DE10043986B4

DE10043986B4 - Verfahren zur Untersuchung einer Probe und konfokales Scan-Mikroskop

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Publication number: DE10043986B4
Application number: DE10043986.1A
Authority: DE
Inventors: Dr. Engelhardt Johann; Dr. Hoffmann Jürgen; Dr. Knebel Werner
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2000-09-05
Filing date: 2000-09-05
Publication date: 2020-01-16
Anticipated expiration: 2020-09-06
Also published as: US6614031B2; DE10043986A1; US20020027203A1

Abstract

Verfahren zur Untersuchung einer Probe (11) mittels eines konfokalen Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für die Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11), mit den folgenden Verfahrensschritten:- Aufnehmen eines Voransichtsbilds (19, 30);- Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs (16, 17; 27, 28) im Voransichtsbild (19, 30);- Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28);- Beleuchten des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) der Probe (11) gemäß der Zuordnung, wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich (25) durchgeführt wird,wobei der Beleuchtungslichtstrahl (4) derart geführt wird, dass im Wesentlichen nur der markierte Bereich (24, 25) oder die markierten Bereiche (24, 25) der Probe (11) beleuchtet werden, wobei die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) oder zwischen den Bereichen (24, 25) von einer sägezahn-, sinus- oder mäanderförmigen Strahlablenkung abweicht undwobei während der Manipulation in mindestens einem Bereich (25) dieser Bereich (25) oder diese Bereiche (25) und/oder mindestens ein anderer Bereich (24) im Wesentlichen simultan beobachtet wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels eines konfokalen Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls für die Probe und einer Strahlablenkeinrichtung zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein konfokales Scan-Mikroskop mit mindestens einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls für eine Probe und einer Strahlablenkeinrichtung zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe.
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels eines Scan-Mikroskops und ein konfokales Scan-Mikroskop der eingangs genannten Arten sind aus der Praxis bekannt. In der bekannten Scan-Mikroskopie wird eine Probe mit einem Beleuchtungslichtstrahl für die Probe beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls wird im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in X- und der andere in Y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der die Strahlablenkeinrichtung im Wesentlichen bildenden Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt, wobei sowohl schnelle resonante als auch langsamere und genauere nichtresonante Galvanometer zum Einsatz kommen. Die Leistung des von der Probe kommenden Lichts wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahls bzw. Beleuchtungslichtstrahls gemessen.
Speziell in der konfokalen Scan-Mikroskopie wird eine Probe mit dem Fokus eines Beleuchtungslichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Lichtquelle auf eine Lochblende fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichts. Das Beleuchtungslicht bzw. der Beleuchtungslichtstrahl wird meist über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das von der Probe kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt in der meist üblichen Descan-Anordnung über dieselben Scanspiegel bzw. über dieselbe Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler und passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren, meist Photomultiplier, befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten der Probe zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Proben werden derzeit meist über das gesamte Scan-Feld hinweg mit Licht einer Wellenlänge oder simultan mit Licht mehrerer Wellenlängen beleuchtet. Aus diesem Grund werden Vergleichsuntersuchungen, die darauf abzielen, Proben unter unterschiedlichen spektralen Beleuchtungsbedingungen, jedoch unter sonst identischen Randbedingungen, zu untersuchen, sequentiell an einer Probe oder sequentiell an gleich präparierten Proben durchgeführt.
In der Zellbiologie werden Proben oft mit Verbindungen präpariert, die Calcium oder Aminosäuren wie Glutamat enthalten. Diese Verbindungen - Caged-Compound - bestehen zum einen aus dem „gefangenen“ Calcium oder Glutamat und zum anderen aus den sogenannten Komplexbildnern - in englischer Sprache: gelators. Diese Verbindungen können durch Einstrahlen von UV-Licht oder durch Zwei-Photonen-Prozesse aufgebrochen werden, wobei man hiervon einer Photoaktivierung spricht. Das freiwerdende Calcium oder das freiwerdende Glutamat ist dann in der Lage, weitere Reaktionen auszulösen.
