JP2005532596A - 観察点の位置の急速な３次元変調が可能な光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

光ビームを拡散または放射可能である、試料(10)を観察するための光学顕微鏡は、試料(10)の観察エリアの実像または虚像の形成のための主光学システムを含む。また、対物レンズ(20)から実像面への、または、虚像の観察方向への主光路を備える。試料(10)の観察面の選択されたエリアの像を実像面または観察方向に向けるように作動可能な１以上の可動性のビーム迂回手段が主光路にそって挿入される。この顕微鏡には、光軸にそって試料(10)の観察面の位置を変調する追加の光学系(30)が配置され、試料の像が焦点で形成または観察される。好ましい実施の形態では、追加の光学系(30)は、ビームを主光路から前記の光路の補助的分岐へ迂回可能な光学ビーム分割手段(40)と、前記の補助的光路の長さを変調可能な可変配置の光学系(44，46)とを備え、光学ビーム分割手段(40)は、前記の変調ビームを主光路に再導入するために配置される。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、接眼レンズによりまたは共焦構成で使用するための、試料観察用の光学顕微鏡に関するものである。より具体的には、本発明は、試料の観察エリアの実像または虚像の形成のための主光学系を含み、光線を拡散または放射可能である、試料を観察するための光学顕微鏡であって、対物レンズから実像面への、または、虚像の観察方向への主光路を備え、試料の観察面の選択されたエリアの直接像（複数）を実像面または観察方向に向けるように作動可能な、可動性のビーム迂回手段が、前記の主光路にそって挿入される光学顕微鏡に関するものである。

たとえば細胞生物学の研究では、試料の観察において、異なる複数の観察面に像の焦点を合わすこと、および／または、粒子または細胞をその周囲の環境の中で追跡することが可能である必要があるが、そのため、視野の急速で正確な３次元スキャンを可能にする像形成のための光学機器を備えることが必要である。

自由粒子を追跡するために配置される顕微鏡において、顕微鏡の光学系は、その粒子のすべての運動に追従しつつ、その粒子を合焦状態に維持できなければならない。

顕微鏡の対物ユニットまたは試料スライドの移動が光軸方向に生じる伝統的な自動焦点技法（米国特許第５，４８３，０５５号公報、米国特許第４，０００，４１７号公報参照）を用いるとともに、観察面の円錐スキャン技法を用いることによりこれらの目的を達成することは、対物ユニットまたは試料スライドの慣性のため、２０ミリ秒〜１秒より短い時間で焦点化手段を調整することにより達成される３次元追跡を可能にしない。

このことは、接眼系を通して操作者が直接に観察する伝統的な顕微鏡にも、対象物（被写体）の観察点に共役な共焦開口のスキャンにより点ごとの（point-by-point）像の形成がよりよいコントラストと分解能で可能な共焦顕微鏡にも、当てはまる。

従来は、１つの粒子の３次元追跡を用いる観察は、また、一連の観察の焦点面の２次元スキャンにより検出される像の重畳により試料のある体積の像を構成することにより得られる。軸方向のスキャンは、アクチュエータにより顕微鏡の対物レンズを移動することにより起こり、そして、異なった面での像を撮影した後で、計算器は観察中の粒子の位置を決定する。この種の技術的解決は、米国特許第５，４８３，０５５号公報と、T. Ragan, P.T. So, K. Kwan and E. Gratton著の「２光子顕微鏡での３次元粒子追跡」（"3D Particle Tracking on the Two-Photon Microscope"）、（SPIE Vol. 4262 (2001)）に記載されている。
米国特許第５，４８３，０５５号公報 米国特許第４，０００，４１７号公報 T. Ragan, P.T. So, K. Kwan and E. Gratton, "3D Particle Tracking on the Two-Photon Microscope", SPIE Vol. 4262 (2001)

本発明の目的は、光軸に平行な方向における焦点位置の急速な変調と、光軸に直交する観察面におけるスキャンとを用いて、従来技術の欠点を避けた、任意の表面での観察と粒子の３次元追跡のための光学顕微鏡を提供することである。

