JP2005528451A - 新規な多量体分子、その製造方法及び医薬の製造のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
A−Xn〔式中、nは3、4、5又は6に等しく、Aは少なくとも3つのアミン官能基又はCOOH官能基により官能化されている化学的基を示し、そしてXはD、B−D又はB(D)−D’基を示し、ここで、Bはスペーサーであり、そしてD及びD’は受容体との界面を形成しておりそして受容体と相互作用することができる残基から選ばれる、リガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表す〕を有することを特徴とする多量体分子に関する。
Description
本発明の主題は免疫応答を活性化又は抑制することができる分子でもある。
A−Xn
〔式中、
−nは3、4、5又は6に等しく、
−Aは少なくとも3つのアミン官能基(functions)又はCOOH官能基により官能化された化学的基であり、
−Xは−D、−B−D又は−B(D)−D’基であり、ここで、
*Bはスペーサーアームであり、
*−D及び−D’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチド(pseudopeptides)であり、該配列は該受容体と相互作用することができる〕
に相当することを特徴とする多量体分子に関する。
A−Xn
〔式中、
−nは3、4、5又は6に等しく、
−Aは少なくとも3つのアミン官能基又はCOOH官能基又はSH官能基又はS−Npys(S−ニトロ−ピリジンスルフェニル)官能基又はS−Pys(S−ピリジンスルフェニル)官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Xは−D、−B−D又は−B(D)−D’基であり、ここで、
*Bはスペーサーアームであり、
*−D及び−D’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはTNFスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド:EDA、CD40L、FasL、OX40L、AITRL、CD30L、VEGI、LIGHT、4−1BBL、CD27L、LTα、TNF、LTβ、TWEAK、APRIL、BLYS、RANKL及びTRAILから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子にも関する。
A−Xn
〔式中、
−nは3、4、5又は6に等しく、
−Aは少なくとも3つのアミン官能基又はCOOH官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Xは−D、−B−D又は−B(D)−D’基を表し、ここで、
*Bはスペーサーアームであり、
*−D及び−D’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはTNFスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド:EDA、CD40L、FasL、OX40L、AITRL、CD30L、VEGI、LIGHT、4−1BBL、CD27L、LTα、TNF、LTβ、TWEAK、APRIL、BLYS、RANKL及びTRAILから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子にも関する。
本発明は、上記した多量体分子であって、
●Aが下記一般式
*m及びm’は1〜5の整数であり、
*VはXとアミド結合を形成する−NH−又は−CO−基を表し、
*Zは酸素原子又はCH2基を表し、
*Yは窒素原子又はR−C−基又はR−CONH−C−基のいずれかを表し、ここでRは1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、1〜10個の炭素原子を有するアルケニル基、1〜10個の炭素原子を有するアルキニル基、5〜12個の炭素原子を有するアリール基、5〜14個の炭素原子を有するアラルキル基又は1〜10個の炭素原子を有するヘテロアリール基であることができ、これらの基は置換されていなくてもよく又は−COOH、−NH2、−CONH2又はアルコキシ基から選ばれる1〜6個の置換基により置換されていてもよい〕
を有するC3対称性を有する分岐状基であるか、
●又はAが下記一般式:
*RaはXとアミド結合を形成する−NH−基又は−CO−基のいずれかを表し、
*Rbはタンパク原性(proteinogenic)アミノ酸の側鎖を表し、
*pは1〜4の整数であり、
*qは0〜4の整数である〕
の1つに相当する環状C3基(cyclic C3 radical)であるか、
●又は、Aが下記一般式
*kは3、4、5又は6を表し、
*R1は水素原子又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基又はRCO−、ROCO−もしくはRNHCO−基のいずれかを表し、ここでRは上記したとおりであり、
*R2は−NH2基又は−NHR基又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基のいずれかを表し、Rは上記したとおりである〕
に相当する非対称性分岐状基であり、
−Bが下記一般式:
*YはC1〜C10アルキル鎖又はアルキニル、又はアルケニル又はアリール又はアラルキル又はヘテロアリール基を表し、