Im Idealfall müsste die Bahn des abgelenkten Beleuchtungslichtstrahls auf der Probenoberfläche oder bei einer konfokalen Anordnung in einer Schichtebene in der Probe einen Mäander beschreiben. Dabei erfolgt zunächst ein Abtasten einer Zeile in X-Richtung bei konstanter Y-Position, anschließend eine Y-Verschiebung bei angehaltener X-Position und nachfolgend bei konstanter Y-Position ein Abfahren einer Zeile in negativer X-Richtung. In der Realität kann eine derartige Mäanderform aufgrund der Massenträgheit der bewegten Galvanometerbauteile und der Spiegel der Strahlablenkeinrichtung nur für geringe Scanraten annähernd erreicht werden. Tatsächlich beschreibt die Scanbahn des Beleuchtungslichtstrahls bei sinnvollen Scanraten von mehr als 100 Hz eine sinusähnliche Kurve, was eine Korrektur der sich daraus ergebenden Abweichungen vom Idealfall erforderlich werden lässt. So ist beispielsweise die Bahngeschwindigkeit in der Nähe der Umkehrpunkte niedriger als im linearen Sinusbereich, was unter anderem zu verstärktem Bleichen in diesen Bereichen führt. Es ist daher seit langem üblich, während des Durchlaufens der Umkehrteilstücke die Probenbeleuchtung mit Hilfe von mechanischen, das Bildfeld eingrenzenden Blenden oder durch geeignete optische Anordnungen - beispielsweise mit akustooptischen Modulatoren (AOTF) - zu unterbrechen. Diese Technik der Strahlunterbrechung während des Scannens wird Blanking genannt. Eine Anordnung mit mechanischen Blenden wurde bereits 1990 in einem konfokalen Laser-Scan-Mikroskop der Anmelderin eingebaut. Eine Anordnung mit einem akustooptischen Modulator ist in „Scientific and Technical Information Vol. XI, No. pp. 1, 9-19, Juni 1995, Leica TCS 4D UV - The system concept for Multiparameter Confocal Microscopy“ beschrieben. In dieser Schrift werden die sinusähnliche Bahnkurve und die damit verbundenen Probleme erklärt, wobei das Blanking jedoch nicht explizit erwähnt wird. Ein kontrolliertes Ausbleichen beliebiger vorbestimmbarer Probenbereiche mit Hilfe einer AOTF-Anordnung, die es ermöglicht, verschiedene Bereiche einer Probe mit unterschiedlicher Lichtintensität zu beleuchten, ist in „P. Wedekind et al: „Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging", Journal of Microscopy, Vol. 176, Pt 1, October 1994, pp 23-33“ beschrieben. Diese Schrift illustriert eine Blanking-Technik auf sehr hohem technischem Niveau.
Die DE 197 33 995 A1 zeigt des Weiteren ein Laser-Scanning-Ophthalmoskop (LSO). Das LSO besteht aus mindestens einer einen Laserstrahl erzeugenden Laserlichtquelle und mindestens einem ersten Scanmittel zur Erzeugung einer oszillierenden Strahlablenkung in einer ersten Richtung sowie mindestens einem zweiten Scanmittel zur Erzeugung einer oszillierenden Strahlablenkung in einer zweiten Richtung. Des Weiteren weist das LSO Detektionsmittel zur Erfassung des vom Auge rückgestrahlten Lichts auf. Das LSO weist eine Schnittstelle zu einem Bildschirm zur bildlichen Darstellung des von der Detektionseinheit detektierten Lichts auf, wobei mit einer PC-Maus ein Bildbereich auswählbar ist. Das erste und zweite Scanmittel kann einzeln oder gemeinsam über mindestens einen über eine Ansteuereinheit steuerbaren Antriebsmotor verschwenkt werden.
