同性を具備するものであれば、これらに限られず、また将来新たに見出されるポリヒドロキシアルカノエート生産菌も本発明に供することができる。
本発明者らはフェニル吉草酸を基質として用いて、3−ヒドロキシフェニル吉草酸モノマーユニットを含むPHAを生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、土壌より所望の能力を有する微生物株を分離することに成功し、YN21株とした。
以下に述べる菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー・第1巻(Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology,Volume1)(1984年)、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ・ディタミネーティブ・バクテリオロジー(Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology)第9版(1994年)に基づいて検索したところ、YN21株はシュードモナス属(Pseudomonas)に属すると判明した。従って、この菌株をシュードモナス・スピーシーズ・YN21株とそれぞれ命名した。
unusualな置換基を有するポリヒドロキシアルカノエート生産菌として本発明者らが土壌より分離した微生物である、シュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21)は特に本発明に好適に供し得る。YN21株は寄託番号「FERM BP-08569」として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨木県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託されている。なお、YN21株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
<YN21株の菌学的性質>
1)形態学的性質
細胞の形と大きさ:桿菌、0.8μm×1.5〜2.0μm
細胞の多形性:なし
運動性:あり
胞子形成:なし
グラム染色性:−
コロニー形状:円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
2)生理学的性質
カタラーゼ活性:+
オキシダーゼ活性:+
O/F試験:酸化型
硝酸還元:+
インドール産生:−
アルギニンジヒドロラーゼ:+
エスクリン加水分解:−
ゼラチン加水分解:−
King's B寒天での蛍光色素産生:+
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :−
Tween 80 の加水分解:+
41℃生育:−
グルコン酸還元:−
レバン産生:−
ジャガイモ腐敗:−
タバコ過敏感反応:−
スクロース:−
カゼイン:−
チロシナーゼ:+
硫化水素:−
ペクチン:−
レシチナーゼ:−
リトマスミルク:B
デンプン:−
3)基質資化能
ブドウ糖:+
L-アラビノース:+
D-マンノース:+
D-マンニトール:−
マルトース:−
グルコン酸:+
D-キシロース:(+)
ラフィノース:−
サリシン:−
グリセリン:+
D-セロビオース:−
D-メレチトース:−
ラクトース:−
ガラクトース:+
D-ソルビトール:−
α-メチル-D-グルコシド:−
D-リボース:(+)
スクロース:−
イノシトール:−
D-フルクトース:+
L-ラムノース:−
D-アラビノース:−
ズルシトール:−
メリビオース:−
アドニトール:−
デンプン:−
エリスリトール:−
トレハロース:−
ベタイン:+
DL-乳酸:+
D-酒石酸:−
L-酒石酸:(+)
メソ酒石酸:+
n-カプリン酸:+
L-リンゴ酸:(+)
クエン酸:+
D-サッカラート:+
レブリン酸:+
メサコン酸:−
マロン酸:+
コハク酸:+
酢酸:+
プロピオン酸:+
n-酪酸:+
ギ酸:−
グルタル酸:+
D-キナ酸:+
セバシン酸:+
p-ヒドロキシ安息香酸:+
アントラニル酸:−
ペラルゴン酸:+
グリセリン酸:+
γ-アミノ酪酸:+
L-ロイシン:+
L-セリン:+
ヒスチジン:+
L-イソロイシン:+
L-アルギニン:+
β-アラニン:+
L-チロシン:+
L-バリン:+
ホモセリン:−
サルコシン:+
トリアセチン:+
トリゴネリン:+
5-フェニル吉草酸:+
3-ヒドロキシ酪酸:+
L-アスパラギン:+
YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株(FERM BP-7375)と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、D-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるPseudomonas cichorii H45 株(FERM BP-7374)とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、L-アラビノース資化能、D-マンニトール資化能において、Pseudomonas jessenii P161 株(FERM BP-7376)とはD-マンニトール資化能において、Pseudomonas putida P91 株(FERM BP-7373)とは硝酸塩還元性、L-アラビノース資化能、D−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
<YN21株の菌学的性質>
1)形態学的性質
細胞の形と大きさ:桿菌、0.8μm×1.5〜2.0μm
細胞の多形性:なし
運動性:あり
胞子形成:なし
グラム染色性:−
コロニー形状:円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
2)生理学的性質
カタラーゼ活性:+
オキシダーゼ活性:+
O/F試験:酸化型
硝酸還元:+
インドール産生:−
アルギニンジヒドロラーゼ:+
エスクリン加水分解:−
ゼラチン加水分解:−
King's B寒天での蛍光色素産生:+
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :−
Tween 80 の加水分解:+
41℃生育:−
グルコン酸還元:−
レバン産生:−
ジャガイモ腐敗:−
タバコ過敏感反応:−
スクロース:−
カゼイン:−
チロシナーゼ:+
硫化水素:−
ペクチン:−
レシチナーゼ:−
リトマスミルク:B
デンプン:−
3)基質資化能
ブドウ糖:+
L-アラビノース:+
D-マンノース:+
D-マンニトール:−
マルトース:−
グルコン酸:+
D-キシロース:(+)
ラフィノース:−
サリシン:−
グリセリン:+
D-セロビオース:−
D-メレチトース:−
ラクトース:−
ガラクトース:+
D-ソルビトール:−
α-メチル-D-グルコシド:−
D-リボース:(+)
スクロース:−
イノシトール:−
D-フルクトース:+
L-ラムノース:−
D-アラビノース:−
ズルシトール:−
メリビオース:−
アドニトール:−
デンプン:−
エリスリトール:−
トレハロース:−
ベタイン:+
DL-乳酸:+
D-酒石酸:−
L-酒石酸:(+)
メソ酒石酸:+
n-カプリン酸:+
L-リンゴ酸:(+)
クエン酸:+
D-サッカラート:+
レブリン酸:+
メサコン酸:−
マロン酸:+
コハク酸:+
酢酸:+
プロピオン酸:+
n-酪酸:+
ギ酸:−
グルタル酸:+
D-キナ酸:+
セバシン酸:+
p-ヒドロキシ安息香酸:+
アントラニル酸:−
ペラルゴン酸:+
グリセリン酸:+
γ-アミノ酪酸:+
L-ロイシン:+
L-セリン:+
ヒスチジン:+
L-イソロイシン:+
L-アルギニン:+
β-アラニン:+
L-チロシン:+
L-バリン:+
ホモセリン:−
サルコシン:+
トリアセチン:+
トリゴネリン:+
5-フェニル吉草酸:+
3-ヒドロキシ酪酸:+
L-アスパラギン:+
YN21株は従来菌株であるPseudomonas cichorii YN2株(FERM BP-7375)と硝酸塩還元性、インドール生成、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ活性、D-マンノース資化能などの生理学的性質及び基質資化能の違いを示すことができる。また同様に従来菌株であるPseudomonas cichorii H45 株(FERM BP-7374)とは硝酸塩の還元性、アルギニンジヒドロラーゼ活性、L-アラビノース資化能、D-マンニトール資化能において、Pseudomonas jessenii P161 株(FERM BP-7376)とはD-マンニトール資化能において、Pseudomonas putida P91 株(FERM BP-7373)とは硝酸塩還元性、L-アラビノース資化能、D−マンノース資化能においてそれぞれ特性を異にする。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌は、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対して、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコ−ドする遺伝子配列の変性に帰結する変異原処理や、該酵素をコ−ドする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み、該酵素をコ−ドする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチセンス遺伝子阻害、さらにまたは選択的遺伝子破壊によって取得し得るものである。
突然変異を起こすのに有用な化学変異原は、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホネート(EMS)及びジエチルスルフェイト(DES)のようなアルキル化剤である。ヒドロキシルアミン、及び亜硝酸のようなDNA塩基を脱アミノ化する化学薬品もまた有用である。電離放射線(γ一及びX−線)並びに紫外線照射 (UV)は、突然変異誘発で有用な物理的誘発原である。
ランダム変異導入法により変異導入した菌株の中からポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された株を取得するには、例えば、変異導入した菌株をPHAの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、細胞内にPHAを合成できる菌を、ナイルレッド染色等により細胞内PHAを蛍光染色することによって、1次スクリーニングし、その後、貧栄養状態で細胞内PHAを分解・再利用できない菌を、ナイルレッドによる細胞内PHAの蛍光染色性の残存によって2次スクリーニングすればよい。
選択的遺伝子破壊によってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得するには、直鎖DNAを用いる相同組換えによる方法を用いることもできるが、特に本出願に係る発明の一つで開示されるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いると、菌に対するダメージを軽減し、より効率的に該遺伝子の破壊されているポリヒドロキシアルカノエート生産菌を取得することが出来る。
一般に、遺伝子の機能解明や実用菌株の育種で望ましくない性質に関わる遺伝子を選択的に破壊するために、染色体上の標的部位への相同組み換えによる選択的遺伝子破壊法が利用されており、選択的遺伝子破壊の方法としては遺伝子挿入破壊法と遺伝子置換破壊法の二つが用いられている(図4)。これらの方法はいずれも、生物の生体において自然に起こり得る遺伝子相同組換えを、該生物の染色体上に存在する内在性ゲノムDNAと外来性ターゲティングDNA(ターゲティングベクター)との間で人為的に起こさせることにより、該内在性ゲノムDNA中の標的DNA配列中に該外来性ターゲティングDNA中に含まれる所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理とするものである。本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌を製造するには、前記遺伝子挿入破壊法と前記遺伝子置換破壊法のいずれの方法も用いることができる。