*R3は、VもしくはRaが−CO−基であるときは−NH−基を、又はVもしくはRaが−NH−基であるときは−CO−基のいずれかを表し、
*R4及びR5は互いに独立に−CO−基又は−NH−基を表す〕
の1つに相当し、
−D及び−D’が受容体と相互作用するリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドである、
ことを特徴とする多量体分子に関する。
Lys143−Gly−Tyr145、Tyr145−Gly−Lys143、
Lys143−Gly−Tyr−Tyr146
Tyr146−Tyr−Gly−Lys143、
Lys−Pro−Arg、Lys−Ψ(CH2NH)Pro−Arg、
Arg200−Phe−Glu−Arg−ILe−Leu−Leu−Arg207、
Arg207−Leu−Leu−Ile−Arg−Glu−Phe−Arg200、
Arg200−Phe−Glu−Arg−Ile204、
Ile204−Arg−Glu−Phe−Arg200、
Arg203−Ile−Leu−Leu−Arg207、
Arg207−Leu−Leu−Ile−Arg203、
Cys218−Gly−Gln−Gln−Ser−Ile223、
Ile223−Ser−Gln−Gln−Gly−Cys218、
Gly200−Ser−Glu−Arg−Ile−Leu−Leu−lys207、
Lys207−Leu−Leu−Ile−Arg−Glu−Ser−Gly200、
Gly200−Ser−Glu−Arg−Ile204、
Ile204−Arg−Glu−Ser−Gly200、
Arg203−Ile−Leu−Leu−Lys207、
Lys207−Leu−Leu−Ile−Arg203、
Cys218−Glu−Gln−Gln−Ser−Val223、
Val223−Ser−Gln−Gln−Glu−Cys218
又は上記した配列の2つの少なくとも2つの連続したアミノ酸により構成されるハイブリッドペプチド、特に配列
Arg203−Ile204−Tyr145−Tyr146又は
Arg203−Ile204−Tyr146−Tyr145−Gly144−Lys143
のペプチド、
又は上記配列の断片、
から選ばれるヒト又はネズミCD40受容体リガンド(CD40L)由来の残基を表し、ここでアミノ酸は同等にL又はD配置であることができる、
ことを特徴とする上記した分子にも関する。
の1つに相当することを特徴とする。
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているAの線状前駆体を形成(ここで、この線状前駆体は、N−保護されたアミノ酸残基の3つがアミン型のRa基を有するN−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものであり、その際最初のアミノ酸残基は固体支持体に結合されている)し、
−上記保護されたAの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂させて保護されたアミン官能基を開放し、
−3つの開放されたアミン官能基をN−保護されたスペーサーアームBとカップリングさせ、
−スペーサーアームBを脱保護し、そしてスペーサーアームBから開放されたアミン官能基を、既に形成されているDペプチド又はDペプチドに相当するアミノ酸残基を連続して結合させることによりその場で(in situ)形成されたDペプチドとカップリングさせ、そして
−Dペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から該分子を開裂させて本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているAの線状前駆体を形成(ここで、この線状前駆体は、N−保護されたアミノ酸残基の3つがアミン型Ra基を有するN−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものである)し、
−上記保護されたAの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂させて保護されたアミン官能基を開放し、
−3つの開放されたアミン官能基を保護されたDペプチドに連結されたスペーサーアームBに相当する−D−Bペプチドとカップリングさせ、
−Dペプチド上に存在する保護基を脱保護して、本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
−式IV、V、VI又はVIaの基Aの3つのアミン官能基を保護されたスペーサーアームBとカップリングさせ、
−スペーサーアームBを脱保護し、
−脱保護されたスペーサーアームBをDペプチドの構成に含まれた保護されたアミノ酸と、上記したアミノ酸のカップリング、精製及び脱保護の連続したサイクルにより結合させ、
−Dペプチドの構成に含まれた最後のアミノ酸を脱保護して、本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
含む本発明の化合物は、以後詳細に述べる方法に従って固相又は溶液中で合成することができる。
−それぞれ位置α及びεにおけるリシンの2つのアミン官能基の各々がそれぞれ異なる且つ直交する(orthogonal)保護基により保護されているリシンを固体支持体にグラフト(graft)させ、
−リシンから形成されたペプチド鎖を、
*保護されたアミン官能基が位置εにある式VIIの基Aを得るために位置αのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護すること、又は
