CN103338782A - 包含表面核仁素的多价合成配体和糖胺聚糖的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，该组合物包括努卡特多价合成化合物和糖胺聚糖，这两种化合物的混合物形成包含这两种化合物的微球体；本发明还涉及它们用于治疗或预防与增殖和/或血管生成的失调相关的疾病(如癌症、炎症性疾病)或用于促进伤口愈合的用途。

Description

包含表面核仁素的多价合成配体和糖胺聚糖的组合物
技术领域
本发明涉及包含多价合成化合物和糖胺聚糖(GAG)的组合物，以及它们用于治疗癌症、涉及血管生成的疾病、炎症性疾病，以及促进伤口愈合的用途。
背景技术
真核细胞通过有丝分裂进行细胞分裂，以支持生长、修复、组织再生、和/或替换死细胞。
在癌细胞中，有丝分裂的调节是有缺陷的，这就是为什么这些细胞杂乱分裂并产生肿瘤。因此，一种防止癌症发展的有效治疗途径包括利用带有抗有丝分裂或其它抗癌特性的分子来阻止癌细胞的分裂。
然而，当前的抗有丝分裂分子(紫杉醇，其常用名为紫杉酚，或例如秋水仙碱)无细胞特异性地作用在所有无差别的细胞上，从而引起许多不期望的副作用。因此，有必要开发具有较少有害作用的抗有丝分裂分子。
为了生长，每个肿瘤都需要营养和氧气。这些因素都是由肿瘤内血管来提供的，其中肿瘤内血管是由已知为血管生成的机制所产生。实际上，如果这些血管不存在，那么肿瘤细胞就经历细胞坏死的过程，并且肿瘤生长减慢然后停止。因此，另一种对抗癌症的治疗途径的实例包括通过阻止控制这种机制的分子来阻断血管生成过程。
当前，多个抗血管生成分子都特定于一种血管生成因子。这种单一特异性产生了抗性现象。一种血管生成因子类型的抑制通过血管生成补偿机制产生另一种类型的表达。因此，具有带有对抗所涉及因子的广谱活性的可用的抗血管生成分子是有益的。
然而，通常发现单单抑制血管生成过程不足以有效地阻断肿瘤生长。另外，它不阻止肿瘤转移的形成。
因此，具有能够抑制肿瘤中的肿瘤细胞的增殖和血管生成过程的可用的新型抗癌分子是极其有用的。实际上，最近的研究已经表明，两种治疗分子(一种为抗有丝分裂分子和另一种为抗血管生成分子)的组合产生协同作用，且与只用一种分子的治疗相比显著地提高了全面治疗的功效。
迄今为止，还没有报道同时具有抗有丝分裂和抗血管生成效果的分子。
此外，大多数当前抗癌药剂并不是真正地特定于肿瘤细胞，并且因此也靶向健康细胞，因此产生许多(有时是严重的)副作用。在某些情况下，通过开发靶向一些肿瘤的表面分子的抗体已经解决了这个问题。然而，抗体的使用会造成其它严重的问题，并且非毒性的有效的治疗性抗体的开发是一个长期的、不确定的且昂贵的过程。此外，大规模地且在严格的健康和安全条件下的抗体生产是特别困难的。作为结果，基于特定抗体的治疗少之又少，并且极其昂贵。
另一个与传统抗癌药物如紫杉醇相关联的问题是：这些分子通常是高度疏水性的，这使得有必要开发复杂且昂贵的药物制剂，以实现体内的可接受的生物利用度。体内生物利用度的问题在采用核酸治疗的情况下更为突出，因为对于核酸而言，以一种高效且特定的方式抵达它们的靶细胞是极度困难的。
因此，具有呈现出以下特征的可用的新型抗癌分子是极其有用的，所述特征为：大大提高的功效，这是由于它们对肿瘤增殖和血管生成有双重抑制作用，使得它们不使用传统的化学治疗或放射治疗而单独使用也是有效的，并因此极大地限制与这些治疗类型相关的副作用；抗血管生成因子的相当广谱的活性，以阻止治疗的抗性；非常少的副作用，这是由于对肿瘤细胞的更大的特异性；易于适应工业规模的合成过程、更容易应用，这明显是由于体内的更好的生物利用度和/或更长的半衰期，特别是由于对肿瘤细胞的直接特异性；所述抗癌分子在水性介质中具有良好的溶解性且对体内的分解过程具有提高的抗性。
因此，本领域需要用于抑制细胞增殖且特别是癌细胞生长的有害形式的组合物和方法。
WO2007/125210公开了由接枝到载体(support)上的至少三个特定假肽单元形成的多价(polyvalent)或多价(multivalent)合成肽。已经显示，这族化合物(已将其命名为努卡特(Nucant)化合物)与表面核仁素RGG结构域相互作用，且同时具有抗增殖和抗血管生成的性能，并可用于治疗癌症或炎症疾病。它们具有抗血管生成因子的相当广谱的活性，在水性介质中具有良好的溶解性，对体内的分解过程具有改进的抗性(由于假肽单元中修饰键的存在)，显示出非常少的副作用，并且具有易于适应工业规模的合成过程。具体的示例性化合物包括化合物HB19和化合物努卡特1、2、3、6和7(参见该文献的图2)。这里将该文献完整并入。
WO2009/141687公开了改进的努卡特化合物，其中在假肽单元中的赖氨酸残基都为相同的L构型或D构型。此文献特别地描述了化合物努卡特6L(N6L)，其与WO2007/125210中所公开的化合物努卡特6对应，在WO2007/125210中假肽单元的所有赖氨酸残基都为L构型。与络合化合物努卡特6相比，该化合物显示出提高的抗癌活性，在络合化合物努卡特6中每个假肽单元的赖氨酸残基可以是L构型或D构型。还显示了这些化合物能够改善伤口愈合。这里将该文献完整并入。WO2009/141687还公开了化合物努卡特4、8和9(参见该文献的权利要求10)。
尽管上述两篇文献公开的努卡特化合物同样很令人感兴趣，但仍希望进一步改善它们的抗增殖和抗血管生成性能。实际上，这将允许降低可有效治疗的量，从而降低治疗的成本并进一步限制副作用。
发明内容
本发明涉及令人惊奇且意外的发现，即本发明的努卡特化合物或多价合成实体与糖胺聚糖(GAG)相互作用以调节和/或增强其有益的治疗活性，如抗增殖活性。例如努卡特与GAG(如，肝素)的组合可以显著提高该努卡特的抗癌效力。
一方面，本发明因此提供了一种组合物，特别是治疗性组合物，其包含努卡特和至少一种糖胺聚糖(GAG)。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种组合物，特别是治疗性组合物，其包含GAG和在此描述的努卡特的复合物。在某些实施方案中，努卡特是肽或假肽，例如HB-19或N6L。在本文所描述的任何组合物中，本发明所提供的治疗性组合物可选地包括药学可接受的载剂(carrier)、赋形剂或佐剂。
另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防细胞增殖的方法，包括在体外、体内或离体向受试者施予组合物，所述组合物含有有效量的努卡特和至少一种GAG，和/或有效量的本文描述的努卡特与GAG的复合物，其中该组合物能有效抑制或防止细胞的增殖。在该方面的示例性实施例中，所述受试者是细胞或个体。在某些实施例中，努卡特是肽或假肽，例如HB-19或N6L。在某些实施例中，上述细胞是真核细胞，例如癌细胞或其它增殖细胞。
另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防个体中的与癌细胞生长和/或增殖相关的疾病或病症的方法，其包括向个体施用含有有效量的本文所述的努卡特和GAG的组合物，其中该组合物能有效抑制或防止癌细胞的生长和/或增殖。
还已经令人惊奇且意外地发现：当与GAG混合时，本文所描述的努卡特形成微球体。因此，就某些方面来说，本发明还提供了一种组合物，特别是一种治疗性组合物，其包括含有本文所描述的努卡特和GAG的微球体。在另一方面，本发明提供包含将努卡特和GAG混合在一起的形成努卡特/GAG微球体的方法，其中各组分自发地形成微球体。在另一方面，本发明提供了治疗疾病或病症如癌症的方法，包括以下步骤：向受试者或个体施用有效量的包括努卡特和GAG的微球体的治疗性组合物。在某些实施方案中，微球体在施用之前形成。在另一个实施方案中，微球体在向受试者或患者施用后(如在体内)形成。
本发明还提供了本文所述的任何发明。
在本公开和所附权利要求的范围内，前述的普通的应用领域仅用于示例而非加以限定。根据本发明的权利要求、说明书和实例，本领域的普通技术人员应该了解与本发明的组合物、方法和过程相关的其他目的和优点。例如，本发明的各个方面和实施例可以以多种组合进行使用，所有这些组合都由本说明书明确地预期。这些其它优点、目的和实施例明确地包括在本发明的范围之内。在此用来说明本发明的背景并且在具体案例中提供有关实践的额外细节的公开和其他材料通过引用而并入，并且为了方便而在所附参考文献中引用。
附图说明
结合在说明书中并且形成说明书的一部分的附图说明了本发明的几个实施方案，并且，与说明书一起用于解释本发明的原理。附图只是为了示出本发明的实施例的目的，不能被认为限制本发明。根据后面的详细描述，结合显示本发明实施例的附图，本发明进一步的目的、特性与优点就很清楚了，在附图中：
图1.核仁素蛋白质的结构。A.人类核仁素由707个氨基酸组成。核仁素可以分解成两个主要部分(Ginisty，H.，Sicard，H.，Roger，B.，and Bouvet，P.Structureand functions of nucleolin(1999)J.细胞科学112，761-772；Srivastava，M.，以及Pollard，H.B.Molecular dissection of nucleolin′s role in growth and cellproliferation：new insights(1999)FASEB J.13，1911-1922)：N-terminal(aa1-308)和C-terminal(aa309-707)。所述N末端结构域由4个长酸性结构域组成，其由不中断重复的谷氨酸和天冬氨酸(A1，A2，A3，A4)构成。C末端结构域由形成4个RNA结合结构域(RBD I，II，III，以及IV)的交替的疏水和亲水区域组成，并且其末端(氨基酸644-707)携带由Arg-Gly-Gly重复组成的高碱性RGG结构域。B.化合物HB19与核仁素的结合结构域的识别需要RGG结构域。通过使用兔网织红细胞裂解液的系统中的体外转录/翻译获得对应于N末端区域和C末端区域的核仁素结构。因此，产生了分别包含氨基酸1-707、1-308和309-707(标记为[35S]Met/Cys)的整个核仁素以及N和C末端部分。然后将标记的粗产物与生物素化的HB19一起培养，且复合物在抗生物素蛋白-琼脂糖-柱上进行纯化。正如所预料的，整个核仁素与HB19相互作用。另一方面，富含酸残基的核仁素的N末端部分根本不与化合物相互作用，而核仁素的C末端包含HB19的靶(Nisole，S.，Said，E.A.，Mische，C.，Prevost，M.C.，Krust，B.，Bouvet，P.，Bianco，A.，Briand，J.P.，以及Hovanessian，A.G.Theanti-HIV pentameric composé HB-19 binds the C-termnal end of nucleolin andprevents anchorage of virus particles in the plasma membrane of target cells(2002)J.Biol.Chem.，277，20877-20886)。已经认识到核仁素的C末端部分包含HB19的靶，就制备得到该区域的各种结构(图2，第1至9)。第一种结构对应于编码包含4个RBD和RGG结构域的人类核仁素的C末端部分的cDNA，与GST蛋白质(谷胱甘肽S-转移酶)融合以允许用抗GST抗体进行检测。也与GST融合的其他的结构对应于该相同部分，但是有一个或多个结构域更短。所有这些蛋白质都是通过大肠杆菌制备的。通过培养粗细菌提取物、表达不同的核仁素结构，使用然后通过固定到抗生物素蛋白-琼脂糖上来纯化的生物素化的HB19，来检验HB19与每种结构相互作用的能力。然后，通过聚丙烯酰胺凝胶和GST分析这些样品，并通过使用抗GST抗体的免疫检测(蛋白质印迹)来揭示这些样品。结果表明RGG结构域的存在对HB19与核仁素的C末端部分的相互作用是必需的。而且，单独的RGG结构域对于该相互作用来说就是足够的。
图2.A.化合物HB19的结构。B.带有作为载体的环状六肽的三价化合物努卡特01的结构，其中环状六肽由D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)交替组成。三个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到每个赖氨酸残基的ε位氨基上。C.带有作为载体的线性肽的五价化合物努卡特2(SEQ ID NO：20)的结构，该线性肽具有序列SEQ ID NO：18的螺旋结构，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到5个赖氨酸残基中的每一个的ε位氨基上，Ac表示CH3-CO-基团。D.带有作为载体的线性肽的五价化合物努卡特3(SEQ ID NO：21)的结构，该线性肽具有序列SEQ ID NO：19的螺旋结构，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到5个赖氨酸残基的每一个的ε氨基上，Ac表示CH3-CO-基团。E.带有包含5个赖氨酸残基的载体的五价化合物努卡特4的结构，所述5个赖氨酸残基通过酰胺键连接在每个赖氨酸残基的ε氨基处，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到5个赖氨酸残基中每一个的α-碳氨基上。F.带有作为载体的线性肽的六价化合物努卡特6(SEQ ID NO：16)的结构，该线性肽具有序列SEQ IDNO：15的螺旋结构，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到6个赖氨酸残基的每一个的ε氨基上，Ac表示CH3-CO-基团。G.带有作为载体的线性肽的六价化合物努卡特7(SEQ ID NO：17)的结构，该线性肽具有序列SEQ ID NO：13的螺旋结构，其中6个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到6个赖氨酸残基的每一个的ε氨基上，Ac表示CH3-CO-基团。H.带有由线性肽组成的载体的四价化合物努卡特8(SEQ ID NO：23)的结构，该线性肽具有螺旋结构(SEQ ID NO：22，包括4个Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)单元)，其中4个假肽KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这4个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上。I.带有由线性肽组成的载体的八价化合物努卡特9(SEQ IDNO：25)的结构，该线性肽具有螺旋结构(SEQ ID NO：24，包括4个Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)单元)，其中8个假肽KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这8个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上。
图3.化合物努卡特6L(N6L)与不同的GAG共同施用的协同效应。N6L+不同的GAG的共同施用对PANC-1(人类胰腺癌)细胞的生长的影响：A.GAG＝肝素；B.GAG＝硫酸软骨素A(Cs-A)；以及C.GAG＝硫酸软骨素C(Cs-C)。每天用混合物N6L/GAG(约20μM N6L对应0μg/ml至1000μg/ml GAG)处理细胞。每天都更换培养基(DMEM5％SVF)。通过MTT测试评价细胞增殖。可以观察到单独用GAG对细胞增殖没有影响。
图4.化合物努卡特6L(N6L)和不同的GAG共同施用的协同效应。N6L+不同的GAG的共同施用对U87-MG(人类胶质母细胞瘤-星形细胞瘤)细胞的生长的影响：A.GAG＝肝素；B.GAG＝硫酸软骨素A；以及C.GAG＝硫酸软骨素C。每天都用混合物N6L/GAG(约20μM N6L对应0μg/ml至1000μg/mlGAG)处理细胞。每天都更换培养基(DMEM5％SVF)。通过MTT测试评价细胞增殖。可以观察到使用GAG对细胞增殖没有影响。
图5.通过N6L和肝素处理PANC-1细胞：A：PANC-1细胞对照，B：用20μM N6L处理的PANC-1细胞，C：用20μM N6L和10μg/ml肝素处理的PANC-1细胞，以及D：用20μM N6L和100μg/ml肝素的混合物处理的PANC-1细胞。
