JP2000509842A - 顕微鏡における多軸検査用偏光装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、顕微鏡で多軸観察を行うための偏光装置において、ある場合には、試料をいくつかの側から照射および／または観察することが可能で、また、ある場合には、光の照射軸に対しある角度で試料を観察することが可能となる顕微鏡の多軸観察用偏光装置に関する。この場合、手持ちの顕微鏡と、対物レンズと顕微鏡の焦点面との間に設置される本発明による偏光装置とで試料を観察することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 顕微鏡における多軸検査用偏光装置 本発明は、顕微鏡において試料を多軸検査するため、ある場合には、複数の方 向から一つ以上の光束を試料に照射および／または試料を観察し、またある場合 には、照射軸に対し一定の角度からその試料を観察することを可能にする多軸検 査用偏光装置に関する。本発明による偏光装置は、従来の遠視野光走査型顕微鏡 に取付可能で、顕微鏡の対物レンズとその焦点面の間に置かれる。この装置は、 試料と対物レンズの自由作動距離の大きさの割合に調整される。 科学技術文献にて共焦点式顕微鏡が知られており、これによると光軸に沿って の解像度（軸解像度）が示され、明確に焦点深度の浅くなった画像を生じさせる ことができる。しかし、この顕微鏡の対物レンズは、全立体角の一部だけしか把 握せず、そのため１点から全方向へ照射された光のほんの一部しか捕足すること ができないという問題点がある。このため実際の解像度は、少なくとも１／３程 度に低下し、一般にその比率はさらに低下する。 軸方向の解像度を補足的に向上させるために、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４０４０ ４４１で、二重共焦点による光走査型顕微鏡が提案されているが、この顕微鏡で は、物体面のもう一つの側に第２の対物レンズを使用するのが特徴である。そし てその場合、両対物レンズが、共通対象点を照射および／またはその点から出射 する光を検出している。その対象物が対物レンズ経由で可干渉的に照射されると 、光軸に沿った干渉のため観察ボリュームは減少する。この観察ボリュームの減 少が、解像度の改善と同義である。 これ以外に、ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３から光走査型顕微鏡が知ら れており、この方式では、少なくとも二つの対物レンズが、一つの物点を同時に 照射および／またはそこから出射する光を集光して、少なくとも、二つの対物レ ンズの光軸が一致しないような方法で配置されている。さらに、２重共焦点光走 査型顕微鏡の場合と同様に、一方の対物レンズを透過した光が、他の対物レンズ の一つを透過した光と干渉するように、対象物および／または少なくとも一つの 光検出器の所で可干渉的に重ねる方法で干渉可変手段を設けることができる。 特にドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３で知られている光走査型顕微鏡には 、二つの対物レンズが設けられ、両者の光軸は互いに直交し、第１の対物レンズ が試料の照明用に、第２の対物レンズが試料の観察用に使用されている。照明用 に使用する対物レンズの光軸として定義される照射軸と、観察用に使用する対物 レンズの光軸として定義される観察軸との両軸で構成する垂直構造により、解像 度の改善が達成される。 高解像度は次のような方法で実現される。 すなわち、焦点領域での光の強度分布が照射の点像消去関数（以下ＰＶＦとい う）により記述される。焦点領域から反射する光の検出確率は、検出孔絞りを使 用する場合、観察のＰＶＦで記述される。共焦点式顕微鏡のＰＶＦは、照射のＰ ＶＦと観察のＰＶＦとの積である。この関数が増大するほど、顕微鏡の解像度は 悪くなる。照明軸と観察軸相互間の構造を直交に近づけることにより、照射軸に 沿った照射ＰＶＦの広い範囲が、この観察軸に沿った観察ＰＶＦのわずかな範囲 で補償されるので、三つのすべての空間軸に沿ってほぼ同程度によい解像度が得 られる。 さらにドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３から知られているもう一つの光走 査型顕微鏡の実施例によれば、三つの対物レンズが設置され、２個の対物レンズ の光軸は互いに直交しており、一方、第３の対物レンズの光軸は、他の両対物レ ンズのいずれかの軸上にある。この場合、いずれか一つの対物レンズを透過した 光は、他の二つの対物レンズのいずれかを透過した光と、対象物および／または 一つの検出器の所で干渉するように可干渉的に重畳される。照明光を干渉させる 場合、高解像度は次の方法で実現される。すなわち、照明光の光束が可干渉的で ある限り、照明光のＰＶＦは、対向方向から到来する両照明光の光束により干渉 縞を貫く照明光の光軸に沿って変調される。両照明光の部分光束が焦点で丁度ゼ ロ、または２¹の整数倍である場合には、幾何学的焦点における干渉は具体的に 有形で、照明光のＰＶＦは、空間的により強く限定された主極大と照明光の光軸 に沿ったいくつかの副極大から構成されている。そしてこれらの副極大を抑制で きない場合には、解像度は悪化するであろう。照明光のＰＶＦと観察光のＰＶＦ との積である共焦点のＰＶＦは、同様に照明光の光軸に沿った干渉により変調さ れる。しかしながら、これらの副極大は、第３の対物レンズによる垂直方向から の観察により抑制されるので、共焦点のＰＶＦは軸上の拡張性を有し、これは基 本的に照明光ＰＶＦの主極大の拡張性により決定される。これは高い解像度と同 義である。 これ以外に、ドイツ特許願１９６２９７２５．７からは、二つの対物レンズを 有する２重対物レンズシステムが知られているが、このうちに一つは照明光の焦 光用として、他の一つは観察光の集光用として作用している。そしてこの場合第 ２の対物レンズの観察軸は、第１の対物レンズの照明軸に対してある一定の角度 を有する。これによりドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている光 学的原理に従い、解像度の改善が達せられる。ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述 されている照明光と観察光の光路を完全分離する構造とは対照的に、特許願１９ ６２９７２５．７からの２重対物レンズシステムは、ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３ に記述されている光学的原理を既存の顕微鏡に適用して実現可能にする。この場 合、従来の光学式顕微鏡では一般的であった単一対物レンズは、２重対物レンズ システムに取って替わられる。 これとは対照的に、本発明では、ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている 光学的原理が、単一対物レンズのみを有する既存の光走査型顕微鏡に対して、ど のようにして実現可能かという一つの方法が挙げられている。 本発明の根拠となる課題は、偏光装置を提案することにあり、その装置は、あ る場合には、複数の側から一つ以上の光束を試料に照射し、および／または複数 の側から一つ以上の光束で試料を観察し、またある場合には、照明軸に対し一定 の角度からその試料の観察を可能にする。それによって、ＤＥ−ＯＳ４３２６４ ７３に記述されている光学的原理に従い解像度ができる限り改善され、共焦点観 察ボリュームは周知の比較可能な光走査型顕微鏡のそれよりも小さくなる。この 課題は、１個の対物レンズを有する既存の光走査型顕微鏡に同偏光装置が取付ら れるように設計することである。 この課題を解決するためには、本発明は、平行化され、対物レンズへ入射する 入射光の光束が、対物レンズの入射開口での入射角に従い焦点にある試料を別の 方向（この方向が照明軸）から照射し、焦点から反射される光束は、方向（この 方向が観察軸）に従い別の異なる反射角の平行光線として対物レンズから離れる ことになるような方法で、この偏光要素（鏡）を顕微鏡の対物レンズとその焦点 面との間に配置する。 特にこの偏光要素は、達成しようとする高解像度を考慮して、照明軸と観察軸 が互いに直交するように光路中に配置される。しかし、本発明の特長は、この角 度が直角から大きく外れない限り十分に達成可能である。この偏光要素は、構造 上特に偏光装置に組み込まれる。 本発明による偏光装置は、蛍光顕微鏡に取付可能である。また、この装置は、 投光照明で機能する顕微鏡にも設置可能である。 