*保護されたアミン官能基が位置αにある式VIIIの基Aを得るために位置εのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護することのいずれかにより、
所望の長さに伸張させ、
−式VIIの基Aの位置ε又は式VIIIの基Aの位置αにおける脱保護されたアミン官能基を保護されたアームBとカップリングさせ、
−脱保護されたスペーサーアームBを、既に形成されているDペプチド又はDペプチドに相当するアミノ酸残基の逐次的結合によりその場で形成されたDペプチドと結合させ、そして
−このようにして得られた分子を、Dペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から開裂させる、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
(ジメチルホルムアミド)中の25%ピペリジンによりFmoc基を開裂させた後(2×15分)、特にアミン官能基の場合にはFmoc基又はMtt(メチルトリチル)基により直交方式(orthogonal manner)で適当に保護された官能化されたアミン鎖を有するアミノ酸(例えば、Fmoc−Lys(Mtt)−OH)を、第三級塩基の存在下にカップリング剤で活性化しそして樹脂にカップリングさせる。Mtt又はFmoc基を85%ジクロロメタン(DCM)、10%トリイソプロピルシラン(TIS)、5%トリフルオロ酢酸(TFA)の溶液(6ml)による処理(3×3分)(Mttの場合)又はDMF中の25%ピペリジンによる処理(Fmocの場合)により選択的に開裂させる。同じアミノ酸(例えば、Fmoc−Lys(Mtt)−OH)を使用して連続したカップリング及び脱保護により鎖を所望の長さ(kは3〜6を含む整数である)に伸長させる。最後のFmoc又はMtt基の脱保護の後、保護基の残り(Mtt又はFmoc)を開裂させ、そして適当に保護されたスペーサーアーム(例えば、Fmoc−Ahx−COOH)を遊離アミン官能基にカップリング剤の存在下にカップリングさせる。このカップリングの終わりに、スペーサーアームの保護基を開裂させそしてDペプチドを標準ペプチド合成方法により合成する。合成の終わりにそして一旦最後の保護基が除去されると、ペプチドを樹脂から開裂させ(例えばトリフルオロ酢酸による処理)、エーテルからの沈殿の後凍結乾燥しそして例えばC18カラムで分取逆相HPLCにより精製する。
A)化合物L1の製造
化合物L1は下記式:
(マトリックス支援式レーザー脱着イオン化質量分光法(Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry)))及び分析HPLCによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してC18カラムでの分取HPLCにより精製する。
化合物L2は下記式:
化合物L3は下記式:
化合物L4は下記式:
a)Boc−D−Ala−OAll
Boc−D−Ala−OHアミノ酸(1.89g、10ミリモル)をACN(アセトニトリル)70mlに可溶化し、そして溶液を0℃に冷却する。DBU(1,8−ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデセン−7−エン)1.5ml(1.2当量)を加えた後、アセトニトリル10ml中の臭化アリル(0.72ml、1当量)の溶液を約15分間滴下により加える。反応を周囲の温度で21時間にわたり行い、次いで薄層クロマトグラフィー(TLC)にかける。アセトニトリルを蒸発させた後、粗生成物を酢酸エチルに溶解させそして有機溶液を5%NaHCO3、H2O、1NのKHSO4及びH2Oで洗浄する。Na2SO4上で乾燥しそして有機相を蒸発させた後、生成物を73%の収率で油の形態で回収する。生成物をNMR及びFT−IR分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
Boc−(D)Ala−OAllアミノ酸(1.67g;7.3ミリモル)をアルゴン雰囲気下にジオキサン中のHCl(4M)5mlの溶液に30分間可溶化する。反応の後TLCにかける。酸溶液を蒸発させた後、生成物が90%収率で真空下に固体として得られる。生成物をNMR及びFT−IR分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
Fmoc−Lys(Mtt)−OHアミノ酸(625mg、1ミリモル)を、HOBt(1当量)及びEDC×HCl(EDC:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドメチオジド(1.1当量)の存在下にジクロロメタン(DCM)5mlに可溶化する。5分後、アリルアルコール(1当量)及びDMAP(4−ジメチルアミノピリジン)(0.1当量)を加える。27時間の後、HOBt、EDC×HCl、アリルアルコール0.5当量及びDAMP0.1当量を加える。全体で、反応を44時間にわたって行う。ジクロロメタンを蒸発させた後、粗生成物を酢酸エチルに溶解させそして有機溶液を5%NaHCO3、H2O、1NのKHSO4及びH2Oで洗浄する。Na2SO4上で乾燥しそして有機相を蒸発させた後、生成物を94%の収率で油の形態で回収する。生成物をNMR及びFT−IR分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