图6.通过N6L和肝素处理U87-MG细胞：A：U87-MG细胞对照，B：用20μM N6L处理的U87-MG细胞，C：用20μM N6L和10μg/ml肝素处理的U87-MG细胞，以及D：用20μM N6L和100μg/ml肝素的混合物处理U87-MG细胞。用N6L/GAG比值为20μM/10μg/ml处理的细胞显示的位于细胞上的“气泡”比用其他比值观察到的“气泡”小得多。
图7.努卡特-GAG微球体。使用20μM N6L/100μg/ml肝素，观察到的U87-MG细胞的微球体。
图8.气泡是由20μM N6L和GAG构成的微球体。使用100μg/ml GAG观察到的最大气泡具有约500nm的大小。该尺寸与培养基中的GAG的浓度正相关。
图9.用肝素培养N6L导致形成纳米微粒，这些纳米微粒增加了N6L对PANC1细胞的贴壁依赖性增殖的抑制效应。用N6L或用浓度递增的肝素(范围为0.1～1000μg/ml)预培养的N6L来处理类似数量的PANC1细胞。每天都处理细胞，持续4天。第4天结束时，使用MTT试验对细胞数目定量。我们观察到：经过三天处理后，N6L抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖。然而，我们的结果显示，用10、100或1000μg/ml肝素预培养N6L导致形成了诱导肽的抑制效应的纳米颗粒。我们观察到在10μg/ml肝素的浓度下该效应最大，并且值得注意的是，抑制几乎高达90％。结果是至少三次独立实验的平均值±SD。**p＜0.01，***p＜0.001。
图10.使用硫酸软骨素-C(Cs-C)培养N6L导致形成纳米微粒，该纳米颗粒增加了N6L对PANC1细胞的贴壁依赖性增殖的抑制效应。用N6L或用浓度递增的Cs-C(范围为0.1～1000μg/ml)预培养的N6L来处理类似数量的PANC1细胞。每天都处理细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验对细胞数目定量。我们观察到：经过三天处理后，N6L抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖。然而，我们的结果显示，使用10、100或1000μg/ml Cs-C预培养N6L导致形成了诱导肽的抑制效应的纳米颗粒。我们观察到在10μg/ml Cs-C的浓度下该效应最大，并且值得注意的是，抑制几乎高达90％。结果是至少三次独立实验的平均值±SD。***p＜0.001。
图11.用肝素培养N6L导致形成纳米微粒，该纳米微粒增加了N6L对U87-MG细胞的贴壁依赖性增值的抑制效应。用N6L或用递增浓度的肝素(范围为0.1～1000μg/ml)预培养的N6L来处理类似数量的U87-MG细胞。每天都处理细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们观察到：经过三天处理后，N6L抑制了U87-MG细胞的贴壁依赖性增殖。然而，我们的结果显示，使用10、100或1000μg/ml的肝素预培养N6L导致形成了诱导肽的抑制效应的纳米颗粒。我们观察到在10μg/ml肝素的浓度下该效应最大，并且值得注意的是，抑制几乎高达90％。结果是至少三次独立实验的平均值±SD。***p＜0.001。
图12.用硫酸软骨素-C(Cs-C)培养N6L导致形成纳米微粒，该纳米微粒增加了N6L对U87-MG细胞的贴壁依赖性增值的抑制效应。用N6L或用递增浓度的Cs-C(范围为0.1～1000μg/ml)预培养的N6L来处理类似数量的U87-MG细胞。每天都处理细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们观察到：经过三天处理后，N6L抑制了U87-MG细胞的贴壁依赖性增殖。然而，我们的结果显示，用10、100或1000μg/ml肝素预培养N6L导致形成了诱导肽的抑制效应的纳米颗粒。我们观察到在10μg/ml肝素的浓度下该效应最大，并且值得注意的是，抑制几乎高达90％。结果是至少三次独立实验的平均值±SD。***p＜0.001。
图13.与N6L和由发挥轻微抑制效应的少量带电的GAG分子所构成的纳米微粒相比，由高度带电的GAG分子构成的纳米微粒强烈地抑制PANC1细胞的贴壁依赖性增殖。在5％FBS的存在下，用递增浓度的N6L或纳米微粒来处理类似数量的PANC1细胞，所述纳米微粒由递增浓度的N6L和10μg/ml的不同GAG分子构成。每天都处理这些细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们观察到在具有IC50＝15μM的剂量依赖方式下，N6L抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖。然而，我们的结果表明用高度带电的GAG分子、肝素、硫酸软骨素-A(Cs-A)、硫酸软骨素-B(Cs-B)、硫酸软骨素-C(Cs-C)预培养N6L导致形成纳米微粒，该纳米微粒强烈地抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖，且在5μM(IC50＝2.5μM)的浓度下该效应最大。由更高浓度的N6L构成的纳米微粒发挥了与5μM浓度类似的效果。与高度带电的GAG分子相比，用部分带电的硫酸乙酰肝素或与不带电的透明质酸预培养N6L不会形成任何纳米微粒，并且以与N6L相似的方式抑制了PANC1的增殖。
图14.在处理1天之后，可观察到纳米微粒对PANC1细胞的贴壁依赖性增殖的抑制效应，而N6L在4次处理之后才发挥作用。在5％FBS的存在下，用20μM的N6L或由20μM的N6L和10μg/ml的肝素或Cs-C构成的纳米微粒处理类似数量的PANC1细胞。处理细胞如下：a.处理第1天，并使细胞增殖另外3天，b.处理第1天和第2天，并使细胞增殖另外2天，c.处理前3天，并使细胞增殖另外1天，以及d.处理4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们的结果表明在处理1天之后N6L没有发挥任何抑制效应，且在4天之后可观察到效果最大(相对于对照的50％抑制率)。有趣的是，我们观察到：在处理1天之后，由肝素或Cs-C构成的纳米微粒以类似于持续4天之后的N6L活性的方式抑制了PANC1的增殖。在每次处理之后，纳米微粒的抑制效应增强了，且在4天的处理结束时，有少量的细胞仍然存活。
图15.N6L或纳米微粒处理1天会抑制U87-MG细胞的贴壁依赖性增殖，但是纳米微粒的效果要比N6L强。在5％FBS的存在下，用20μM的N6L或由20μM的N6L和10μg/ml的肝素或Cs-C构成的纳米微粒处理类似数量的U87-MG细胞。处理细胞如下：a.处理第1天，并使细胞增殖另外3天，b.处理第1天和第2天，并使细胞增殖另外2天，c.处理前3天，并使细胞增殖另外1天，以及d.处理4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们观察到：在处理一天之后，N6L和纳米微粒都抑制U87-MG的增殖，但是纳米微粒的效果要比N6L强。在每次处理之后，纳米微粒的抑制效应都增强了，且在第4天结束时在N6L的情况下一些细胞仍然存活，但是在纳米微粒的情况下大部分细胞已死亡。
图16、图17、图18和图19.调节纳米微粒活性的因子的研究(处理阶段和N6L浓度)。每天使用递增浓度的N6L或纳米微粒处理类似数量的PANC1细胞2小时，所述纳米微粒在以最终比例8∶1和16∶1混合N6L和Cs-C之后形成。在第7天结束时，用MTT试验定量细胞数目。我们的结果表明在7天的每天2小时处理之后，N6L和纳米微粒仍然保留活性，这证明了这些细胞对该处理没有产生抗性，也表明了每天2小时的处理是让N6L和纳米微粒发挥它们生物活性的最短要求时间。另外，我们观察到由N6L和Cs-C以比值为8∶1构成的纳米微粒比以比值为16∶1构成的纳米微粒或单独使用N6L更强地抑制PANC1细胞的贴壁依赖性增殖。最后，我们假定N6L和Cs-C之间的比值不是纳米微粒活性的关键因子，因为对于相同比值但浓度不同的N6L和Cs-C形成的纳米微粒而言效果不同。
图20.与N6L和由发挥微小的抑制效应的少量带电的GAG分子构成的纳米微粒相比，由高度带电的GAG分子构成的纳米微粒强烈地抑制HUVEC细胞的增殖。在5％FBS的存在下，用递增浓度的N6L或纳米微粒来处理类似数量的HUVEC细胞，所述纳米微粒由N6L和不同的GAG分子构成。每天都处理这些细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们观察到以具有IC50＝15μM的剂量依赖方式，N6L抑制HUVEC细胞的增殖。然而，我们的结果表明用高度带电的GAG分子、肝素、硫酸软骨素-A(Cs-A)、硫酸软骨素-B(Cs-B)、硫酸软骨素-C(Cs-C)预培养N6L导致形成纳米微粒，该纳米微粒强烈地抑制了HUVEC的增殖，且在5μM(IC50＝2.5μM)的浓度下效果最大。由更高浓度的N6L构成的纳米微粒发挥了与5μM浓度的N6L类似的效果。与高度带电的GAG分子相比，用部分带电的硫酸乙酰肝素或与不带电的透明质酸预培养N6L不会形成任何纳米微粒，并且以与N6L(IC50＝10μM)相似的方式抑制HUVEC的增殖。
图21.如通过鸡胚CAM试验所测定，由N6L+肝素或N6L+Cs-C，而非只有N6L构成的纳米微粒强烈地抑制体内血管生成。用20μM的N6L或纳米微粒培养面积为1cm2的鸡胚CAM(用硅环限制)，所述纳米微粒由20μM的N6L和10μg/ml的肝素或Cs-C构成。48小时之后，测定血管的总长度。我们观察到N6L对体内血管生成没有影响，这与由抑制新血管形成的肝素或Cs-C(分别为50％和70％)构成的纳米微粒形成对比。该结果是至少三次独立实验的平均值±SD。
图22.纳米微粒，而非N6L，诱导吉西他滨的活性。单独用递增浓度的吉西他滨，或递增浓度的吉西他滨与N6L、Cs-C或由Cs-C构成的纳米微粒结合处理类似数量的PANC1细胞。在5％FBS的存在下，每天处理细胞持续4天。在第四天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。我们的结果表明吉西他滨轻微地抑制PANC1的增殖。而且，将吉西他滨与N6L或Cs-C混合不会产生任何附加效应(additive effect)。但是，在吉西他滨与纳米微粒混合的情况下观察到了附加效应。
具体实施方式
以下提供了本发明的详细描述，用于帮助本领域中的技术人员实施本发明。本领域的普通技术人员可以对本文所述的实施例进行修改和变化，而不脱离本发明的精神或范围。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明中使用的术语仅用于描述具体实施例，而不是对本发明的限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其它参考文献以其全部内容纳入本文作为参考。
当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中明显地另有所指，所述中间值是下限单位的十分之一)和其它所说明的或者在所说明范围中的中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上下限可以独立地包含在更小的范围内且也属于本发明，除了任何明确超出上述特定范围之外的限定值。当所示出的范围包含该两界限值的其中一者或两者，除了该些界限值以外的范围亦属于本发明。
尽管与此处描述相似或等价的任一方法和材料也可以用在本发明的实践和测试中，但是，现在描述的是优选的方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。以下参考文献，其全部公开内容在此引入作为参考，为技术人员提供本发明使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，微生物学和分子生物学词典(第2版，1994)；科学和技术剑桥词典(Walker编，1988)；遗传学词典，第5版，R.Rieger等人(编)，Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham，Harper Collins生物学词典(1991)。正如本文所使用的，以下术语除非另外规定具有在下面对其所赋予的含义。然而，应当理解，也可能具有普通专业技术的本领域人员已知的或理解的其他含义，并且是在本发明的范围之内。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其全部内容纳入本文作为参考。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，材料、方法和实施例只是示意性的，并非限制性的。
必须指出，如此处以及在附带的权利要求中所使用的，单数形式的“一”、“和”、“该”包括复数意义，除非上下文另有明确指示。本文所用的所有技术和科学术语具有相同的含义。
为了更容易理解本发明，首先对某些术语进行定义。
正如本文所使用的，“衍生物”是指从原初的化合物直接地或通过修饰或部分取代而形成的组合物(composition)。如本文所使用的，“类似物(analog)”是指与原初化合物结构类似但不相同的组合物。
术语“肽”可以指但决不限于重组多肽，该重组多肽具有通过肽键连接的至少4个氨基酸。此外，本发明的肽可以包括氨基酸模拟物(mimentic)和类似物。肽的重组形式可以根据本领域技术人员所公知的标准方法和规程来生产，包括例如在原核和/或真核细胞中的重组蛋白质的表达，随后进行一个或多个分离和纯化步骤，和/或使用肽合成器来化学地合成肽或其部分。
术语“具有生物活性的(biologically active)”或“生物活性的(bioactive)”可以指但决不限于药剂(诸如本发明所提供的努卡特)实现生理变化或者响应的能力。例如，在细胞水平上，例如，该响应作为生长和/或存活能力、基因表达、蛋白质数量、蛋白质修饰、蛋白质活性、或它们的组合中的变化；在组织水平上；在全身水平上；或在生物体水平上可以检测到该响应。用于监测这些表型变化的技术包括，例如，测量：配基和其受体在细胞内或细胞上的结合、细胞信号传导途径的活化、细胞反应的刺激或活化、生物活性分子从细胞中的分泌或释放、细胞增殖和/或分化、或它们的组合。在一个实例中，本发明提供的肽的生物活性可以通过检测其抑制细胞生长和/或增殖的能力来测定。
术语“有效量/剂量”、“药物学有效量/剂量”、“药物学有效量/剂量”或“治疗有效量/剂量”可以指但决不限于活性药物成分的量/剂量，该活性药物成分的量/剂量足以阻止、抑制、减轻、延缓或治疗(在某种程度上减轻一种症状，优选地减轻所有)障碍或疾病状态的症状。有效量取决于疾病的类型、所使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物类型、所考虑到的特定哺乳动物的身体特点、并行药物以及那些医学领域的技术人员认识到的其他因子。通常，根据药剂的效力，施用活性成分的量为每天每千克体重在0.1mg和1000mg之间。可以通过标准药物程序在细胞培养或实验动物中测定这些化合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(导致群体50％死亡的剂量)和ED50(在50％群体中是治疗有效的剂量)。
毒性效应和治疗效应之间的剂量比值即为治疗指数，可以表示为比值LD50/ED50。优选的化合物具有大的治疗指数。虽然可能使用显现毒副作用的化合物，但应小心设计将这类化合物靶向到感染组织的输送系统，以使对未感染细胞的可能损伤减至最小，从而降低副作用。从细胞培养和动物研究得到的数据可用于制定用于人的化合物的剂量范围。这种化合物的剂量优选在循环浓度范围之中，包括具有很少或没有毒性的ED50。根据所用剂型和给药途径，剂量可能在此范围内变动。对于本发明方法中所用的任何化合物，最初都可以从细胞培养分析中评价治疗有效剂量。与细胞培养中的测定一样，可能在动物模型中配制剂量，以达到包括IC50(即，达到症状一半最大抑制的待测化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用此类信息更准确地确定人用剂量。例如，可通过高效液相层析测定血浆中的水平。
术语“药理组合物”、“治疗性组合物”、“治疗制剂”或“药学可接受的制剂”可以指但决不限于允许有效分配本发明所提供的药剂的组合物或配剂，该组合物或配剂是以一种适于施用到最适合于发挥其期望活性的物理位置的形式，例如，全身施用。