Die Offenlegungsschrift DE 198 29 981 A1 „Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie“, Carl Zeiss Jena GmbH, beschreibt die Vermeidung des Bleichproblems und zusätzlich die Vermeidung des Durchblutens dadurch, dass die spektrale Zusammensetzung und/oder die Intensität des in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelten Laserlichts verändert wird, während die Ablenkung ununterbrochen fortgesetzt wird, wodurch mindestens zwei nebeneinanderliegende Orte bzw. Rasterpunkte der Probe mit Licht unterschiedlicher Spektraleigenschaften und/oder unterschiedlicher Intensität beaufschlagt werden.
Bei dem bekannten Verfahren und bei dem bekannten konfokalen Scan-Mikroskop ist problematisch, dass nicht klar ist, wie ein auszuwertendes Detail einer Probe für eine differenzierte Beleuchtung auswählbar ist. Somit ist eine sichere Auswahl und Festlegung der interessierenden Details der Probe nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe und ein konfokales Scan-Mikroskop bereitzustellen, wonach eine sichere Definierung interessierender Details einer Probe für eine differenzierte Beleuchtung und Manipulation auf einfache Weise ermöglicht ist.
Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach weist das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte auf:
Zunächst erfolgt ein Aufnehmen eines Voransichtsbilds. Hierdurch wird eine bildhafte Darstellung der zu untersuchenden Probe für den Beobachter geliefert. Anschließend erfolgt ein Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild. Durch diese beiden Verfahrensschritte ist in erfindungsgemäßer Weise eine besonders einfache Auswahl und Festlegung eines interessierenden Details einer Probe ermöglicht. Der Beobachter muß lediglich das Voransichtsbild studieren, um dann eine Markierung im Voransichtsbild vorzunehmen.
Anschließend erfolgt ein Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich oder den Bereichen. Anschließend wird der Bereich oder werden die Bereiche der Probe gemäß der Zuordnung beleuchtet, wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich durchgeführt wird. Damit können ganz individuell ausgewählte Bereiche einer Manipulation unterzogen werden.
Weiterhin wird der Beleuchtungslichtstrahl zur Vermeidung einer unerwünschten Belichtung der Probe außerhalb des zu untersuchenden Bereichs oder der zu untersuchenden Bereiche derart geführt, dass im Wesentlichen nur der markierte Bereich oder die markierten Bereiche der Probe beleuchtet werden, wobei die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs oder der Bereiche oder zwischen den Bereich von einer sinus-, sägezahn- oder mäanderförmigen Strahlablenkung abweicht.
Des Weiteren wird während der Manipulation in mindestens einem Bereich dieser Bereich oder diese Bereiche und/oder mindestens ein anderer Bereich im Wesentlichen simultan beobachtet. Hierdurch wird der Nachteil vermieden, dass zwischen einer Manipulation und einer sequentiell erfolgenden Beobachtung Ereignisse auftreten, die nicht oder nur noch teilweise beobachtbar sind. Damit ist eine quasi simultane und ortsspezifische Manipulation und Beobachtung ermöglicht. Dabei ist es grundsätzlich auch möglich, denselben Bereich zu manipulieren und quasi simultan zu beobachten.
Nach dem Beleuchten des Bereichs oder der Bereiche der Probe könnte das von der Probe ausgehende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektiert werden. Damit könnte ein Übersichtsbild der Probe nach dem Beleuchten bereitgestellt werden.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens könnte der Beleuchtungslichtstrahl den kürzesten Weg zu dem ausgewählten Bereich oder den ausgewählten Bereichen oder zwischen den ausgewählten Bereichen überstreichen.
Im Konkreten könnte während der fortlaufenden Aufnahme eines Übersichtsbilds mindestens eines Bereichs durch gezieltes, vorzugsweise zeitlich begrenztes, Zuschalten des Beleuchtungslichts einer zweiten Lichtquelle, vorzugsweise eines Lasers, eine chemische Reaktion ausgelöst oder Verbindungen aufgebrochen werden. Bei den Verbindungen könnte es sich um Caged-Calcium- oder Caged-Glutamat-Verbindungen handeln. Hierbei könnte die Reaktion mindestens eines anderen Bereichs auf den Aufbruchsvorgang beobachtet werden. Die zweite Lichtquelle könnte ein Infrarot- oder UV-Laser sein.