本発明における遺伝子ターゲティングベクターとは、相同組換えにより、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムDNA中の標的DNA(ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素)をコードする遺伝子を破壊するために用いられるDNA構造体を意味する。ここで当該「破壊」(gene disruption)とはターゲティングDNAと内在性ゲノムDNAとの相同組換えにより、該内在性ゲノムの一部に導入される下記のようなDNA配列の改変を意味する。
(1)該標的DNAの一部DNA配列の欠失
(2)該標的DNAの一部DNA配列の外来性DNAとの置換
(3)該標的DNAのDNA配列中への外来性DNAの挿入
遺伝子挿入破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記(3)による改変であり、遺伝子置換破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記(1)、(2)または(3)による改変である。これらの改変によりポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムDNA中のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子は実質機能を失い、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が転写・翻訳・あるいは活性を保持したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素タンパク質が生合成されることを無くすることができる。
(2)該標的DNAの一部DNA配列の外来性DNAとの置換
(3)該標的DNAのDNA配列中への外来性DNAの挿入
遺伝子挿入破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記(3)による改変であり、遺伝子置換破壊法で達成されるDNA配列の改変は前記(1)、(2)または(3)による改変である。これらの改変によりポリヒドロキシアルカノエート生産菌の内在性ゲノムDNA中のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子は実質機能を失い、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が転写・翻訳・あるいは活性を保持したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素タンパク質が生合成されることを無くすることができる。
本発明に係るポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターの基本構造は、どのような手法で遺伝子破壊を行うかによって異なり、次の3つの基本構造をとり得る。
(I)基本的に、相同組換えのための下記(a)または(b)に示すDNAと、所望の遺伝子破壊のための領域と、がベクターに連結してなる構成を有するもの。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部。
(II)遺伝子挿入破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)として、下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有するという基本構造からなるもの。
(III)遺伝子置換破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)として、下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
を含有し、かつ該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)中に該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAが挿入された基本構造からなるもの。
(I)基本的に、相同組換えのための下記(a)または(b)に示すDNAと、所望の遺伝子破壊のための領域と、がベクターに連結してなる構成を有するもの。
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部。
(II)遺伝子挿入破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)として、下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
を含有し、さらに該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAを有するという基本構造からなるもの。
(III)遺伝子置換破壊法にて標的遺伝子を破壊する場合には、本発明の遺伝子ターゲティングベクターは、該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)として、下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
を含有し、かつ該標的DNA配列に相同なDNA配列(相同領域)中に該内在性ゲノムDNAにとって外来である所望の外来性DNAが挿入された基本構造からなるもの。
ここで、基本構造(I)、(II)、(III)における「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するDNAとは、以下に示すDNAをいう。すなわち、(1)高イオン濃度下[例えば、6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号1で示される塩基配列を含むDNAとDNA−DNAハイブリッドを形成し、(2)低イオン濃度下[例えば、0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)等が挙げられる。] に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持されるDNAをいう。具体的には、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、その一部が、所望の遺伝子破壊機能を損なわない範囲内で、欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるDNAなどが挙げられる。かかるDNAは自然界からクローニングされたDNAであってもよいし、自然界からクローニングされたDNAに塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されたDNAであってもよく、また、人為的に合成されたDNAであってもよい。また基本構造(I)、(II)、(III)における「(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部」はポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性を有するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性が挙げられる。またポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊株の作製に用いるDNAは、染色体上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊できる程度の大きさであれば、前記(a)または(b)に示すDNAの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは50塩基以上、より好ましくは100塩基以上の長さを有するもので、所望の遺伝子破壊機能を有する部分が挙げられる。
遺伝子ターゲティングベクターに設ける(a)または(b)に示すDNAの「一部」について具体的な配列を例示するならば、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15である。
基本構造(I)におけるベクターは特に限定されないが、一般的な広域宿主ベクターが使用可能であり、例えばpJRD215(Davidson et al.,Gene, 51,275-280(1987))及びpBBR1MCSシリーズ(Kovach et al., Gene, 166,175-176(1995))等を例示することができる。
基本構造(II)、(III)における「外来性DNA」としては、例えばマーカー遺伝子、レポーター遺伝子、遺伝子増幅遺伝子、内在性ゲノムDNA中の標的DNA配列に対する欠失・置換または挿入により、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の実質的な機能停止に至る様な性質を付加し得る遺伝子発現制御DNA配列、あるいはそれらの1つ以上を含むDNA配列を挙げることができる。ここで「マーカー遺伝子」としては、遺伝子組換え技術分野において通常使用されるいかなるマーカー遺伝子も用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。また「レポーター遺伝子」としては、ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク質(GFP)、βラクタマーゼなどの遺伝子が例示される。さらにまた「遺伝子増幅遺伝子」としては、染色体DNAを鋳型としたPCR法による破壊株の特異的遺伝子増幅産物が得られるような所望のプライマー結合配列を有するDNA配列が例示される。
基本構造(II)、(III)の遺伝子ターゲティングベクターには、接合起点遺伝子(OriT)を含有するMobサイトを含有させることにより、大腸菌運動性株(mobilizer strain, 例えばS17−1株(ATCC 47055))に形質転換しプラスミド供与菌体として用いた場合、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌への効率的な導入が可能になり、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に与えるダメージを軽減し、より簡便にまた効率的にポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された菌株を取得することができるのでより好ましい。これは大腸菌運動性株がtra遺伝子を有しているために、接合伝達における、mob+, tra- の遺伝子ターゲティングベクターをヘルパープラスミドの助けなしに接合伝達することができる(R.Simon et al.(1983) Bio-Technology 1: 784)からである。
基本構造(III)の遺伝子ターゲティングベクターには、プラスミド受容菌をある条件下に致死に導く遺伝子(感受性遺伝子)を含有させることが望ましい。
感受性遺伝子としては、例えばバチルス サブチルス (Buccilus subtilis)由来のレヴァンスクラーゼ(Levansucrase, sacB)が、多くのグラム陰性菌にとって、ショ糖が5重量%を超えて含有する培地において、致死にいたることが見出されており(Gay et al. J. Bacteriol.164, 918)、またシュードモナス スピーシーズ YN21株においても機能することが、発明者らによって確認されたので、本発明においても好適に用いることができる。
基本構造(III)の遺伝子ターゲティングベクターでは、前記(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部への選択マーカーの挿入位置は、該ベクターに組込まれた該(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部の長さを10としたとき、1から9の間、好ましくは2から8の間、より好ましくは4から6の間である。選択マーカーの挿入位置が前記(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部の一端に偏ると、感受性遺伝子の作用を利用した二重相同組換え体の取得効率が下がるので好ましくない。