Fmoc−Lys(Mtt)−OAll(240mg、0.36ミリモル)をDCM(10ml)中のDEA(ジエチルアミン)20%中に可溶化する。反応を、TLCにより監視して、DEA3mlを更に加えた後5時間にわたり行う。溶液を蒸発させた後、粗生成物をジエチルエーテルに可溶化しそして1NのKHSO4溶液で抽出する。酸溶液を固体NaHCO3で塩基性にしそして生成物を酢酸エチルで再抽出する。有機相をH2Oで洗浄し、N2SO4上で乾燥しそして蒸発させる。生成物を定量的収率で油の形態で回収し、そして次の反応で使用する。
市販の2−(3,5−ジメトキシ−4−ホルミルフェノキシ)エチルポリスチレン樹脂上で62μモルのスケールで固相で還元アミノ化反応を行う。HCl×H−D−Ala−OAll(10当量)及びNaBH3CN(10当量)をDMF中に可溶化しそして樹脂に加える。反応を、FT−IR分光法により監視して、攪拌下に24時間にわたって行う。
Fmoc−Lys(Mtt)−OHアミノ酸(5当量)を、コリジン(14当量)の存在下にジクロロメタン1mlに可溶化しそしてトリホスゲン(1.65当量)で1分間活性化する。次いで溶液を樹脂(62μモル)に加えそして30分間にわたってカップリング反応を行う。樹脂をDCM、DMFで徹底的に洗浄しそしてエーテルで乾燥する。
ジペプチド−樹脂コンジュゲート(62μモル)を、Pd(Ph3)4(2当量)で処理し、1850:100:50の割合のDCM:AcOH(酢酸):NMM(N−メチルモルホリン)の溶液2ml中でアルゴン下に6時間可溶化する。反応をFT−IR分光法により監視する。次いで、HATU[O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスファート](4当量)、HOAt(7−アザベンゾトリアゾール)(4当量)、CuCl2(0.5当量)及びコリジン(9当量)を、DMF1.5ml及びDCM600μlに可溶化されたH−Lys(Mtt)−OAllアミノ酸(5.8当量)に加える。溶液を樹脂(62μモル)に加えそしてカップリング反応を2時間行う。樹脂をDMF、DCM、メタノールで徹底的に洗浄し、エーテルで乾燥しそしてFT−IR分光法によりチェックする。
DMF中の25%ピペリジンによるFmoc基の脱保護(2×15分)の後、DMF中のBop(5当量)、HOBt(5当量)及びDIEA(15当量)で活性化されたFmoc−D−Ala−OH、Fmoc−Lys(Mtt)−OH及びFmoc−D−Ala−OHアミノ酸(5当量)を1時間にわたりカップリングさせる(各カップリングを2回繰り返す)。アリル基をPd(Ph3)4(2当量)で開裂させ、1850:100:50の割合のDCM:AcOH:NMMの溶液2ml中にアルゴン下に6時間可溶化する。Fmoc基をDMF中のピペリジンの25%溶液で開裂させる(2×15分)。遊離N−末端及びC−末端を有する線状ヘキサペプチド−樹脂誘導体をDMF/DCM5:2(2.1ml)の溶液でHOAt(4当量)、DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)(4.4当量)の存在下に3時間にわたって環化させる。Mtt基を85%DCM、10%TIS、5%TFAの溶液(2ml)で開裂させる(3×2分)。DMF中のBop(15当量)、HOBt(15当量)及びDIEA(45当量)で活性化されたFmoc−Ahx−OH(H−Ahx−OH:6−アミノヘキサン酸)、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Tyr(tBu)−OH、Fmoc−Gly(tBu)−OH及びFmoc−Lys(Boc)−OHアミノ酸(15当量)を1時間にわたりカップリングさせる(各カップリングを2回繰り返す)。環状ペプチドを90%TFA、5%H2O、5%TISの溶液(3ml)で2時間にわたって樹脂から開裂させる。開裂を同じ条件下に3時間にわたって二回目を繰り返す。冷エーテルからの沈殿の後、生成物L4及び副生物L4aの両方が得られ、次いでこれをH2O/アセトニトリル/酢酸混合物(80/15/5)において凍結乾燥させる。生成物を質量分光法(MALDI−MS)及び分析HPLCによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してC18カラムでの分取HPLCにより精製しそして分離する。
リガンドL7は下記式:
それは、構造L7−1
又はスペーサーアームの修飾:グリシンによるアミノヘキサン酸の置換:L7−3
リガンドL11は下記式
樹脂上での反応を注射器中で攪拌しながら行った。
2−クロロトリチルクロリド樹脂(R1−A)(0.96ミリモル/g)1.5g(1当量)を注射器中で攪拌しながら蒸留されたDCMで2回洗浄した。DCM中のFmoc−6−アミノカプロン酸1.02g(2当量)及びDIEA1.5ml(6当量)の混合物を調製しそして樹脂に加えた。3時間後、樹脂をろ過しそしてDCMで洗浄した。それを再び攪拌しながら1時間メタノール中に膨潤させた。次いでそれをろ過しそしてDMF、IpOH(イソプロパノール)、DCM、エーテルで洗浄した。次いでそれを真空下に乾燥してR−2Aを生成させた。
1)Z−β−Lys(Boc)−OH(4B)及びZ−β−Lys(Boc)−OMe(5B)の製造
a)Z−Lys(Boc)−OHの40ミリモル(1当量)を攪拌しながらTHFの100ml中に溶解した。NMNの5.27ml(1.2当量)を加え、次いで反応混合物を−20℃に冷却した。クロロギ酸エチルの4.59ml(1.2当量)をTHFの30mlに溶解し、次いで混合物を反応系に滴下により加えた。2−Bを含有する反応混合物を更に20分間冷たく保った。
