JP2005534925A - 特異的配位子結合用混合単層膜を含んでなるナノ粒子 - Google Patents

特異的配位子結合用混合単層膜を含んでなるナノ粒子 Download PDF

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Abstract

遮蔽成分と捕獲成分との比が定義された混合単層膜をコーティングした金属質ナノ粒子を、該当する配位子の特異的捕獲に合わせて単離する。

Description

関連出願の相互参照
本件特許出願は、２００２年８月１日に出願された米国仮特許出願第６０／４００，１４４号の利益を主張するものである。
本発明は、該当する配位子の特異的結合が最大限になるように最適化した混合単層膜をコーティングした金属ナノ粒子の作製に関する。したがって、本発明の方法は、ナノ粒子上の生命体（タンパク質、ＤＮＡ、細胞など）に合わせて数を制御した特異的結合部位を提供するものである。
ナノ材料やこのような材料と生体分子とのハイブリッドを、エレクトロニクス、光学、ゲノミクス、プロテオミクス、生物医学、生体分析の各分野でさまざまに活用できる可能性があることが認められている。こうしたハイブリッド材料の有用性は、無機ナノ材料と生体分子との間の特異的結合を踏まえた上でいかにうまく合理的な設計を行うことができるか否かに大きく左右される。Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｃｕなどの多くのナノ粒子は表面電荷を有することから、静電相互作用による生体分子との非特異的結合が生じるというのが一般的な認識である。アルキルチオール保護ナノ粒子であれば静電相互作用が低減されるが、もうひとつのタイプの非特異的な相互作用である疎水相互作用が生じてしまう。また、アルキルチオール保護ナノ粒子は水に可溶ではないことから、活動に水性環境を必要とする生体分子には適合できないものとなる。プライム（Ｐｒｉｍｅ）ら（非特許文献１）およびラヒリ（Ｌａｈｉｒｉ）ら（非特許文献２）はいずれも、金薄膜上にアルカンチオールの自己組織化単層膜を形成することで、表面にタンパク質を吸着させるためのモデル系を作製するための方法について説明している。また、シング（Ｓｉｎｇｈ）らは、誘導体化したアルカンチオールを使用して、生体分子群を抽出する目的で金のナノロッドを用いる方法について説明（特許文献１）している。
米国特許出願第２００２００３４８２７号明細書 Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５２（５００９）、１１６４〜７。 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年２月１５日、７１（４）７７７〜９０。
チオプロニン（Ｎ−２−メルカプトプロピオニルグリシン、ＴＰ）をコーティングしたナノ粒子には水溶性だという利点こそあれ、生体分子配位子の非特異的結合が生じてしまう。一方、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（ＪＡＣＳ、１９９９、１２１、第７０８１頁）は、チオプロニンと酸性の水溶性配位子とからなる単層膜を１層コーティングした金のクラスターを作製した。そこでは、金とシリコンの表面にエチレングリコール誘導体がコーティングされ、平らな金の表面でのタンパク質結合が阻止されることが示された。さらに、ポリエチレングリコールをコーティングした金ナノ粒子は水溶性であることも示された。しかしながら、中性であるグリコールと生体分子との反応は容易ではなく、特に大きなポリマー鎖がある場合に単層膜の厚さをうまく定めることができない。
フーズ（Ｆｏｏｓ）ら（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．（２００２）、１４、第２４０１〜２４０８頁）は、単層膜で短鎖エチレングリコールオリゴマーをコーティングした金のナノクラスターを作製した。しかしながら、この著者らは（水性／有機混合溶媒に対するものとして）二相有機溶媒系を用いて作製を行っており、コーティングをほどこした粒子の中には水溶性であることが確認できなかった粒子もあった。
本願出願人らはかつて、単相の有機／水性溶媒系を使用し、厚さまたは長さが十分に画定された、捕獲成分と遮蔽成分とを含んでなる混合単層膜を有する水溶性の金属質ナノ粒子を構成したことがある（米国仮特許出願第６０／４００，１４４号）。厚さまたは長さが十分に画定された遮蔽成分であるチオール化エチレングリコール短鎖オリゴマーがナノ粒子と生体分子との間の非特異的相互作用を最小限に抑えるよう機能したのに対し、捕獲コーティング成分（チオプロニンなど）は生体分子を特異的に引き付ける配位子としての役割を果たした。本願出願人らは、捕獲成分と遮蔽成分との臨界比を求めるための方法を開発し、生体分子との特異的結合を維持しつつ生体分子との非特異的結合に対して不活性になる機能を最適化することで、この系を改良した。
本発明は、該当する配位子の特異的結合を明確に最適化した混合単層膜をコーティングしたナノ粒子の作製方法を提供するものである。この単層膜は遮蔽成分と捕獲成分とを含有する。遮蔽成分は、配位子、特に生体分子が単層膜に非特異的に結合するのを防止する目的で設計されるものであり、一般にはエチレングリコール誘導体である。捕獲成分は、該当する配位子（一般には核酸のペプチドなどの生体分子）に対する結合部位を持たせる目的で設計されるものである。本願出願人らは、捕獲成分と遮蔽成分との比を変えることで、ナノ粒子を操作し、他の配位子または材料をすべて除外した状態で該当する配位子を特異的に結合できることを発見した。本発明は、結合対象となる特定の配位子について２つの単層膜成分の具体的な臨界比を求める方法を提供するものである。したがって、本発明は、該当する配位子に対して特定の親和性を有する水溶性金属質ナノ粒子の集団を単離するための方法であって、
ａ）
ｉ）エチレングリコール成分と、
ｉｉ）該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、を含んでなる混合単層膜で各々コーティングされた、多数の可溶性金属質ナノ粒子であって、各ナノ粒子のエチレングリコール成分と捕獲コーティング成分との比が異なる、前記可溶性金属質ナノ粒子を提供し、
ｂ）いくつかのナノ粒子で非特異的配位子結合が生じ、かつ、他のナノ粒子では配位子結合が生じない時間および条件下で、（ａ）の各金属質ナノ粒子を多種多様な標準配位子の混合物と接触させ、
ｃ）配位子結合が生じない（ｂ）のナノ粒子の第１の小集団を同定し、
ｄ）ナノ粒子への配位子の結合が生じる時間および条件下で、（ｃ）のナノ粒子の第１の小集団を該当する配位子と接触させ、そして
ｅ）ナノ粒子への配位子結合が特異的である（ｄ）のナノ粒子の第２の小集団を単離することを含んでなる方法を提供するものである。
発明の詳細な記述
本発明は、特定の配位子を除外する一方で他の配位子と結合するように設計した混合単層膜をコーティングしたナノ粒子に関する。本発明の被覆ナノ粒子は、特定の方法でのタンパク質や核酸の固定化用ならびにタンパク質や核酸への付着用の結合剤および他の材料として均一な水溶性粒子が必要とされるナノデバイスの製造に有用である。さらに、本発明の被覆ナノ粒子は、電子デバイス、多機能触媒、化学センサならびに、バイオセンサや生物学的アッセイなどの多くの生物学的用途にナノスケールで用いることができるものである。
特許請求の範囲および明細書を解釈するにあたり、本願明細書では以下の定義および略号を使用する。
「ＥＧ２」はジエチレングリコールの略号であり、
「ＥＧ３」はトリエチレングリコールの略号であり、
「ＥＧ４」はテトラエチレングリコールの略号であり、
「ＧＳＨ」はグルタチオンの略号であり、
「ＧＳＴ」はグルタチオンｓ−トランスフェラーゼの略号であり、
「ＴＢＥ」はトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡの略号であり、
「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドの略号であり、
「ＥＤＣ」は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの略号である。
「ＧＳＨ」はグルタチオンの略号である。
「ＭＥＳ」はモルホリノエタンスルホン酸の略号である。
「ＴＰ」はチオプロニンの略号であり、
「Ｖ／Ｖ」は容量／容量の略号である。
本願明細書において「ナノ粒子」とは、平均粒径が１〜１００ｎｍの間にある金属質粒子であると定義する。好ましくは、粒子の平均粒径が約１〜４０ｎｍの間である。本願明細書において使用する場合、「粒度」と「粒径」は同じ意味である。金属質ナノ粒子としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属で構成される合金の粒子があげられるが、これに限定されるものではない。本願明細書において「合金」とは、２以上の金属からなる均質な混合物であると定義する。
「単層膜」とは、単一分子の厚さである、ナノ粒子にコーティングされる材料の層を示す。