适用于带有例如本发明提供的努卡特的制剂的药剂的非限制性实施例包括：肉桂酰基、PEG、磷脂或亲脂性部分、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(如普卢兰尼克P85)，该P-糖蛋白抑制剂能够增加药物进入到各种组织，例如CNS(Jolliet-Riant和Tillement，1999，Fundam.基本临床药理，13，16-26)；可生物降解聚合物，例如用于植入后的持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球体(Emerich，DF等人，1999，细胞移植，8，47-58)麻省，剑桥市，Alkermes公司；以及例如由聚氰基丙烯酸制成的装载纳米粒子，其可将药物穿过血脑屏障进行递送并且可以改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry，23，941-949，1999)。术语“药物学可接受的”或“药理学可接受的”可以指但决不限于实体和组合物，该实体和组合物在适当地施用到动物或人时不会产生相反的、过敏性的或其它不希望的反应。
术语“药物学可接受的载剂”或“药理学可接受的载剂”可以指但决不限于与药学给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。适合的载剂描述在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences中，它是本领域的标准参考书，结合在此作为参考。这类载剂或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性载剂，例如固定油。此类介质和试剂针对药物活性物质的使用为本领域所熟知。除了任一常规基质或试剂与活性化合物不相容的情况，其在组合物中的用途都涵盖在内。也可将增补的活性化合物结合到所述组合物中。
术语“系统给药”是指一种给药途径，例如，肠道或非肠道给药，且导致药剂的全身分布，从而导致血流中的药剂的全身吸收或累积，并随之分布遍及整个身体。适当的形式部分取决于用途或进入途径，例如，口服、透皮或者通过注射。这种形式不应阻止所述组合物或制剂到达靶细胞(即，带负电的聚合物需要被输送到的细胞)。例如，注射到血流中的药理学组合物应该是可溶的。其它因素是本领域已知的，并包括诸如防止所述组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式的考虑。导致全身吸收的给药途径包括但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内给药。药物进入循环中的速度已经显示是分子量或尺寸的函数。脂质体或包括本发明组合物的其它药物载体的应用，可潜在地定位如某种组织类型(例如网状内皮系统(RES)的组织)中的药物。可促进药物与细胞(如淋巴细胞和巨噬细胞)表面关联的脂质体制剂也是有用的。
术语“保守突变”是指核酸的取代、缺失或添加，该核酸改变、添加或缺失在编码序列中的单个氨基酸或小数量的氨基酸，其中，该核酸的改变导致化学性质类似的氨基酸的取代。可充当互为保守性取代体的氨基酸包括如下的：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水性：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水性：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。另外，由于保守变异而有所不同的序列一般同源。
术语“结合”可以指但决不限于在两个分子(例如，化合物、氨基酸、核苷酸、多肽或核酸)之间的直接或间接的物理或化学的相互作用。结合包括共价、氢键、离子、非离子、范德华力和疏水的相互作用等。
术语“细胞”可以指但决不限于其通常的生物学意义，而且不是指整个多细胞生物体。例如，该细胞可以是在体内、体外或离体，例如，在细胞培养物中，或存在于多细胞生物体中，该多细胞生物体包括，例如，鸟类、植物和哺乳动物，该哺乳动物例如人、牛、羊、猿、猴、大猩猩、狗和猫。该细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)或真核细胞(例如，哺乳动物或植物细胞)。
本发明涉及到令人吃惊且意外的发现，即本文所述的努卡特化合物或实体与GAG相互作用来调解和/或增强其有益的治疗活性，如抗增殖活性。例如，努卡特与GAG的组合物，例如肝素，可以显著地增加努卡特的抗癌效力。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种组合物，优选地是一种治疗性组合物，该治疗性组合物含有有效量的努卡特，例如HB-19或N6L，如本文所述，以及与其组合的至少一种糖胺聚糖(GAG)。
本发明还提供了一种组合物，特别是一种治疗性组合物，该治疗性组合物包括GAG和本文所述的努卡特的复合物。
还令人吃惊且意外地发现，即当本文所述的努卡特与GAG混合时形成了微球体。因此，在某些方面，本发明还提供了一种组合物，特别是包含微球体的治疗性组合物，该微球体包括本文所述的努卡特和GAG。在另一个实施方案中，本发明提供了一个或多个包含了努卡特和GAG的组合的微球体。在某些实施方案中，努卡特是肽或假肽，例如HB-19或N6L。正如本文所使用的，术语“努卡特”可以指但不限于核仁素结合的化合物或实体(entity)，例如，核仁素抗体或核仁素拮抗剂，其包括例如核仁素结合的肽或假肽、衍生物或其类似物(统称为“努卡特肽”)。在某些实施方案中，努卡特化合物包括载体，在该载体上接枝有至少3个假肽单元，所述化合物为式(I)：
其中
每个X独立地代表任何氨基酸；
Y1和Y2独立地选自具有碱性侧链的氨基酸；
Z选自脯氨酸，该脯氨酸可选地在γ、β和δ位被取代；天然的或非天然的N-烷基氨基酸；二烷基氨基酸；环状的二烷基氨基酸；哌可酸或其衍生物；
n和i各自为0或1；
m是0和3之间的整数；
k是大于或等于3的整数；以及
Ψ表示经修饰的肽键，其对于至少一种蛋白酶比标准肽键明显更有抗性。
在本发明的上下文中，术语“载体”是指任何药学上可接受的分子，换句话说，其没有固有毒性，在该载体上可接枝至少3个式(I)的假肽单元。因此，可接受的载体必须具有足够的尺寸以允许至少3个式(I)的假肽单元接枝在其上，优选地允许3到8个式(I)的假肽单元接枝在其上。优选地，这种可接受的载体也应该足够大以允许式(I)的至少3个，优选为3到8个假肽单元可以一起在一个或多个核仁素分子的RGG结构域内进行相互作用。此外，该载体必须不是免疫原性的。
这样的载体可以选自线性肽或环肽、线性或环状的类肽(N-取代的甘氨酸低聚物)、折叠体(在溶液中具有强烈的倾向采用紧凑、轮廓分明并可预测的构型的低聚物或聚合物)、线性聚合物或球形树状分子(大分子组成的或按照树状方法围绕多官能团中心核进行组合的聚合物)、糖或纳米颗粒。有利的是，所述载体选自线性肽或环肽，或甚至线性或环状类肽。
线性肽的使用(参见图2中的努卡特肽HB19，努卡特2-3，和努卡特6-9的结构)允许容易地合成载体，并且发明人使用化合物HB19和N6L得到的结果表明，这样的载体实际上确实解决了本申请所提出的技术问题。有利的是，本发明中用作载体的线性肽含有大于25％比例的赖氨酸。更准确地说，当线性肽在本发明中用作载体时，假肽单元优选地接枝到赖氨酸的ε位上。因此，当线性肽在本发明中用作载体时，它优选地包括至少与将要接枝在赖氨酸上的假肽单元的数量一样多的赖氨酸。
例如，载体线性肽可以具有选自如下的序列：KKKGPKEKGC(SEQ IDNO：1)、KKKKGC(SEQ ID NO：2)、KKKKGPKKKKGA(SEQ ID NO：3)或KKKGPKEKAhxCONH2(SEQ ID NO：4)，其中，Ahx代表己氨基酸，而CONH2代表这样的事实，即羧酸基团由酰胺基团所替代，AhxCONH2代表(2S)-2-氨基己酰胺；或者具有由2-4个单元(KAKPG，SEQ ID NO：12)组成的线性序列，即序列AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2(SEQ ID NO：13，其中Ac代表乙酰基CH3-CO-，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2所替代)。有利的是，载体线性肽可以是肽KKKGPKEKAhxCONH2(例如参见图2A中的HB19，SEQ ID NO：5，其具有作为载体的这种线性肽。)，或者可以是肽AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH2(SEQ ID NO：13，其中Ac表示乙酰基CH3-CO-，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2所替代，例如图2G中的努卡特7，SEQID NO：17，其具有作为载体的这种线性肽)。
在这些线性肽中，已知有一些采用螺旋结构。这些线性肽也可以在本发明中用作载体。螺旋结构中的这种线性肽载体包含由大于或等于3的整数个即3至8个肽单元的重复所组成的载体，这些肽单元的序列分别为Aib-Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：6)或Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)，其中Aib代表2-氨基-异丁酸。由于这些单元中的每一个都由单个赖氨酸残基(Lys)组成，需要与待接枝在式(I)的假肽单元上一样多的这些单元的重复。
例如，为了获得带有4个式(I)的假肽单元的四价化合物，该载体可以是形成式Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：22)的螺旋结构的线性肽，其中Ac代表CH3-CO-基团，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2所替代(例如参见图2H中的努卡特8，SEQ ID NO：23，其具有作为载体的这种肽)。
可选地，为了获得带有5个式(I)的假肽单元的五价化合物，该载体可以是形成式Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：8)或Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly(SEQ IDNO：9)的螺旋结构的线性肽。有利的是，使用形成从SEQ ID NO：8和SEQID NO：9衍生出的结构式的螺旋结构的线性肽。该结构式选自Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：18，其中Ac代表乙酰基CH3-CO-，并且CONH2指的是甘氨酸的COOH羧酸基团由酰胺基团CONH2所取代，例如参见图2C中的努卡特2，SEQ ID NO：20，其具有作为载体的这种肽)或选自Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：19，其中Ac基团表示乙酰基CH3-CO-，并且CONH2指的是甘氨酸的COOH羧酸基团由酰胺基团CONH2替代，例如参见图2D中努卡特3，SEQ ID NO：21，其具有作为载体的这种肽)。
可选地，为了获得带有6个式(I)的假肽单元的六价化合物，该载体可以是形成式Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：14，其中Ac表示CH3-CO-基团，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2取代)或者式Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：15，其中Ac表示CH3-CO-基团，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2替代，例如参见图2F中努卡特6，SEQ ID NO：17，其具有作为载体的这种肽)的螺旋结构的线性肽。
可选地，为了获得带有8个式(I)的假肽单元的八价化合物，该载体可以是形成式Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：24)的螺旋结构的线性肽，其中Ac代表CH3-CO-基团，并且CONH2指的是甘氨酸的羧酸基团COOH由酰胺基团CONH2替代(例如参见图2I中的努卡特9，SEQ ID NO：25，其具有作为载体的这种肽)。
有利地是，环状的肽或类肽也可用于作为载体。特别地，这允许结构的柔性能被限制。载体环肽或类肽可以主要选自六-、八-、十-或十二-环肽，其优选地由交替的L(左旋)和D(右旋)构型的氨基酸残基(D，L-环肽)组成或由N-烷基甘氨酸残基链(环状类肽)所组成。带有这种载体的化合物的实例是环状六肽，该环状六肽由交替的构型(D)的丙氨酸(A)残基以及构型L的赖氨酸残基(K)组成，带有3个KPR单元，并且在K和P之间带有Ψ(-CH2N-)键，如图2B所示(化合物努卡特01)。
也可以使用通过酰胺键在每个赖氨酸残基的ε氨基基团处连接的由5个赖氨酸残基形成的载体(参见在图2E中化合物努卡特4)。
有利地是，根据本发明的式(I)化合物的载体是选自环状六肽的载体，该环状六肽的组成为：
交替的构型D的碱性(A)残基和构型L的赖氨酸(K)残基(参见图2B中化合物努卡特01)；
5个赖氨酸残基，其通过酰胺键在每个赖氨酸残基的ε位氨基处连接，(参见在图2E中化合物努卡特4)，以及
线性肽，其序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24。
在本发明的上下文中，用于假肽单元的术语“接枝”指的是通过共价键直接地或者是通过假肽和载体之间的间隔化合物的媒介作用被结合在载体上。因此，在一个特定的实施例中，假肽单元被直接接枝在载体上，在它们与载体之间没有间隔化合物。在另一个实施方案中，假肽单元通过间隔物的媒介作用接枝到载体上。可接受的间隔物包括乙二醇、哌嗪类型的化合物或氨基己酸或β丙氨酸类型的氨基酸。
在其中载体是一种线性肽或环肽，并且其中假肽单元直接接枝在肽上的情况下，在肽和假肽单元之间的结合优选地在肽载体的赖氨酸残基处进行，在α或ε位置的氨基处进行，优选地在赖氨酸的ε位(在侧链上)的氨基处进行。因此，有利的是，假肽单元在肽载体上的直接接枝是通过酰胺键来进行，该酰胺键处于假肽单元的C-末端位置上的氨基酸的羧酸基团COOH与赖氨酸残基的氨基(优选地在赖氨酸的ε位置(在侧链上)的氨基)之间。
在根据本发明的化合物中，载体上接枝了至少3个假肽单元。事实上，本发明人的结果显示了与核仁素的RGG结构域(参见图1)的结合对于化合物HB19和衍生物或其类似物的抗肿瘤疗效的重要性。结合到核仁素的RGG结构域是通过多个假肽单元(如结合到式(I)中的假肽单元)的多价呈现而获得的。对于其载体是序列为KKKGPKEKGC、KKKKGC、KKKKGPKKKKGA或KKKGPKEKAhxCONH2的线性肽的化合物而言，本发明人已证明少于3个单元(k＜3)，与核仁素结合的效率较低，并且抗肿瘤疗效可能较小。因此，根据本发明的化合物包括至少3个假肽单元接枝到载体上，其中k为大于或等于3的整数。因此，根据本发明的化合物有利地呈现出3至8个假肽单元(3≤k≤8)接枝在载体上。此外，本发明人已证明当5或6个假肽单元接枝到载体(k＝5)上时的活性是最佳的，因为当假肽单元的数目更高时，与核仁素结合的效率不会增加了。因此优选地，在式(I)的化合物中，k是在3和8之间，优选地是在4和7之间、在4和6之间、在4和5之间或者在5与6之间。更有利的是，在式(I)中化合物中，k等于5或者更好地甚至等于6。
在本发明的上下文中，术语“任何氨基酸”指任何天然的或合成的氨基酸，其可能由于一个或多个取代基的存在而被修饰。更准确地说，术语氨基酸是指具有以下通式结构的α胺化的氨基酸：
Figure BDA00003300729400221
其中R表示氨基酸的侧链。因此，在本发明的上下文中，R表示侧氨基酸或非侧氨基酸的侧链。术语“天然氨基酸”是指经发现天然存在于活体体内的任何氨基酸。因此，天然氨基酸包括在翻译期间通过纳入蛋白质的mRNA进行编码的氨基酸，还包括发现的天然存在于体内的其它氨基酸，这些其它氨基酸是代谢过程中的产物或者副产物，例如，通过源于L-精氨酸的精氨酸酶进行尿素生产过程所产生的鸟氨酸。因此，在本发明中，所用的氨基酸可以是天然的或者非天然的。即，天然氨基酸通常具有L构型，但是，根据本发明，氨基酸也可以具有L构型或D构型。此外，R当然不限于天然氨基酸的侧链，而是可以进行自由选择。
在式(I)的化合物的假肽单元中，Z要么缺失(i＝0)要么存在(i＝1)，然后，Z选自：