Alternativ oder zusätzlich zu dem Auslösen einer chemischen Reaktion oder dem Aufbrechen von Verbindungen könnte die Manipulation das Herausschneiden von Teilen eines Zellkerns oder eines vollständigen Zellkerns umfassen. Auch diese Manipulation könnte während der fortlaufenden Aufnahme eines Übersichtsbilds in mindestens einem vordefinierbaren Bereich durch gezieltes, vorzugsweise zeitlich begrenztes, Zuschalten des Beleuchtungslichts einer zweiten Lichtquelle, vorzugsweise eines Lasers, erfolgen.
Derart herausgeschnittene Teile könnten mit einer Mikropipette abgesaugt oder mit einer Laserfalle abtransportiert werden. Je nach Erfordernis ist hier das geeignete Verfahren auszuwählen.
Im Konkreten ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Untersuchung der Informationsweitergabe von Zelle zu Zelle. Der Informationstransport von Zelle zu Zelle vollzieht sich zum einen durch elektrischen Informationsübertrag und zum anderen durch die Weitergabe von Neurotransmittern wie beispielsweise Calcium.
Im konkreten Anwendungsfall könnte in dem Voransichtsbild eine Zelle markiert werden. Eine derartige Zelle könnte beispielsweise mit einer Caged-Calcium-Verbindung präpariert sein.
Die Zelle könnte dann zu einem vorgewählten Zeitpunkt mit UV- oder Infrarot-Licht beleuchtet werden. Die Beleuchtung erfolgt dabei gezielt und ortsspezifisch.
Die obige Caged-Calcium-Verbindung könnte dadurch aufgebrochen werden und das frei werdende Calcium könnte eine Reaktion in der Zelle auslösen. Durch Beobachtung einer Nachbarzelle könnte die Informationsweiterleitung nachgewiesen werden. Hierzu könnte die Nachbarzelle im Konkreten mit einem Calcium-Indikator präpariert sein.
Es ist bekannt, dass die Reaktion der Nachbarzelle ausbleiben kann, wenn innerhalb eines bestimmten Zeitfensters die Reizinformation einer dritten Zelle eintrifft. Insbesondere zur Untersuchung dieser Phänomenologie könnte es hilfreich sein, quasi gleichzeitig oder definiert zeitversetzt eine Reaktion in zwei Zellen auszulösen. Auch dies wird durch das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht. Es ist des weiteren denkbar, abwechselnd verschiedene Rasterpunkte in den beiden Zellen zu beleuchten.
Sowohl in einer zweidimensionalen X-Y-Darstellung als auch in einer dreidimensionalen X-Y-Z-Darstellung könnte man den interessierenden Bereich oder die interessierenden Bereiche der Probe über einen Rechner und vorzugsweise eine Computermaus auswählen oder markieren.
Über einen derartigen Rechner könnte dann auch das Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich oder den Bereichen erfolgen.
Zur Vermeidung des Beleuchtens der Probe außerhalb des Bereichs oder der Bereiche könnte ein vorgebbares Blanking durchgeführt werden. Hierbei wird der Beleuchtungslichtstrahl während des Scannens gezielt unterbrochen, so dass die nicht markierten Bereiche gar nicht beleuchtet werden. Hierdurch wird oder werden der Bereich oder die Bereiche besonders hervorgehoben und der nicht markierte Restbereich der Probe nicht unnötig ausgeblichen.
Zur Erzielung eines höheren Kontrasts und zur Verringerung der Gesamtdatennahmezeit könnte oder könnten der Bereich oder die Bereiche im Vergleich zur verbleibenden Probe langsamer und mit erhöhter Photonenstatistik abgetastet werden.