「混合単層膜」とは、少なくとも２種類の分子成分を有する単層膜を示す。
「配位子」とは、捕獲コーティング成分と特異的に結合する物質を示す。配位子はどのような物質であってもよく、一般にはペプチドやタンパク質、細胞、核酸断片などのバイオポリマーである。「該当する配位子」とは、何らかの研究調査の対象となる特定の配位子である。
「多種多様な標準配位子」という表現は、該当する配位子を含有しない配位子の群を意味する。一般に、多種多様な標準配位子には、該当する（ｏｆ ｉｎｔｅｎｔｓ）配位子が見られる環境と同じ環境で見出される生体分子が含まれる。
「結合対」という用語は、化学ポリマーまたはバイオポリマーをベースにした、互いに特異的に結合するカップルを示す。結合対の一般的な例に、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型の結合対がある。
「捕獲コーティング成分」とは、本願明細書において使用する場合、配位子との親和性を有する、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。
「遮蔽用コーティング成分」とは、該当する配位子ではない物質の非特異的結合を防止する機能を有する、ナノ粒子に単層膜を形成できる材料を示す。遮蔽用コーティング成分はさまざまな材料で構成されるもので構わないが、エチレングリコールが特に適している。
混合単層膜の遮蔽成分に関連して用いる場合の「絡み合い分子量」という表現は、この分子量を超えると遮蔽成分として用いるポリマー分子が絡み合いをみせる、最低限の分子量を意味する。ポリマーの絡み合い分子量を求める方法は周知であり、たとえば、フリードリッヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ Ｖ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｈｅｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、第５版、ポルトロージュ（Ｐｏｒｔｏｒｏｚ）、スロベニア（Ｓｌｏｖｅｎｉａ）、１９９８年９月６〜１１（１９９８）、３８７。編者（ら）：エミリ（Ｅｍｒｉ），Ｉ．、出版社：シュタインコップフ（Ｓｔｅｉｎｋｏｐｆｆ）、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツを参照のこと。
「ナノ構造」という用語は、少なくとも１つの特徴寸法（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）が約１００ミクロン未満である、チューブ、ロッド、シリンダ、束状構造体、ウエハ、ディスク、シート、プレート、平面、錐体、細長い小片、顆粒、楕円体、楔体、ポリマー繊維、天然繊維、このような他の物体を意味する。
「ナノロッド」という用語は、中空であっても中実であってもよく、断面（ｃｒｏｓｓｅｃｔｉｏｎａｌ）形状が円形であっても円形でなくても構わない、さまざまなナノ構造を意味する。本発明のナノロッドには、ナノチューブ、ナノファイバ、ポリマーナノファイバ、束状構造体、多壁構造体を含み得る。
「ナノチューブ」という用語は、狭い方の寸法（直径）が約１〜２００ｎｍであり、長い方の寸法（長さ）については、短い方の寸法に対する長い方の寸法の比すなわちアスペクト比が少なくとも５である、中空の物品を示す。通常、アスペクト比は１０〜２０００の間である。
「ナノ平面」とは、１つの特徴寸法が５００ナノメートル未満である、単層または二層のグラファイトシートまたはグラフェンシートなどの表面を意味する。
「ナノファイバ」とは、寸法が１０００ナノメートル未満と小さい天然のフィラメントまたはポリマーフィラメントを意味する。
「金属結合官能基」という用語は、金属表面への分子の付着を担う化学基を示す。金属結合官能基の非限定的な一例に、金および他の金属に材料を結合させる、スルフィドラル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）（−ＳＨ）官能基がある。
「混合溶媒」という用語は、有機成分と水性成分の両方を含んでなり、有機成分が実質的に水混和性である溶媒を示す。
本願明細書において「実質的に水混和性の有機溶媒」とは、少なくとも８０容量％の濃度になるまで水に完全に溶解する有機溶媒であると定義する。
「配位子置換法」という用語は、ナノ粒子を混合単層膜でコーティングする方法であって、混合単層膜の第１の成分をナノ粒子にコーティングした後、混合単層膜が達成されるまで第１の成分の要素を第２の成分の要素で置換する方法を示す。
「直接合成法」という用語は、混合単層膜の両方の成分が単一の溶液中で反応し、ナノ粒子で混合単層膜が形成される金属ナノ粒子の存在下にて、ナノ粒子を混合単層膜でコーティングする方法を示す。
被覆ナノ粒子
本発明は、該当する配位子の特異的結合が、他の配位子の結合を除外した状態で得られるような比で遮蔽用コーティング成分と捕獲成分を有する混合単層膜をコーティングした水溶性金属ナノ粒子を提供するものである。
本発明のナノ粒子は、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属からなる合金を含むがこれに限定されるものではない、多種多様な金属で構成し得るものである。使用するのに好ましいのは、金からなるナノ粒子である。一般に、本発明の未被覆ナノ粒子は直径が約１ｎｍから約１００ｎｍの範囲であり、約１ｎｍから約４０ｎｍが好ましい。金属ナノ粒子を作製する方法は従来技術において周知（たとえば、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ），Ａ．Ｃ．ら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０００、３３、２７〜３６を参照のこと）であり、さらにシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの提供元から商用入手される。
本発明のナノ粒子には、同一単層膜の一部として捕獲成分と遮蔽成分とを有する混合単層膜をコーティングする。捕獲成分については単層膜の約１０％から約９０％の範囲にすればよいが、捕獲成分を混合単層膜の約５０％未満にする方が普通であり、約２０％〜４０％が好ましい。逆に、遮蔽成分は一般に、単層膜の約１０％から約９０％に達する、単層膜の主成分をなすものであり、単層膜の少なくとも約５０％であるのが適しており、約６０％から約９０％が好ましい。
捕獲成分は、さまざまな材料を被覆ナノ粒子に結合するように機能する。単一の配位子に対する特定の親和性が捕獲成分にあると好ましい。本発明の典型的な配位子としては、たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸断片、コラーゲンなどのバイオポリマーならびに、さまざまなナノ構造（本願明細書にて定義するようなナノロッド、ナノチューブ、ナノ平面、ナノ繊維）などのナノデバイスの組立てと合成に役立つナノ材料があげられる。また、配位子は結合対の一メンバーを含んでなり得る。化学ベースおよびタンパク質ベースの結合対は従来技術において周知であり、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６Ｘヒスチジンタグ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、Ｃｕｔｉｎａｓｅ／ホスホネートインヒビターなどの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない。さらに、結合対には、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系などの免疫型のあらゆるクラスの結合対ならびに、ビオチン／アビジン；ビオチン／ストレプトアビジン；葉酸／葉酸塩結合タンパク質などの非免疫型のあらゆるクラスの結合対；ペプチド核酸配列を含む相補的核酸セグメント；タンパク質ＡまたはＧ／免疫グロブリン；マレイミドおよびハロアセチル誘導体をはじめとするスルフヒドリル反応基などの共有結合を形成する結合対、イソトリオシアネート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルなどのアミン反応基も含まれる。
捕獲成分は、該当する配位子への結合を可能にするさまざまな化学基で官能化し得るものである。このような化学反応基の非限定的な例としては、−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、エポキシ基よりなる群から選択されるものがあげられる。好適な捕獲成分の好ましい例にチオプロニンおよびＧＳＨがある。チオプロニン（ＴＰと略記）、Ｎ−２−メルカプトプロピオニル−グリシン、は配位子に合った都合のよい結合部位として機能する露出したカルボキシ基（下記に示す）が存在することから、特に捕獲成分として好適である。
Figure 2005534925