基本構造(I)、(II)、または(III)の遺伝子ターゲティングベクターを構築するには、上記基本構造の構成要件である各DNAを通常の分子生物学的手法を用いてベクターに組込んでいけばよいが、予めポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、接合起点遺伝子および感受性遺伝子を備えた可動性ベクターを利用すると、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターをより短い工程で作製することができるので有用である。このような可動性ベクターとして、たとえばpEX100T(ATCC 87436)、pJQ200(ATCC 77482)、pDMS197(ATCC 87694)、pRE107(ATCC 87691)などを挙げることができ、本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築する際に好適に用いることができる。
例えば基本構造(III)の遺伝子ターゲティングベクターを構築するためには、上記可動性ベクターに、前記(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部、及び選択マーカーを組込めばよい。これらを組込む順番について制限はないが、その手順の一例を示すならばまず、上記可動性ベクターに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターDNA断片と、前記(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部とを混合し、これにDNAリガーゼを作用させる。次に前記制限酵素とは別の認識部位を切断する制限酵素を作用させ、上記ベクターの一部、または上記ベクターに組込まれた前記(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部で切断する。得られたベクターDNA断片を、前記選択マーカーを含むDNA断片と混合し、これにDNAリガーゼを作用させることによって選択マーカーを挿入する。なお以上の工程中、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。
基本構造(I)の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊するには、該遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌に導入する。遺伝子ターゲティングベクターを導入する方法としてはコンピテント細胞に接触せしめる方法や、エレクトロポレーション法など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
続いて例えば、PHAの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、細胞内にPHAを合成できる菌を、ナイルレッド染色等により細胞内PHAを蛍光染色することによって、1次スクリーニングし、その後、貧栄養状態で細胞内PHAを分解・再利用できない菌を、ナイルレッドによる細胞内PHAの蛍光染色性の残存によって2次スクリーニングする。
続いて例えば、PHAの構成単位として利用し得るアルカン酸を含む寒天プレート上で培養し、細胞内にPHAを合成できる菌を、ナイルレッド染色等により細胞内PHAを蛍光染色することによって、1次スクリーニングし、その後、貧栄養状態で細胞内PHAを分解・再利用できない菌を、ナイルレッドによる細胞内PHAの蛍光染色性の残存によって2次スクリーニングする。
基本構造(II)または(III)の遺伝子ターゲティングベクターを用いてポリヒドロキシアルカノエート生産菌のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子を破壊するには、基本構造(I)の遺伝子ターゲティングベクターを用いる場合と同様に行うこともできるが、まず該遺伝子ターゲティングベクターを前記大腸菌運動性株に形質転換する。次に形質転換された大腸菌運動性株とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合転移を利用して、遺伝子ターゲティングベクターをポリヒドロキシアルカノエート生産菌体内に転移させる。 前記選択マーカーで選択することによって遺伝子ターゲティングベクターと染色体DNAとの相同組換えの結果、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊された株を取得することができる。なお、宿主であるポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体と遺伝子ターゲティングベクターには前記選択マーカーの前後に2箇所の相同部位が存在するので、この段階で得られる相同組換え体の大部分は、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が相異なる位置で挿入された染色体構造を有する相異なる2種類の組換え体であって、選択マーカー前後の2箇所の相同部位で同時に交叉の生じた相同組換え体の割合は非常に少ないと考えられる。ただし、遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列が挿入されることにより、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子は破壊される。
基本構造(III)の遺伝子ターゲティングベクターを用いた場合には、続いて感受性遺伝子の機能に基づいた選択を行う。この選択により、プラスミド受容菌から、前記選択マーカーで選択された組換え体の、染色体へ挿入された遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列の内、可動性ベクター部分が欠失除去された変異株を取得することができる。これは前段階の相同組換えの際に、利用されなかった他方の相同部位での相同組換えが起こることにより成される。従ってこの段階で、前段階の相異なる染色体構造を有する2種類の組換え体は、同じ染色体構造の(ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が選択マーカーで分断された)組換え体になる。
基本構造(III)の遺伝子ターゲティングベクターを用いた場合には、続いて感受性遺伝子の機能に基づいた選択を行う。この選択により、プラスミド受容菌から、前記選択マーカーで選択された組換え体の、染色体へ挿入された遺伝子ターゲティングベクターに由来する配列の内、可動性ベクター部分が欠失除去された変異株を取得することができる。これは前段階の相同組換えの際に、利用されなかった他方の相同部位での相同組換えが起こることにより成される。従ってこの段階で、前段階の相異なる染色体構造を有する2種類の組換え体は、同じ染色体構造の(ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が選択マーカーで分断された)組換え体になる。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを用いて取得される組換え体の、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されていることの確認は、前述の方法にて組換え体のポリヒドロキシアルカノエート分解活性の消失を確認するか、組換え体の染色体DNAを制限酵素で切断した後、サザンハイブリダイゼーション法を用いるか、適当なプライマーを用いて染色体DNAに対してPCR法を用いるなどして行うことができる。
本発明のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターは、適当な宿主細胞内で、自律的に複製、増幅するので、このベクターを宿主細胞中へ導入して形質転換を行って得られた形質転換体を培養することで、このベクターのコピーを製造することができる。このような宿主細胞としては、上記で得られたポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターで形質転換でき、かつこのベクターの安定維持、複製が可能であるようなものであれば、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。宿主細胞にポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを導入するためには、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレーションなど当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
本発明にかかるPHAの製造方法に用いるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、PHAの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる破壊株の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、破壊株の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
培養は液体培養、固体培養等該破壊株が増殖し、PHAを生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株を用いて生産できるPHAの組成や構造、特に側鎖に置換基を有するunusual PHAの種類は、この同質遺伝子系統であるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子非破壊株の性質により規定されるが、シュードモナス スピーシーズ YN21株の同質遺伝子系統でありポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズPZ1株を用いると、例えば下記化学式[1]から[16]に示すポリマーユニットからなる群から選ばれた少なくとも1種類のポリマーユニットをポリマー分子中に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートを製造することができる。
(ただし式中R1およびaの組合せが下記のいずれかであるポリマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
(1)R1が水素原子(H)でありaが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
(2)R1がハロゲン元素であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
(3)R1が、
(1)R1が水素原子(H)でありaが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
(2)R1がハロゲン元素であり、aが1から10の整数のいずれかであるポリマーユニット、
(3)R1が、
であり、aが1から8の整数のいずれかであるポリマーユニット)
(式中R2は芳香環への置換基を示し、R2は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'(R' : H、Na、およびKのいずれかを表す)基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH=CH2基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中bは0から7の整数のいずれかを表す。)
(式中R3は芳香環への置換基を示し、R3は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、SCH3基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中cは0から7の整数のいずれかを表す。)