Die Probe könnte außerhalb des Bereichs oder der Bereiche oder zwischen den Bereichen mit maximaler Ablenkgeschwindigkeit abgetastet werden. Eine weitere Reduktion der Gesamtdatennahmezeit könnte dadurch erreicht werden, dass die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs oder der Bereiche oder zwischen den Bereich von der sinus-, sägezahn- oder mäanderförmigen Strahlablenkung abweicht. Hierdurch könnten die Bereiche auf einem kürzeren Weg angefahren werden. Im Idealfall könnte die Strahlablenkung zwischen zwei oder den Bereichen im Wesentlichen in direkter Linie von einem Bereich zu einem anderen Bereich erfolgen.
Im Hinblick auf ein konfokales Scan-Mikroskop ist die obige Aufgabe durch ein konfokales Scan-Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 20 gelöst. Danach ist das konfokale Scan-Mikroskop der eingangs genannten Art durch Mittel zum Aufnehmen eines Voransichtsbilds und Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild gekennzeichnet, wobei dem Bereich oder den Bereichen individuelle Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zuordenbar und der Bereich oder die Bereiche der Probe gemäß der Zuordnung beleuchtbar sind und wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich durchführbar ist.
Weiterhin weist die Strahlablenkeinrichtung in besonders einfacher Weise Galvanometerstellelemente auf. Die Galvanometerstellelemente sind mit Hilfe eines Rechners steuerbar, mit dem die Strahlablenk-Geschwindigkeiten individuell an Erfordernisse bezüglich des markierten Bereichs oder der markierten Bereiche anpassbar sind.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung könnte während der Manipulation in mindestens einem Bereich dieser Bereich oder diese Bereiche und/oder mindestens ein anderer Bereich im Wesentlichen simultan beobachtbar sein.
Alternativ oder zusätzlich hierzu könnte nach dem Beleuchten des Bereichs oder der Bereiche der Probe das von der Probe ausgehende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektierbar sein.
Im Konkreten könnte das konfokale Scan-Mikroskop ein spektral selektives Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder - Wellenlängen aufweisen. Das spektral selektive Element könnte ein AOTF - ein akustooptischer einstellbarer Filter -, ein AOD - ein akustooptischer Deflektor -, ein EOM - ein elektrooptischer Modulator - oder ein mechanisches Bauteil sein. Akustooptische einstellbare Filter zeichnen sich durch hohe Flexibilität aus und ermöglichen es, die Beleuchtungslichtwellenlänge sehr schnell, d.h. im Bereich von µs, umzuschalten, Licht einer oder mehrerer Wellenlängen zuzuschalten oder die Lichtleistung zu variieren.
Ein derartiges spektral selektives Element könnte über einen Rechner, vorzugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar sein.
Des weiteren könnte das konfokale Scan-Mikroskop ein Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung aufweisen. Ein derartiges Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung könnte einen AOTF oder ein mechanisches Bauteil aufweisen. Auch das Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung könnte über einen Rechner, vorzugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar sein.
In besonders einfacher Weise könnte dasselbe Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder -Wellenlängen und zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung verwendbar sein. Hierbei kommt insbesondere ein AOTF in Frage.
Zur Bereitstellung mehrerer unterschiedlicher Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen könnten mehrere Laser zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen sein. Alternativ könnten auch ein oder mehrere Mehrlinienlaser zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen sein.
Zur Darstellung und Markierung des Bereichs oder der Bereiche könnte ein PC verwendbar sein, auf dessen Monitor das Bild oder Voransichtsbild der Probe angezeigt wird.
Die Markierung eines dreidimensionalen Bereichs oder dreidimensionaler Bereiche könnte in einer x, y, z-Darstellung oder in zweidimensionalen Schnittdarstellungen durchführbar sein.