混合単層膜の遮蔽成分は、該当するものではない配位子の被覆ナノ粒子との結合をブロックする機能を果たし、該当する特定の配位子を結合、単離または固定化する目的でナノ粒子を利用できるようにするものである。配位子を結合しないことが遮蔽成分の主な要件であり、十分に長さの定義された非荷電水溶性分子が一般的である。過剰な長さのポリマーが捕獲成分の結合部位をブロックする作用を有する場合もあるため、ポリマーの長さを制御しなければならない。好適な遮蔽成分としては、短鎖エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールメタクリレート、糖類、クラウンエーテル、アクリルアミドがあげられるが、これに限定されるものではなく、短鎖エチレングリコールオリゴマーが好ましい。
遮蔽成分については、金属ナノ粒子の表面に結合するように官能化することができる。ある材料に金属結合官能基を持たせる一般的な方法のひとつに、好ましい２種類の短鎖エチレングリコールオリゴマーについて下記に示すようにして、スフヒドラル（ｓｕｆｈｙｄｒａｌ）基を加える方法がある。
Figure 2005534925
短鎖エチレングリコールオリゴマーであれば何でも適しているのではあるが、通常はオリゴマーの絡み合い分子量よりも小さくなるようにサイズを制限してあるものの方が好ましい。どういった機序でこのような選択基準になるのかを示唆するつもりはないが、捕獲成分の結合部位のブロックを回避するには、長いポリマー鎖との対比で短鎖遮蔽成分の方が適していると考えられる。捕獲成分の配位子結合部位が配位子に近付くことができるようになるのは短鎖遮蔽成分がゆえであると想定すると理にかなう。主成分の鎖長が長くなると配位子結合官能基がブロックされ、結合の発生が妨げられる場合がある。
被覆ナノ粒子の合成
本発明は、コーティング成分と遮蔽成分との比が合理的に設計された混合単層膜をコーティングしたナノ粒子を提供するものである。本願明細書において好ましいのは、配位子置換法および直接合成法と呼ばれる、このようなナノ粒子を合成するための２つの方法である。これら２つの方法は主に成分を添加する順序の点で異なるものであり、その詳細を下記にて説明する。
配位子置換
配位子置換法は、金属ナノ粒子を混合単層膜の第１の成分でコーティングすることから始まり、続いて被覆粒子を第２の成分に曝露する。適切な反応条件下では、混合単層膜が形成されるような形で第１の成分の要素が第２の成分の要素に置換される。この配位子置換法は、次のような工程ステップを含んでなる。
ａ）該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分の単層膜をコーティングした水溶性金属質ナノ粒子を提供し、
ｂ）少なくとも１種の実質的に水混和性の有機溶媒と少なくとも１種の水性溶媒とを含んでなる、ｐＨが７．０未満の混合溶媒中で、（ａ）の被覆ナノ粒子を、金属結合官能基を有する遮蔽用コーティング成分と混合し、遮蔽用コーティング成分と捕獲コーティング成分との間で置換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）を発生させて混合単層膜のコーティングされたナノ粒子を形成する。
場合により、濾過、遠心分離または蒸留などの標準的な方法によって、混合単層膜被覆金属ナノ粒子を溶液から単離してもよい。
混合単層膜を調製するための配位子置換法で特に重要なのは、酸性ｐＨで混合溶媒を用いることである。混合溶媒は水性分と有機分とを含んでなり、有機分は実質的に水混和性である。好適な有機溶媒としては、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、アセトンがあげられるが、これに限定されるものではない。また、好適な溶媒には、互いに完全に混和し、実質的に水混和性の有機溶媒である混合物が得られる有機溶媒の混合物も含まれる。多成分有機溶媒の例としては、酢酸エチルとメタノール、酢酸エチルとエタノール、酢酸エチルとイソプロパノール、酢酸エチルとアセトン、酢酸エチルとジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド、酢酸エチルとテトラヒドロフランとジオキサンがあげられるが、これに限定されるものではない。好ましい有機溶媒はメタノールまたはエタノールである。
混合溶媒の水性分は単なる水であってもよいが、通常はｐＨ約７．０未満（ｐＨについては約５．５未満であると好ましい）の酸環境で反応が起こる方が好ましいため、酢酸などの酸を用いるのが普通である。
配位子置換法では、単層膜をコーティングした金属質ナノ粒子を提供することに頼っている。単一の単層膜をコーティングしたナノ粒子を合成する方法については周知である。たとえば、本願明細書に援用する、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １５：６６〜７６（１９９９））には、チオプロニンまたはコエンザイムＡ単層膜で保護された、荷電水溶性金ナノ粒子を作製するための方法が記載されている。チオプロニン保護金ナノ粒子を作製するにあたって、四塩化金酸とＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン）とをメタノールと酢酸との混合物に同時溶解させた。素早く攪拌しながら水素化ホウ素ナトリウムを添加した。コエンザイムＡ保護金ナノ粒子についても、反応におけるチオプロニンをコエンザイムＡに変えて同様にして作製した。金だけでなく、他の金属を使用してもよい。たとえば、ヒース（Ｈｅａｔｈ）らの米国特許第６，１０３，８６８号明細書には、チオール、ホスフィン、ジスルフィド、アミン、オキシドまたはアミドなどの官能基を有していた有機表面パッシバントの溶液を用いて、金、銀、白金、パラジウム、コバルト、ニッケルをコーティングすることについて記載されている。本願明細書に援用する、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ １６９：１０７〜１１６（２０００））には、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）の存在下にてクロロ白金酸をエタノールで還元し、エタノール−水混合物中でナノ粒子を作製することを伴う別の方法が記載されている。他の方法についても、ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）らの米国特許第６，０７４，９７９号明細書；ウェルフィング（Ｗｕｅｌｆｉｎｇ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１２６９６〜１２６９７（１９９８））；チャン（Ｃｈａｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：２０１６〜２０１８（１９９８））；ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：８１２２〜８１２３（１９９９））；ナパー（Ｎａｐｐｅｒ）（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｓｃｉ ５８：３９０〜４０７（１９７７））などに説明がある。
したがって、本発明において用いる、捕獲成分をコーティングしたナノ粒子を合成する好ましい方法には以下の工程ステップを伴う。
ａ）該当する配位子に対する親和性を有する、金属結合官能基を含んでなる捕獲コーティング成分と、金属塩とを混合し、ｐＨが７．０未満の第１の反応混合物を形成し、
ｂ）（ａ）の第１の反応混合物に好適な還元剤を添加し、前記捕獲コーティング成分をコーティングした金属ナノ粒子を含んでなる第２の反応混合物を形成する。
上記の方法または同様の方法を使用して単一の単層膜をコーティングしたナノ粒子を作製する場合、金属塩から開始するのがよい。好適な金属塩として、金属、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属からなる合金の塩があげられるが、これに限定されるものではない。特に適した塩には、ＨＡｕＣｌ４、ＡｇＮＯ３、Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯ２）２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、ＨＰｔＣｌ６、Ｋ２ＰｄＣｌ４がある。
金属結合官能化捕獲成分または遮蔽成分を金属ナノ粒子の表面に結合するには還元剤が必要である。捕獲または遮蔽用コーティング成分に金属結合官能基を持たせるには、還元後に金属表面を結合するさまざまな反応基を加えるのが普通である。この種の一般的な反応基は、多くの好適な捕獲コーティング成分の誘導体化に使用できるスルフヒドラル（−ＳＨ）基である。一般的な還元剤には、捕獲成分の金属−結合官能基と相互作用するものがある。金属結合官能基が−ＳＨである好適な還元剤には、ＮａＢＨ４、トリエチル水素化ホウ素リチウム、過酸化水素がある。
直接合成
２段階での配位子置換法とは対照的に、単一ステップの直接合成法で本発明の混合単層膜被覆ナノ粒子を合成することも可能である。この方法は、遮蔽成分がエチレングリコールからなるものである場合に有用である。直接合成法は、以下の工程ステップから進む。