脯氨酸，其可能在γ、β或δ位被羟基、胺基、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C5-C12芳基、C5-C14芳烷基、C5-C12杂芳基(有利地为C5杂芳基)取代，这些基团本身可能被选自卤原子、NO2、OH、C1-C4烷基、NH2、CN、三卤代甲基、C1-C4烷氧基、C1-C4二烷基氨基、胍基基团、巯基基团的1至6个取代基所取代；
N-烷基氨基酸，天然的或非天然的；
二烷基氨基乙酸(例如异丁氨基酸)；
环状的二烷基氨基酸；或
哌可酸或其衍生物。
术语“C1-Ci烷基”是指式-CjH2j+1的直链或支链饱和烃基，式-CjH2j+1中1≤j≤i。因此，C1-C10烷基包括C1烷基(甲基)、C2(乙基)、C3(正丙基或异丙基)、C4(正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)、C5(例如：正戊基、新戊基、异戊基、叔戊基)和C6至C10烷基。术语“C1-C10烯基(alkanyl)”指的是1至10个碳原子组成的直链或支链的不饱和烃基，并且其包括至少一个C＝C双键。术语“C1-C10炔基”指的是带有1至10个碳原子和至少一个C≡C三键的直链或支链的不饱和烃基。术语“C5-C12芳基”指的是带有5-12个碳原子的芳族多环或单环烃基。术语“C5-C14芳烷基”是指总共具有5-14个碳原子的烷基和芳基的组合。术语“C5-C12杂芳基”指一种芳基基团，其中通常携带5至12个碳原子的烃链上的至少一个碳原子由选自N、O或S的另一个原子所取代。因此，术语“C5杂芳基”指一种芳基基团，其中烃链上的5个碳原子中的至少一个由选自N、O或S的另一个原子所取代。术语”C1-C4烷氧基”表示式-O(O)C-(C1-C4烷基)、-O(O)C-(C4-C12环烷基)、-O(O)C-(C4-C12芳基)、-O(O)C-(C4-C12芳烷基)、或-O(O)C-(C4-C12杂芳基)的基团。有利地，在式(I)的化合物中，这样的“C1-C4烷氧基”选自式-O(O)C-(C1-C4烷基)、-O(O)C-(C4环烷基)、-O(O)C-(C4芳基)-O(O)C-(C4芳烷基)或-O(O)C-(C4杂芳基)的基团。术语“C1-C4二烷基氨基”是指式-N(C1-C4烷基)2的基，其中每个烷基是相同的或不同的。
术语“N-烷基氨基酸”是指其中胺基中的一个氢原子由有可能被取代的C1-C10烷基链或C5-C14芳烷基(优选地是C5-C10，即C10)所取代的任何氨基酸。N-烷基氨基酸的实例包括N-甲基甘氨酸或肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸等。术语“二烷基氨基酸”是指其中(在中心碳上或胺基上的)2个氢原子由有可能被取代的C1-C10的烷基链或C5-C14芳烷基(优选地是C5-C10，即C10)所取代的任何氨基酸。二烷基氨基酸的例子包括2-氨基-异丁酸(Aib)、氨基环丙烷羧酸、硬脂酸等。
有利地，Z存在，并且因此i＝1。同样有利的是，如前所述，当Z存在时(i＝1)，那么Z是脯氨酸，可能在γ、β或δ处被取代。
在式(I)的化合物的假肽单元中，Y1和Y2选自带有碱性侧链的氨基酸。术语“带有碱性侧链的氨基酸”是指其侧链R具有大于7的pKa值(pKa(R)＞7)的任何天然或非天然氨基酸。因此，任何氨基酸都可用于Y1和Y2，只要它的侧链具有大于7的pKa值，该pKa值优选地是大于7.5、大于8、大于8.5或大于9。特别地，在其侧链具有大于7的pKa值的天然氨基酸中，包括赖氨酸(K，pKa(R)≈10.5)、精氨酸(R，pKa(R)≈12.5)，鸟氨酸(赖氨酸的次级同系物pKa(R)≈10.8)，它们常被认为是天然碱性氨基酸。因此，在一个有利的实施例中，Y1和Y2各自选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和鸟氨酸。甚至更有利地是，Y1是赖氨酸(K)，而Y2是精氨酸(R)。然而，可以使用其它非天然氨基酸来代替，只要它们的侧链R的pKa值大于7、优选大于7.5、大于8、大于8.5或大于9。
在本发明的化合物中，与核仁素的RGG结构域结合所必需的假肽单元为式(II)的子单元：
Figure BDA00003300729400241
其中Y1和Y2为如上所定义的那样。然而，由几个如上所定义的氨基酸组成的基本子单元在一端或另一端处的存在并不会使得防止结合至核仁素。这就是为什么式(II)的基本子单元可以在一端和/或另一端包括0至3个在式(I)中分别由(X)n和(X)m表示的任何氨基酸，其中n等于0或1，且m为0和3之间的整数。有利的是，存在于式(II)的基本子单元的一端和/或另一端处的氨基酸的数目很低，换句话说，有利地是，n有利地是0，而m是在0和2之间的整数，有利地为0或1，有利地是0。因此，在一个有利的实施方案中，n和m都等于0。
在本发明的化合物中，式(II)的子单元包括经修饰的肽键ψ，其对于至少一种蛋白酶比标准肽明显更具有抗性。
术语“标准肽键”是指式(-CONH-)的酰胺键，通常存在于天然蛋白质的2个氨基酸之间。这样的键对蛋白酶的作用敏感。术语“经修饰的肽键ψ”是指2个氨基酸之间的一种化学键，其化学式不同于式(-CONH-)的标准肽键。该经修饰的肽键ψ是这样的，即它对于至少一种蛋白酶明显比式(-CONH-)的标准肽键更有抗性。术语“蛋白酶”，也称为“肽酶”或“蛋白水解酶”，是指使得蛋白质中的标准肽键裂解的任何酶。这种过程被称为蛋白酶解。这包括使用水分子，水分子使得蛋白酶被归类为水解酶。所述蛋白酶即包括进行蛋白质的N-末端裂解的称为N-肽酶的蛋白酶。就无经修饰的肽键的肽的体内稳定性而言，这些蛋白酶特别不方便。这就是为什么式(I)的化合物的假肽单元包括经修饰的键ψ，该经修饰的键ψ在Y1和Z之间(如果i＝1)或Y1和Y2之间(如果i＝0)，使得式(II)的子单元的抗性显著增加，即对这些N-肽酶的抗性显著增加。因此，ψ键使得很有可能显著增加对至少一个N-肽酶的抗性。这使得可以显著地增加式(I)的化合物在体内和体外的半衰期。例如，在37℃下，在人血清或胎牛血清中，具有经修饰的键ψ的HB19具有超过24小时的半衰期，而在这些相同的条件下，具有标准肽键而不是ψ键的化合物具有1小时的半衰期。
此外，本发明人已经发现，经修饰的肽键ψ的存在也使得与核仁素结合的效率有可能显著地增加。这种现象可能是由于这允许努卡特肽与核仁素形成了不可逆的复合物。
已知各种化学键可能会显著增加对至少一种蛋白酶的抗性。因此，在一个有利的实施例中，ψ表示还原键(reduced bond)(-CH2NH-)或(-CH2N-)，(在如同与脯氨酸结合一样，结合发生在仲胺基水平的情况下)、逆反键(retro-inverso bond)(-NHCO-)、亚甲氧基键(-CH2-O-)、硫代亚甲基键(-CH2-S-)，卡巴键(carba bond)(-CH2CH2-)、酮基亚甲基键(ketomethylenebond)(-CO-CH2-)、羟基亚乙基键(-CHOH-CH2-)、(-N-N-)键、E-烯键或(-CH＝CH-)键。即，本发明人已证明使用还原键(-CH2NH-)可以显著地增加对至少一种蛋白酶的抗性。
尽管只有Y1和Z之间(如果i＝1)或Y1和Y2之间(如果i＝0)的ψ系统地存在于式(I)的化合物中，但是假肽单元的其它肽键也可以如前面所述的被修饰。特别地，在本发明的上下文中，未指定的氨基酸之间的键同样可以是如前面所述的标准肽键或经修饰的ψ键。另外的ψ键的存在可以使得有可能进一步提高式(I)的化合物对蛋白酶的抗性。尽管如此，在Y1和Z之间(如果i＝1)或Y1和Y2之间(如果i＝0)的第一个Y键的存在相关的提高已经非常显著，而其它ψ键的添加使得假肽单元的合成复杂化，因此使得式(I)的化合物的合成复杂化。因此，另外的ψ键的存在是有可能的但是为可选的。
可用于本发明的化合物的例子特别包括这些化合物(参见图2和实施例)：
HB19(图2A，SEQ ID NO：5，一种化合物，其具有作为载体的SEQ ID NO：4的线性肽，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这5个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上)，
努卡特01(图2B)，一种化合物，其具有作为载体的环状六肽，环状六肽由构型D的碱性残基(A)和构型L的赖氨酸残基(K)交替组成，其中3个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这3个赖氨酸残基(K)中每一个的ε位氨基上；见图2B)。
努卡特2(图2C，SEQ ID NO：20，一种化合物，其具有作为载体的序列SEQ ID NO：18的螺旋结构的线性肽，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这5个赖氨酸残基中每一个的ε位的氨基上)，
努卡特3(图2D，SEQ ID NO：21，一种化合物，其具有作为载体的序列SEQ ID NO：19的螺旋结构的线性肽，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这5个赖氨酸残基中每一个ε位的氨基上)，
努卡特4(图2E，一种化合物，其具有载体，该载体包括通过酰胺键在每个赖氨酸残基的ε位氨基处连接的5个赖氨酸残基，其中5个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到5个赖氨酸残基中每一个的α-碳氨基上)，
努卡特6(图2F，SEQ ID NO：16，一种化合物，其具有作为载体的序列SEQ ID NO：15的螺旋结构的线性肽，其中6个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这6个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上)，
努卡特7(图2G，SEQ ID NO：17，一种化合物，其具有作为载体的序列SEQ ID NO：13的线性肽，其中6个假肽单元KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这6个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上)，
努卡特8(图2H，SEQ ID NO：23，一种化合物，其具有作为载体的螺旋结构(SEQ ID NO：22)的线性肽，该螺旋结构包括序列Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)的4个单元，其中4个假肽KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这4个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上)，以及
努卡特9(图2I，SEQ ID NO：25，一种化合物，其具有作为载体的螺旋结构(SEQ ID NO：24)的线性肽，该螺旋结构包括序列Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)的8个单元，其中8个假肽KψPR(其中ψ＝CH2-N)共价结合到这8个赖氨酸残基中每一个的ε位氨基上)。
在一个实施方案中，本发明所提供的努卡特是一种在模板结构上携带有一个或多个KψPR三肽的假肽，并包括例如图2的化合物HB19和努卡特肽1-4和6-9。所述三肽可以通过含有1至6个残基的接头序列连接到模板中。
在某些实施方案中，包含在本发明的组合物中的努卡特肽包括具有式III的五价肽或由具有式III的五价肽组成，(在这里是“HB-19”，对应于图2A)：
Figure BDA00003300729400281
HB-19假肽的通式在本文中还用下式表示：5[Kψ(CH2N)PR]-TASP。其中，ψ代表还原的肽键(即，CH2N)。HB-19是努卡特家族的原型，它是表面核仁素的特异性配体。HB-19是由聚赖氨酸基质来承载的三肽KψPR的五价构建体。关于HB-19肽的详细讨论，请参见：Nisole等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，2000年2月10日；16(3)：237-49；Nisole等，J.Biol.Chem.，2002年6月7日；277(23)20877-86；Nisole等，J.Biol.Chem.，1999年9月24日；274(39)：27875-84；Krust等，PNAS，2001卷20；98(24)：14090-095；Alete等，FEBSJ.，2006年；273：4668-81；通过引用将它们整体并入本文用于所有目的。
核仁素基本上位于其受保护的正常细胞核中，然而，核仁素在增殖的细胞表面和活性内皮细胞表面很丰富，在那里，核仁素可以是本文所描述努卡特以及它们的衍生物和同源物的靶。所述努卡特以及它们的衍生物和同源物特异地与表面核仁素和/或糖胺聚糖(GAG)结合。
努卡特家族的其它示例性成员在基质结构上不同。实施例示于图2B至图2I中。
例如，在本发明的一个优选实施例中，包含在本发明组合物中的努卡特肽包括努卡特6L(“N6L”，见图2F)或由努卡特6L组成。
存在于本发明的组合物中的努卡特化合物可能是光学纯或不是光学纯的，这意味着在假肽单元中的赖氨酸残基可以随机的是L构型或D构型(不是光学纯的)，或全部都是D构型，或全部都是L构型(光学纯的)。有利的是，包含在本发明组合物中的努卡特化合物是光学纯的，即，在假肽单元中的赖氨酸残基全部都是D构型或全部都是L构型，优选地，全部都是L构型。这种光学纯的努卡特化合物可以通过在WO2009/141687中描述的方法来获得。
可用于本发明实施方法的免疫化学实验对于本领域的技术人员来说是公知的，如在以下中的描述，例如，Klug，T.L.等，癌症研究，44：1048(1984)，Herlyn，M.等，免疫学临床杂志，2：135(1982)，Metzgar，R.S.等，国家科学协会公报，美国，81：5242(1984)，Papsidero，L.D.等，癌症研究，44：4653(1984)，Hayes，D.F.等，实验临床研究杂志，75：1671(1985)，Killian，C.S.等，国家癌研究所杂志，76：179(1986)，Killian，C.S.等，癌症研究，45：886(1985)，Hedin，A.等，国家科学协会公报，美国，80：3470(1983)，Pekary，A.E.等，临床化学，30：1213-1215(1984)，Bast，R.C.等，新英格兰医学期刊，309：883-887(1983年)以及Bellet，D.H.等，国家科学协会公报，美国，81：3869-3873(1984)，本文通过参考具体地并入其所有内容。
努卡特肽的一个优点是它们显示出了双重活性，它们能够独立地阻止肿瘤的增殖和血管的生成。当前市场上没有一种产品表现出这种双重活性。本发明努卡特药物缀合物的另一主要优点在于其显示出了极好的安全性。另外，由于努卡特肽的尺寸小，所以不具有免疫原性，因而生产和商品成本会处于合理的水平。
如在这里所描述的努卡特以近似不可逆的方式结合表面核仁素，表面核仁素存在于负责血管生成的内皮细胞内以及癌细胞内。努卡特已经显示出了双重效果：直接阻断肿瘤细胞的生长并抑制血管的生成，这导致完全根除了在动物模型中植入的肿瘤。在位于蛋白质的C端区域的RGG结构域中发生了特异性结合。在相互作用之后，该复合物通过温度相关机制被快速内化了。努卡特可以被认为是表面核仁素的稳定和不可逆的配体。内化后，该努卡特仍然保持在细胞质中而不穿越核膜。
如本文中所使用的，术语“努卡特”还包括具有轻微修饰的肽，这些修饰例如，保守性氨基酸修饰、模仿化合价性质的化学修饰、以及用来提高其稳定性、溶解度、生物吸收和/或生物利用度的修饰；例如，来自消化道的吸收或通过脑血屏障(BBB)的渗透。关于增加在脑中的肽和肽药物的生物利用度的这些策略的综述，以及在体外及体内实验中使用的通过BBB来确定肽的渗透性的方法，参见Engleton等人，Peptides9：1431-1439(1997)，其内容通过引用并入本文。药学上可接受的载剂可以含有生理学上可接受的化合物，所述生理学上可接受的化合物包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；以及低分子量的蛋白质。可以提高努卡特肽生物利用度的另外的修饰包括将肽结合到亲脂部分(如亲脂性氨基酸或化合物)。
术语“努卡特”还意在包括在模板结构上承载有一个或更多个KψPR三肽或KψPRR四肽的假肽，并具有对努卡特序列的一个或几个轻微修饰。预期的修饰包括化学修饰或酶修饰(例如磷酸化、糖基化、酰化等)，以及努卡特序列的一个或几个氨基酸的取代。本领域的技术人员认识到，可能需要这种修饰来增强肽的生物活性、生物利用度或稳定性，或者便于其合成或纯化。