KOHの7.76gを水12.5ml、エーテル10ml及び2−(2−エトキシエトキシ)エタノール35mlの混合物中に攪拌しながら溶解し、次いで75℃で加熱した。ジアザルド(N−メチル−N−ニトロソ−p−トルエンスルホンアミド;Aldrich)15.52gをエーテル140mlに溶解しそして混合物を反応混合物に滴下により加えた。このようにして生成されたジアゾメタンをアセトン中の氷浴中で−75℃で凝縮させた。このようにして製造されたジアゾメタンのエーテル溶液を2−Bの反応溶液に加え、次いで反応混合物を一夜周囲の温度に維持した。エチルアミン(EA)1mlを加え、次いで多量のNaHCO3(飽和(st))を加えた。有機相と水性相との分離の後、有機相をNaHCO3で2回及びNaCl(飽和(st))で1回洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥した後、溶媒を蒸発させ、そしてこのようにして製造されたジアゾケトン3−Bを真空下に乾燥した。質量:15.4g;収率:95%。
ジアゾケトン3−B、7g(1当量)をTHFの110mlと水18mlの混合物中に光の不存在下に攪拌しながら溶解し、そして混合物を−20℃に冷却した。安息香酸銀435mg(0.11当量)及びトリエチルアミン6.07ml(2.5当量)を加えた。反応混合物を暗所で一夜周囲の温度に維持した。THFの部分を蒸発させ、エーテル20mlを加え、それをNaHCO3で数回抽出した。水性相を一緒にしそしてKHSO4粉末によりpH3に酸性化した。溶液をDCMで抽出しそして硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、4最終生成物4−Bを真空下に乾燥した。質量:5g;収率:73%。
反応略図
3)コア分子の脱保護及びL−9の合成
これらの試験を3つの段階で行う。最初に最も興味深いリガンドを簡単な試験により選び、次いでそれらの生理学的効果をインビトロ(in vitro)で細胞活性化モデルにおいて試験する。最後に、最も興味深いリガンドをインビボ(in vivo)でネズミモデルで試験する。
これらのリガンドの構造的完全性(integrity)が分析されると、それらの結合を可溶性又は膜CD40分子で試験する。これをするために、プラスチックに吸着されたCD40分子又は正常なもしくは形質転換されたB細胞(バーキットリンパ腫(Burkitt's lymphoma))により提示されたCD40分子に対する可溶性のCD40Lの結合の抑制。この段階はCD40/CD40L結合の可視化を可能とするELISA試験及びフローサイトメトリーラベリングを使用して評価する。
1− CD40Lにより誘発されるCD95の発現
リンパ腫B細胞は、それらが構成的方式で発現するCD40分子を介してシグナルを受け取るとき、CD95分子を発現する。このシグナルは他の細胞により発現されるCD40L(CD154)分子により一般に運ばれる。アンタゴニストリガンドはCD40Lに対するCD40の結合を抑制し、かくしてCD95の発現をまねる。アゴニストリガンドはCD40L分子を模倣しそしてCD40Lを発現する細胞の不存在下においてさえCD95の発現を誘発する。
BL41バーキットリンパ腫細胞(5.105/ml)をCD40Lによりトランスフェクションされた3T6繊維芽細胞(105/ml)(3T6−CD40L)又はCD40Lでトランスフェクションされていない3T6繊維芽細胞(3T6)の存在下に培養し、そしてマイトマイシンで処理してそれらの増殖を停止させる。リガンドを、選ばれた濃度で培養の開始時に加える。48時間の培養の後、CD95分子の発現をフローサイトメトリーにより測定する。BL41細胞は抗CD19抗体(B細胞の特異的マーカー)を使用して繊維芽細胞から区別される。
3T6細胞の存在下に培養されたBL41細胞はCD95分子を発現しない(図3A)。他方、CD95の発現は3T6−CD40L細胞の存在下にBL41細胞の表面で誘発される(図3B)。CD40/CD40L相互作用をブロックする市販の抗CD40L抗体は、3T6−CD40L細胞の存在下にBL41細胞上に誘発されるCD95の発現を完全に抑制する(図3D)。
ある種のBリンパ腫は、それらのCD40分子が抗CD40抗体又はCD95分子とは独立に可溶性のCD40Lによりブリッジされると、アポトーシスに入る。このアポトーシスの誘発は、トリチウム化されたチミジンの取り込みにより測定される増殖の減少として発現される。CD40のアゴニストリガンドはアポトーシスの増加を誘発しそして結果としてトリチウム化されたチミジンの取り込みの減少を誘発するであろう。
BL41バーキットリンパ腫細胞(4.105/mL)を、選ばれた濃度の種々のリガンドの存在下に培養する。24時間後、細胞をトリチウム化されたチミジン(1μci/ウエル)と8時間インキュベーションして増殖を測定するか、又はアネキシン V−FITC及びヨウ化プロピジウムで標識してフローサイトメトリーによりアポトーシス細胞の百分率を評価する。
リガンドL4(環状構造コア+CD40−CD40L界面によく似たペプチド配列の3つの例)は、可溶性CD40L分子と同様にBL41細胞の増殖を大きく抑制する。しかしながら、リガンドL7(L4と同じペプチド配列を有する分岐状コア構造)及びその誘導体L7−1、L7−2及びL7−3はBL41細胞の増殖に対する少しの効果を持つか又は効果を持たない(図4A)。
方法の原理