(式中R4は芳香環への置換基を示し、R4は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中dは0から7の整数のいずれかを表す。)
(式中R5は芳香環への置換基を示し、R5は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'(R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す)基、SO2R"(R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す)基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中eは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中R6は芳香環への置換基を示し、R6は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、COOR'(R' : H、Na、K、CH3、及びC2H5のいずれかを表す)基、SO2R"(R" : OH、ONa、OK、ハロゲン原子、OCH3、及びOC2H5のいずれかを表す)基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CH(CH3)2基、及びC(CH3)3基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中fは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中gは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中hは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中iは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中jは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中R7はシクロヘキシル基への置換基を示し、R7は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中kは0から8の整数のいずれかを表す。)
(式中R8はシクロヘキシルオキシ基への置換基を示し、R8は水素原子(H)、ハロゲン原子、CN基、NO2基、CH3基、C2H5基、C3H7基、CF3基、C2F5基、及びC3F7基からなる群から選ばれたいずれか1つを表し、式中mは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中nは1から8の整数のいずれかを表す。)
(式中pは3または5のいずれかの整数を表す。)
(式中q1は1から8の整数のいずれかを表し、q2は0から8の整数のいずれかを表す。)
(式中R9は水素原子(H)、Na原子またはK原子であり、式中rは1から8の整数のいずれかを表す。)
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株を用いて、3-ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むPHAを製造する場合は、PHA生産用の原料としてそれぞれ対応するアルカン酸またはアルカンと、破壊株の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株を用いて、3-ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むPHAを製造する場合は、PHA生産用の原料としてそれぞれ対応するアルカン酸またはアルカンと、破壊株の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培地などを用いることができる。
増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸などの天然物由来の培地成分を用いることが可能であり、更に、糖類、TCAサイクルに関与する有機酸(TCA回路中の中間体として生じる有機酸及びTCA回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸)或いはその塩等、β酸化サイクルを経ずにアセチルCoAを生じる化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができ、用いる菌株に対する基質としての有用性で適宜選択することができる。
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる1つ以上の化合物が好適に利用できる。
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などがその例であり、或いはその塩から選ばれる1つ以上の化合物が好適に利用できる。
これらの中でも、特に糖類を用いるのが好ましく、中でもグルコース、フルクトース、マンノースからなる群から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株にPHAを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、D-グルコースを 0.05重量%から 5.0重量%程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量%から 1.0重量%程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量%から 1.0重量%程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株にPHAを生産・蓄積させる方法としては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例えば、D-グルコースを 0.05重量%から 5.0重量%程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量%から 1.0重量%程度含んだ無機培地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量%から 1.0重量%程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは実質的に存在しない無機培地でさらに培養する方法がある。
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等)等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、MSB培地、E培地(J.Biol.Chem.,218,97-106(1956))、M9培地等を挙げることができる。
なお、本発明における実施例で用いるM9培地の組成は以下の通りである。
なお、本発明における実施例で用いるM9培地の組成は以下の通りである。
Na2HPO4: 6.2g
KH2PO4 : 3.0g
NaCl : 0.5g
NH4Cl : 1.0g
(培地1リットル中、pH 7.0)
更に、良好な増殖及びPHAの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3%(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸: 1.5g
MgSO4 : 3.0g
MnSO4 : 0.5g
NaCl : 1.0g
FeSO4 : 0.1g
CaCl2 : 0.1g
CoCl2 : 0.1g
ZnSO4 : 0.1g
CuSO4 : 0.1g
AlK(SO4)2 : 0.1g
H3BO3 : 0.1g
Na2MoO4 : 0.1g
NiCl2 : 0.1g
(1リットル中)
培養温度としてはポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
KH2PO4 : 3.0g
NaCl : 0.5g
NH4Cl : 1.0g
(培地1リットル中、pH 7.0)
更に、良好な増殖及びPHAの生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を 0.3%(v/v)程度添加するのが好ましい。
微量成分溶液
ニトリロ三酢酸: 1.5g
MgSO4 : 3.0g
MnSO4 : 0.5g
NaCl : 1.0g
FeSO4 : 0.1g
CaCl2 : 0.1g
CoCl2 : 0.1g
ZnSO4 : 0.1g
CuSO4 : 0.1g
AlK(SO4)2 : 0.1g
H3BO3 : 0.1g
Na2MoO4 : 0.1g
NiCl2 : 0.1g
(1リットル中)
培養温度としてはポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましくは 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適当である。
具体的な例としては、D-グルコースを 0.05重量%から 5.0重量%程度、および、アルカン酸またはアルカンを 0.01重量%から 1.0重量%程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収して目的外のモノマーユニットの混在が少ない、あるいは全くない所望のPHAを抽出することができる。このようなPHAは、一般にR-体のみから構成され、アイソタクチックなポリマーである。D-グルコースの代わりに同量のTCAサイクルに関与する有機酸や、酵母エキス、ポリペプトンを与えても良い。また、それらの組み合わせを用いてもよい。
本発明にかかる培養液からのPHAの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。PHAが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのPHAの回収には、通常行なわれているクロロホルムなどの有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、SDS等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、EDTA等の薬剤による処理によってPHA以外の菌体成分を除去して、PHAを回収する方法を用いることもできる。
なお、本発明の微生物の培養、本発明の微生物によるPHAの生産と菌体への蓄積、並びに、本発明における菌体からのPHAの回収は、上記の方法に限定されるものではない。
ポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21、FERM BP−08569)の薬剤耐性に関する予備検討の結果、アンピシリンとクロラムフェニコールに対しては耐性で、ゲンタマイシンに対しては感受性であることがわかったので、ゲンタマイシンに対する薬剤耐性遺伝子をマーカーにしてポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターを構築した。構築した遺伝子破壊ベクターは配列番号1に示す塩基配列の塩基番号36から塩基番号708の部分配列(途中、配列番号1の塩基番号345の位置で制限酵素XbaIにより切断されるように塩基配列が置換されている)を含む環状プラスミドDNA(pPZ1(配列番号10))である。以下その手順について説明する。図1はその手順の概略について図示したものである。
1)ゲノムDNAの調製
シュードモナス スピーシーズ YN21株を0.5%(w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、30℃、24時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN21株のゲノムDNAを調製した。
2)インサートDNA断片の調整