ａ）
ｉ）金属質ナノ粒子と、
ｉｉ）金属結合官能基を有するエチレングリコール成分と、
ｉｉｉ）金属結合官能基を有し、かつ、該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、
ｉｖ）好適な還元剤と、
ｖ）少なくとも１種の実質的に水混和性の有機溶媒と少なくとも１種の水性溶媒とを含んでなり、ｐＨが７．０未満である混合溶媒と、を提供し、
ｂ）（ｖ）の混合溶媒中で要素（ｉ）〜（ｉｖ）を混合して反応混合物を形成し、反応混合物中での水の最終濃度が約９％から約１８％Ｖ／Ｖであり、混合単層膜が金属質ナノ粒子上に形成される。
場合により、従来技術において周知のいずれかの手段で被覆ナノ粒子を単離してもよい。
あるいは、まず最初に混合溶媒の成分同士を分離する一連のステップを直接合成法で利用してもよい。金属塩、遮蔽成分、捕獲成分を有機溶媒に溶解させた上で水に溶解させた還元剤と混合した場合に、良好な結果が得られた。最終溶液をｐＨ７．０未満としなければならないため、混合物中での水の最終濃度が約９％から約１８％Ｖ／Ｖであると好ましい。したがって、本発明は、
ａ）
（ｉ）金属塩と、
（ｉｉ）金属結合官能基を有する遮蔽成分と、
（ｉｉｉ）金属結合官能基を有し、かつ、該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、
（ｉｖ）有機溶媒と、を含んでなる第１の反応混合物を提供し、
ｂ）水性溶媒中に好適な還元剤を含んでなる第２の反応混合物であって、ｐＨが７．０未満である第２の反応混合物を提供し、
ｃ）第１および第２の反応混合物を混合し、混合物中の水の最終濃度が約９％から約１８％Ｖ／Ｖであり、混合単層膜をコーティングした水溶性金属質ナノ粒子を形成することを含んでなる、混合単層膜をコーティングした水溶性金属質ナノ粒子を合成するための方法を提供するものである。
直接合成法では一反応ステップの利点が得られるが、反応混合物中の水の量を制御するのは必須である。たとえば、反応物の最終的な水分含有量を約５％から約２０％（Ｖ／Ｖ）にすべきであり、約９％から約１８％（Ｖ／Ｖ）が好ましい。直接合成法では、ナノ粒子の溶解性が水の濃度に影響されやすく、溶液から析出するナノ粒子に水濃度の変動が影響する場合がある。
いずれかの方法で合成して得られるナノ粒子の平均サイズについては、「Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ， Ｉｓｏｌａｂｌｅ Ｇｏｌｄ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｔｉｏｐｒｏｎｉｎ ａｎｄ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」、Ａ．Ｃ．テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）、Ｓ．チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｓ．Ｍ．グロス（Ｇｒｏｓｓ）、Ｒ．Ｗ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、１９９９年、１５、第６６〜７６頁に記載されているように、金属塩と捕獲コーティング成分とのモル比を変えることで制御可能である。
上述した方法はいずれも室温で実施できるものであるが、室温よりも高い温度または低い温度を利用することも可能である。
特定の配位子と結合しているナノ粒子の単離と分離
本発明の方法を用いて、非特異的に結合する材料および配位子を除外しつつ該当する特定の配位子を結合する単層膜被覆ナノ粒子を単離する。本発明に不可欠な特徴のひとつに、単層膜の遮蔽成分と捕獲成分との比を変更して該当する配位子の最適な結合を得ると同時に、他のすべての配位子または材料を最大限に除外することがある。これを達成するには、各々が遮蔽率：捕獲成分の異なる多数のナノ粒子を提供する必要がある。これは、上述した方法のいずれにおいても遮蔽成分および捕獲成分の供給比を変えることで作製工程の間に行い得るものである。
異なる組成物の単層膜を用いてナノ粒子のプールを作製した後、これらのナノ粒子を多種多様な標準配位子の混合物と接触させればよい。これらの配位子は該当する配位子を含有せず、かつ検出対象となる該当する配位子の環境に見られる材料（通常は他の生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｌｕｅ））を含んでなるのが普通である。特に好適な多種多様な標準配位子混合物としては、リゾチーム、ウシ血清アルブミン、シトクロムがあげられるが、これに限定されるものではない。配位子標準は一般にナノ粒子の多くを非特異的に結合するが、中には完全にこれを耐えるものもある。こうして、さまざまな配位子の非特異的結合にうまく抵抗するナノ粒子の小集団を選別する。この小集団を該当する配位子に曝露し、該当する配位子に対して高い結合親和性を示すナノ粒子を第２の小集団として選択する。この第２の小集団に含まれるナノ粒子は、単層膜の遮蔽成分と捕獲成分との比が該当する配位子の特異的結合を行うのに最適なものとなっている。このような特定の単層膜組成物を有するナノ粒子をアッセイに利用すれば、該当する配位子を検出または単離することができる。あるいは、該当する配位子を使用し、ナノ粒子をナノワイヤまたはナノエレクトリックデバイスの他の成分に固定化またはアセンブルすることもできる。
したがって、本発明の目的は、該当する配位子に対して特定の親和性を有する水溶性金属質ナノ粒子の集団を単離するための方法であって、
ａ）
ｉ）エチレングリコールからなる遮蔽成分と、
ｉｉ）該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、を含んでなる混合単層膜で各々コーティングされた多数の可溶性金属質ナノ粒子であって、各ナノ粒子の遮蔽成分と捕獲コーティング成分との比が異なる、前記可溶性金属質ナノ粒子を提供し、
ｂ）いくつかのナノ粒子で非特異的配位子結合が生じ、かつ、他のナノ粒子では配位子結合が生じない時間および条件下で、（ａ）の各金属質ナノ粒子を多種多様な標準配位子の混合物と接触させ、
ｃ）配位子結合が生じない（ｂ）のナノ粒子の第１の小集団を同定し、
ｄ）ナノ粒子への配位子の結合が生じる時間および条件下で、（ｃ）のナノ粒子の第１の小集団を該当する配位子と接触させ、そして
ｅ）ナノ粒子への配位子結合が特異的である（ｄ）のナノ粒子の第２の小集団を単離することを含んでなる方法を提供することにある。
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
材料および方法
特に明記しない限り、試薬はいずれもアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））から購入し、それ以上精製することなく使用した。
略号の意味は以下のとおりである。「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
実施例１
ジエチレングリコールチオール（ＥＧ２−ＳＨ）の合成
２５０ｍＬ容の乾燥した丸底フラスコに、１−ブロモ−２−（２−メトキシエトキシ）エタン（９０％、１０．０ｇ）と尿素（９９％、８．３ｇ）とを入れた。次に、このフラスコにエタノール（９９．９％）８０ｍＬを加えた。混合物を６時間還流した。混合物を室温まで冷却した後、回転蒸発によってＥｔＯＨを回収した。続いて２０％ＮａＯＨ１５０ｇを加え、３時間還流した。この混合物を室温まで冷却し、５００ｍＬ容のビーカーに注いだ。この混合物に、ｐＨが２になるまで１５％ＨＣｌ（濃ＨＣｌから調製）を攪拌しながらゆっくりと加えた。混合物をエーテル２００ｍＬで４回抽出した。エーテル相の液体分を１０００ｍＬ容のビーカーに回収し、Ｄ．Ｉ．水２００ｍＬでエーテル相を抽出し、塩と他の不純物とをさらに除去した。回転蒸発によってエーテルを除去し、４１〜４２℃にて圧力１．２ｍｍＨｇで粗生成物を蒸留した。最終生成物は一般的なチオールの臭いのする無色のもので、重量は６．０ｇ、収率５７％であった。ｎｍＲ測定によって構造を確認した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．６０〜１．６５（ｔ，１Ｈ）、２．７０〜２．８０（ｍ，２Ｈ）、３．４５（ｓ，３Ｈ）、３．５５〜３．７５（ｍ，６Ｈ）。
実施例２
トリエチレングリコールチオール（ＥＧ３−ＳＨ）の合成