Biacore3000は、表面プラズモン共鳴に基づいて2つの分子間の相互作用を調べることを可能とする装置である。それはリアルタイムでの測定を可能とし、それゆえアナライト(注入された溶液である)とリガンド(測定を支持するマイクロチップに固定化された)の相互作用(会合及び解離)の動力学を監視することを可能とする。アナライトの種々の濃度での動力学的測定はリガンドとアナライトとの相互作用のアフィニティー定数の計算を可能とする。マイクロチップは異なる測定のための4つのセルを含有し、これは、適切ではないが(調査されるリガンドとのアフィニィーを持たないタンパク質)リガンドに類似したタンパク質が固定化されている参照セルと、リガンドが固定化されているセルとの直接の比較を可能とする。
マウス免疫グロブリンの定常部に向けられたウサギ抗体をマイクロチップに固定化した。参照セルにおいては、40nMのアイソタイプIgG2a(LG112)のモノクローナルマウス抗体が5μL/分の流量で2分間固定化され;リガンドのセルでは、マウスIgG2a重鎖の定常部と会合した組換えCD40(ヒトCD40muIg融合タンパク質、ANCELL Corporation, Bayport, MN)を同じ条件下に固定化させる。
CD40に対するCD40Lのアフィニティー定数を調べるために、62.5〜500nMの4つの濃度のCD40Lを使用する。平衡定数を54nMで計算する。
ヒト単球からインビトロで分化された未成熟樹状細胞は、それらの成熟を誘発するCD40Lに対して非常に感受性である。この成熟は、(i)深い表現型転移(profound phenotype rearrangements)、(ii)サイトカイン及びケモカインの分泌、(iii)CD95により媒介されるアポトーシスに対する抵抗(Koppi et al.,1997;Bjorck et al.,1997)、(iv)増加した樹状細胞寿命(Miga et al.,1997)及び(v)成熟樹状細胞の同種Tリンパ球を刺激する明らかに増加した能力を伴う。CDsに対するこれらのリガンドの効果を調べる。最初に、可能性のある(potential)アゴニストリガンドの未成熟CDsの表現型を修飾する能力をフローサイトメトリーにより調べる。この調査は、ELISA試験を使用して、アゴニストリガンドによるサイトカインの分泌の開始を証明することを追求することにより続けられる。最後に、この調査はアゴニスト分子の存在下に予備インキュベーションされたCDsの同種T細胞を刺激する能力を調べることにより完了する。アンタゴニストリガンドの効果は、アンタゴニスト分子の存在下にCDsを予備インキュベーションすることにより観察される、CD40Lにより普通に誘発される変化の減少の測定により評価される。リガンドの効果は、(i)サイトカインの存在下にCD40による扁桃腺のB細胞の活性化によりインビトロで模倣されうるBリンパ球のクラスのスイッチ及び(ii)CD40により活性化された樹状細胞及び前駆細胞障害性T細胞の共インキュベーションにより模倣されうる細胞障害性Tリンパ球の分化に関して試験することもできる。
リガンドL4及びL9はアゴニストであることが示されたが、それらは我々の分子の治療効果を試験するための興味深いてがかりを示す。全身性エリテマトーデスはCD40−CD40L相互作用の重要性が十分に証明されている全身性自己免疫疾患である。アゴニスト抗CD40抗体による狼瘡性マウス(lupic mice)の処理は、狼瘡疾患を顕著に促進する。種々のリガンドのインビボでの効果を試験するために、我々はヒト全身性エリテマトーデスのような症状を示す狼瘡疾患を自然に発生するマウスにそれらを注入した。我々は疾患の発生に対するリガンドの効果を調べた。
プレ自己免疫(preautoimmune)MRL−lprマウス(Koopman et al., 1988)(5週齢)に、リガンドL4の100μgを含有するPBS又は含有しないPBSをマウス当り100μLで静脈内経路により注入する。注入を2週間間隔で2回繰り返す。これらのマウスの血清を後方眼窩(retro-orbital)出血により規則的にサンプリングする。狼瘡疾患の発生は、尿中のタンパク尿の測定、ELISA試験による血清中の抗DNA抗体の存在の測定及びマウスの生存率により監視される。これらの2つのマーカーはMRL−lprマウスにおける狼瘡疾患の発生の特徴である。
リガンドL4で処理されたマウスはPBSで処理されたマウスより有意に(p=0.0101)より速く死ぬ(図5A)。この死亡の促進は、血清中の抗DNAのより早期の出現を伴い(図5B)そして尿中のタンパク尿のより早期の出現(図5C)を伴い、死亡は明白に狼瘡疾患の促進によることを示す。これらの結果はリガンドL4がインビボでアゴニスト効果を有することを明らかに示す。
Claims (16)
- 多量体分子であって、該多量体分子が、下記の一般式
A−Xn
〔式中、
−nは3、4、5又は6に等しく、
−Aは少なくとも3つのアミノ官能基又はCOOH官能基又はSH官能基又はS−Npys(S−ニトロ−ピリジンスルフェニル)官能基又はS−Pys(S−ピリジンスルフェニル)官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Xは−D、−B−D又は−B(D)−D’基であり、ここで、
*Bはスペーサーアームであり、
*−D及び−D’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはTNFスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド:EDA、CD40L、FasL、OX40L、AITRL、CD30L、VEGI、LIGHT、4−1BBL、CD27L、LTα、TNF、LTβ、TWEAK、APRIL、BLYS、RANKL及びTRAILから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子。 - −D及び−D’がヒト又はネズミCD40受容体のリガンド(CD40L)由来のペプチドを表し、該ペプチドはCD40のCD40Lリガンドの一次配列に属しそしてそのアミノ酸の数は3〜10を含むことを特徴とする請求項1に記載の分子。
