CN103344576B - 一种用于溶菌酶检测的双输出传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于溶菌酶检测的双输出传感器及其制备方法和应用，其制备过程包括（1）制备3-叠氮-7羟基香豆素；（2）将1.0 mM丙炔胺与1.0 mM 3-叠氮-7羟基香豆素混合后，再加入0.1 mM CuSO4与0.5 mM抗坏血酸钠，室温培育10分钟，发生点击化学反应，生成三唑香豆素化合物；（3）制备直径为13 nm的金纳米粒子溶液；（4）将10 uM三唑香豆素化合物和100 uL金纳米粒子溶液在pH为7.5的10 mM 3-（N-吗啉基）丙磺酸缓冲溶液中混合2分钟，再加入0.25 mM聚乙烯吡咯烷酮。用肉眼观察到该传感器对溶菌酶检测的最低浓度为50 ng/mL，已成功应用于市场上鸡蛋蛋清液中溶菌酶含量的检测。本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用于溶菌酶检测的双输出传感器及其制备方法。
背景技术
溶菌酶全称为14-O-溶菌酶，又称N-乙酰基胞酸水解酶，等电点pI为11左右，是一种碱性水解酶，存在于微生物和多种动植物的组织及体液中。它可以裂解细菌细胞N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的-14-苷键，因而具有抗菌、抗肿瘤、抑制血管生成等活性，在生物体内具有重要作用。乳房炎是奶牛三大疾病之一，对奶牛业的影响很大，天然奶牛乳汁中的溶菌酶含量较低，可能是导致乳房炎高发病率的主要原因。同时，溶菌酶与各种肿瘤疾病也息息相关。有研究者报道称胃癌、大肠癌分泌的溶菌酶致使黏液癌细胞侵袭力强，是癌细胞转移率高的原因之一。
目前有很多基于溶菌酶与其适配体DNA的结合而提出的方法应用于溶菌酶的检测，例如荧光法、电化学法、电致化学发光法、酶联免疫法、表面等离子体共振法和毛细管电泳法。由于溶菌酶通常要耗费长时间与其适配体DNA结合，致使这些方法都需要大量的时间，并且操作也较为复杂，成本高，大大限制了其在现场检测和日常生活中的应用。而本发明则是通过金纳米颗粒颜色的变化以及三唑化合物的荧光强度的变化构建一种双输出传感器，对溶菌酶进行检测。该传感器成本低、灵敏度高、制备简单，可实现现场检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于溶菌酶检测的双输出传感器及其制备方法，本发明对溶菌酶的检测灵敏度高、特异性好；既可以通过比色检测，也能借助于荧光光谱和紫外光谱检测。从50 ng/mL到5.0 ug/mL浓度范围内对溶菌酶检测呈现良好地线性响应。其肉眼能观察到的最低浓度为50 ng/mL，荧光和紫外光谱的检测限为23 ng/mL。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于溶菌酶检测的双输出传感器的制备方法包括以下步骤：
（1）按照参考文献（Sivakumar, K.; Xie, F.; Cash, B. M.; Long, S.; Barnhill, H. N.; Wang, Q. A Fluorogenic 1,3-Dipolar Cycloaddition Reaction of 3-Azidocoumarins and Acetylenes. Org. Lett., 2004, 6, 4603-4606.）制备3-叠氮-7羟基香豆素；
（2）将1.0 mM丙炔胺与1.0 mM 3-叠氮-7羟基香豆素混合后，再加入0.1 mM CuSO4与0.5 mM抗坏血酸钠，室温培育10分钟，发生点击化学反应，生成三唑香豆素化合物；
（3）按照参考文献（Liu, D.; Chen, W.; Wei, J.; Li, X.; Wang, Z.; Jiang, X. A Highly Sensitive, Dual-Readout Assay Based on Gold Nanoparticles for Organophosphorus and Carbamate Pesticides. Anal. Chem. 2012, 84, 4185-4191.）制备直径为13 nm的金纳米粒子溶液；