亜リン酸の三臭化物（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｔｒｉｂｒｏｍｉｄｅ）（９９％、２２．０ｇ、０．０８１モル）をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬに入れたものを、トリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（９８％、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ））２０．０ｇ（０．１２２モル）とピリジン７．０ｍＬとＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬとの攪拌混合物に０℃でゆっくりと加えた。得られた混合物を室温にて１６時間攪拌した。次に、Ｄ．Ｉ．水１０ｍＬを加えた。この混合物を、１０％炭酸ナトリウム水溶液１６０ｍＬ、飽和ＮａＯＨ１６０ｍＬ、５％硫酸１６０ｍＬ、Ｄ．Ｉ．水１６０ｍＬで続けて洗浄し、さらに無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を回転蒸発により除去した。粗生成物であるＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ（７．８ｇ、０．０３４モル）と、尿素（９９％、５．６ｇ、０．０７３モル）と、エタノール（９９．９％）６５ｍＬとを混合し、６時間還流した。この混合物を室温まで冷却した後、回転蒸発によってＥｔＯＨを除去した。続いて２０％ＮａＯＨ１５０ｇを加え、３時間還流した。この混合物を室温まで冷却し、１５％ＨＣｌを用いてｐＨが２．０に達するまで酸性化した。混合物をエーテル２００ｍＬずつで４回抽出した。Ｄ．Ｉ．水２００ｍＬでエーテル相を抽出し、塩と他の不純物とをさらに除去した。回転蒸発によってエーテルを除去し、粗生成物を蒸留し、収率７０％で最終生成物（ＥＧ３−ＳＨ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．５０〜１．５５（ｔ，１Ｈ）、２．６２〜２．６７（ｄｔ，２Ｈ）、３．３３（ｓ，３Ｈ）、３．４９〜３．５１（ｄｔ，２Ｈ）および３．５５〜３．６２（ｍ，８Ｈ）。
実施例３
テトラエチレングリコールチオール（ＥＧ４−ＳＨ）の合成
亜リン酸の三臭化物（９９％、２２．０ｇ、０．０８１モル）を、テトラ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（９８％、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ））１０．０ｇ（０．０４８モル）とピリジン２．０ｇとの攪拌混合物に０℃でゆっくりと加えた。得られた混合物を室温にて１６時間攪拌した。次に、Ｄ．Ｉ．水１０ｍＬを加えた。この混合物を、四塩化炭素４０ｍＬずつで３回抽出した。この混合有機抽出物を、２５ｍＬの１０％炭酸ナトリウム水溶液、５％硫酸、Ｄ．Ｉ．水で続けて洗浄し、さらに無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を回転蒸発により除去した。粗生成物であるＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ（９０％、１０．０ｇ）と、尿素（９９％、８．３ｇ）と、エタノール（９９．９％）８０ｍＬとを混合し、６時間還流した。この混合物を室温まで冷却した後、、回転蒸発によってＥｔＯＨを除去した。続いて２０％ＮａＯＨ１５０ｇを加え、３時間還流した。この混合物を室温まで冷却し、１５％ＨＣｌを用いてｐＨが２．０に達するまで酸性化した。混合物をエーテル２００ｍＬずつで４回抽出した。Ｄ．Ｉ．水２００ｍＬでエーテル相を抽出し、塩と他の不純物とをさらに除去した。回転蒸発によってエーテルを除去し、粗生成物を蒸留し、最終生成物（ＥＧ４−ＳＨ）を収率２２％で得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．５０〜１．５５（ｔ，１Ｈ）、２．６０〜２．６５（ｄｔ，２Ｈ）、３．３１（ｓ，３Ｈ）、３．４５〜３．５０（ｄｔ，２Ｈ）および３．５３〜３．６２（ｍ，１４Ｈ）。
実施例４
平均直径３．５ｎｍのチオプロニン単層膜保護金ナノ粒子［Ａｕ−（ＴＰ）ｎ］の合成
一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）６０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）１０ｍＬとを、２５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。次に、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ）（９９．９９％）０．３７ｇ（０．９４ｍｍｏｌ）とＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン、９９％）１６．３２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）とを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．６ｇ（１６ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水３０ｇに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応が発熱を伴うものであることに気付いた。反応時に生成された熱により、溶液を１５分以内で温めた。反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。素早い攪拌を２時間維持した。このチオプロニン保護金ナノ粒子は水に可溶であった。希釈すると透明な紫色になった。この粒子溶液をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
［ＨＡｕＣｌ４］と［チオプロニン］とのモル比を変更すれば、ナノ粒子の平均サイズを調節することができる。この比を大きくすると、平均粒度も大きくなる。
実施例５
グルタチオン単層膜保護金ナノ粒子の作製
一般的な反応では、メタノール（ＨＰＬＣグレード）６０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）１０ｍＬとを、エルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ、９９．９９％）（０．３７ｇ）とグルタチオン（ＧＳＨ）（最低９９％、ミズーリ州セント・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手）６１．４ｍｇとを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。ＮａＢＨ４（９９％）０．６ｇをナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水３０ｇに溶解させることによって、水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製した。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４溶液の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応は発熱を伴うものであり、溶液をおよそ１５分間温めた。反応時、溶液のｐＨが１．２から約５．０まで変化した。この反応溶液を２時間素早く攪拌した。このグルタチオン単層膜保護金ナノ粒子は水に可溶であり、希釈すると溶液は透明な紫色になった。この粒子溶液フィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
実施例６
平均直径３．０ｎｍのトリエチレングリコール単層膜保護金ナノ粒子（Ａｕ−ＥＧ３）の合成
一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）３０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）５．０ｍＬとを、１５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。次に、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ）（９９．９９％）０．１７５ｇ（０．４４ｍｍｏｌ）とトリエチレングリコールチオール（ＥＧ３−ＳＨ）４０．０ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）とを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．１５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水５．０ｍＬに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応が発熱を伴うものであることに気付いた。反応時に生成された熱により、溶液を１５分以内で温めた。反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。素早い攪拌を２時間継続した。このジエチレングリコール保護金ナノ粒子は水に可溶である。希釈すると透明な赤紫色になった。この粒子溶液をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