Vorzugsweise werden zur UV-Beleuchtung blaue Halbleiterlaser oder Ar-Laser verwendet. Zur Beleuchtung im Infrarot-Bereich dienen vorzugsweise Ti:Saphir-Laser.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen

1 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops,
2 in einer schematischen Darstellung zwei mittels eines Monitors dargestellte markierte zweidimensionale Bereiche,
3 in einer schematischen Darstellung die markierten Bereiche gemäß 2 mit einer sinusförmigen Abtastbahn des Beleuchtungslichtstrahls für die Probe,
4 in einer schematischen Darstellung die markierten Bereiche gemäß 2, wobei die Bereiche spezifisch abgetastet werden,
5 in einer schematischen Darstellung zwei mittels eines Monitors dargestellte markierte dreidimensionale Bereiche und
6 in einer schematischen Darstellung drei Zellen, von denen zwei durch Einstrahlen von UV-Licht alternierend, quasi gleichzeitig manipuliert werden, während die dritte Zelle zur Beobachtung mit Licht im sichtbaren Spektralbereich abgetastet wird.

1 zeigt in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops zur Untersuchung einer Probe 11. Das konfokale Scan-Mikroskop weist eine Lichtquelle 1 in Form eines ersten Lasers auf. Das konfokale Scan-Mikroskop weist des weiteren einen zweiten Laser 2 in Form eines Multilinelasers auf. Die durch den ersten und den zweiten Laser 2 erzeugten Lichtstrahlen werden mittels eines Strahlvereinigers 3 zur Bildung des Beleuchtungslichtstrahls 4 vereinigt.
Der Beleuchtungslichtstrahl 4 durchläuft einen AOTF 5, der mittels einer AOTF-Hochfrequenz-Ansteuerung 6 betrieben wird. An den AOTF 5 schließt sich eine Strahlfalle 7 an. Das durch den AOTF 5 ausgewählte Beleuchtungslicht wird mittels eines Hauptstrahlteilers 8 auf eine Strahlablenkeinrichtung 9 reflektiert. An die Strahlablenkeinrichtung 9 schließt sich ein Objektiv 10 an, das das Beleuchtungslicht auf die Probe 11 leitet.
Des weiteren ist ein Detektor 12 für Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht vorgesehen.
Zur Steuerung der AOTF-Hochfrequenz-Ansteuerung 6 und der Strahlablenkeinrichtung 9 ist ein Steuerungsrechner 13 vorgesehen. Der Steuerungsrechner 13 ist mit einem PC 14 und einem Monitor 15 gekoppelt. Hierdurch sind eine Darstellung der Probe 11 und eine Markierung der interessierenden Bereiche mittels einer Computermaus 34 ermöglicht.
2 zeigt in einer schematischen Darstellung zwei mittels des Monitors 15 dargestellte markierte zweidimensionale Bereiche 16 und 17. Die Bereiche 16 und 17 sind mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu beleuchten. Der Bereich 16 ist der zu manipulierende Bereich, in dem eine Caged-Calcium-Verbindung aufgebrochen wird. In dem anderen zu beobachtenden Bereich 17 wird die Reaktion dieser Manipulation beobachtet. Zur Markierung der Bereiche 16 und 17 ist ein Mauszeiger 18 vorgesehen, der über das Voransichtsbild 19 führbar ist. Durch Drücken einer Maustaste während des Umfahrens der Bereiche 16 und 17 wird eine für den Benutzer sichtbare Umrandungslinie gezogen.
3 zeigt in einer schematischen Darstellung Probenbereiche 24 und 25, die den markierten Bereichen 17 und 16 gemäß 2 entsprechen, wobei das Scanfeld 20 entlang einer Scanbahn 23 sinusförmig abgetastet wird. Der Probenbereich 25 wird einer Beleuchtung 21 mit der Wellenlänge A1 unterworfen, wohingegen der Probenbereich 24 einer Beleuchtung 22 mit der Wellenlänge Ä2 unterworfen wird.