在另一实施例中，在这里描述的努卡特可直接或间接地结合到一个或多个载体、诊断试剂或细胞毒性剂上，例如，通过接头部分。可选地，该细胞毒性剂可以共价地连接到接头部分上，该接头部分进而共价地连接到载剂上。接头部分可以是例如氨基酸(包括模拟物、类似物和衍生物)、肽或多肽(包括模拟物、类似物和衍生物)、空间不稳定化合物、脂质、脂族基团、碳水化合物、甘油酯、核苷酸或核酸、肽核酸、核酸衍生物等。在努卡特6L中的缀合物结合到细胞毒性药物5-氟-尿嘧啶(“5-FU”)上的例子如下所示：
Figure BDA00003300729400301
Aib＝α-氨基异丁酸
由本发明提供的努卡特的预期的氨基酸取代(例如努卡特肽)包括保守性变化，其中，被取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用另一个非极性氨基酸取代一个非极性氨基酸；用一个类似带电荷的氨基酸取代一个带电荷的氨基酸等)。本领域的技术人员还认识到，可以进行非保守性变化(例如，用一个非极性氨基酸取代一个不带电荷的极性氨基酸；用一个不带电荷的极性氨基酸取代一个带电荷的氨基酸等)而不会影响努卡特的功能。此外，可以制得包括支化序列和循环序列的努卡特序列的非线性变体，以及含有一个或多个D-氨基酸残基来取代它们的L-氨基酸对应物的变体。
在其它的实施方案中，努卡特载剂可以整合到脂质体中(Gregoriadis，Liposome Technology，卷I至III，第二版(CRC出版社，佛罗里达州波卡拉顿(1993))。脂质体由磷脂或其他脂质组成，属于无毒的、生理上可接受的且相对易于制造和管理的可代谢的载剂。在另一实施方案中，努卡特载剂可以作为纳米粒子来制备。已经证明，将肽化合物吸附在纳米粒子表面上在将肽药物递送到脑部的过程中是有效的(参见Kreuter等，Brain Res.，674：171-174(1995))。示例性的纳米粒子是由HB-19P吸附在表面上并随后用聚山梨醇酯80涂覆的聚丁基氰基丙烯酸酯的胶态聚合物颗粒。
本领域的技术人员可以确定哪些残基和努卡特序列的哪些区域可以耐受修饰，并仍然保持通过临床相关的亲和力来结合核仁素的能力。例如，在菌种之间不太保守的残基处的氨基酸取代，或化学修饰，或酶修饰更可能比在高度保守的残基处的取代耐受。因此，在某些实施例中，上述载剂可以经过修饰，以使得经修饰的载剂形式可以更容易地与诊断试剂相结合。
本文描述的努卡特肽可以使用已公知的重组方法或通过已公知的合成方法来生产。有多种用于执行肽合成的已公知方法，包括液相和固相合成。各种方法的详细讨论可见于例如，Atherton，E.；Sheppard，R.C.(1989年).固相肽合成：一种实用方法.牛津，英国：IRL出版社；Stewart，J.M.；Young，J.D.(1984).固相肽合成，第二版，Rockford：Pierce化学公司，91；R.B.Merrifield(1963).″固相肽合成.I.四肽的合成″，美国化学协会杂志，85(14)：2149-2154；L.A.Carpino(1993)，“1-羟基-7-氮杂苯并三唑.有效的肽偶联添加剂”，美国化学协会杂志，115(10)：4397-4398；通过引用将它们整体并入本文用于所有目的。
在机体中最丰富的杂多糖为糖胺聚糖(GAG)。这些分子是含有重复二糖单元的长直链多糖。二糖单元含有两种改性糖中的任一种(N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc))以及诸如葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的糖醛酸。GAG是高度带负电的分子，其具有赋予溶液高粘性的伸展构象。GAG主要位于细胞表面或在细胞外基质(ECM)中。伴随着GAG的高粘度的是低压缩性，这使得这些分子用于接头中的润滑液来说是理想的。同时，它们的刚性提供了细胞的结构完整性并在细胞间提供了允许细胞迁移的通道。生理意义的特定GAG是透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)和硫酸角质素。虽然这些GAG中的每一种都具有一种主要的二糖成分(参见下面的表I)，但是在任意给定种类的GAG的构成中存在的糖类中确实存在着异质性。
在自然界中的糖胺聚糖的用途的一些实例包括作为抗凝血剂的肝素、作为在主体关节中的滑液润滑剂成分的透明质酸，和软骨素，这些肝素、透明质酸和软骨素存在于结缔组织、软骨和肌腱中。糖胺聚糖家族的成员在它们包含的氨基己糖、己糖或己糖醛酸单元(例如葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺)(表I)的类型方面是不同的。它们在糖苷键的几何形状方面也是不同的。
根据本发明，存在于上述组合物中的GAG可以是天然的或合成的。所谓“天然的”是指可以从自然资源中分离出GAG，尽管它也可以通过化学合成或生物化学合成来获得。相反，所谓“合成的”是指所述的GAG不存在于自然界中，并且只能通过化学合成或生物化学合成来获得。另外，通过加入各种取代基对GAG链进行了进一步的修改。
天然GAG的例子在下表I中进行描述：
Figure BDA00003300729400331
表I.几种天然GAG的结构。GlcUA：β-D-葡萄糖醛酸；GlcUA(2S)＝2-O-磺基-β-D-葡萄糖醛酸；IdoUA＝α-L-艾杜糖醛酸；IdoUA(2S)＝2-O-磺基-α-L-艾杜糖醛酸；Gal＝β-D-半乳糖；Gal(6S)＝6-O-磺基-β-D-半乳醣；GalNAc＝β-D-N-乙酰半乳糖胺；GalNAc(4S)＝β-D-N-乙酰半乳糖氨-4-O-硫酸盐；GalNAc(6S)＝β-D-N-乙酰半乳糖氨-6-O-硫酸盐；GalNAc(4S，6S)＝β-D-N-乙酰半乳糖氨-4-O，6-O-硫酸盐；GlcNAc＝α-D-N-乙酰半乳糖氨；GlcNS＝α-D-N乙酰半乳糖氨；GlcNS(6S)＝α-D-N-乙酰半乳糖氨-6-O-硫酸盐。
在上表I中，“硫酸软骨素”是指若干个不同的GAG，这取决于硫酸化的位置，如下表II所述：
Figure BDA00003300729400341
表II.取决于硫酸化的位置的硫酸软骨素的各种类型
“硫酸软骨素B”是硫酸皮肤素的旧称，但不再归类为硫酸软骨素的形式。
在人体中的大部分GAG都与核心蛋白相连，形成了蛋白聚糖(也称为粘多糖)。GAG垂直地从在刷状结构中的核心延伸出来。GAG与蛋白核心的连接涉及了一种由两个半乳糖残基和一个木糖残基(GAG-GalGalXy1-O-CH2-蛋白)组成的特定的三糖。该三糖连接体通过键合到在蛋白质中的S残基上的O-糖苷键偶联到蛋白核心上。一些形式的硫酸角质素通过N-天冬酰胺酰键连接到蛋白核心上。蛋白聚糖的蛋白核心具有丰富的S和T残基，这允许附接多个GAG。
在本文所描述的组合物或方法的任一实施例中，由本发明提供的努卡特可以与GAG进行混合或复合，其中该GAG是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸或它们组合中的至少一种。
有利的是，在此处描述的根据本发明的组合物或方法中，GAG是选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素或它们的组合。更优选地，在此处描述的根据本发明的组合物或方法中，GAG是选自肝素、硫酸软骨素(特别是硫酸软骨素A或C)以及硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)或它们的组合。实际上，通过使用这些特定的GAG，已经获得了特别有利的结果，而使用硫酸乙酰肝素和透明质获得的结果则不太有利(参见实施例1)。
本发明的特别优选的组合物包括一种努卡特化合物，该努卡特化合物选自与肝素、硫酸软骨素(尤其是硫酸软骨素A或C)和/或硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)结合的HB19(优选HB19L或HB19D)、努卡特1(优选努卡特1L或努卡特1D)、努卡特2(优选努卡特2L或努卡特2D)、努卡特3(优选努卡特3L或努卡特3D)、努卡特6(优选努卡特6L或努卡特6D，更优选努卡特6L)、努卡特7(优选努卡特7L或努卡特7D)、努卡特8(优选努卡特8L或努卡特8D)和努卡特9(优选努卡特9L或努卡特9D)。本发明的特别优选的组合物包括与硫酸软骨素(尤其是硫酸软骨素A或C)和/或硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)结合的HB19或努卡特6L(N6L)。因此，优选的组合物的实例包括：
HB19和肝素，
HB19和硫酸软骨素A，
HB19和硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)，
HB19和硫酸软骨素C，
N6L和肝素，
N6L和硫酸软骨素A，
N6L和硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)，
N6L和硫酸软骨素C，
在本发明的组合物中，为了确保通过GAG而带来的努卡特性质的强化，努卡特的浓度优选为至少1μM，优选为至少2.5μM。
在某些实施方案中，由本发明提供的治疗性组合物包括努卡特和GAG的组合，其中努卡特与GAG的摩尔比从1∶1000到1000∶1之间变化，并且包括在这其间的所有比例。
本发明人已经发现，尤其是在低努卡特浓度下，应当考虑到在组合物中的努卡特与GAG的重量比的范围从而保证通过GAG而带来的努卡特的性质的强化。因此，有利的是，在根据本发明的组合物中，努卡特与GAG的重量比至多为24、优选地至多为20、优选地至多为15、优选地至多为14、优选地至多为13、优选地至多为12、优选地至多为11、优选地至多为10、优选地至多为9，优选地至多为8。在本发明的组合物中，努卡特与GAG的重量比也有利的至少为0.01、至少为0.05、至少为0.08、优选地至少为0.1、优选地至少为0.2、优选地至少为0.3、优选地至少为0.4、优选地至少为0.5、优选地至少为0.6、优选地至少为0.7、优选地至少为0.8、优选地至少为0.9、优选地至少为1。在根据本发明的组合物的有利实施方案中，努卡特与GAG的重量比在0.01和24之间、在0.05和20之间、在0.1和15之间、在0.1和10之间、在0.1和8之间、在0.2和8之间、在0.3和8之间、在0.4和8之间、在0.5和8之间、在0.6和8之间、在0.7和8之间、在0.8和8之间、在0.9和8之间、在1和8之间。
在组合物中努卡特的浓度越低，努卡特与GAG的重量比包括在上述的范围内的这一事实就越重要。
对于化合物努卡特6L(N6L)而言，已经根据N6L在组合物中的的浓度确定了N6L与GAG的重量比的最佳范围(参见实施例2)：
N6L为5μM(对应于20μg/ml)：N6L/GAG重量比在0.2与2之间，
N6L为20μM(对应于80μg/ml)：N6L/GAG重量比在0.8与8之间，
在包括努卡特和GAG的微球体的本发明的组合物中，有利地是，努卡特/GAG微球体具有小于5mm，或从约1nm到约1mm，或从约1nm到约10μm，或从约10nm到约500nm的直径。
在此处描述的任意组合物中，由本发明提供的治疗性组合物任选地包括药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。
本发明还提供了用于制造一种包括努卡特和GAG的微球体的组合物的方法，包括将足量的努卡特和GAG混合以产生一个微球体或多个微球体。优选地，努卡特与GAG以包括在上述范围内的重量比混合。
在另一方面，本发明提供了如在此处描述的组合物和方法，用于治疗和/或预防与有害增长和/或细胞(例如癌细胞)的增殖相关的疾病或病症。
因此，本文描述的本发明的任何组合物都可用于治疗和/或预防与细胞(例如癌细胞)的有害生长和/或增殖相关的疾病或病症。本发明还涉及本文描述的本发明的任何组合物的应用，用于生产用于治疗和/或预防与细胞(例如癌细胞)的有害生长和/或增殖相关的疾病或病症的药品。
在某些实施方案中，该方法包括在体内、离体或在体外向受治疗者施用组合物，该组合物包含有效量的如本文描述的努卡特和GAG，其中所述组合物能有效地抑制或预防癌细胞的生长和/或增殖。
实际上，由专利WO2007/125210可以知道，努卡特化合物可用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成失调的疾病。
在本发明的上下文中，术语“涉及细胞增殖和/或血管生成失调的疾病”是指影响一个或多个器官的任何人类或动物疾病，在所述器官中，观察到一种或多种异常细胞增殖的现象以及成组的细胞或组织和/或异常的新生血管。显然，这种疾病包括所有类型的癌症，例如腺瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤，特别是卵巢、乳腺、胰腺、淋巴节、皮肤、血液、肺、脑、肾、肝、鼻咽腔、甲状腺、中枢神经系统、前列腺、结肠、直肠、子宫颈、睾丸或膀胱的癌症。它们也包括皮肤的非癌性疾病(如表皮或真皮包囊、牛皮癣、血管瘤)以及眼部疾病(如老年黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病或新生血管性青光眼)。神经变性疾病(如多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默氏)或自身免疫疾病(如狼疮或类风湿性多关节炎)以及与动脉粥样硬化相关的疾病。
因此，本文描述的本发明的任何组合物都可用于治疗与细胞增殖和/或血管生成失调相关的疾病。本发明还涉及本文描述的本发明的组合物的应用，用于生产用于治疗与细胞增殖和/或血管生成失调相关的疾病的药品。
实际上，如图3-图6和图9-图19所证明的，由本发明提供的多价努卡特的抗癌症效力(事实上就是对癌细胞的抗增殖效力)通过将努卡特和GAG一起并入微球体中而增强。
因此，本发明还提供了本发明的组合物以及用于治疗和/或预防与在个体中的癌细胞的生长和/或增殖相关的疾病的方法。
因此，本文描述的本发明的任何组合物都可用于治疗和/或预防与在个体中的癌细胞的生长和/或增殖相关的疾病，特别是用于治疗和/或预防癌症。本发明还涉及本文描述的本发明的组合物用于制备用来治疗和/或预防与在个体中的癌细胞的生长和/或增殖相关的疾病和病症(特别是用于治疗和/或预防癌症)的药品的用途。
本文所述的方法包括向个体施用一种包含有效量的如本文描述的努卡特和GAG的组合物，或施用一种包含如本文描述的努卡特和GAG的微球体的组合物，其中，所述组合物能有效地抑制或预防癌细胞的生长和/或增殖。