実施例７
平均直径３．０ｎｍのテトラエチレングリコール単層膜保護金ナノ粒子（Ａｕ−ＥＧ４）の合成
一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）３０ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）５．０ｍＬとを、１５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。次に、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ）（９９．９９％）０．０８８５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）とテトラエチレングリコールチオール（ＥＧ４−ＳＨ）２２．４ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）とを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．０７５ｇ（２．０ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水５．０ｍＬに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えたところ、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応が発熱を伴うものであることに気付いた。反応時に生成された熱により、溶液を１５分以内で温めることができよう。反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。素早い攪拌を２時間継続した。このテトラエチレングリコール保護金ナノ粒子は水に可溶である。希釈すると透明な赤紫色になった。この粒子溶液をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
実施例８
遊離ＥＧ３−ＳＨ、Ａｕ−ＥＧ３および混合単層膜保護金ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトル
純粋な材料３ｍｇとＣＣｌ３Ｄ２ｍＬとをＮＭＲチューブ内で混合することによって、遊離ＥＧ３−ＳＨの１Ｈ ＮＭＲサンプルを調製した。ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）５００ＭＨｚを用いて、室温にてＣＣｌ３Ｄで遊離ＥＧ３−ＳＨの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１（ａ）に示すような形で記録した。乾燥ナノ粒子１５．０ｍｇをＤＭＳＯ−ｄ６溶媒２ｍＬに溶解させ、ナノ粒子サンプルを作製した。バリアン・イノバ（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ）４００ＭＨｚを用いて、室温にてＤＭＳＯ−ｄ６でＡｕ−ＥＧ３単層膜保護ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１（ｂ）に示すような形で記録した。また、バリアン・イノバ（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ）４００ＭＨｚを用いて、室温にてＤＭＳＯ−ｄ６で混合単層膜（Ａｕ−ＥＧ３／Ｔｐ）保護ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２に示すような形で記録した。これらのサンプルについて、９０°パルスを２０秒間の遅延で用いて１パルス実験を行った。スプライン基線修正装置を用いて基線を平坦化した。
混合単層膜保護ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、１．３２〜１．３６（δ）の二重線ピークはチオプロニンの−ＣＨ３基によるものであり、２．８７〜２．９２（δ）の三重線ピークは−ＳＣＨ２基によるものであることが明らかに分かった。これらの２つのピークの積分比から、金ナノ粒子の表面にあるトリエチレングリコールとチオプロニンの比が求められる。
実施例９
平均直径３．０ｎｍのトリエチレングリコールおよびチオプロニン混合単層膜保護金ナノ粒子の合成
Figure 2005534925
トリエチレングリコールとチオプロニンとの仕込みモル比を１：１とする一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）４５ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）７．５ｍＬとを、１５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。次に、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ）（９９．９９％）０．２３６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）とテトラエチレングリコールチオール（ＥＧ４−ＳＨ）２７．０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）とチオプロニン（０．１５ｍｍｏｌ）２４．５ｍｇとを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．２２５ｇ（６．０ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水（Ｒ）７．５ｍＬに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応が発熱を伴うものであることに気付いた。反応時に生成された熱により、溶液を１５分以内で温めた。反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。素早い攪拌を２時間継続した。このトリエチレングリコール／チオプロニン混合単層膜保護金ナノ粒子は水に可溶であった。希釈すると透明な赤紫色になった。この粒子溶液をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
モル比の異なるトリエチレングリコールおよびチオプロニン混合単層膜保護金ナノ粒子の合成では、各試薬の重量を下記の表１に示すようにさまざまに変えた上で、上記と同じプロトコールに従った。
Figure 2005534925
これらの上記の混合単層膜保護金ナノ粒子を合成した後、トリエチレングリコールおよびチオプロニンの量的な表面成分を実施例８で説明したようにして１Ｈ ＮＭＲスペクトルから求めた。結果を表２に示す。表面比を図３に示すように仕込み比に対してプロットする。図３が勾配３．２の線形関係にあるのは、混合単層膜保護金ナノ粒子の合成時においてＥＧ３−ＳＨの反応性がＴｐよりもほぼ３倍高いことを意味する。
Figure 2005534925
実施例１０
トリエチレングリコール（ＥＧ３−ＳＨ）およびグルタチオン（ＧＳＨ）混合単層膜保護金ナノ粒子の合成
トリエチレングリコールとグルタチオンの仕込みモル比を１：１とする一般的な反応では、ＭｅＯＨ（ＨＰＬＣグレード）４５ｍＬと酢酸（ＨＰＬＣグレード）７．５ｍＬとを、１５０ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコ内で２〜５分間攪拌することによって混合した。次に、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ）（９９．９９％）０．１７５ｇ（０．６ｍｍｏｌ）とトリエチレングリコールチオール（ＥＧ３−ＳＨ）２７．０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）とグルタチオン（０．１５ｍｍｏｌ）４６．１ｍｇとを上記の混合溶媒に加え、５分間攪拌することによって溶解させたところ、透明な黄色の溶液が得られた。次に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４、９９％）０．２２５ｇ（６．０ｍｍｏｌ）をナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水５．０ｍＬに溶解させた。このＮａＢＨ４溶液を上記の溶液に素早く攪拌しながら滴下して加えた。ＮａＢＨ４の最初の１滴を加えると、ＨＡｕＣｌ４溶液は瞬時に黄色から暗褐色に変化した。この反応が発熱を伴うものであることに気付いた。反応時に生成された熱により、溶液を１５分以内で温めることができよう。反応時、溶液のｐＨが１．２から５．０以内まで変化した。素早い攪拌を２時間継続した。このＥＧ３−ＳＨ／ＧＳＨ保護金ナノ粒子は水に可溶であった。希釈すると透明な赤紫色になった。この粒子溶液をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）水で４回洗浄した後、凍結乾燥器（ｌｙｐｈｏｌｉｚｅｒ）で３日間かけて乾燥させた。