（4）将10 uM三唑香豆素化合物和100 uL金纳米粒子溶液在pH为7.5的10 mM MOPS（3-（N-吗啉基）丙磺酸）缓冲溶液中混合2分钟，再加入0.25 mM聚乙烯吡咯烷酮，溶液呈现酒红色。
由于溶菌酶与金纳米颗粒表面结合能力大于三唑香豆素化合物的结合能力，致使溶菌酶加入至三唑香豆素化合物功能化的金纳米颗粒溶液中，溶菌酶取代了三唑香豆素化合物在金纳米颗粒表面的位置，使部分的三唑香豆素化合物回到溶液中，与金纳米颗粒表面的距离增大，不能发生荧光共振能量转移（FRET），导致先前被金纳米颗粒淬灭的三唑香豆素化合物的荧光得到恢复，并且观测到溶液颜色由酒红色变为蓝紫色。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明的三唑香豆素化合物合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制，得到的三唑香豆素化合物具有优良的光学性能和光稳定性。
（2）本发明的金纳米颗粒表面功能化方法简单、快速，得到的功能化的金纳米颗粒溶液稳定。
（3）本发明的双输出传感器在识别溶菌酶的过程中，除了溶液颜色发生变化外，紫外吸收光谱和荧光光谱也发生了明显的变化，其特征明显，有利于对溶菌酶的检测。
（4）紫外吸收光谱和荧光光谱具有操作简单、便捷、灵敏、成本低等优势。
附图说明
图1为本发明的双输出传感器对溶菌酶检测的示意图。
图2为本发明所述的双输出传感器在不同溶菌酶浓度中的紫外吸收光谱和荧光光谱。（A）该传感器在不同溶菌酶浓度中的紫外吸收光谱；（B）为（A）相应的紫外吸收强度的变化（吸光度526是指在526 nm处的紫外吸收强度），从a到i分别为0.0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL、1.0 ug/mL、2.5 ug/mL、5.0 ug/mL 和 10 ug/mL；（C）该传感器在上述不同溶菌酶浓度中的荧光光谱；（D）为（C）相应的荧光强度的变化（F0与F分别为溶菌酶不存在和存在时的荧光强度）。
图3为本发明所述的双输出传感器在其它不同蛋白质或氨基酸中的荧光光谱；从a到n分别为赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、细胞色素C、血红素、胰蛋白酶和溶菌酶；除细胞色素C（10 ug/mL）、胰蛋白酶（10 ug/mL）和溶菌酶（1.0 ug/mL）外，其他干扰物质的浓度为1.0 mg/mL。
具体实施方式
实施例1
按照参考文献（Sivakumar, K.; Xie, F.; Cash, B. M.; Long, S.; Barnhill, H. N.; Wang, Q. A Fluorogenic 1,3-Dipolar Cycloaddition Reaction of 3-Azidocoumarins and Acetylenes. Org. Lett., 2004, 6, 4603-4606.）制备3-叠氮-7羟基香豆素化合物。具体步骤如下：分别称取1.38 g 2,4-二羟基苯甲醛和1.12 g N-乙酰甘氨酸至50 mL无水乙酸钠中，并超声溶解，然后回流搅拌4 小时，反应完成后，所得混合物倒入冰水中，得到黄色沉淀，过滤取黄色沉淀，并用冰水清洗沉淀物，然后再在30 mL盐酸和乙醇的混合液（2：1）中回流1小时，反应完成后，采用冰浴将上述溶液冷却，并用20 mL冰水稀释上述溶液；加入20 mmol亚硝酸钠，搅拌10分钟后，再加入30 mmol 叠氮化钠，搅拌20分钟。经过滤，减压干燥后得到的棕色固体为3-叠氮-7羟基香豆素化合物：(0.97 g, 47.8%). 