本発明に係る顕微鏡は、
試料の観察のエリアの実像または虚像を形成する主光学系を含み、光線のビームを拡散または放射可能である、試料を観察するための光学顕微鏡である。この顕微鏡において、対物レンズから実像面への、または、虚像の観察方向への主光路を備え、試料の観察面の選択されたエリアの像（複数）を前記の実像面または観察方向に向けるように作動可能な、可動性のビーム迂回手段が、前記の主光路に挿入される。光軸にそって試料の観察のエリアの位置を変調する追加の光学系が前記の光軸にそって配置され、試料の像が焦点で形成または観察される。前記の追加の光学系は、前記のビームを前記の主光路から前記の主光路の補助的分岐へ迂回するように作動可能な光ビーム分割手段と、前記の光路の補助的分岐の長さを変調可能な可変配置を備える光学系とを備える。前記の分割手段は、ビームを前記の可変配置の光学系から前記の主光路へ前記の実像面または虚像の観察方向の方に再導入するように作動可能であり、前記のビーム迂回手段と前記の可変配置の光学系をあらかじめ決められたように移動可能なアクチュエータ手段を備える。

発明の個々の実施の形態は、特許請求の範囲において従属形式に記載された請求項に記載されている。

まとめると、本発明は、対物ユニットまたは試料・担体スライドの動きへの干渉なしに、当機器の焦点面を変調可能にする追加の光学系を、対物レンズの下流に、導入することにより、対物レンズにより集められた光ビームの光路を変更して実像面（共焦顕微鏡において）または観察方向（伝統的な顕微鏡において）に向けるという原理に基づく。

このシステムは、好ましい実施の形態では、レンズと、このレンズの焦点の近くに配置されるミラーとからなる補助光路を形成する。この光学系の光軸方向でのレンズとミラーとの相対的距離は、像の面に合焦された資料の観察面を変えるように、変化できる。

以下の説明において採用されている一般的な光学的定義では、屈折面と反射面の両方を含むシステムは、反射屈折光学系という。

別の実施の形態では、前記の補助光路は、複数のミラーのみからなり、この場合、整合のため反射光学系の名称を採用する。

補助光路の１つの変形は、反射屈折光学系と反射光学系の両方に適用可能であり、この系の素子の間に１対の回転可能なプリズムの介在のためにもうけられ、それは固定して維持される。

好ましくは、本発明による顕微鏡のアーキテクチャは、既知の２軸での円錐スキャンシステムを改良することにより、３軸での円錐スキャンを用いた自由粒子の追跡のための伝統的顕微鏡として、また、任意の観察面での像の検出と３次元円錐スキャンによる追跡のための共焦顕微鏡として、顕微鏡を形成することを可能にする。

以下、添付の図面を参照して、非限定的な例を用いた以下の一般的な説明により発明をより詳細に説明する。

図式的に示される図１において、被写体、より一般的には、観察中の試料は、１０で示されていて、たとえば、顕微鏡の外側の光源からくる光線により照射され、入射光を拡散でき、蛍光により光自体を放射できる。

この顕微鏡の光学系は、対物レンズ２０（ここでは１つのレンズで象徴的に表している）を備え、対物レンズ２０は、試料１０の近くに配置され、試料により拡散された光、または、試料から放射された光を集めて、平行な光または合焦された光を形成する。

この機器の光路は、光ビームを反射する一連の固定されたミラー２２，２４，２６と、視野レンズ２７とを備える。ミラー２２，２４，２６は、光路の最初の部分において、機器を小さくする目的でビームを折り曲げるために使用され、視野レンズ２７は、観察中の物体の像の視野を決定するため使用される。

可動性ミラー２８は、圧電位置決め装置により２つの直交軸の周りで傾動可能であり、光線の角度方向のずれを作るように作動可能である。この機能は、それぞれ１つの軸の周りで傾動可能な１対の可動性ミラーまたは１つの可動性レンズによっても同様に行える。