YN21株のゲノムDNAをテンプレートとして、phaZ-f1(配列番号2)およびphaZ-r1(配列番号3)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR(ポリメラーゼチェーン反応)を行った。以下の反応混合液を調製した。
シュードモナス スピーシーズ YN21株を0.5%(w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、30℃、24時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、YN21株のゲノムDNAを調製した。
2)インサートDNA断片の調整
YN21株のゲノムDNAをテンプレートとして、phaZ-f1(配列番号2)およびphaZ-r1(配列番号3)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いて、PCR(ポリメラーゼチェーン反応)を行った。以下の反応混合液を調製した。
PCRは、変性[98℃で20秒間]、アニーリング[65℃で20秒間]、伸長反応[72℃で1分間]からなる一連の処理を30サイクル繰り返して行った。PCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1重量%)により行った。その結果、約330塩基対の断片が増幅された。約330塩基対のPCR増幅産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてDNA断片を回収した。回収した約330塩基対のDNA断片およびphaZ-r2(配列番号4)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、YN21株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
PCRは、変性[98℃で20秒間]、アニーリング[68℃で20秒間]、伸長反応[72℃で1分間]からなる一連の処理を30サイクル繰り返して行った。PCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1重量%)により行った。その結果、約690塩基対の断片が増幅された。約690塩基対のPCR増幅産物をアガロースゲルから切出し、MinElute Gel Extraction Kit [(株)キアゲン製]を用いてDNA断片を回収した。約690塩基対のPCR増幅産物の塩基配列を、phaZ-f1(配列番号2)、phaZ-r1(配列番号3)、に示す塩基配列のDNA、配列番号3に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA、およびphaZ-r2(配列番号4)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用い、ジェネティックアナライザーCEQ8000(ベックマン コールター製)で解析した。増幅産物は配列番号1のDNAの塩基番号36から塩基番号708までの673塩基分の部分配列(途中、配列番号1の塩基番号345の位置で制限酵素XbaIにより切断されるように塩基配列が置換されている)に相当することが確認できた。上記PCRに用いたプライマー;phaZ-f1(配列番号2)中には制限酵素SacIの認識部位、phaZ-r1(配列番号3)中には制限酵素XbaIの認識部位、phaZ-r2(配列番号4)中には制限酵素BamHIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約690塩基対のPCR増幅産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した。
また、上記約690塩基対は、(1)高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム) に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号1で示される塩基配列を含むDNAとDNA−DNAハイブリッドを形成し、(2)低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)] に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするDNAであることが確認された。DNA−DNAハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System(アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて行った。
また、上記約690塩基対は、(1)高イオン濃度下[6xSSC(900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム) に、65℃の温度条件でハイブリダイズさせることにより配列番号1で示される塩基配列を含むDNAとDNA−DNAハイブリッドを形成し、(2)低イオン濃度下[0.1xSSC(15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム)] に、65℃の温度条件で30分間洗浄したあとでも該ハイブリッドが維持され、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするDNAであることが確認された。DNA−DNAハイブリッドの検出はAlkPhos Direct Labelling and Detection System(アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて行った。
3)ベクターDNA断片の調製
pEX100T(ATCCナンバー87436)をテンプレートに、pEX-f1(配列番号5)およびpEX-r1(配列番号6)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
pEX100T(ATCCナンバー87436)をテンプレートに、pEX-f1(配列番号5)およびpEX-r1(配列番号6)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
PCRは、変性[98℃で20秒間]、アニーリング[65℃で20秒間]、伸長反応[72℃で6分間]からなる一連の処理を30サイクル繰り返して行った。PCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1重量%)により行った。その結果、約5.6kbの断片が増幅された。用いたプライマーpEX-f1(配列番号5)中には制限酵素BamHIの認識部位、pEX-r1(配列番号6)中には制限酵素SacIの認識部位がそれぞれ予め含まれている。約5.6kbのPCR産物を制限酵素BamHIとSacIで消化した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(宝酒造(株)製)を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。
4)ライゲーション
前記2)で調製した約690塩基対のBamHI・SacI消化産物(インサート)と、前記3)で調整した約5.6kbのBamHI・SacI消化産物(ベクター)とを、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造(株)製)を用いてライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
前記2)で調製した約690塩基対のBamHI・SacI消化産物(インサート)と、前記3)で調整した約5.6kbのBamHI・SacI消化産物(ベクター)とを、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造(株)製)を用いてライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
ライゲーション反応液を16℃の恒温槽で1時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpEX-phaZ(配列番号7)を得た。プラスミドpEX-phaZの制限酵素切断地図を図2に示す。
5)ゲンタマイシンカセットの挿入
前記4)で調整したプラスミドpEX-phaZを制限酵素XbaIで消化したした後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(宝酒造(株)製)を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。pDONR207(インビトロジェン(株)製)をテンプレートに、gen-f1(配列番号8)およびgen-r1(配列番号9)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
前記4)で調整したプラスミドpEX-phaZを制限酵素XbaIで消化したした後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(宝酒造(株)製)を用いて5'末端を脱リン酸化処理した。pDONR207(インビトロジェン(株)製)をテンプレートに、gen-f1(配列番号8)およびgen-r1(配列番号9)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いてPCRを行った。
以下の反応混合液を調製した。
PCRは、変性[98℃で20秒間]、アニーリング[65℃で20秒間]、伸長反応[72℃で1分間]からなる一連の処理を30サイクル繰り返して行った。PCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1重量%)により行った。その結果、約850塩基対の断片が増幅された。用いたプライマーgen-f1(配列番号8)およびgen-r1(配列番号9)中には制限酵素XbaIの認識部位が予め含まれており、制限酵素XbaIを用いて、約850塩基のPCR産物を消化した。前記約850塩基対のXbaI消化産物(インサート)と、pEX-phaZのXbaI消化産物(ベクター)とをライゲーションした。以下にライゲーション反応液の組成を示す。
ライゲーション反応液を16℃の恒温槽で1時間保持した後、Escherichia coli JM109コンピテントセルに形質転換した。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーを選択した。その結果、プラスミドpPZ1(配列番号10)を得た。プラスミドpPZ1(ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター)の制限酵素切断地図を図3に示す。
(実施例2)
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株(Pseudomonas sp. PZ1、FERM BP−08571)の取得]
実施例1で構築したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター(プラスミドpPZ1、配列番号10)で大腸菌mobilizing strain Escherichia coli S17-1(ATCCナンバー47055)をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、2.5kV、25μF、200Ωで、0.2cmギャップのセル(ジーンパルサーキュベット0.2cm、バイオラッド社製)で市販のエレクトロポーレーション装置(Gene Pulser,バイオラッド社製)を用いて行った。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーとして取得したS17-1株のpPZ1形質転換体を、アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地5mlで、30℃、12時間振とう培養した。また、シュードモナス スピーシーズ YN21株をアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地5mlで、30℃、12時間振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液150μlをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度(対照として滅菌したLB液体培地を用いた)を随時モニターしながら30℃で振とう培養した。同様にYN21株の培養液150μlをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度(対照として滅菌したLB液体培地を用いた)を随時モニターしながら30℃で振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液(600nmでの吸光度は0.35であった)の4.5mlと、YN21株の培養液(600nmでの吸光度は0.39であった)の0.5mlとを、混合し、ニトロセルロース製フィルター(ポアサイズ0.45μm、直径25mm、ミリポア製white surfactant free HATF)を用いて、ろ過して集菌した。