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 6.76 (d, J = 2.13 Hz, 1 H), 6.80 (dd, J = 8.47 Hz, J = 2.28 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 8.54 Hz, 1 H), 7.61 (s, 1 H), 5.23 (s, 1 H). IR (KBr, cm-1): 3159 (s), 2117 (vs), 1688 (s), 1617 (m), 1310 (s). MS (EIS) m/z: calculated for C9H5N3O3: 203.0, found 202.5 ([M]-); 238.1 ([M+ Cl] -)。
实施例2
三唑香豆素化合物功能化的金纳米颗粒溶液的制备，具体步骤如下：
（1）按照参考文献（Liu, D.; Chen, W.; Wei, J.; Li, X.; Wang, Z.; Jiang, X. A Highly Sensitive, Dual-Readout Assay Based on Gold Nanoparticles for Organophosphorus and Carbamate Pesticides. Anal. Chem. 2012, 84, 4185-4191.）制备直径为13 nm的金纳米颗粒溶液，具体步骤如下：先将制备过程中所用的圆底烧瓶、回流管等玻璃器皿用王水清洗干净，然后加入氯金酸（0.206 mg/mL）至25 mL水中搅拌、加热回流，沸腾后，加入1.0 mL 1.3%的柠檬酸钠溶液至上述的热水溶液中，继续加热回流，剧烈搅拌15分钟，此过程伴随着溶液颜色由浅红色变为酒红色。最后，将溶液停止加热回流，继续搅拌冷却至室温，将得到的13 nm金纳米颗粒溶液储存至4 oC备用。
（2）将1.0 mM丙炔胺与1.0 mM 3-叠氮-7羟基香豆素混合后，再加入0.1 mM CuSO4与0.5 mM抗坏血酸钠，室温培育10分钟，发生点击化学反应，生成三唑香豆素化合物；
（3）将（2）所得三唑香豆素化合物（10 uM）、100 uL（1）所得的金纳米颗粒溶液在pH为7.5的10 mM MOPS缓冲溶液中混合2分钟，再加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP, 0.25 mM）保护该功能化的金纳米颗粒不会发生团聚，得到三唑香豆素化合物功能化的金纳米颗粒溶液。此时该溶液颜色为酒红色，但是三唑香豆素化合物的荧光被金纳米颗粒所淬灭。
实施例3
用于检测溶菌酶的双输出传感器的制备方法：在三唑香豆素化合物功能化的金纳米颗粒溶液中加入不同浓度的溶菌酶，在摇床上振荡30分钟后，用肉眼观察到金纳米颗粒溶液颜色由酒红色逐渐变为蓝紫色，该过程伴随着荧光的恢复，分别采用荧光光谱和紫外光谱检测。发现其溶液荧光强度随着溶菌酶浓度的增加而逐渐增大，而且在526 nm处的吸光度逐渐减小，并且吸收波长逐渐向长波方向移动。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种用于溶菌酶检测的双输出传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备3-叠氮-7-羟基香豆素；
（2）将1.0 mM丙炔胺与1.0 mM 3-叠氮-7-羟基香豆素混合后，再加入0.1 mM CuSO4与0.5 mM抗坏血酸钠，室温培育10分钟，发生点击化学反应，生成三唑香豆素化合物；
（3）制备直径为13 nm的金纳米粒子溶液；
（4）将10 μM三唑香豆素化合物和100 μL金纳米粒子溶液在pH为7.5的3-（N-吗啉基）丙磺酸缓冲溶液中混合2分钟，再加入0.25 mM聚乙烯吡咯烷酮，溶液呈现酒红色。
2.一种如权利要求1所述的方法制得的用于溶菌酶检测的双输出传感器。
3.一种如权利要求1所述的方法制得的用于溶菌酶检测的双输出传感器的应用，其特征在于：通过比色法，或借助于荧光光谱和紫外光谱对溶菌酶进行检测。
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