光軸にそって試料観察エリアの位置を調整するために動作する追加光学系３０は、光路の追加の分岐を挿入するように光路に挿入される。

ビーム分割器３２（たとえばダイクロイックミラー）は、追加光学系３０の下流の光路に、光ビームの一部を、操作者による機器を通しての直接観察を可能にする収集レンズ３４のほうに向けるように、また、入射光ビームの一部を、観察エリアに共役な共焦開口３６で透過するように、配置される。観測エリアの背後には光検出器３８がシステムの光軸にそって配置され、ある瞬間でのビームの光強度を検出可能である。

追加光学系３０は、ビーム分割器、たとえば部分反射ミラーまたは図示されている偏光プリズム４０と、ビームの偏光を変換する１／４波長板４２、収束レンズ４４、及び、レンズの焦点の近くに配置されたミラー４６を備える。

この好ましい実施の形態では、光軸に直交して配置されるレンズ４４とミラー４６の位置は、この軸に沿って移動することにより変えられる。この目的のため、レンズ４４は、圧電位置決め装置の上に取り付けられ、ミラー４６は磁気的位置決め装置の上に取り付けられる。または、その逆でもよい。しかし、この２つの素子のうち１つのみが移動可能であるというより単純な実施の形態も可能である。

図２に詳細に示される変形例において、レンズ４４とミラー４６は固定されていて、追加の分岐の光路を変えるために、１対の回転可能なプリズム４８がレンズ４４とミラー４６の間に配置される。

別のビーム分割器５０（多くの場合ダイクロイックミラー）は、たとえば蛍光を励起して、または、光学的閉じ込め技法（光学的ピンセット）を用いて粒子を捕らえることにより、光路にそって被写体を照射可能にするために、光路に挿入可能である。ビーム分割器５０は、それに関連する光源（図示しない）から光ビームを受け取り可能であり、また、光ビームを光学系の光軸にそって対象レンズのほうに反射可能である。また、被写体１０からくるビームの実像面への透過または対物レンズにより集められるビームの観察方向への透過も可能である。

対物レンズ２０の下流で、また、像収集及び偏向光学部品（素子２２，２４，２６，２７）の下流で挿入可能であるミラー５２は、これらの素子を排除し、これにより、顕微鏡が外部の画像形成光学素子、たとえば、反転顕微鏡の補助ポート、に結合可能になる。

図３に示される他の実施の形態では、追加光学系３０は、収束ミラー５５と、収束ミラーの焦点の近くに配置され光軸に沿って移動可能な面ミラー５７からなる。当業者は、図２の構造の変形を応用し、１対の回転可能なプリズムを複数のミラーの間に配置して、ミラー５７を動かさずに補助的分岐の光路長を変更することにより、ミラーのみの構成を容易に具体化できる

上述の顕微鏡の伝統的な像収集及びビーム偏向部の操作は、当業者に周知であり、したがって、ここでは詳細には説明しない。

対物レンズの像面に配置される視野レンズ２７は、対物レンズ２０の瞳の像を、可動性ミラー２８の上に形成し、観察エリア（視野）は、ミラー２８の位置により選択される。ミラー２８の変化する方向は、光軸に直交する観察面の探索を可能にする。

共焦開口３６と光検知器３８とからなる組み合わせは、共焦構成での被写体１０の観察と、ミラー２８の傾きの変化の際の観察面における強度分布のマップの形成を可能にする。

発明の主題を形成する追加の光学系３０は、開口に共焦的に共役な観察点の、光軸に平行な方向での移動の制御を可能にする。

詳細に説明すると、ビーム分割器４０は、ミラー２８により偏向されるビームを途中で遮り、素子４２，４６からなる補助光路のほうに向ける。

光ビームは、偏光プリズム４０を通り、線形偏光を持って現れ、直交方向の分極は反射により失われている。そして、１／４波長板４２は、線形偏光から円偏光への変換のために用意される。ミラー４６での反射は、円偏光の回転方向の変換を生じるが、ビームが１／４波長板４２を通ると、円偏光は次に線形偏光に戻される。最後に、分割プリズム４０は、入射する偏光ビームの全体を反射し、共焦開口３６により定義される実像面または収集レンズ３４により形成される虚像の観察方向のほうに、主光路にそってビームを送る。