使用される対物レンズとして重要なことは、カバーグラスの使用に対して補正 されない、より高い開口数をもつ対物レンズである。そのとき試料は特に薄い毛 細管の先端に準備される。カバーグラスの使用に対して補正されない対物レンズ を使用する場合、カバーグラスはその対物レンズと本発明による偏光装置、また は試料との間に挿入することができる。液浸媒体の使用を必要とする対物レンズ を使用する場合には、対物レンズと試料の間の空間は、液浸媒体で満たすことが できる。 利点としては偏光装置が顕微鏡のスライドテーブル上に設置されるスライドホ ルダー上にあることである。これにより、高速偏光装置はスライドテーブルを動 かすことで調整することができる、試料の移動は、スライドテーブルに左右され ない追加的な移動調整要素による。この移動調整要素では、焦点による試料の走 査が３次元で可能となり、それにより試料を１次元以上の高解像度で撮影するこ とができるようなスライドテーブルが重要となる。 本発明について、添付図に基づき下記により詳細に説明する。 図１ ：本発明による偏光装置で、特に他に優先した実施形式におけるビーム 光路の概略図。この場合、試料はあるひとつの方向から照射され、観察は照射軸 に対して直交方向から行うことができる。そしてこの場合、この方向は対物レン ズの光軸を含む平面内にある。 図２ ：本発明による偏光装置で、特に好適な実施形式におけるビーム光路の 概略図。この場合、試料は二つの正反対の方向から照射され、観察は照射軸に対 して直交してに行うことができる。 図３ ：本発明による偏光装置で、特に好適な実施形式における光束の光路の 概略図。この場合、試料はある一つの方向から照射され、観察は照射軸に対して 直交方向から行うことができる。そしてこの場合、この交点は対物レンズの光軸 が垂直に立っている平面内にある。 図１は、本発明による偏光装置の代表的な実施例を示し、この場合、照射軸と 観察軸が互いに直交し、その交点は、対物レンズの光軸を含む１平面内にある。 照光レンズ２７、２８、レンズ２３、および反射鏡２４を経由してくる光源３１ からの照射光束の光路１は、３本の透過光、すなわち１本の中心光２と２本の周 縁光３、４で示されている。照射光は、焦点距離６内の顕微鏡の対物レンズ５に よりその焦点面内に焦点を結び、各光線２，３，および４は、もしビーム偏光装 置がなければ、焦点面６上の点７で交差する。この光線の流れは部分的に細い実 線で示されている。対物レンズ５と焦点面６との間に、対物レンズ５の光軸が垂 直となる面に対して角度がα１およびα２となり、かつ光線の方向を変更する少 なくとも二つの鏡面からなる、本発明による偏光装置８が設置された場合、光線 ２，３．および４は反射され、点９に集光する。中央の光線２は、照射軸を示し ている。 平行化された照射光が顕微鏡の開口１０へ入射（入射角β₁）する場合、焦点 面上６の仮想焦点７は、対物レンズ５の光軸上にはない。偏光装置８が焦点面６ に対応する距離と傾斜角α₁により、たとえば焦点９が対物レンズ５の光軸上に 来るようにすることができる。 観察光の光路１１は、照射光の光路１に対して部分的に対称に構築可能である （点線で示してある）。照射光の焦点９から出射する中央の光束１２は、観察軸 の状態も示し、一方、周縁光１３および１４は、本発明による偏光装置８へ当た り、そこで反射される。これらの光線は、対応する焦点面６と偏光装置との距離 と顕微鏡の対物レンズ５に対して光束ビーム偏光装置８がなす傾斜角α_２により 平行光線となる。光束１２、１３、および１４は、入射角β₂で対物レンズ５の 出射開口を通過しレンズ２３、およびレンズ系２５、２６を経由してあらかじめ 設けられているピンホール２９を有する検出器３０へ達する。偏光装置がなけれ ば、光束１２、１３、および１４は、焦点面６上の点１５に集光するはずである 。この光線の流れは図では細い点線で示してある。 都合良く構造は対称となり、α₁とα₂は同じ値を有する。α₁とα₂の角度がそ れぞれ２２．５度の場合、照射軸と観察軸とを定義付ける中央光２と１２は、互 いに直交する。 照射軸と観察軸が互いに直交するためには、焦点９は顕微鏡の対物レンズ５の 光軸上にあってはならない。対物レンズの光軸上にあると、構造上対称性が失わ れる。対照的構造は、焦点距離９とビーム偏光装置８の鏡面との距離が大きいの で、利点となる。 