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株(Pseudomonas sp. PZ1、FERM BP−08571)の取得]
実施例1で構築したポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター(プラスミドpPZ1、配列番号10)で大腸菌mobilizing strain Escherichia coli S17-1(ATCCナンバー47055)をエレクトロポーレーション法により形質転換した。エレクトロポーレーションの条件は、2.5kV、25μF、200Ωで、0.2cmギャップのセル(ジーンパルサーキュベット0.2cm、バイオラッド社製)で市販のエレクトロポーレーション装置(Gene Pulser,バイオラッド社製)を用いて行った。ゲンタマイシン15μg/mlを含むLB寒天プレート上で増殖可能なコロニーとして取得したS17-1株のpPZ1形質転換体を、アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地5mlで、30℃、12時間振とう培養した。また、シュードモナス スピーシーズ YN21株をアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地5mlで、30℃、12時間振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液150μlをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度(対照として滅菌したLB液体培地を用いた)を随時モニターしながら30℃で振とう培養した。同様にYN21株の培養液150μlをアンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地150mlに接種し、600nmでの吸光度(対照として滅菌したLB液体培地を用いた)を随時モニターしながら30℃で振とう培養した。E. coli S17-1株のpPZ1形質転換体の培養液(600nmでの吸光度は0.35であった)の4.5mlと、YN21株の培養液(600nmでの吸光度は0.39であった)の0.5mlとを、混合し、ニトロセルロース製フィルター(ポアサイズ0.45μm、直径25mm、ミリポア製white surfactant free HATF)を用いて、ろ過して集菌した。
ニトロセルロース製フィルターの集菌した面を上に向け、LB寒天プレート上に乗せて、乾燥しないように蓋をかぶせ、30℃で90分間恒温保持した。アンピシリン100μg/mlを含むLB液体培地の1mlで、フィルター上の菌体をピペッティングにより懸濁し、懸濁液の適量をゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに蒔種した。30℃で2日間培養後出現したコロニーを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/ml、およびシュークロース%(w/v)を含むLB寒天プレートに画線して、30℃で2日間培養した。ゲンタマイシン15μg/ml、およびクロラムフェニコール10μg/ml、シュークロース%(w/v)を含むLB寒天プレート上に生育したコロニーの幾つかを、ゲンタマイシン15μg/ml、クロラムフェニコール10μg/mlおよび0.5%(w/v)ポリペプトンを含むM9培地で、30℃、24時間培養した。培養液から菌体を集菌した後、Wizard Genomic DNA Purification System(プロメガ(株)製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNA、および対照としてYN21株のゲノムDNA(前記1)で調製したもの)をテンプレートとして、phaZ-f1(配列番号2)と phaZ-r2(配列番号4)に示す塩基配列のDNAをプライマーとして用いPCRを行った。以下の反応混合液を調製した。
PCRは、変性[98℃で20秒間]、アニーリング[64℃で20秒間]、伸長反応[72℃で2分間]からなる一連の処理を30サイクル繰り返して行った。PCR産物の確認はアガロースゲル電気泳動(ゲル濃度1%)により行った。その結果、新たに取得したコロニーから調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いた場合には約1.5 kbのDNA断片が、また対照のYN21株から調製したゲノムDNAをテンプレートとして用いた場合には約690塩基対のDNA断片がそれぞれ増幅された。これは、新たに取得されたコロニーではポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の中程に、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むDNAが挿入され、この分だけPCRによって増幅されるDNA断片の長さが長くなったことを表しており、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されていることを意味する。
(実施例3)
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 200mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。138時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC-8020、カラム:ポリマーラボラトリー PLgel MIXED-C(5μm)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表8に示す。
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 200mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。138時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC-8020、カラム:ポリマーラボラトリー PLgel MIXED-C(5μm)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表8に示す。
表8の結果から明らかなように、PZ1株の方がポリヒドロキシアルカノエートの生産性が高く、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌がunusualなPHAの生産に有用であることがわかった。
(実施例4)
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.2%(w/v)ポリペプトン、0.2%(w/v)グルコース、0.1%(v/v)ノナン酸を含むM9培地 200mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC-8020、カラム:ポリマーラボラトリー PLgel MIXED-C(5μm)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表9に示す。
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.2%(w/v)ポリペプトン、0.2%(w/v)グルコース、0.1%(v/v)ノナン酸を含むM9培地 200mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。90時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。得られたPHAの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC-8020、カラム:ポリマーラボラトリー PLgel MIXED-C(5μm)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。それらの結果を表9に示す。
表9の結果から明らかなように、PZ1株の方がポリヒドロキシアルカノエートの生産性が高く、本発明のポリヒドロキシアルカノエート生産菌がusualなPHAの生産にも有用であることがわかった。
(実施例5)
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 50mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、24時間、48時間、96時間、または195時間振盪培養した。
また、0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 50mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で48時間振盪培養後、菌体を遠心分離によって回収し、炭素源を含まないM9培地200mLに再懸濁し、更に30℃、125ストローク/分で147時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 50mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、24時間、48時間、96時間、または195時間振盪培養した。
また、0.5%(w/v)ポリペプトン、0.5%(w/v)グルコース、12mM 5-フェニル吉草酸(PVA)を含むM9培地 50mLに、PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で48時間振盪培養後、菌体を遠心分離によって回収し、炭素源を含まないM9培地200mLに再懸濁し、更に30℃、125ストローク/分で147時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。
得られたPHAの分子量を、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC;東ソーHLC-8020、カラム:ポリマーラボラトリー PLgel MIXED-C(5μm)、溶媒:クロロホルム、ポリスチレン換算)により測定した。これらの結果を表10および表11に示す。
得られたPHAは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(GC-MS,島津QP-5050、EI法)で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。結果、製造されたPHAは3-ヒドロキシ-5-フェニル吉草酸のホモポリマーであった。
以上の結果から明らかなように、PZ1株はポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子が破壊されているため、従来のポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるYN21株よりも生産性が向上しており、PHAの生産に有用であることがわかった。
(実施例6)
