JP2024062998A - ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体 - Google Patents
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Abstract
【課題】がんの予防、抑制または治療に有用な、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体、およびその使用を提供する。【解決手段】ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体は、(a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンドであって、(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、第1のペプチドリガンドを含み、前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含む。【選択図】図1
Description
本発明は、がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを
介してコンジュゲートされた、免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガ
ンドを含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体に関する。本発明はまた、がんの予防、
抑制または治療における前記ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体の使用に関する。
介してコンジュゲートされた、免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガ
ンドを含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体に関する。本発明はまた、がんの予防、
抑制または治療における前記ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体の使用に関する。
環状ペプチドは、タンパク質に、高い親和性および標的特異性で結合することができ、
よって、治療薬の開発にとって魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環状ペプチ
ドが、例えば、抗菌ペプチドバンコマイシン、免疫抑制薬シクロスポリンまたは抗がん薬
オクトレオチドとして、診療所で既にうまく使用されている(Driggers et
al.(2008),Nat Rev Drug Discov 7(7),608-2
4)。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きな相互作用表面
、ならびに環状構造の構造的柔軟性の減少に起因する。典型的には、大環状分子は、例え
ば、環状ペプチドCXCR4アンタゴニストCVX15(400Å2;Wu et al
.(2007),Science 330,1066-71)、インテグリンαVb3に
結合するArg-Gly-Aspモチーフを有する環状ペプチド(355Å2)(Xio
ng et al.(2002),Science 296(5565),151-5)
またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイ
ン-1(upain-1)(603Å2;Zhao et al.(2007),J S
truct Biol 160(1),1-10)として、数百平方オングストロームの
表面に結合する。
よって、治療薬の開発にとって魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環状ペプチ
ドが、例えば、抗菌ペプチドバンコマイシン、免疫抑制薬シクロスポリンまたは抗がん薬
オクトレオチドとして、診療所で既にうまく使用されている(Driggers et
al.(2008),Nat Rev Drug Discov 7(7),608-2
4)。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きな相互作用表面
、ならびに環状構造の構造的柔軟性の減少に起因する。典型的には、大環状分子は、例え
ば、環状ペプチドCXCR4アンタゴニストCVX15(400Å2;Wu et al
.(2007),Science 330,1066-71)、インテグリンαVb3に
結合するArg-Gly-Aspモチーフを有する環状ペプチド(355Å2)(Xio
ng et al.(2002),Science 296(5565),151-5)
またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイ
ン-1(upain-1)(603Å2;Zhao et al.(2007),J S
truct Biol 160(1),1-10)として、数百平方オングストロームの
表面に結合する。
その環状構造のために、ペプチド大環状分子は、直鎖ペプチドよりも柔軟性が低く、標
的への結合時にエントロピーの損失が少なく、結合親和性が高くなる。柔軟性の減少はま
た、標的-特異的構造のロックをもたらし、直鎖ペプチドと比較して結合特異性を増加さ
せる。この効果は、マトリックスメタロプロテイナーゼ8(MMP-8)の強力な選択的
阻害剤によって例示され、この阻害剤は開環すると、他のMMPに対するその選択性を失
った(Cherney et al.(1998),J Med Chem 41(11
),1749-51)。大環状化を通して達成される好ましい結合特性は、例えば、バン
コマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンとして、2つ以上のペプチド環を有する多
環式ペプチドでより一層顕著である。
的への結合時にエントロピーの損失が少なく、結合親和性が高くなる。柔軟性の減少はま
た、標的-特異的構造のロックをもたらし、直鎖ペプチドと比較して結合特異性を増加さ
せる。この効果は、マトリックスメタロプロテイナーゼ8(MMP-8)の強力な選択的
阻害剤によって例示され、この阻害剤は開環すると、他のMMPに対するその選択性を失
った(Cherney et al.(1998),J Med Chem 41(11
),1749-51)。大環状化を通して達成される好ましい結合特性は、例えば、バン
コマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンとして、2つ以上のペプチド環を有する多
環式ペプチドでより一層顕著である。
様々な研究チームが、以前、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋
いだ(Kemp and McNamara(1985),J.Org.Chem;Ti
mmerman et al.(2005),ChemBioChem)。Meloen
および同僚らは、タンパク質表面の構造的模倣のため、合成足場上での複数のペプチドル
ープの迅速で定量的な環化のためにトリス(ブロモメチル)ベンゼンおよび関連分子を使
用した(Timmerman et al.(2005),ChemBioChem)。
システイン含有ポリペプチドを、例えば、トリス(ブロモメチル)ベンゼンとしての分子
足場に連結することによって生成される候補薬物化合物を生成する方法は、国際公開第2
004/077062号および国際公開第2006/078161号に開示されている。
いだ(Kemp and McNamara(1985),J.Org.Chem;Ti
mmerman et al.(2005),ChemBioChem)。Meloen
および同僚らは、タンパク質表面の構造的模倣のため、合成足場上での複数のペプチドル
ープの迅速で定量的な環化のためにトリス(ブロモメチル)ベンゼンおよび関連分子を使
用した(Timmerman et al.(2005),ChemBioChem)。
システイン含有ポリペプチドを、例えば、トリス(ブロモメチル)ベンゼンとしての分子
足場に連結することによって生成される候補薬物化合物を生成する方法は、国際公開第2
004/077062号および国際公開第2006/078161号に開示されている。
目的の標的に対する二環式ペプチドの大きなライブラリーを作成およびスクリーニング
するためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発されている
(Heinis et al.(2009)、Nat Chem Biol 5(7)、
502-7および国際公開第2009/098450号)。手短に言えば、3つのシステ
イン残基および6つのランダムアミノ酸の2つの領域を含有する直鎖ペプチド(Cys-