偏光装置８は、特に可動なので、照射光および観察光の両焦点は調整可能であ る。特長として、傾斜角α₁とα₂は可変である。 照射光と観察光が顕微鏡５の入射、または出射開口１０へ達するときの入射角 は、それぞれβ₁とβ₂である。好都合にも、この両角度は等しい。照射光と観察 光の流れは、一般の光走査型顕微鏡で光走査する場合の光束の光路に対応してい る。一般に、この型の顕微鏡では、照射光と観察光の光路は同じ流れである。本 発明にしたがう偏光装置を適用する場合、両光束の分離は、たとえば適当な点光 源と点検出器（図示になし）の移動により達成可能である。 検査すべき試料は、照射光と観察光の共焦点９に置かれる。１次元、２次元、 あるいは３次元での試料の完全撮影は、試料の走査（物体走査）、または試料を 通しての共焦点９による走査（光走査）のどちらかによって達成できる。物体走 査が一つ以上の軸に沿って実行さる場合、試料はテーブル２１の上に置かれる。 すなわち、ここではホルダー２１の上に置かれ、これにより試料を走査テーブル ２２上へ都合良く任意に移動または回転することができる。光走査が行なう場合 は、既存の顕微鏡の走査装置が、照射光と観察光の光路を、制御された条件の下 に試料が照射光と観察光の焦点を動かすという周知の方法で動かす。物体走査と 光走査は組み合わせることができる。 本発明によるこの実施例の偏光装置を通常の顕微鏡に装備することにより、ド イツ特許ＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述されている周知の光走査型顕微鏡の原 理に従い、遠視野光学式顕微鏡で干渉を使用せずに得られる範囲では最高の解像 度を有する撮影が可能となる。 図２は、本発明偏光装置の代表的な実施例を示す。この実施例では、試料は正 反対の二つの方向から照射され、観察は照射光軸に対して直角の方向で行われる 。この場合、解像度が改善される焦点範囲で照射光の干渉が利用される。 照射光１は、図１の場合と同様に通過する３本の光線２、３、および４で示さ れている。入射開口１０へ傾斜して入射する照射光（入射角β₁）は、顕微鏡５ の対物レンズにより焦点を結ぶ。光線２、３、および４は本発明による偏光装置 ８により反射され点９に集光する。第２の照射光１６は３本の破線１７、１８、 および１９により示されている。この照射光はいずれにしても入射開口１０へ傾 斜して入射し（入射角β₃）、焦点面６上の仮想焦点２０へ焦点を結ぶ。これら の光線１₇、１８、および１９は、本発明による偏光装置により反射され、偏光 装置８と焦点面６間の適切な距離、および偏光装置８の適切な傾斜角α₂により 第１の光線９の照射焦点に焦点が結ばれる。 観察光の光路１１は、図１の場合と同様に点線で示されている。照射光の共焦 点₉から出射する光線１２、１３および１４は、この発明による偏光装置８によ り焦点面６の対応する距離に反射され、顕微鏡の対物レンズで平行光線となる。 都合良く構造は対称的となり、α₁とα₂は同じ値を有する。α₁とα₂の角度が それぞれ４５度の場合、両照射軸を定義付ける中心光２と１７は、照射光焦点９ で互いに向きが正反対で集光する。角度α₂＝０°の場合には、図１に示した本 発明の実施例の構造と一致する。 両照射光が顕微鏡対物レンズ５の入射開口１０へ入射する入射角は、β₁およ びβ₃である。特にこの両角度の値は同じである。観察光は、反射角β₂で対物レ ンズ５の開口１０を離れる。好都合にも、この角度の値は９０°である。両照射 光の流れは、通常の走査型顕微鏡で光走査する場合の流れに相当する。本発明に よる偏光装置を適用する場合、両照射光の分離は、たとえば二重点照射光源、ま たは顕微鏡内の共通照射光内にあるプリズムによって達成可能である。 照射と観察は、また入れ替え可能である。すなわち、両照射光の光路は、両観 察光の光路としても使用可能であり、また観察光の光路は照射光の光路としても 使用可能である。そしてその場合、試料は正反対の二つの方向から照射光に直角 な方向で観察される。 検査すべき試料は、図１の場合と同様に、照射光と観察光の共焦点９に置かれ る。１次元、２次元、あるいは３次元での試料の撮影は、主として一つ以上の軸 に沿った物体走査により可能となる。 