如背景技术部分中所示，已经显示努卡特化合物与表面核仁素RGG结构域相结合。此外，还已经显示表面核仁素表达在肿瘤细胞的表面，肿瘤细胞如源于肝癌(Semenkovich，C.F.，Ostlund，R.E.J.，Olson，M.O.，和Yang，J.W.部分地表达在HepG2细胞表面的与脂蛋白结合的一种蛋白质是核仁素.(1990)生物化学29，9708-9713)、T淋巴细胞白血病(Callebaut，C.，Jacotot，E.，Krust，B.，Guichar，G.，Blanco，J.，Svab，J.，Muller，S.，Briand，J.P.，和Hovanessian，A.G.艾滋病毒侵入的Composé TASP抑制剂与95-kDa的细胞表面蛋白特异性结合.(1997)，生物化学杂志，272，7159-7166；以及Callebaut，C.，Blanco，J.，Benkirane，N.，Krust，B.，Jacotot，E.，Guichard，G.，Seddiki，N.，Svab，J.，Dam，E.，Muller，S.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.在HIV颗粒与CD4(+)细胞的结合中作为潜在受体的V3环结合蛋白的鉴别.(1998)，生物化学杂志，273，21988-2199)的肿瘤细胞和子宫癌细胞(Callebaut，C.，Jacotot，E.，Krust，B.，Guichar，G.，Blanco，J.，Svab，J.，Muller，S.，Briand，J.P.，以及Hovanessian，A.G.艾滋病毒侵入的Composé TASP抑制剂与95-kDa的细胞表面蛋白特异性结合.(1997)，生物化学杂志，272，7159-7166)，以及表达在活化的内皮细胞的表面(Christian，S.，Pilch，J.，Akerman，M.E.，Porkka，K.，Laakkonen，P.，和Ruoslahti，E.在细胞表面表达的核仁素是在血管生成性血管中的内皮细胞的标记物(2003)，细胞生物学杂志，163，871-878)，这是参与血管生成过程的细胞。因为本文所描述的努卡特与核仁素的结合是泛化的效果，本发明所提供的包含努卡特的组合物可适合用于治疗任何已知的癌症。例如，适合通过本发明提供的组合物和方法来治疗的癌症的类型包括：急性淋巴细胞白血病；急性髓细胞性白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌；艾滋病相关的癌症；艾滋病相关的淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸形/杆状的肿瘤；基底细胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤；恶性纤维性组织细胞瘤；脑干神经胶质瘤；脑瘤；胚胎性瘤；星形细胞瘤；颅咽管瘤；成室管膜细胞瘤；髓上皮瘤；松果体实质肿瘤的中间分化；原发神经外胚层肿瘤；成松果体细胞瘤；脑和脊髓肿瘤；乳房癌；支气管瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；宫颈癌；儿童期癌症；背索上皮瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤；食管癌；鼻腔神经胶质瘤；尤因肿瘤；颅外生殖细胞肿瘤；生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌；眼内黑素瘤；成视网膜细胞瘤；胆囊癌；胃癌；胃肠类癌肿瘤；胃肠道间质瘤(要点)；生殖细胞瘤；颅外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞病，朗格汉斯细胞；何杰金氏淋巴瘤；何杰金氏淋巴瘤，儿童期；下咽癌；眼内黑素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)；卡波济肉瘤；肾(肾细胞)癌；细胞组织细胞增多病；喉癌；喉癌；唇和口腔癌，儿童；肺癌；非小细胞肺癌，小细胞；非何杰金淋巴瘤；巨球蛋白血症；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓上皮瘤；成神经管细胞瘤；黑素瘤；梅克尔细胞癌；间皮瘤；转移性鳞状颈癌；口癌；多发性内分泌瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生瘤；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口腔癌、口咽癌；骨肉瘤；骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；鼻窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌症；松果体实质肿瘤的中间分化；成松果体细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤；垂体肿瘤浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管癌；移行细胞癌；由染色体15改变引起的呼吸道癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；尤因家族肿瘤；卡波济肉瘤，软组织；皮肤癌(黑素瘤癌或鳞状细胞皮肤癌；)；皮肤癌(黑素瘤)，梅克尔细胞；胃(胃)癌症；幕上原始神经外胚层肿瘤；皮肤T细胞淋巴瘤(参见蕈样霉菌病和sézary综合征)；睾丸癌；胸腺瘤和胸腺癌；喉癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；尿道癌；子宫癌；子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；
Figure BDA00003300729400391
巨球蛋白血症；以及维尔姆斯氏瘤。
令人惊奇并意想不到地发现，本文所描述的努卡特当与GAG混合时形成微球体。因此，在另一方面，本发明提供治疗疾病或病症(例如癌症)的方法，包括以下步骤：向受试者或个体施用有效量的包含努卡特和GAG的微球体的治疗性组合物。在某些实施方案中，微球体是在给药之前形成的。在另一个实施方案中，微球体是在对受试者或患者给药后(例如，在体内)形成的。
当用于治疗癌症时，本发明的组合物可进一步包括细胞毒性剂，例如吉西他滨。
另外，实施例3和图20-图21示出了努卡特化合物的抗血管生成特性也通过将努卡特和GAG合并到微球体中而增强。因此，本文描述的本发明的组合物也可以用于治疗涉及血管生成失调的疾病。本发明还涉及本文描述的本发明的组合物的应用，用于制备用于治疗涉及血管生成失调的疾病的药品。
如在专利WO2007125210中公开的，已经发现努卡特化合物具有抗炎症性活性，特别是，它们通过由LPS刺激的各种细胞类型能抑制TNF-α、IL-6和IL-8的生产以及CAM-1的表达。这些化合物是极其令人感兴趣的，因为，如前面所提到的，发明人已经观察到这些化合物无论是在体外还是在体内都是没有毒性的；在容易控制的条件下，这些化合物即使在工业规模上也是易于合成的；这些化合物本身具有足够的体内生物利用度，并不需要开发特定的药物形式。
此外，努卡特化合物的抗炎症性作用至少部分地与由于增殖的炎症细胞的表面核仁素表达使得努卡特化合物在炎症性细胞上施加抗增殖活性这一事实有关联。因此，努卡特化合物的抗炎作用也与表达表面核仁素的细胞上的其抗增殖活性有关联。通过与GAG混合使得对于癌细胞这种效果增强，通过与GAG混合使这种效果增强以使炎症性细胞增殖。
因此，本发明还涉及本文所述的本发明的任一组合物，该组合物用于治疗炎症性疾病。本发明还涉及本文所述的本发明的任一组合物的应用，用于制备治疗炎症性疾病的药品。
术语“炎症性疾病”是指炎症反应具有生物的病理学后果的任何疾病。特别地，在本发明的上下文中的炎症性疾病包括自身免疫疾病(例如狼疮或类风湿性多关节炎)、败血症、脓毒性休克、心脏炎症性疾病(心脏炎，尤其是心内膜炎、心包炎、心肌炎，特别是由金黄色葡萄球菌引起的感染源)、移植物排斥、创伤、关节的炎症性疾病(特别是，不同形式的关节炎)、胃肠系统的炎症性疾病(特别是结肠炎、肠炎、胃炎、肠胃炎，以及肠内的慢性炎症性疾病如克罗恩氏病和出血性直肠结肠炎(HRC))、皮肤的炎症性疾病(湿疹、变应性接触性皮炎、牛皮癣、炎症性疾病、皮肤病)、呼吸系统的炎症性疾病、尤其是慢性阻塞性肺疾病(COPD)，以及过敏反应。
在有利的实施方案中，炎症性疾病是自身免疫疾病，特别是狼疮或类风湿性关节炎。在另一个有利的实施方案中，炎症性疾病是脓毒性休克。在再一个有利的实施方案中，炎症性疾病是心内膜炎，特别是由感染源例如金黄色葡萄球菌引起的心内膜炎。
如WO2009/141687中所公开的，已经发现努卡特化合物可用于促进伤口愈合。因此，本发明还涉及本文所述的本发明的任一组合物，该组合物可用于促进伤口愈合。本发明还涉及本文所述的本发明的任一组合物的应用，用于制备促进伤口愈合的药品。
在本发明的任何方面，本发明的治疗性组合物可以是任何药物学上可接受的形式并且通过任何药物学上可接收的途径来给药，例如，治疗性组合物可以作为口服剂量给药，以每天一次服用法给药或单位剂量形式给药，用于治疗肌肉失调或病症如糖尿病。这些药物学上可接受的载剂和赋形剂以及给药的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的，并包括在USP-NF2008(美国药典/国家处方集)中描述的组合物和方法，USP-NF2008以引用的方式将其全部内容合并于本文中。在某些方面，本发明提供了所描述的化合物的药物学上可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如，酸加成盐，例如，盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。
活性化合物通常配制成用于胃肠外给药，例如，配制成用于通过静脉、关节内、鞘内、肌内、皮下组织、病灶内、或甚至腹膜内途径来注射。根据本发明，包含癌症标记抗体、偶联物、抑制剂或其它作为活性组分或成分的试剂的水性组合物的制备对于本领域的技术人员是已知的。通常，这些组合物可以制备成或为液体溶液或为悬浮液的注射剂；还可以制成适用于在注射前通过加入液体来制备溶液或混悬液的固体形式；并且所述制剂也可以被乳化。
一种药物组合物或制剂是指适于向细胞或受试者(优选地是人)给药(如系统给药)的形式的组合物或制剂。“系统给药”是指体内在血流中的药物的全身吸收或积累，随后分布到整个身体。合适的形式部分地取决于用途和进入的途径，例如口服、透皮、或通过注射。这些形式不应阻止组合物或制剂到达靶细胞(即，带负电荷的聚合物需要输送到的细胞)。例如，注射到血流中的药物组合物应该是可溶的。其它因素在本领域中是已知的，并包括诸如防止所述组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式的考虑。
本发明的用于治疗性给药的制剂包括无菌的水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。媒介包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠，乳酸化林格氏静脉内媒介包括液体和营养补充物、电解质补充物等类似补充物。可以加入防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等类似物。
本发明的药物组合物按照与预期的给药途径相兼容的形式来配制。给药途径的实例包括胃肠外给药，例如，静脉内、皮内、皮下、口服(如吸入)、透皮(局部)、经粘膜、腹膜内和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱来调节，如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂包装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
实现全身吸收的给药途径可包括但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内给药。药物进入循环的速率已经表明是分子量或尺寸的函数。使用包括本发明的化合物的脂质体或其它药物载剂，可以潜在地定位如在某种组织类型(如网状内皮系统(RES)的组织)中的药物。可促进药物与细胞(如淋巴细胞和巨噬细胞)表面关联的脂质体制剂也是有用的。
药物学上可接受的制剂是指允许在物理位置最适合于所需活性的本发明的核酸分子有效分布的组合物或制剂。适合用于与本发明的核酸分子配制的试剂的非限制性实例包括：PEG共轭核酸、磷脂共轭核酸、含有亲脂性部分的核酸、硫代磷酸酯、能增强药物进入到各种组织中的P-糖蛋白抑制剂(如普流罗尼P85)，例如，CNS(Jolliet-Riant and Tillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.，13，16-26)；生物可降解的聚合物，例如聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球体，在植入后用于缓释递送(Emerich，DF等人，1999，细胞移植物，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass；以及装载的纳米粒子，如由聚氰基丙烯酸制成的那些，其可穿过血脑屏障递送药物并且可以改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。其他递送策略的非限制性实例包括核酸分子的CNS递送，该核酸分子包括在Boado等人，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.给药Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，核酸研究，26，4910-4916；和Tyler等人1999，PNAS USA.，96，7053-7058中描述的材料。本文将所有这些文献纳入作为参考。
本发明的特征还在于组合物的应用，该组合物包括含有聚(乙二醇)脂类(PEG-修饰的、或长循环的脂质体或隐身脂质体)的经表面修饰的脂质体。本发明的核酸分子也包括各种分子量的共价连接PEG分子。这些制剂提供一种用于提高药物在靶组织中积聚的方法。这类药物载剂通过单核吞噬系统(MPS或RES)来抵抗调理和消除，从而对于封装的药物能够有更长的血液循环时间以及增强的组织暴露(Lasic等人.Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等人.，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。与阳离子脂质体相比，基于它们能够避免在如肝和脾等代谢组织中的积累的能力，长期循环脂质体也可以用来阻止药物在较大程度上进行核酸酶降解。所有的这些参考文献均以引用的方式并入本文。
本发明的化合物，及其衍生物、碎片、类似物及其同系物(homolog)，都可以掺入适于给药的药物组合物中。这些组合物通常包括核酸分子、蛋白质或抗体以及药物学上可接受的载剂。这里所使用的“药物学上可接受的载剂”意在包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及类似物，与药物给药相容。适合的载剂描述在最新版《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中，它是本领域的标准参考书，该文献被引入本文中供参考。这些载剂或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、finger’s溶液、葡萄糖溶液以及5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水媒介如固定油。用于药物活性物质的此类介质和试剂的应用为本领域所熟知。除了某些常规的介质或试剂与活性化合物不相容的情况，可考虑在组合物内使用这类介质和试剂。也可将增补的活性化合物掺入到所述组合物中。
本发明还包括为储存或施用而制备的组合物，所述组合物包括所需化合物在药学上可接受的载剂或稀释剂中的药物有效量。在药物领域，用于治疗用途的可接受载剂或稀释剂是众所周知的，并且在例如引入本文作为参考的雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)中进行了描述。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染色剂和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外，也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
这种化合物的毒性和疗效可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50(导致群体50％死亡的剂量)和ED50(在50％群体中是治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比值是治疗指数，可以表示为比值LD50/ED50。优选的化合物具有大的治疗指数。虽然可以使用显现毒副作用的化合物，但应小心设计将这类化合物靶向到感染组织的输送系统，以使对未感染细胞的可能损伤减至最小，降低副作用。从细胞培养和动物研究得到的数据可用于制定用于人的化合物的剂量范围。这种化合物的剂量优选在循环浓度范围之中，包括具有很少或没有毒性的ED50。根据所用剂型和给药途径，剂量可能在此范围内变动。对于本发明方法所用的任何化合物而言，最初都可以从细胞培养分析中评价治疗有效剂量。与细胞培养中的测定一样，可在动物模型中配制剂量，以达到包括IC50(即，达到症状的一半最大抑制作用的待测化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用此类信息更准确地确定人用剂量。例如通过高效液相层析，可测定血浆中的水平。