モル比の異なるＥＧ３−ＳＨおよびＧＳＨ混合単層膜保護金ナノ粒子の合成では、各試薬の重量を表３に示すようにさまざまに変えた上で、上記と同じプロトコールに従った。
Figure 2005534925
実施例１１
ビオチン化トリエチレングリコール／グルタチオン（ＥＧ３／ＧＳＨ）混合単層膜保護金ナノ粒子の合成
この実施例は、混合単層膜保護ナノ粒子との単純な反応によって官能基または配位子を導入可能であることを示すものである。この実施例では、表面のカルボン酸基との反応によってナノ粒子にビオチン配位子を導入した。一般的な反応スキームを以下にあげておく。
５ｍＬ容の丸底フラスコ内で、ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護Ａｕナノ粒子［Ａｕ（ＥＧ３）４Ｔｐ］（ＥＧ３−ＳＨとＧＳＨの仕込み比を４：１にして実施例１０で作製）７．７ｍｇをｐＨ５．５で０．１ＭのＮ−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）１．５ｍＬと混合した後、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（Ｒ）５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（分子量３２８．４８、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手）７．３ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ）（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）のピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手）５０ｍｇとを加えた。この混合物を室温にて一晩攪拌した。次に、反応混合物をフィルタチューブ（５０Ｋ ＭＷカットオフ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））に移し、３，５００ｒｐｍでの遠心により精製し、ナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（Ｒ）水で４回洗浄した。
実施例１２
ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子−タンパク質結合のゲル電気泳動分析
タンパク質−ナノ粒子複合体は遊離Ａｕ粒子とは違った形で移動すると思われるため、Ａｕナノ粒子へのタンパク質結合をゲル電気泳動によって都合よくモニタリングすることが可能である。ゲル電気泳動実験。１×ＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）中にて９０Ｖの定電圧で２０分間、ゲル電気泳動を行った。ＨＰ スキャンジェット（ＳｃａｎＪｅｔ） ６３００Ｃでゲルを直接走査することによって、ゲル画像を得た。ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍｍ、ｐＨ７．３）１０μＬ中にて１ｕＭ以内のＡｕ粒子１μＬを特定の量のタンパク質と混合することで、タンパク質結合反応を行った。室温にて１０分間のインキュベーション後、反応混合物全体を１％アガロースゲルに仕込んだ。
ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子で得られた結果を図４に示す。図４ａでは、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、Ａｕ−（ＥＧ３）３Ｔｐ（Ａｕナノ粒子表面での表面ＥＧ３／Ｔｐ比が３：１であることを示す）７μＬを０．１ｍＭ以内で用いた場合がレーン１である。レーン２、３、４、５、６はそれぞれ、ＥＧ３とＴｐの比が１２：１、２７：１、４２：１、５７／１ならびに純粋なＡｕ−ＥＧ３での同量のＡｕ粒子の場合である。ナノ粒子表面のチオプロニンの割合が小さくなるにつれて、ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子の移動速度が低下した。図４ｂでは、レーン１、３、５、７がそれぞれ、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、４、１２、２７、４２の比で、ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子７μＬを０．１ｍＭ以内で用いた場合である。レーン２、４、６、８はそれぞれ、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、粒子をリゾジム（ｌｙｓｏｚｍｅ）７μｇと混合したこと以外はレーン１、３ ５、７と同じである。Ｔｐ％（モル比率）が７．７％未満の場合、ＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子には無視できる程度にリゾチームとの結合が生じる。
実施例１３
ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子−タンパク質結合のゲル電気泳動分析
ゲル移動およびタンパク質結合実験のプロトコールは実施例１２で説明したものと同じである。ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子での結果を図５に示す。図５ａでは、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護Ａｕナノ粒子７μＬを０．１ｍＭ以内でＥＧ３−ＳＨ／ＧＳＨ仕込み比３：１）とした場合がレーン１である。レーン２、３、４、５、６はそれぞれ、ＥＧ３／ＧＳＨ仕込み比が４、１４、１９ならびに純粋なＡｕ−ＥＧ３での同量のＡｕ粒子の場合である。ナノ粒子表面のＧＳＨの割合が小さくなるにつれて、ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子の移動速度が低下した。図５ｂでは、レーン１、３、５、７がそれぞれ、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、１、４、９、１４の仕込み比で、ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子７μＬを０．１ｍＭ以内で用いた場合である。レーン２、４、６、８はそれぞれ、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、１、４、９、１４の仕込み比でリゾジム（ｌｙｓｏｚｍｅ）７μｇと混合した、ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護Ａｕナノ粒子の場合である。この実施例では、ナノ粒子表面でのＥＧ３／ＧＳＨの比を測定しなかった。ＧＳＨ％（仕込みモル比率）が２０％未満の場合、ＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子には無視できる程度にリゾチームとの結合が生じる。
実施例１４
タンパク質との特異的結合を有するナノ粒子
ゲル移動およびタンパク質結合実験のプロトコールを実施例１１で説明したものと同じにした。実施例１２では、［ＥＧ３−ＳＨ］／［ＧＳＨ］の仕込み比が１４を超えるとＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子にリゾチームとの無視できる程度の結合が生じることが示された。仕込み比１９でナノ粒子には依然としてカソードへの相当な移動が見られたことから、このナノ粒子は表面にＧＳＨ分子を有することが分かった。このようなナノ粒子には、リゾチームのようなタンパク質との非特異的結合を排除し、特異的結合を可能にするという２つの機能があるのではないかと考えられる。図６は、このナノ粒子がＳＧＨ−ＧＳＴの相互作用によりＧＳＴタンパク質との特異的結合をなすことを示している。レーン１は、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、ＧＳＨ単層膜保護ナノ粒子を０．１ｍＭ以内で用いた場合である。レーン２はリゾチーム１０μｇを加えたこと以外、レーン３はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ５μｇを加えたこと以外、それぞれレーン１と同一である。レーン４、５、６は、［ＥＧ３−ＳＨ］１９／［ＧＳＨ］Ａｕナノ粒子を０．０１ｍＭ以内の濃度で用いたこと以外、レーン１、２、３と同様である。
実施例１５
ストレプトアビジンとの特異的結合を有するビオチン化ナノ粒子