本発明によるこの実施例での偏光装置を通常の顕微鏡に装備することにより、 ドイツ特許ＤＥ−ＯＳ４０４０４４１、およびＤＥ−ＯＳ４３２６４７３に記述 されている周知の光走査型顕微鏡の原理に従い、遠視野光学式顕微鏡で干渉を使 用して得られる最高解像度による撮影が可能となる。 図３は、本発明による偏光装置の代表的な実施例を示し、この実施例では照射 軸と観察軸は互いに直交している。そしてこの場合、その交点は、対物レンズの 光軸と垂直を成している平面内にある。図は、実施例を上部から（対物レンズの 光軸に沿って）見た場合（左）と側面（図１、２と同様）から見た場合を示して おり、この場合、断面は、左方から見た図に点線で示した線ＡＢＣ沿って図示さ れている。 照射・観察光１および１１は、図１の場合と同様に図示されている。平行光線 となった照射光（２、３、および４）は、対物レンズ５の入射開口１０に対し傾 斜して入射する（入射角β１）。本発明による偏光装置８で照射光２、３、およ び４を偏光させることにより、対物レンズ５を経た光は、照射光焦点９に焦点を 結ぶ。ここで偏光が生じ、中心光２は反射後対物レンズ５の光軸に対し垂直方向 へ進む。 照射光焦点９から出ていく観察光１２、１３、および１４は、偏光装置８へ反 射され対物レンズ５によって平行になる。観察光１２、１３、および１４の流れ は照射光２、３、および４の流れに相当する。これにより観測が行われ、中心の 観察光１２は、焦点９と偏光装置８への衝突の間、中心照射光１２に垂直に、そ して対物レンズ５の光軸に対しても垂直に進む。この場合、照射軸と観察軸との 交角は、角度ＣＡＢである。 観察光は、反射角β₂で出射開口１０を通過して進む。この反射角β₂は図１に おける実施例とは対照的に入射角β₁を含む平面（点Ａと対物レンズの光軸の間 に張られた平面）内にはなく、点Ｃと光軸との間に張られた平面内にある。 この特別な実施例では、角度α１およびα２は、同じ値を有し、同様に、角度 β₁およびβ₂も同じ値である。 これらの特別な実施例は、偏光装置を拡張することにより３本か４本の光線が 焦点９で集光するようにすることができる。そのために、α１またはα２だけ傾 斜した偏光要素（鏡面）に対し一つ、または二つの傾斜した偏光要素を追加する ことができる。図２と図３の実施例の組み合わせにより、５本の光路が、共焦点 ９で集光するように導くことも可能である。その場合、光路は、照射光あるいは 観察光の光路としてが利用される。 この特別の実施例における照射光と観察光としての流れも、また従来の光走査 型顕微鏡で光走査する場合の光線の流れに相当している。光束の分離は、たとえ ば、点照射（図示なし）または点検出器（図示なし）の傾斜移動により行うこと ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．顕微鏡で多軸観察を行うための偏光装置において、顕微鏡の対物レンズと顕 微鏡の焦点面との間に光束偏光装置があり、そして、ある場合には、一つ以上の 光線で試料をいくつかの側から照射することが可能で、および／または一つ以上 の光線で試料をいくつかの側から観察することが可能で、またある場合には、光 の照射軸に対しある角度で試料を観察することが可能であることを特徴とする顕 微鏡の多軸観察用偏光装置。 ２．前記装置が顕微鏡の光軸に関して回転可能なことを特徴とする請求項１に記 載の偏光装置。 ３．照射軸と観察軸の間の角度が約９０度をなしていることを特徴とする前述の 請求項のいずれかに記載の偏光装置。 ４．照射軸と観察軸の間の角度が可変であることを特徴とする前述の請求項のい ずれかに記載の偏光装置。 ５．二つの光束光路が、顕微鏡の対物レンズの焦点で同一線上にあり、したがっ て光が正反対方向から到達するか、または正反対方向から観察可能となるように 偏光されることを特徴とする前述の請求項のいずれかに記載の偏光装置。 ６．光学要素が変更可能および／またはスライド可能であることを特徴とする前 述の請求項のいずれかに記載の偏光装置。７．前述の請求項のいずれかによる偏 光装置を具備した顕微鏡において、特に共焦点光走査型顕微鏡。 ８．それが蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。 ９．顕微鏡が投光および／または反射光の観察目的のために設けられていること を特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。