- ヒト又はネズミCD40受容体のリガンド(CD40L)由来のペプチドが、下記の:
Lys143−Gly−Tyr145、Tyr145−Gly−Lys143、
Lys143−Gly−Tyr−Tyr146
Tyr146−Tyr−Gly−Lys143、
Lys−Pro−Arg、H−Lys−Ψ(CH2NH)Pro−Arg、
Arg200−Phe−Glu−Arg−ILe−Leu−Leu−Arg207、
Arg207−Leu−Leu−Ile−Arg−Glu−Phe−Arg200、
Arg200−Phe−Glu−Arg−Ile204、
Ile204−Arg−Glu−Phe−Arg200、
Arg203−Ile−Leu−Leu−Arg207、
Arg207−Leu−Leu−Ile−Arg203、
Cys218−Gly−Gln−Gln−Ser−Ile223、
Ile223−Ser−Gln−Gln−Gly−Cys218、
Gly200−Ser−Glu−Arg−Ile−Leu−Leu−Lys207、
Lys207−Leu−Leu−Ile−Arg−Glu−Ser−Gly200、
Gly200−Ser−Glu−Arg−Ile204、
Ile204−Arg−Glu−Ser−Gly200、
Arg203−Ile−Leu−Leu−Lys207、
Lys207−Leu−Leu−Ile−Arg203、
Cys218−Glu−Gln−Gln−Ser−Val223、
Val223−Ser−Gln−Gln−Glu−Cys218
又は上記した配列の2つの少なくとも2つの連続したアミノ酸により構成されるハイブリッドペプチド、特に配列
Arg203−Ile204−Tyr145−Tyr146又は
Arg203−Ile204−Tyr146−Tyr145−Gly144−Lys143
を有するペプチド、
又は上記配列の断片、
から選ばれ、これらのアミノ酸は同等にL又はD配置であることができる、
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の分子。 - AがC3対称性を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の多量体分子。
- ●Aが下記一般式:
〔式中、
*m及びm’は1〜5の整数であり、
*VはXとアミド結合を形成する−NH−又は−CO−基を表し、
*Zは酸素原子又はCH2基を表し、
*Yは窒素原子又はR−C−基又はR−CONH−C−基を表し、ここでRは1〜10個の炭素原子を有するアルキル基、1〜10個の炭素原子を有するアルケニル基、1〜10個の炭素原子を有するアルキニル基、5〜12個の炭素原子を有するアリール基、5〜14個の炭素原子を有するアラルキル基又は1〜10個の炭素原子を有するヘテロアリール基であることができ、これらの基は置換されていなくてもよく又は−COOH、−NH2、−CONH2又はアルコキシ基から選ばれる1〜6個の置換基により置換されていてもよい〕
を有するC3対称性を有する分岐状基であるか、
●又は、Aが下記一般式:
〔式中、
*RaはXとアミド結合を形成する−NH−基又は−CO−基のいずれかを表し、
*Rbはタンパク原性アミノ酸の側鎖を表し、
*pは1〜4の整数であり、
*qは0〜4の整数である〕
の1つに相当する環状C3基であるか、
●又は、Aが下記一般式:
〔式中、
*kは3、4、5又は6を表し、
*R1は水素原子又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基又はRCO−、ROCO−もしくはRNHCO−基のいずれかを表し、ここでRは上記したとおりであり、
*R2は−NH2基又は−NHR基又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基のいずれかを表し、Rは上記したとおりである〕
に相当する非対称性分岐状基であり、
−Bが下記一般式:
〔式中、
*YはC1〜C10アルキル鎖又はアルキニル、又はアルケニル又はアリール又はアラルキル又はヘテロアリール基を表し、
*R3は、VもしくはRaが−CO−基であるときは−NH−基を表し又はVもしくはRaが−NH−基であるときは−CO−基を表し、
*R4及びR5は互いに独立に−CO−基又は−NH−基を表す〕
の1つに相当し、
−D及び−D’が請求項1又は2で定義されたペプチド又は擬ペプチドである、
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の多量体分子。 - 医薬学的に許容できるベクターと組み合わせて請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子を活性成分として含むことを特徴とする医薬学的組成物。
- 医薬学的に許容できるアジュバントと組み合わせて請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子を活性成分として含むことを特徴とするワクチン組成物。
- 免疫応答の抑制又は活性化を必要とする病理の処置を目的とした医薬の製造のための請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子の使用。