本発明による顕微鏡が使用される用途の種々の網羅的でない例は、液体中の粒子および／または細胞の追跡、試料または任意の表面での試料の探索のための共焦技法を用いた像の形成、空間的に選択的な蛍光の追跡と同時性の励起、液体中の粒子の追跡および本質的に正しい位置関係の光学的捕捉を含む。

円錐スキャン技法を用いた自由な粒子の追跡の用途では、可動性素子２８，４４，４６（または２８，５５，５７）の位置は、被写体の観察点の位置を共焦開口３６に共役するように変化される。

これらの可動性素子のためのアクチュエータは、第１作動モードでは、ミラー２８の方向を調整し、かつ、光学系のレンズ４４〜ミラー４６（または、収束ミラー５５〜面ミラー５７）の空間的配置を変えるように配置される。これは、前記のエリアと観察面の観察点付近での交互の（必ずしも周期的でない）変位を生じて、３次元円錐スキャンを実現するようにするためである。さらに、第２作動モードでは、前記のアクチュエータは、ミラー２８の方位を変え、かつ、レンズ４４とミラー４６（または収束レンズ５５〜面ミラー５７）からなる系の方位を変えるように配置される。これは、観察対象の粒子の３次元追跡をするため、光検出器３８からの光強度分布信号の関数として前記のエリアと観察面の正確な変位を行うようにするためである。

開口３６と共焦的に共役な観察点の光軸に平行な方向への移動、すなわち、被写体１０の異なる観察面での焦点合わせは、レンズ４４とミラー４６（または収束ミラー５５と面ミラー５７）の間の相対的位置を変えることにより、または、図２の実施の形態では、１対のプリズム４８の調和した回転により、レンズとミラー（または２つのミラー）の間の光路長を変えるようにして、得られる。

観察点（視野）の位置は、系の光軸（一般的にｚ軸で示す）にそって、かつ、それに直交する観察面の複数の軸（一般的にｙ軸とｚ軸で示す）にわたって、ミラー２８と、収束ミラー５５と面ミラー５７により作られる反射屈折性光学系（または、収束ミラー５５と面ミラー５７により形成される反射光学系）の移動を、関連するアクチュエータ（図示しない）により制御することにより変調される。

もしこの変調が、周波数ｆのサイン法則により周期的であれば、系の対称性により、光検出器３８により集められる光の強度は、変調周波数の２倍である２ｆで変化する。たとえば観察中の被写体が変調軸にそって移動すると、１つの成分が、変調周波数ｆで検出された信号の中に現れ、その位相は変位の符号である。

変調信号に関して同期して信号を検出することにより、観察点を被写体に対して正しい位置関係に合わせるために可動性素子２８，４４，４６（または２８，５５，５７）に与える必要がある補正に比例したアナログ信号が、光検出器３８から得られる。

全体にまたは部分的にディジタルの解決に関して、好ましくは、検出された信号と、アクチュエータの制御信号の全体にアナログの処理は、ＡＤ変換の時間、計算時間および／またはＤＡ変換の時間が経過する必要がないので、非常に短い時間で追跡を達成できることを可能にし、そして、より高い正確さが、被写体の位置の決定における量子化雑音の介入がないことにより、得られる。こうして、３軸Ｘ，Ｙ，Ｚでの被写体の位置に比例した３つのアナログ信号が利用可能である。

周波数および／または位相において３軸に関連する信号を分離することにより（たとえば、面の周辺の探索をするように、光軸に直交する面の上での観察点の位置を同じ周波数で直交位相で変調することにより、そして、異なる周波数で光軸にそって観察点の位置を変調することにより）、同時に３軸に沿った被写体の追跡を行うことを可能にする。

任意の面の上で試料の探索の用途において、可動性素子２８，４４，４６（または２８，５５，５７）の位置は、共焦開口３６を被写体の観察点と共役するように調整される。空間における観察点の位置は、あらかじめ決められた規則によって変化する。

したがって、可動性素子のアクチュエータは、第３作動モードでは、ミラー２８の方位を調整するため、また、レンズ系４４〜ミラー４６の空間的配置を変えるために配置される。この配置は、あらかじめ決められた観察表面に属する曲線（光路）上で観察点の３次元変位を起こすように行う。