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、および0.5%(w/v)グルコースを含むM9培地 50mLに、次の表に示すアルカン酸を個別に加えた培地をそれぞれ調製した。
[ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子の破壊されたシュードモナス スピーシーズ PZ1株を用いたPHA生産]
0.5%(w/v)ポリペプトン、および0.5%(w/v)グルコースを含むM9培地 50mLに、次の表に示すアルカン酸を個別に加えた培地をそれぞれ調製した。
PZ1株または対照としてYN21株を植菌し、30℃、125ストローク/分で、96時間振盪培養した。それぞれの菌体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。この凍結乾燥ペレットを 100mLのクロロホルムに懸濁し、60℃で 20時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径 0.45μmのメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してPHAを得た。
得られたPHAのモノマーユニット比を、1H−NMR(FT−NMR:BrukerDPX400;共鳴周波数:400MHz;測定核種:1H;使用溶媒:CDCl3;reference:キャピラリ封入TMS/CDCl3;測定温度:室温)によってもとめた。ポリマー乾燥重量(PDW)およびモノマーユニット比の結果を表13(1)及び(2)に示す。
以上の結果から明らかなように、PZ1株は従来のポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるYN21株よりも生産性が向上しており、PHAの生産に有用であることがわかった。
(実施例7)
[YN21株の取得]
ポリペプトン0.5%、フェニル吉草酸0.1%、ミネラル溶液0.3%、粉末寒天1.2%を含むM9培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0.1%添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
[YN21株の取得]
ポリペプトン0.5%、フェニル吉草酸0.1%、ミネラル溶液0.3%、粉末寒天1.2%を含むM9培地をオートクレーブ滅菌し、50℃に冷却後、ナイルレッドを0.05%含有するDMSO溶液を0.1%添加し、滅菌シャーレに15mlずつ分注し、寒天を固化させて寒天培地を作製した。
なお、M9培地及びミネラル溶液の組成は以下に示す。
[M9培地]
Na2HPO4:6.2g、KH2PO4:3.0g、NaCl:0.5g、NH4Cl:1.0g(培地1リットル中、pH7.0)
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5 g、MgSO4:3.0 g、MnSO4:0.5 g、NaCl:1.0 g、FeSO4:0.1 g、CaCl2:0.1 g、CoCl2:0.1 g、ZnSO4:0.1 g、CuSO4:0.1 g、AlK(SO4)2:0.1 g、H3BO3:0.1 g、Na2MoO4:0.1 g、NiCl2:0.1 g(1リットル中、pH7.0)
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0.5mlを4.5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0.1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次に、ポリペプトン0.5%、グルコース0.5%、フェニル吉草酸0.1%、ミネラル溶液0.3%を含むM9培地(pH7.0)50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク/分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル10mlに懸濁し、35℃で15時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたPHAを秤量してポリマー乾燥重量(PDW)を求めた。得られたPHAのモノマーユニット比を、1H−NMR(FT−NMR:BrukerDPX400;共鳴周波数:400MHz;測定核種:1H;使用溶媒:CDCl3;reference:キャピラリ封入TMS/CDCl3;測定温度:室温)によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量(PDW)及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
[M9培地]
Na2HPO4:6.2g、KH2PO4:3.0g、NaCl:0.5g、NH4Cl:1.0g(培地1リットル中、pH7.0)
[ミネラル溶液]
ニトリロ三酢酸:1.5 g、MgSO4:3.0 g、MnSO4:0.5 g、NaCl:1.0 g、FeSO4:0.1 g、CaCl2:0.1 g、CoCl2:0.1 g、ZnSO4:0.1 g、CuSO4:0.1 g、AlK(SO4)2:0.1 g、H3BO3:0.1 g、Na2MoO4:0.1 g、NiCl2:0.1 g(1リットル中、pH7.0)
次に、野外から採取した土壌試料5gを10mlの滅菌蒸留水に添加し、1分間攪拌した。この土壌懸濁液0.5mlを4.5mlの滅菌水に添加・攪拌し、10倍希釈液を作製した。同様の操作を繰り返し、100倍希釈液、1000倍希釈液、10000倍希釈液を作製した。10倍〜10000倍希釈液を先に作製した寒天培地に各0.1mlずつ分注し、寒天表面に均一になるように広げた。これを培養器に移し、30℃で5日間培養した。培養後、PHAを合成したと思われる赤色のコロニーのうち、形態の異なる株を分離した。こうして野生株を十数株取得した。次に、ポリペプトン0.5%、グルコース0.5%、フェニル吉草酸0.1%、ミネラル溶液0.3%を含むM9培地(pH7.0)50mlに上記野生株を保存寒天培地のコロニーから植菌し、500ml容坂口フラスコにて30℃、125ストローク/分で振盪培養した。また上記培地をpH5.0、pH8.5にそれぞれ調整した培地に関しても同様に培養を行った。72時間後、菌体を遠心分離により回収し、冷メタノールにて洗浄した後、真空乾燥した。この乾燥菌体ペレットを酢酸エチル10mlに懸濁し、35℃で15時間攪拌してPHAを抽出した。抽出液を孔径0.45μmのメンブラン・フィルターで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この濃縮液を冷メタノール中に加えて、PHAを再沈澱させ、沈澱物のみを回収して真空乾燥し、得られたPHAを秤量してポリマー乾燥重量(PDW)を求めた。得られたPHAのモノマーユニット比を、1H−NMR(FT−NMR:BrukerDPX400;共鳴周波数:400MHz;測定核種:1H;使用溶媒:CDCl3;reference:キャピラリ封入TMS/CDCl3;測定温度:室温)によって求めた。以上により得られたポリマー乾燥重量(PDW)及びモノマーユニット比を各野生株及び従来菌株に関して比較することで、PHA生産性を有するYN21株を取得した。
Claims (13)
- ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌。
- ポリヒドロキシアルカノエート生産菌であるシュードモナス スピーシーズ YN21株(Pseudomonas sp. YN21、FERM BP−08569)の同質遺伝子系統であってポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されていることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌シュードモナス スピーシーズ PZ1株(Pseudomonas sp. PZ1、FERM BP−08571)。
- ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌を培養し、培養液からポリヒドロキシアルカノエートを回収することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
- 下記(a)または(b)に示す相同組換えのためのDNAと、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊のための部分と、ベクターと、を有し、これらが機能的に連結してなるポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部。 - ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)接合起点遺伝子、及び
(5)ベクター
とを有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。 - ポリヒドロキシアルカノエート生産菌に対するポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクターであって、
(1)下記(a)または(b)に示すDNA;
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAまたはその一部、
(b)配列番号1に示す塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAまたはその一部、
(2)該(a)または(b)に示すDNA、またはそれらの一部に挿入された外来性DNA、
(3)該ポリヒドロキシアルカノエート生産菌が持つ複製遺伝子と不和合性をもつ複製遺伝子、
(4)感受性遺伝子、
(5)接合起点遺伝子、及び
(6)ベクター
を有し、これらが機能的に連結してなることを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。 - 感受性遺伝子がレヴァンスクラーゼ遺伝子である、請求項6に記載のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
- 外来性DNAがゲンタマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子である請求項5から7のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子ターゲティングベクター。
- 請求項4から8のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 原核性宿主である請求項9記載の宿主細胞。
- 大腸菌である請求項10記載の宿主細胞。
- ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項4に記載の遺伝子ターゲティングベクターDNAとポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体DNA上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えによりポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統の製造方法であって、請求項9から11のいずれかに記載の宿主細胞とポリヒドロキシアルカノエート生産菌との接合により、ポリヒドロキシアルカノエート生産菌の染色体DNA上のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子との相同組換えを惹起しポリヒドロキシアルカノエート分解酵素をコードする遺伝子を破壊することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート生産菌の製造方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005023975A JP2006204256A (ja) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