ゲル移動およびタンパク質結合実験のプロトコールは実施例１２で説明したものと同じである。ビオチン化Ａｕナノ粒子（実施例１１から）には、リゾチームのようなタンパク質との非特異的結合を排除し、特異的結合を可能にするという２つの機能がある。図７は、このナノ粒子がビオチン−ストレプトアビジン相互作用によりストレプトアビジンタンパク質との特異的結合をなすことを示している。レーン１は、ナトリウムリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）１０μＬ中、０．１ｍＭ以内でのビオチン化ナノ粒子の場合である。レーン２、３、４はそれぞれ、ＢＳＡ１０μｇ、リゾチーム１０μｇ、ストレプトアビジン１０μｇを加えたこと以外、レーン１と同一である。このゲル実験から、ビオチン化Ａｕナノ粒子には、負に荷電したタンパク質であるＢＳＡならびに正に荷電したタンパク質であるリゾチームとの非特異的結合がなかったが、標的タンパク質であるストレプトアビジンとは強く結合したことが明らかになった。
ＣＣｌ３Ｄでの遊離トリエチレングリコールチオールの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ＤＭＳＯ−ｄ６でのトリエチレングリコール保護金ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ＤＭＳＯ−ｄ６でのトリエチレングリコールおよびチオプロニン混合単層膜保護金ナノ粒子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。ナノ粒子合成用のＥＧ３−ＳＨおよびＴｐのモル単位の仕込み比は４／１である。 混合単層膜保護ナノ粒子の形成時におけるＥＧ３−ＳＨとチオプロニンとの反応性をプロットするグラフである。 ナノ粒子表面上のＴｐの割合で制御されたＥＧ３／Ｔｐ混合単層膜保護ナノ粒子の変化と移動とを示すゲル電気泳動画像である。 図４（ｂ）に示すナノ粒子がリゾチームに結合した場合のゲル電気泳動画像である。 ナノ粒子表面上のＧＳＨの割合で制御されたＥＧ３／ＧＳＨ混合単層膜保護ナノ粒子の変化と移動とを示すゲル電気泳動画像である。 図５（ａ）のナノ粒子がリゾチームに結合した場合のゲル電気泳動画像である。 ＧＳＴタンパク質での仕込み比１９（［ＥＧ３−ＳＨ］／［ＧＳＨ］）でのＥＧ３およびＧＳＨの混合単層膜を有するナノ粒子の特異的結合を示すゲル電気泳動画像である。 ＥＧ３およびＧＳＨ−ビオチンの混合単層膜を有するナノ粒子とストレプトアビジンタンパク質との特異的結合を示すゲル電気泳動画像である。

Claims (16)

  1. 該当する配位子に対して特定の親和性を有する水溶性金属質ナノ粒子の集団を単離するための方法であって、
    ａ）
    ｉ）エチレングリコールを含んでなる遮蔽成分と、
    ｉｉ）該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、を含んでなる混合単層膜で各々コーティングされた多数の可溶性金属質ナノ粒子であって、各ナノ粒子の遮蔽成分と捕獲コーティング成分との比が異なる、前記可溶性金属質ナノ粒子を提供し、
    ｂ）いくつかのナノ粒子で非特異的配位子結合が生じ、かつ、他のナノ粒子では配位子結合が生じない時間および条件下で、（ａ）の各金属質ナノ粒子を多種多様な標準配位子の混合物と接触させ、
    ｃ）配位子結合が生じない（ｂ）のナノ粒子の第１の小集団を同定し、
    ｄ）ナノ粒子への配位子の結合が生じる時間および条件下で、（ｃ）のナノ粒子の第１の小集団を該当する配位子と接触させ、そして
    ｅ）ナノ粒子への配位子結合が特異的である（ｄ）のナノ粒子の第２の小集団を単離することを含んでなる方法。
  2. 単層膜中の遮蔽成分の量が約９０％から約１０％である、請求項１に記載の方法。
  3. 捕獲コーティング成分単層膜の量が約９０％から約１０％である、請求項１に記載の方法。
  4. 多種多様な標準配位子の混合物が、核酸と、タンパク質と、ペプチドと、よりなる群から選択される配位子を含有する、請求項１に記載の方法。
  5. タンパク質が、リゾチームと、ウシ血清アルブミンと、チトクロムＣと、よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 該当する配位子が、ペプチドと、タンパク質と、核酸断片と、コラーゲンと、ナノロッドと、ナノチューブと、ナノ平面と、ナノ繊維と、よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 配位子が結合対の一方のメンバーである、請求項１に記載の方法。
  8. 結合対が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、６×ヒスチジンＴａｇ／Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン／ビオチン、ビオチン／アビジン、Ｓ−タンパク質／Ｓ−ペプチド、クチナーゼ／ホスホネートインヒビター、抗原／抗体、ハプテン／抗ハプテン、葉酸／葉酸塩結合タンパク質、タンパク質ＡまたはＧ／免疫グロブリンよりなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 金属質ナノ粒子の金属が、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属で構成される合金よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記捕獲コーティング成分が、
    ａ）−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＣＨＯ−基、−ＯＨ基、−Ｘ（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）基、スクシンイミド基、エポキシ基よりなる群から選択される反応基を有する分子と、
    ｂ）ペプチド、チオプロニン、ＧＳＨよりなる群から選択される配位子と、
    よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記遮蔽成分が短鎖エチレングリコールオリゴマーである、請求項１に記載の方法。
  12. 短鎖エチレングリコールオリゴマーの分子量が絡み合い分子量未満である、請求項１１に記載の方法。
  13. 短鎖エチレングリコールオリゴマーが、テトラエチレングリコールチオールと、トリエチレングリコールチオールと、ジエチレングリコールチオールと、よりなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. ａ）該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分の単層膜をコーティングした水溶性金属質ナノ粒子を提供するステップと、
    ｂ）少なくとも１種の実質的に水混和性の有機溶媒と少なくとも１種の水性溶媒とを含んでなる、ｐＨが７．０未満の混合溶媒中で、（ａ）の被覆ナノ粒子を、金属結合官能基を有する遮蔽用コーティング成分と混合し、遮蔽用コーティング成分と捕獲コーティング成分との間で置換を発生させて混合単層膜のコーティングされたナノ粒子を形成するステップと、
    ｃ）場合により（ｂ）の混合単層膜コート金属ナノ粒子を単離するステップと、を含んでなるプロセスによって、水溶性金属質ナノ粒子に混合単層膜をコーティングする、請求項１に記載の方法。
  15. ａ）
    ｉ）金属塩と、
    ｉｉ）金属結合官能基を有する遮蔽成分と、
    ｉｉｉ）金属結合官能基を有し、かつ、該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、
    ｉｖ）好適な還元剤と、
    ｖ）少なくとも１種の実質的に水混和性の有機溶媒と少なくとも１種の水性溶媒とを含んでなり、ｐＨが７．０未満である混合溶媒と、を提供するステップと、
    ｂ）（ｖ）の混合溶媒中で要素（ｉ）〜（ｉｖ）を混合し、反応混合物であって、該反応混合物中の水の最終濃度が約９％から約１８％Ｖ／Ｖであり、混合単層膜が金属質ナノ粒子上に形成される、前記反応混合物を形成するステップと、
    ｃ）場合により（ｂ）の混合単層膜コート金属ナノ粒子を単離するステップと、を含んでなるプロセスによって、水溶性金属質ナノ粒子に混合単層膜をコーティングする、請求項１に記載の方法。
  16. ａ）
    （ｉ）金属塩と、
    （ｉｉ）金属結合官能基を有する遮蔽成分と、
    （ｉｉｉ）金属結合官能基を有し、かつ、該当する配位子に対する親和性を有する捕獲コーティング成分と、
    （ｉｖ）有機溶媒と、を含んでなる第１の反応混合物を提供するステップと、
    ｂ）水性溶媒中に好適な還元剤を含んでなる第２の反応混合物であって、ｐＨが７．０未満である第２の反応混合物を提供するステップと、
    ｃ）第１および第２の反応混合物を混合し、混合物中の水の最終濃度が約９％から約１８％Ｖ／Ｖであり、混合単層膜をコーティングした水溶性金属質ナノ粒子を形成するステップと、を含んでなるプロセスによって、水溶性金属質ナノ粒子に混合単層膜をコーティングする、請求項１に記載の方法。
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