制剂可以以含有常规无毒可药用载剂、佐剂和赋形剂的剂量单位制剂，通过口服、局部、肠胃外、吸入喷雾或直肠给药。本文所用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内，或鞘内注射或输液技术和类似方法。此外，提供了一种药物制剂，其包含本发明的核酸分子和药学上可接受的载剂。一个或多个本发明的核酸分子可与一种或多种无毒的药学上可接受的载剂和/或稀释剂和/或佐剂相联合，以及需要时与其他任何活性成分相联合。本发明的药物组合物可以是适于口服使用的形式，例如作为片剂、药片、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。
可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备用于口服的组合物，这种组合物可包含一种或多种这样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以提供药学上美观可口的制剂。对于口服给药而言，药物组合物可以采用的形式是例如通过药学上可接受的赋形剂按照常规方法制备的片剂或胶囊，所述赋形剂是例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)、或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。这些片剂可以通过本领域公知的方法进行包衣。用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液剂、糖浆剂或悬浮剂的形式，或者它们可以是干的产品，用来在使用前与水或其它合适的载体构成液体制剂。这些液体制剂可以是按照常规方法通过药学上可接受的添加剂来制备，所述添加剂如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用脂肪)、乳化剂(如卵磷酯或阿拉伯树脂)、无水载体(如杏仁油、油脂、乙醇或者分馏植物油)、以及防腐剂(如-对-羟基苯甲酸甲基或丙基酯或者山梨酸)。这些制剂还可适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服制剂可适当地配制成可以控制释放活性化合物。对于颊部给药而言，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。所述片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知的技术进行包衣。在一些情形中，可以通过已知技术制备这样的包衣，以延缓胃肠道中的崩解和吸收，从而提供较长期的缓释作用。例如，可以采用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。口服用的制剂还可以以硬的明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者以软的明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油介质混合，所述油介质是例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
水性悬浮液含有与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性物质。这类赋形剂为悬浮剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；为分散剂或湿润剂例如天然磷脂如卵磷脂，或烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七亚乙基氧基鲸蜡醇、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或更多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油或矿物油中配制，所述植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，矿物油如液体石蜡。油性悬浮液可包含增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸而保存。
适合于通过加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或湿润剂或悬浮剂通过上文已经提及的那些示例。还可存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药物组合物还可以是水包油的乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(如阿拉伯树胶或黄蓍胶)、天然存在的磷脂(如大豆、卵磷脂)、以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(如脱水山梨糖醇单油酸酯)以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。乳剂还可含有甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可以使用甜味剂配制，所述甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖。这些制剂也可含有缓和剂、防腐剂和调味剂及着色剂。药物组合物可以以无菌注射水性或油性悬浮液的形式存在。这种混悬液可以按照已知的技术使用上文已经提及的那些适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂进行配制。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的赋形剂和溶剂中是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无毒固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可采用任何温和固定油，包括合成的单酸甘油脂或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于可注射的制剂中。
对于吸入给药而言，可使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，从加压的包或喷雾器中以气溶胶喷雾形式方便地传送本发明的化合物。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的(例如明胶)凝胶胶囊和凝胶柱，使其包含本发明化合物的粉末混合物和合适的粉末基料例如乳糖或淀粉。可以将化合物配制用于通过注射例如推注或连续输液进行胃肠外给药。
也可以将化合物配制成例如包含常规栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯的直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。除上述制剂外，组合物还可以配制为贮存制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射而施用。因此，例如，这些化合物可使用适当的聚合物或疏水性物质(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂，或者作为微溶的衍生物(例如作为微溶盐)进行配制。
适合于注射应用的药用组合物包括无菌水溶液(在此是水溶性的)或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。用于注射的制剂可以是例如在安瓿或多剂量容器中的单位剂量形式，并添加有防腐剂。组合物可以是溶于油性或水性载体中的悬浮剂、溶液或者乳剂，并且可以包含剂型配制剂，比如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择的是，活性成分可以制成粉末，在使用前配以适当的载体如无菌无致热原的水。对于静脉内给药而言，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、CremophorTM(巴斯夫公司，新泽西州帕瑟伯尼)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。所有情况下，组合物必须是无菌的，应该具有易于注射的流动性。在生产和储藏条件下必须保持稳定，且必须在避免微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。上述载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。适当的流动性可以通过使用如卵磷脂的包衣、或通过使用分散剂维持所需的颗粒大小或通过使用表面活性剂来持。对微生物作用的防止可以使用诸如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。通过使组合物含有延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可以实现注射型组合物延长的吸收。
在一个实施方案中，该活性化合物是与可以保护该化合物不会从体内快速消除的载剂一起进行制备的，所述载剂如包括植入剂和微囊化递送系统的控释制剂。可以使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些材料在市场上也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。脂质体悬液(包括带有作用于病毒抗原的单克隆抗体的可靶向作用于受感染的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些物质可按照本领域技术人员已知的方法(例如，在美国专利4,522,811中所描述的方法)制备。
为了易于给药和剂量的均一性，尤其有利的是配制剂量单位形式的口服组合物或胃肠外组合物。这里使用的“剂量单位形式”是指物理上分离的单位，它适合作为要治疗的对象的单位剂量；每个单位含有经计算可以产生期望的治疗效果的预定量活性成分和所需的药物载剂。本发明的剂量单位形式的规格取决于和直接依赖于所述活性化合物的独特特性和要取得的特定治疗效果，以及将该活性化合物组合用于个体治疗领域时存在的固有局限性。
可以制备缓释制剂。适当的持续释放制剂的例子包括固体疏水多聚体的半可渗透基质，含有抗体，基质的形式是成形颗粒形式，如薄膜，或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯))、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质的时间期限较短。
对于向非人类的动物给药而言，本发明的治疗性组合物还可以添加到动物饲料或饮用水中。可方便地制备动物饲料和饮用水组合物，以便使动物随着饮食一起摄取合适量的组合物。还可以方便地将该组合物作为添加到饲料或饮用水中的预混物形式使用。该组合物也可以与其它治疗化合物组合施用给受试者，以提高综合治疗效果。使用多个化合物治疗的指示可以增加有益效果，同时减少副作用的存在。
本发明的一些优点在附图和在下面给出的实例中示出，这些实例不构成对本发明范围的限制。附加的优点和修改对所属领域的技术人员来说是显而易见的，并包括本领域常规技术的应用，因此，其被认为明确地落入本发明的范围之内。
实施例
应理解，本发明的示范性实施例不应解释为限制于下述实施例，相反，本发明的示范性实施例应解释为包括本文提供的任何和全部应用，以及本领域普通技术人员可得的所有等同变化。
实施例1，不同的GAG与努卡特6L共同施用对努卡特6L抗增殖特性的协同效应。
对人类胰腺癌细胞(PANC-1，人类胰腺癌)细胞生长的影响。
在人类胰腺癌细胞(PANC-1，人类胰腺癌)细胞生长上共同施用N6L+不同的GAG(参见图3)。在图3A中，肝素用作示例性GAG。在图3B和图3C中，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C与N6L结合使用。每天都使用混合物N6L/GAG(从约20μM/0μg/ml到1000μg/ml GAG)来处理细胞。每天更换培养基(DMEM5％SVF)。通过MTT试验对增殖进行评定。观察到单独使用GAG对细胞增殖没有影响。在图5中，PANC-1未经处理(A)，或用20μM的N6L处理(B)、用20μM的N6L和10μg/ml的肝素处理(C)、或用20μM的N6L与100μg/ml的肝素混合物处理(D)。
在图9中，PANC-1细胞要么未经处理(对照)，要么使用单独的20μM的N6L处理，或使用与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml或1000μg/ml的肝素混合的20μM的N6L来处理。与对照组(未经处理的细胞)相比，在处理后3天和4天，N6L显著地抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖(anchorage-dependent proliferation)，抑制的范围为从50％到60％。有趣的是，使用从10μg/ml到1000μg/ml范围的各种浓度的肝素对N6L进行预培养导致增强了这种抑制效果。在处理后4天，在肝素浓度为10μg/ml时观察到了最大效果，值得注意的是，该抑制效果达到了86％。在这个试验中，当单独使用肝素培养细胞时，无论使用何种浓度的肝素，都没有观察到效果。
在图10中，PANC-1细胞要么未经处理(对照)，要么使用单独的20μM的N6L处理，或使用与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml或1000μg/ml的硫酸软骨素C(Cs-C)混合的20μM的N6L来处理。与对照组(未处理的细胞)相比，在处理后3到4天，N6L显著地抑制了PANC1细胞的贴壁依赖性增殖，抑制的范围为从50％到60％。有趣的是，使用从10μg/ml到1000μg/ml的各种浓度范围的肝素对N6L进行预培养导致增强了这种抑制效果。在处理后4天，在CS-C浓度为10μg/ml时观察到了最大效果，值得注意的是，该抑制效果几乎达到了90％。在这个试验中当单独使用CS-C培养细胞时，无论使用何种浓度的CS-C，都没有观察到效果。
对人类胶质母细胞瘤细胞(U87-MG，人类胶质母细胞瘤-星形细胞瘤)的 影响
在人类胶质母细胞瘤细胞(U87-MG，人类胶质母细胞瘤-星形细胞瘤)细胞生长上共同施用N6L+不同的GAG(见图4)。在图4A中，肝素用作示例性GAG。在图4B和图4C中，硫酸软骨素A和硫酸软骨素C与N6L结合使用。每天都使用N6L/GAG(从约20μM N6L/0μg/ml至1000μg/ml的GAG)的混合物处理细胞。每天都更换培养基(DMEM5％SVF)。通过MTT试验评定增殖。观察到使用GAG对增殖没有影响。在图6中，U87-MG细胞要么未经处理(A)，要么用20μM的N6L处理(B)，用20μM的N6L和10μg/ml的肝素处理(C)，或用20μM的N6L和100μg/ml的肝素的混合物处理(D)。
在图11中，U87-MG细胞要么未经处理(对照)，要么用单独的20μM的N6L处理，或用与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml或1000μg/ml肝素混合的20μM的N6L进行处理。与对照组(未经处理的细胞)相比，在处理后3天和4天，N6L显著抑制U87-MG细胞的贴壁依赖性增殖，抑制范围从50％到60％的。有趣的是，用范围为10μg/ml至1000μg/ml的各种浓度的肝素预培养N6L导致增强了这种抑制效果。在处理后4天，观察到在肝素浓度为10μg/ml时，该效果最大，并且值得注意的是，该抑制达到89％。在这个试验中，当单独使用肝素培养细胞时，无论使用何种浓度的肝素，都没有观察到效果。
在图12中，U87-MG细胞要么未经处理(对照)，要么用单独的20μM的N6L处理，或用与0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml或1000μg/ml硫酸软骨素C(Cs-C)混合的20μM的N6L进行处理。相比于对照组(未经处理的细胞)，经处理3天和4天后，N6L显著抑制U87-MG细胞的贴壁依赖性增殖，抑制范围从55％到70％。有趣的是，用范围为10μg/ml至1000μg/ml的各种浓度的CS-C预培养N6L导致增强这种抑制效果。在处理后4天，观察到在CS-C的浓度为10μg/ml时该效果最大，并且值得注意的是，该抑制达到90％。在这个试验中，当单独使用CS-C培养细胞时，无论使用何种浓度的CS-C，都没有观察到效果。