当然に、本発明の原理は同じであるが、実施の形態と構成の詳細は、非限定的な例を用いて説明のために記載した内容を、添付された特許請求の範囲に記載された保護範囲からはずれることなく、広く変えることができる。

特に、光軸に沿った他の調節を重畳するために、上述の追加の光学系を含む系に、他の複数の補助的分岐が、その下流に、追加できる。

本発明による顕微鏡の完全な光学系の好ましい実施の形態の図式的な図 変形実施形態による、図１に示された光学系の一部の図式的な図 光学系の一部の他の実施の形態の図式的な図

符号の説明

１０ 試料、 ２０ 対物レンズ、 ３０ 追加の光学系、 ４０ 光学ビーム分割手段、 ４４，４６ 可変配置の光学系。

Claims (23)

1. 試料（10）を観察するための、光線のビームを拡散または放射可能である光学顕微鏡であって、
   試料（10）の観察のエリアの実像または虚像を形成する主光学系を含み、対物レンズ（20）から実像面へ、または、虚像の観察方向への主光路を備え、試料（10）の観察面の選択されたエリアの像（複数）を前記の実像面または観察方向に向けるように作動可能な、可動性のビーム迂回手段（28）が、前記の主光路に挿入され、
   光軸にそって試料（10）の観察のエリアの位置を変調する追加の光学系（30）が前記の光軸にそって配置され、試料の像が焦点で形成または観察され、
   前記の追加の光学系は、
   前記のビームを前記の主光路から前記の主光路の補助的分岐へ迂回するように作動可能な光ビーム分割手段（40）と、
   前記の光路の補助的分岐の長さを変調可能な可変配置を備える光学系（44，46；55，57）とを備え、
   前記の分割手段（40）は、ビームを前記の可変配置の光学系（44，46；55，57）から前記の主光路へ前記の実像面または虚像の観察方向の方に再導入するように作動可能であり、
   前記のビーム迂回手段（28）と前記の可変配置の光学系（44，46；55，57）をあらかじめ決められたように移動可能なアクチュエータ手段を備える
   ことを特徴とする顕微鏡。
2. 請求項１に記載された顕微鏡であって、
   前記の主光学系の実像面の近くに配置され主光学系の光軸に配置され、ビームの光強度を瞬間的に検出する光検知手段（38）を含み、
   前記のアクチュエータ手段は、第１の作動モードにおいて、観察点の近くで観察の前記エリア及び面の交互の変位を起こして３次元スキャンを達成するように、前記のビーム分割手段の方位を調節するため、かつ、前記の可変配置の光学系（44，46；55，57）の空間的配置を変えるために配置される
   顕微鏡。
3. 請求項２に記載された顕微鏡であって、
   前記のアクチュエータ手段は、さらに、第２の作動モードにおいて、観察下の物体の３次元追跡を行うために、前記の光検出手段（38）により送られる信号の関数として前記のエリアと観察面の矯正的変位を行うように、前記のビーム迂回手段（28）の方位を調節し、かつ、前記の可変配置の光学系（44，46；55，57）の空間的配置を変えるように配置されることを特徴とする顕微鏡。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載された顕微鏡であって、
   前記の開口（36）の下流に配置された光検出手段（38）の方に光ビームの一部を透過可能にする、観察点に共役な共焦開口（36）を含み、
   前記のアクチュエータ手段は、さらに、第３の作動モードにおいて、あらかじめ決められた観察光路において前記の観察点の３次元変位を生じるように、前記の光ビーム迂回手段の方位を調節するため、かつ、前記の可変配置の光学系（44，46；55，57）の空間的配置を変えるために配置される
   顕微鏡。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載された顕微鏡であって、
   前記の可変配置の光学系は、収束レンズ（44）と、光軸に直交して配置され前記の収束レンズの焦点の近くに位置されるミラー（46）とからなる反射屈折システムである
   顕微鏡。
6. 請求項１〜４のいずれかに記載された顕微鏡であって、