4 zeigt in einer schematischen Darstellung die Probenbereiche 24 und 25, wobei die Bereiche 24 und 25 spezifisch abgetastet werden. Hierzu ist eine bereichsangepasste Scanbahn 26 erzeugt. Die Strahlablenkung erfolgt zwischen den Bereichen 24 und 25 im Wesentlichen auf direktem Weg, was ein Bleichen von Probenbereichen außerhalb der Bereiche 24 und 25 verhindert und die Totzeit zwischen dem Abtasten der Probenbereiche 24 und 25 reduziert. Darüber hinaus kann zusätzlich der Beleuchtungslichtstrahl nach der Abtastung des Bereichs 24 mit Hilfe des AOTF 5 unterbrochen werden, bis die Abtastung des Bereichs 25 beginnt.
5 zeigt in einer schematischen Darstellung zwei mittels des Monitors 15 dargestellte markierte dreidimensionale Bereiche 27 und 28. Des weiteren ist ein Mauszeiger 29 zur Bereichsmarkierung gezeigt. Hierdurch ist ein dreidimensionales Voransichtsbild 30 gebildet. Auch hier sollen die Probenbereiche 27 und 28 mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge und/oder unterschiedlicher Intensität beleuchtet werden.
6 zeigt ein Bild mit drei Zellen 31, 32 und 33, wobei die Zellen 31 und 32 alternierend, quasi gleichzeitig durch Einstrahlen von UV-Licht manipuliert werden. Während dieser Manipulation wird die dritte Zelle 33 zur Beobachtung mit Licht im sichtbaren Spektralbereich abgetastet.
Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. des erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den Allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.
Bezugszeichenliste

1: Lichtquelle
2: zweiter Laser
3: Strahlvereiniger
4: Beleuchtungslichtstrahl
5: AOTF
6: AOTF-Hochfrequenz-Ansteuerung
7: Strahlfalle
8: Hauptstrahlteiler
9: Strahlablenkeinrichtung
10: Objektiv
11: Probe
12: Detektor
13: Steuerungsrechner
14: PC
15: Monitor
16: zu manipulierender Bereich
17: zu beobachtender Bereich
18: Mauszeiger zur Bereichsmarkierung
19: Voransichtsbild
20: Scanfeld
21: Beleuchtung mit Wellenlänge λ1
22: Beleuchtung mit Wellenlänge λ2
23: Scanbahn
24: Probenbereich, der zur Markierung 17 korrespondiert
25: Probenbereich, der zur Markierung 16 korrespondiert
26: bereichsangepasste Scanbahn
27: erster markierter dreidimensionaler Bereich
28: zweiter markierter dreidimensionaler Bereich
29: Mauszeiger zur Bereichsmarkierung
30: dreidimensionales Voransichtsbild
31: erste zu manipulierende Zelle
32: zweite zu manipulierende Zelle
33: zu beobachtende Zelle
34: Computermaus

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer Probe (11) mittels eines konfokalen Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle (1) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für die Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11), mit den folgenden Verfahrensschritten: - Aufnehmen eines Voransichtsbilds (19, 30); - Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs (16, 17; 27, 28) im Voransichtsbild (19, 30); - Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28); - Beleuchten des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) der Probe (11) gemäß der Zuordnung, wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich (25) durchgeführt wird, wobei der Beleuchtungslichtstrahl (4) derart geführt wird, dass im Wesentlichen nur der markierte Bereich (24, 25) oder die markierten Bereiche (24, 25) der Probe (11) beleuchtet werden, wobei die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) oder zwischen den Bereichen (24, 25) von einer sägezahn-, sinus- oder mäanderförmigen Strahlablenkung abweicht und wobei während der Manipulation in mindestens einem Bereich (25) dieser Bereich (25) oder diese Bereiche (25) und/oder mindestens ein anderer Bereich (24) im Wesentlichen simultan beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Beleuchten des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) der Probe (11) das von der Probe (11) ausgehende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass während der fortlaufenden Aufnahme eines Übersichtsbilds mindestens eines Bereichs (25) durch gezieltes, vorzugsweise zeitlich begrenztes, Zuschalten des Beleuchtungslichts einer zweiten Lichtquelle, vorzugsweise eines Lasers (2), eine chemische Reaktion ausgelöst wird oder Verbindungen aufgebrochen werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen Caged-Calcium- oder Caged-Glutamat-Verbindungen sind.