- 免疫応答抑制を含む、病理、例えば、移植片の拒絶又は自己免疫疾患の処置を目的とした医薬の製造のための請求項10に記載の使用。
- 免疫応答の増加を含む、病理、例えば、癌又は寄生虫、バクテリアもしくはウイルス感染症の処置を目的とした医薬の製造のための請求項10に記載の使用。
- Aが環状C3基でありそして請求項5で記載された式Ia、Ib、II、VIb、VIc又はVIdの1つに相当する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法は、下記の工程:
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているAの線状前駆体を形成(ここで、この線状前駆体は、N−保護されたアミノ酸の残基の3つがアミン型のRa基を有するN−保護されたアミノ酸の残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものであり、その際最初のアミノ酸残基は固体支持体に結合されている)し、
−上記保護されたAの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂して保護されたアミン官能基を開放し、
−3つの開放されたアミン官能基を、N−保護されたスペーサーアームBとカップリングさせ、
−スペーサーアームBを脱保護し、そしてスペーサーアームBから開放されたアミン官能基を、既に形成されているDペプチド又はDペプチドに相当するアミノ酸残基を連続して結合させることによりその場で形成されたDペプチドとカップリングさせ、そして
−Dペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から分子を開裂させて請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。 - Aが環状C3基でありそして請求項5に記載された式Ia、Ib、II、VIb、VIc又はVIdの1つに相当する請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子の溶液における製造方法であって、該方法は、下記の工程:
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているAの線状前駆体を形成(ここで、この線状前駆体は、N−保護されたアミノ酸残基の3つがアミン型Ra基を有するN−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものである)し、
−上記保護されたAの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂して保護されたアミン官能基を開放し、
−3つの開放されたアミン官能基を、保護されたDペプチドに連結されたスペーサーアームBに相当する−D−Bペプチドとカップリングさせ、
−Dペプチド上に存在する保護基を脱保護して、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。 - Aが分岐状C3基でありそして請求項5に記載された式IV、V、VI又はVIaの1つに相当する請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子の製造方法であって、該方法は、下記の工程:
−式IV、V、VI又はVIaの基Aの3つのアミン官能基を保護されたスペーサーアームBとカップリングさせ、
−スペーサーアームBを脱保護し、
−脱保護されたスペーサーアームBをDペプチドの構成に含まれた保護されたアミノ酸と、上記したアミノ酸のカップリング、精製及び脱保護の連続したサイクルにより結合させ、
−Dペプチドの構成に含まれた最後のアミノ酸を脱保護して、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。 - Aが請求項5に記載された式VII又はVIIIの1つに相当する非対称性分岐状基である請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法が下記の工程:
−それぞれ位置α及びεにおけるリシンの2つのアミン官能基の各々がそれぞれ異なる且つ直交する保護基により保護されているリシンを固体支持体にグラフトさせ、
−リシンから形成されたペプチド鎖を、
*保護されたアミン官能基が位置εにある式VIIの基Aを得るために位置αのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護すること、又は
*保護されたアミン官能基が位置αにある式VIIIの基Aを得るために位置εのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護することのいずれかにより、
所望の長さに伸長させ、
−式VIIの基Aの位置ε又は式VIIIの基Aの位置αにおける脱保護されたアミン官能基を保護されたアームBとカップリングさせ、
−脱保護されたスペーサーアームBを、既に形成されているDペプチド又はDペプチドに相当するアミノ酸残基の逐次的結合によりその場で形成されたDペプチドと結合させ、そして
−このようにして得られた分子を、Dペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から開裂させる、
段階を含むことを特徴とする方法。
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