   前記の可変配置の光学系は、第１の収束ミラー（55）と、この収束ミラーの焦点の近くに位置される第２の面ミラー（57）とからなる反射システムである
   顕微鏡。
7. 請求項５または６に記載された顕微鏡であって、
   前記のビーム分割手段は分極プリズムであることを特徴とする顕微鏡。
8. 請求項５または６に記載された顕微鏡であって、
   前記のビーム分割手段はダイクロイックミラーであることを特徴とする顕微鏡。
9. 請求項５または６に記載された顕微鏡であって、
   前記のビーム分割手段は、部分的に反射するミラーであることを特徴とする顕微鏡。
10. 請求項５または６に記載された顕微鏡であって、
    前記の追加の光学系は、さらに、前記のビーム分割手段（40）と前記の配置の光学系（44，46；55，57）との間に配置されて入射ビームの偏光の変換が可能な可変１／４波長板（42）を備える
    顕微鏡。
11. 請求項５に記載された顕微鏡であって、
    前記のアクチュエータ手段は、前記のレンズ（44）と前記のミラー（46）の間の相対的距離を変えように作動可能である
    顕微鏡。
12. 請求項１１に記載された顕微鏡であって、
    前記のアクチュエータ手段は、光軸にそって前記のレンズ（44）の移動を起こさせる磁気的または圧電性の位置決め装置である
    顕微鏡。
13. 請求項１１に記載された顕微鏡であって、
    前記のアクチュエータ手段は、光軸にそって前記のミラー（46）の移動を起こさせる磁気的または圧電性の位置決め装置である
    顕微鏡。
14. 請求項６に記載された顕微鏡であって、
    前記のアクチュエータ手段は、前記の収束ミラー（55）からの距離を変えるように、光軸にそって前記の面ミラー（57）の移動を起こさせる磁気的または圧電性の位置決め装置である
    顕微鏡。
15. 請求項５に記載された顕微鏡であって、
    前記の反射屈折システムは、前記のレンズ（44）と前記のミラー（46）の間に挿入された１対の回転可能なプリズム（48）を備える
    顕微鏡。
16. 請求項６に記載された顕微鏡であって、
    前記の反射システムは、前記の収束ミラー（55）と前記の面ミラー（57）の間に挿入された１対の回転可能なプリズム（48）を備える
    顕微鏡。
17. 請求項１５または１６に記載された顕微鏡であって、
    前記のアクチュエータ手段は、前記の１対のプリズム（48）の回転を行うように配置され、このプリズムを用いて光路の補助的分岐の長さが変化される
    顕微鏡。
18. 請求項１〜１６のいずれかに記載された顕微鏡であって、
    前記のビーム迂回手段は、２つの直交する軸の回りで回転可能な可動性のミラー（28）を備える
    顕微鏡。
19. 請求項１〜１７のいずれかに記載された顕微鏡であって、
    前記のビーム迂回手段は、直交する軸のそれぞれの回りで回転可能な１対の独立に動作する可動性ミラーを含む
    顕微鏡。
20. 請求項１８または１９に記載された顕微鏡であって、
    各々の可動性ミラーがそれぞれ圧電性または磁気的な位置決め装置により移動される
    顕微鏡
21. 請求項１〜２０のいずれかに記載された顕微鏡であって、
    操作者による観察のための接眼光学系（32，34）を含む
    顕微鏡。
22. 請求項１〜２１のいずれかに記載された顕微鏡であって、
    試料を同軸に照明するための照明手段を含み、この照明手段は、光路の中にあり光源から光ビームを受け取る光源およびビーム分割手段（50）を備え、前記のビーム分割手段（５０）は光ビームを光軸にそって対物レンズ（20）の方に反射し、かつ、実像面または対物レンズにより集められる光ビームの観察方向の方に透過する
    顕微鏡。
23. 請求項１〜２２のいずれかに記載された顕微鏡であって、
    顕微鏡を外部の画像形成光学系に結合するとともに対物レンズ（20）により集められたビームを除くための、対物レンズ（20）と上記のビーム分割手段（28）の間に挿入可能な反射素子（52）を含む
    顕微鏡。

Images