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion mindestens eines anderen Bereichs (24) auf den Aufbruchsvorgang beobachtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Lichtquelle ein Infrarot- oder UV-Laser ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulation das Herausschneiden von Teilen eines Zellkerns oder eines vollständigen Zellkerns umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die herausgeschnittenen Teile mit einer Mikropipette abgesaugt oder mit einer Laserfalle abtransportiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Voransichtsbild (19, 30) eine Zelle markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle zu einem vorgewählten Zeitpunkt mit UV- oder Infrarot-Licht beleuchtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass durch Beobachtung einer Nachbarzelle (33) die Informationsweiterleitung nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass quasi gleichzeitig oder definiert zeitversetzt eine Reaktion in zwei Zellen (31, 32) ausgelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass abwechselnd verschiedene Rasterpunkte in den beiden Zellen beleuchtet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich (16, 17; 27, 28) oder die Bereiche (16, 17; 27, 28) über einen Rechner und vorzugsweise eine Computermaus (31) markiert werden.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28) über den Rechner erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zur Vermeidung des Beleuchtens der Probe (11) außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) ein vorgebbares Blanking durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Bereich (24, 25) oder die Bereiche (24, 25) im Vergleich zur verbleibenden Probe (11) langsamer und mit erhöhter Photonenstatistik abgetastet wird oder werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (11) außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) oder zwischen den Bereichen (24, 25) mit maximaler Ablenkgeschwindigkeit abgetastet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkung zwischen zwei oder den Bereichen (24, 25) im Wesentlichen in direkter Linie von einem Bereich (24, 25) zu einem anderen Bereich (25, 24) erfolgt.
Konfokales Scan-Mikroskop, zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit mindestens einer Lichtquelle (1)zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für eine Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11), gekennzeichnet durch Mittel zum Aufnehmen eines Voransichtsbilds (19, 30) und Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs (16, 17; 27, 28) im Voransichtsbild (19, 30), wobei dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28) individuelle Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zuordenbar und der Bereich (24, 25) oder die Bereiche (24, 25) der Probe (11) gemäß der Zuordnung beleuchtbar sind, wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich (25) durchführbar ist, wobei die Strahlablenkeinrichtung (9) Galvanometerstellelemente aufweist und wobei die Galvanometerstellelemente mit Hilfe eines Rechners (13) steuerbar sind, mit dem die Strahlablenk-Geschwindigkeiten individuell an Erfordernisse bezüglich des markierten Bereichs oder der markierten Bereiche anpassbar sind.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass während der Manipulation in mindestens einem Bereich (25) dieser Bereich (25) oder diese Bereiche (25) und/oder mindestens ein anderer Bereich (24) im Wesentlichen simultan beobachtbar ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Beleuchten des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) der Probe (11) das von der Probe (11) ausgehende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektierbar ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein spektral selektives Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder -Wellenlängen vorgesehen ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element ein AOTF (5), ein AOD, ein EOM oder ein mechanisches Bauteil ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element über einen Rechner (13), vorzugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass ein Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung vorgesehen ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Element einen AOTF (5) oder ein mechanisches Bauteil aufweist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Element über einen Rechner (13), vorzugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass dasselbe Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder - Wellenlängen und zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung verwendbar ist.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Laser (2) zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls (4) vorgesehen sind.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Mehrlinienlaser zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls (4) vorgesehen sind.
Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass zur Darstellung und Markierung des Bereichs (16, 17; 27, 28) oder der Bereiche (16, 17; 27, 28) ein PC (14) verwendbar ist, auf dessen Monitor (15) das Bild oder Voransichtsbild (19, 30) der Probe (11) angezeigt wird.
Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung eines dreidimensionalen Bereichs oder dreidimensionaler Bereiche in einer x, y, z-Darstellung oder in zweidimensionalen Schnittdarstellungen durchführbar ist.