用各种糖胺聚糖预培养的N6L对经一整天处理的PANC1胰腺癌细胞系的 贴壁依赖性增殖的影响
为了对比不同糖胺聚糖在调整N6L对癌细胞的贴壁依赖性增殖的影响中的功效，用N6L和这些糖胺聚糖(GAG)的混合物培养人类胰腺癌细胞系(PANC-1)，并通过MMT试验定量细胞增殖(参见图13)。
用10μg/ml的肝素、CS-A、CS-B、CS-C硫酸乙酰肝素或玻璃酸透明质酸预培养或未经预培养，使用范围从0μM到50μM的各种浓度的N6L。每天都处理细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
单独使用的N6L以一种剂量依赖方式，即产生15μM的半最大抑制浓度(IC50)，抑制了PANC-1细胞的贴壁依赖性增殖。如图5所示，用包括肝素、硫酸软骨素-A(Cs-A)、硫酸软骨素-B(Cs-B)和硫酸软骨素-C(Cs-C)中的任一种的硫酸化的GAG分子来预培养N6L，导致单独使用N6L的效果增强，最大效果为5μM，且IC50为2.5μM。相反，用硫酸乙酰肝素或透明质酸预培养的N6L以类似于N6L的方式抑制了PANC-1细胞的贴壁依赖性增殖。
单独的N6L或用肝素或CS-C预培养的N6L对PANC1胰腺癌细胞系的抑 制效果的动力学
用20μM的N6L(对照细胞)或用10μg/ml肝素或CS-C预培养的N6L处理PANC1细胞。处理细胞要么1)在第一天处理，且允许细胞增殖3天；或者2)在第1天和第2天处理，且允许细胞增殖2天；或者3)在前3天处理，且允许细胞增殖1天；以及4)持续处理4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
图14表明，经过1天的处理后，N6L没有发挥任何抑制效果，与对照组相比，在4天后观察到相当于50％的抑制的最大效果。有趣的是，在用包括肝素或CS-C的GAG预培养的N6L处理的细胞中，观察到依赖于时间的细胞增殖抑制。在这种情况下，经过1天的处理后观察到细胞增殖的抑制，其相当于50％的抑制效果，并且经4次处理后抑制效果超过80％。
单独的N6L或用肝素或CS-C预培养的N6L对U87-MG胶质母细胞瘤癌细 胞系的抑制效果的动力学
用20μM的N6L(对照细胞)或用10μg/ml肝素或CS-C预培养的N6L处理U87-MG细胞。处理细胞：要么1)在第一天处理，且允许细胞增殖3天；或者2)在第1天和第2天处理，且允许细胞增殖2天；或者3)在前3天处理，且允许细胞增殖1天；以及4)持续处理4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
图15表明，经过1天的处理后，N6L发挥了轻微的抑制效果，与对照相比，在4天后，观察到相当于50％抑制的最大效果。有趣的是，在用包括肝素或CS-C的GAG预培养的N6L处理的细胞中，观察到了依赖于时间的细胞增殖抑制。在这种情况下，经过1天的处理后观察到细胞增殖的抑制，其相当于80％的抑制效果，且经4次处理后抑制效果超过90％。
N6L与GAG的混合物导致形成微球体
用比值N6L/GAG(20μM/10μg/ml和/或100μg/ml)处理的细胞显示微球体或“气泡”，这些微球体或“气泡”远小于在细胞上用其它比值观察到的微球体或气泡(图7和图8)。这些气泡是由N6L和GAG构成的微球体。当GAG为100μg/ml时，观察到的最大气泡具有约500nm的尺寸。该尺寸与培养基中的GAG的浓度呈正相关。N6L连同GAG一起构成了尺寸与GAG的浓度相关的微球体。
结论
总之，尽管用单独的GAG对增殖没有效果，但是肝素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B(现在称为硫酸皮肤素)和硫酸软骨素C都增强了N6L在PANC1(人类胰腺癌细胞)和U87-MG(人类胶质母细胞瘤细胞)癌细胞上的抗增殖效果(参见图3-图6和图9-图12)。当使用透明质酸或硫酸肝素时，没有观察到N6L抗增殖特性的这种增强(数据未示出并见图13)。
另外，虽然重复处理(每天)显著地提高了单独的N6L的抗增殖效果，但仅轻微地提高了先前与肝素或硫酸软骨素混合的N6L的抗增殖效果(参见图14-图15)。实际上，即使是用先前与肝素或硫酸软骨素C(Cs-C)混合的N6L的单独处理也会导致PANC1和U87-MG癌细胞的依赖于时间的抑制效果。
N6L和GAG的混合物导致这两种化合物相互作用并形成微球体(参见图7-图8)。
实施例2.努卡特6L与GAG的重量比对努卡特6L抗增殖特性增强的影响
大约5×103的PANC1(获自ATCC，美国型培养收集，细胞重悬在包含10％的胎牛血清(FBS)的DMEM中)接种入48孔培养板中，并在37℃下培养24小时。然后将培养基换成含有0.5％FBS的DMEM。然后，使用浓度范围从2.5μM至40μM的用Cs-C预处理的或未预处理的N6L处理细胞2小时，其中N6L与Cs-C的重量比为8和16，然后在7天内进行全天处理。在第7天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
结果显示在图16至图19中，且结果表明用CS-C预培养的N6L每天处理2小时足以抑制细胞的贴壁依赖性增殖。此外，生长曲线的对比表明重量比为8的N6L/Cs-C比重量比为16的N6L/Cs-C更有效。
在用CS-C预培养的N6L的浓度为2.5μM(图19)或更大(图16至图18)时观察到依赖于时间的抑制。
另外，必须注意的是，虽然在低N6L浓度(2.5或5μM，参见图18-19)时选择最佳重量比N6L/Cs-C为8是特别重要的，但不如在较高的N6L浓度(20或40μM，参见图16-17)下重要。
实施例3.共同施用不同的GAG与努卡特6L对努卡特6L抗血管生成特性的协同效应
用各种糖胺聚糖预培养的N6L对人类内皮细胞的贴壁依赖性增殖的影响 的研究(参见图20)
综述：为了比较不同GAG在调节N6L对人类内皮细胞的贴壁依赖性增殖的影响中的功效，用N6L和这些GAG的混合物来对抗HUVEC细胞。4天后，通过MTT试验定量细胞增殖。
方法：用范围从0.1μM至50μM的浓度递增的N6L来处理，或用10μg/ml的CS-A、CS-B、CS-C、肝素、硫酸乙酰肝素或透明质酸进行预培养或未预培养类似数量(5×103)的HUVEC细胞。每天都处理细胞，持续4天。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
结果：单独使用的N6L以一种剂量依赖方式，即在50μM时产生最大效果，抑制了HUVEC细胞的贴壁依赖性增殖。有趣的是，使用硫酸化的GAG分子(包括肝素、硫酸软骨素-A(CS-A)，硫酸软骨素-B(CS-B)，硫酸软骨素-C(CS-C))进行N6L的预培养导致单独使用N6L的效果的增强，在5μM和2.5μM的IC50下观察到最大效果。相反，以与N6L类似的方式，用硫酸乙酰肝素或透明质酸预培养的N6L抑制了PANC-1细胞的贴壁依赖性增殖(图20)。
用硫酸化的糖胺聚糖预培养的N6L对体内血管生成的影响的研究(参见图 21)
综述：采用鸡胚绒毛尿囊膜试验来分析用硫酸化的糖胺聚糖预培养的N6L对体内血管生成的影响。
方法：在37℃下对来亨鸡受精卵培养4天。然后在蛋壳上开个窗口，露出CAM。窗口用无菌胶带封住，并且将卵放回到培养箱中。在胚胎发育的第9天，20ml的蒸馏水作为对照，在硅环内的1cm2的受限区域内含有20μM的N6L、10μg/ml的肝素，或含有单独的10μg/ml的CS-C，或含有用10μg/ml肝素或10μg/ml的CS-C预培养的20μM的N6L。在37℃下培养48小时后，用盐水缓冲的福尔马林原位固定CAM，将CAM从卵中切除，置于载玻片上，并在空气中干燥。拍摄照片，并且使用电脑图像分析软件(美国塞恩公司)对血管总长度进行量化。结果是至少3次独立实验的平均值±SD。
结果：与用水进行的对照相比，使用浓度为20μM的N6L对体内血管生成没有产生显著影响。相反，当用肝素或CS-C对20μM的N6L进行预培养，并将N6L施加到鸡胚绒毛尿囊膜上时，观察到了新血管形成的显著抑制(分别为50％和70％，参见图21)。作为对照，当将肝素或CS-C独自施加到鸡胚绒毛尿囊膜上时，没有观察到影响。结果是至少3次独立实验的平均值±SD。
结论
上述结果表明努卡特化合物与GAG的混合物不仅增强了它们的抗增殖活性，而且还增强了它们的抗血管生成活性。
实施例4.用CS-C和吉西他滨预培养的N6L的协同效应
综述：本研究的目的是确定使用CS-C预培养的或未预培养的N6L和吉西他宾是否具有协同效应。
方法：将大约5×103的PANC1(得自ATCC，美国型培养菌种集，重悬在包含10％的胎牛血清(FBS)的DMEM中的细胞)接种入48孔培养板中，并在37℃下培养24小时。然后将培养基换成含有5％FBS的DMEM。然后，使用经过Cs-C预培养的或未预培养的浓度范围为1μM至50μM的N6L处理细胞，在存在或不存在范围为1nM至50nM的各种浓度的吉西他滨时，在4天内每天进行处理。在第4天结束时，使用MTT试验定量细胞数目。
结果：在该实验条件下，观察到吉西他滨对细胞增殖有轻微的抑制效果，但是当吉他西滨使用CS-C进行预培养时并没有发现增强作用。正如所预期的，与单独使用N6L相比，用Cs-C预培养N6L产生了增强作用。有趣的是，向N6L+CS-C混合物中添加吉西他滨导致了进一步的协同效应。
本申请全文所引用的所有参考文献、专利、待决专利申请和公开的专利的全部内容，在此通过引用清楚地并入本文。
等同方案
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规试验，能够确定本文描述的本发明具体实施方式的许多等同方案。这些等同方案包括在下面的权利要求书中。
可以理解的是，详细的实例和实施例只是通过示例的方式给出，仅用于说明目的，并且无论如何也不认为是对本发明的限制。向本领域技术人员建议考虑其各种修改或变化，这些修改或变化包括在本申请的精神和范围内，并且认为在所附权利要求的范围内。例如，可改变各成分的相对量以优化所需效果，可以添加附加的成分，和/或类似的成分可以用来代替所描述的一种或多种成分。与所述系统、方法和工艺相关联的其它有利的特征和功能在附属权利要求中是显而易见的。此外，本领域的技术人员将认识到，或者仅仅使用常规实验，能够确定本文中描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案包括在下面的权利要求书中。
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Figure IDA00003300729900021
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Figure IDA00003300729900171
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Claims (19)

1.一种组合物，包括：
a)多价合成化合物，包括载体，在所述载体上接枝有至少3个假肽单元，所述化合物具有式(I)：
Figure FDA00003300729300011
其中，每个X独立地代表任何氨基酸；
Y1和Y2独立地选自具有碱性侧链的氨基酸；
Z选自：脯氨酸，该脯氨酸可能在γ、β或δ位被羟基、胺基、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C5-C12芳基、C5-C14芳烷基、C5-C12杂芳基取代，这些基团本身可能被选自卤原子、NO2、OH、C1-C4烷基、NH2、CN、三卤代甲基、C1-C4烷氧基、C1-C4二烷基氨基、胍基、巯基的1至6个取代基所取代；天然的或非天然的N-烷基氨基酸；二烷基氨基酸；环状的二烷基氨基酸；或哌可酸或其衍生物；
n和i各自是0或1；
m是0和3之间的整数；
k是大于或等于3的整数；并且
Ψ代表经修饰的肽键，所述经修饰的肽键对于至少一种蛋白酶比标准肽键明显更有抗性。
b)糖胺聚糖(GAG)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述载体选自线性肽或环肽、线性或环状类肽、折叠体、线性聚合物或者球形树状分子、糖或纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述载体选自：
a)环状六肽，由交替的构型D的碱性(A)残基和构型L的赖氨酸(K)残基组成；
b)5个赖氨酸残基，所述赖氨酸残基通过每个赖氨酸残基的ε位氨基处的酰胺键连接(参见图2E中的化合物努卡特4)；以及
c)以下序列的线性肽：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：24。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述假肽单元直接接枝在所述载体上。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，k是在3和8之间，优选地在5和6之间。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，i等于1，Z为脯氨酸(P)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，Y1和Y2独立地选自精氨酸(R)和赖氨酸(K)，优选Y1为赖氨酸(K)，而Y2为精氨酸(R)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，n和m等于0。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，Ψ代表还原键(-CH2NH-)、逆反键(-NHCO-)、亚甲氧基键(-CH2-O-)、硫代亚甲基键(-CH2-S-)、卡巴键(-CH2CH2-)、酮基亚甲基键(-CO-CH2-)、羟基亚乙基键(-CHOH-CH2-)、(-N-N-)键、E-烯烃键或(-CH＝CH-)键。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物选自下式的化合物：
Figure FDA00003300729300031
Figure FDA00003300729300041
Figure FDA00003300729300051
以及
Figure FDA00003300729300052
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述假肽单元中的所述赖氨酸残基都为D构型或都为L构型。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述GAG选自肝素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C及其它们的组合，优选所述GAG选自肝素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B和硫酸软骨素C。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含至少1μM的所述多价合成化合物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中，所述多价合成化合物与所述GAG的重量比在0.01与24之间。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述多价合成化合物与所述GAG混合，该混和优选导致微球体的形成。
16.如权利要求15所述的组合物，其中，另一种活性化合物被混合到所述组合物中，所述另一种活性化合物例如，但不限于为细胞毒性剂。
17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，用于治疗与细胞增殖和/或血管生成失调相关的疾病，特别用于治疗癌症。
18.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，用于治疗炎症性疾病。
19.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，用于促进伤口的愈合。
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