US11/341,665 US7235396B2 (en) | 2005-01-31 | 2006-01-30 | Bacterium for producing polyhydroxyalkanoate having polyhydroxyalkanoate depolymerase gene disrupted and method for producing polyhydroxyalkanoate using the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005023975A JP2006204256A (ja) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006204256A true JP2006204256A (ja) | 2006-08-10 |
Family
ID=36757072
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005023975A Pending JP2006204256A (ja) | 2005-01-31 | 2005-01-31 | ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7235396B2 (ja) |
JP (1) | JP2006204256A (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4429105B2 (ja) * | 2003-08-19 | 2010-03-10 | キヤノン株式会社 | 有機物固定化構造体及びその製造方法、ペプチド及びdna |
JP2006204258A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | 新規ポリヒドロキシアルカノエート合成微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
JP2006204257A (ja) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
JP2006204255A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
WO2006129843A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Canon Kabushiki Kaisha | Bispecific capturing molecule |
US7875465B2 (en) * | 2005-05-31 | 2011-01-25 | Canon Kabushiki Kaisha | Target substance capturing molecule |
JP2006333825A (ja) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Canon Inc | 標的物質捕捉用タンパク質の製造方法及びその構成材料の選択方法 |
JP2007163185A (ja) * | 2005-12-09 | 2007-06-28 | Canon Inc | 酵素電極 |
JP2007163268A (ja) * | 2005-12-13 | 2007-06-28 | Canon Inc | 酵素電極 |
US20090233280A1 (en) * | 2005-12-28 | 2009-09-17 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of acquiring information regarding base sequence and information reading device for the same |
US8329011B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-12-11 | Canon Kabushiki Kaisha | Polymerase-immobilized electrode |
US8093060B2 (en) * | 2008-02-28 | 2012-01-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Multisite phosphorylated peptide (protein) recognizing compound and detection method, imaging method, alzheimer's disease diagnosing method and reagent kit using the same |
EP2370111B1 (en) | 2008-12-25 | 2014-11-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe for a biological specimen and labelling method and screening method using the probe |
CN111996185B (zh) * | 2020-08-04 | 2023-07-21 | 湖南科技学院 | 一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用 |
CN111982875A (zh) * | 2020-08-20 | 2020-11-24 | 北京大学深圳研究院 | 一种基于三维荧光光谱分析的产聚羟基脂肪酸酯菌的筛选方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006204257A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子の破壊されたポリヒドロキシアルカノエート生産菌の同質遺伝子系統、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
JP2006204258A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | 新規ポリヒドロキシアルカノエート合成微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 |
JP2006204255A (ja) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Canon Inc | アセチル−CoAアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 |
-
2005
- 2005-01-31 JP JP2005023975A patent/JP2006204256A/ja active Pending
-
2006
- 2006-01-30 US US11/341,665 patent/US7235396B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20060172400A1 (en) | 2006-08-03 |
US7235396B2 (en) | 2007-06-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006204256A (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法 | |
US7524659B2 (en) | Isogenic strain line of bacterium for producing polyhydroxyalkanoate in which polyhydroxyalkanoate synthase gene is disrupted and method for producing polyhydroxyalkanoate using the same | |
US7527963B2 (en) | Acetyl-CoA acyltransferase gene disrupted bacterium for producing polyhydroxyalkanoate and method for producing polyhydroxyalkanoate using the same | |
US7267974B2 (en) | Polyhydroxyalkanoate synthesizing microorganism and process of producing polyhydroxyalkanoate using the same | |
KR100498221B1 (ko) | 곁사슬에 (메틸술파닐)페녹시 구조를 가지는 유닛을포함하는 신규한 폴리하이드록시알카노에이트 및 그제조방법 | |
KR20010096546A (ko) | 폴리히드록시 알카노에이트, 폴리히드록시 알카노에이트이제조방법 및 폴리히드록시 알카노이드에 사용되는 미생물 | |
JP2007259708A (ja) | 新規生分解性ポリエステルの製造方法 | |
JP4264819B2 (ja) | 生分解性ポリエステルの製造方法 | |
Steinbüchel et al. | Application of recombinant gene technology for production of polyhydroxyalkanoic acids: biosynthesis of poly (4-hydroxybutyric acid) homopolyester | |
JP3848047B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子 | |
JP4960033B2 (ja) | 酵素活性を低下させた微生物を用いる共重合ポリエステルの製造方法 | |
JP3848045B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子 | |
JP3848048B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子 | |
JP2008086238A (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 | |
JP3848046B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子 | |
JPWO2008090873A1 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 | |
EP2963119A1 (en) | Production method for copolymer polyhydroxyalkanoate using genetically modified strain of fatty acid -oxidation pathway | |
US7101696B2 (en) | Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme | |
US6972192B2 (en) | Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme | |
US6875596B2 (en) | Polyhydroxyalkanoate synthase and gene encoding the same enzyme | |
JP2002253285A (ja) | ポリヒドロキシアルカノエートの生産方法 | |
JP2001316462A (ja) | 3−ヒドロキシチエニルアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカノエート及びその製造方法 | |
JP2009225775A (ja) | ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 | |
JP2001238668A (ja) | ポリ−3−ヒドロキシ−4−フェノキシ−n−酪酸を生産する微生物およびこれを用いたポリ−3−ヒドロキシ−4−フェノキシ−n−酪酸の生産方法 |