(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)のコンビナトリアルライブラリーをファ
ージ上にディスプレイし、システイン側鎖を小分子(トリス(ブロモメチル)ベンゼン)
に共有結合的に連結することによって環化した。
するためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発されている
(Heinis et al.(2009)、Nat Chem Biol 5(7)、
502-7および国際公開第2009/098450号)。手短に言えば、3つのシステ
イン残基および6つのランダムアミノ酸の2つの領域を含有する直鎖ペプチド(Cys-
(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)のコンビナトリアルライブラリーをファ
ージ上にディスプレイし、システイン側鎖を小分子(トリス(ブロモメチル)ベンゼン)
に共有結合的に連結することによって環化した。
本発明の第1の態様によると、
(a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンドであって、
(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介し
てコンジュゲートされた、第1のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少
なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドル
ープが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成
する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
(a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンドであって、
(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介し
てコンジュゲートされた、第1のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少
なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドル
ープが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成
する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
本発明のさらなる態様によると、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合
わせて、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体を含む医薬組成物が
提供される。
わせて、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体を含む医薬組成物が
提供される。
本発明のさらなる態様によると、がんの予防、抑制または治療に使用するための、本明
細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
本発明の第1の態様によると、
(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介し
てコンジュゲートされた、
(a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少な
くとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドルー
プが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成す
る分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介し
てコンジュゲートされた、
(a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少な
くとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドルー
プが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成す
る分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
第1のペプチドリガンド
本明細書における「免疫細胞」という用語への言及は、免疫系中の任意の細胞を含む。
適切な例としては、リンパ球(例えば、Tリンパ球もしくはT細胞、B細胞またはナチュ
ラルキラー細胞)などの白血球が挙げられる。一実施形態では、T細胞がCD8またはC
D4である。さらなる実施形態では、T細胞がCD8である。免疫細胞の他の例としては
、樹状細胞、濾胞樹状細胞および顆粒球が挙げられる。
本明細書における「免疫細胞」という用語への言及は、免疫系中の任意の細胞を含む。
適切な例としては、リンパ球(例えば、Tリンパ球もしくはT細胞、B細胞またはナチュ
ラルキラー細胞)などの白血球が挙げられる。一実施形態では、T細胞がCD8またはC
D4である。さらなる実施形態では、T細胞がCD8である。免疫細胞の他の例としては
、樹状細胞、濾胞樹状細胞および顆粒球が挙げられる。
一実施形態では、免疫細胞上に存在する成分がCD137である。
CD137は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのメンバーである。その代替
名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(TNFRSF9)、4-IB
Bおよびリンパ球活性化により誘導された(ILA)である。CD137は、活性化T細
胞によって発現され得るが、CD4+T細胞よりもCD8+T細胞上でより多く発現され
る。さらに、CD137発現は、樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒
球および炎症部位の血管壁の細胞に見られる。CD137の1つの特徴付けられた活性は
、活性化T細胞に対するその共刺激活性である。CD137の架橋により、T細胞増殖、
IL-2分泌、生存および細胞溶解活性が増強される。さらに、これにより、マウスにお
いて腫瘍を除去する免疫活性が増強され得る。
名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(TNFRSF9)、4-IB
Bおよびリンパ球活性化により誘導された(ILA)である。CD137は、活性化T細
胞によって発現され得るが、CD4+T細胞よりもCD8+T細胞上でより多く発現され
る。さらに、CD137発現は、樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒
球および炎症部位の血管壁の細胞に見られる。CD137の1つの特徴付けられた活性は
、活性化T細胞に対するその共刺激活性である。CD137の架橋により、T細胞増殖、
IL-2分泌、生存および細胞溶解活性が増強される。さらに、これにより、マウスにお
いて腫瘍を除去する免疫活性が増強され得る。
CD137は、TCR活性化で誘導されるT細胞共刺激受容体である(Nam et
al.,Curr.Cancer Drug Targets,5:357-363(2
005);Waits et al.,Annu.Rev,Immunol.,23:2
3-68(2005))。活性化CD4+およびCD8+T細胞上でのその発現に加えて
、CD137はまた、CD4+CD25+制御性T細胞、ナチュラルキラー(NK)およ
びNK-T細胞、単球、好中球ならびに樹状細胞上でも発現される。その天然リガンド、
CD137Lは、B細胞、単球/マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞で記
載されている(Watts et al.Annu.Rev.Immunol,23:2
3-68(2005))。そのリガンドと相互作用すると、CD137は、増加したTC
R誘導T細胞増殖、サイトカイン産生、機能的成熟および延長したCD8+T細胞生存を
もたらす(Nam et al,Curr.Cancer Drug Targets,
5:357-363(2005),Watts et d-l.,Annu.Rev.I
mmunol,23:23-68(2005))。
al.,Curr.Cancer Drug Targets,5:357-363(2
005);Waits et al.,Annu.Rev,Immunol.,23:2
3-68(2005))。活性化CD4+およびCD8+T細胞上でのその発現に加えて
、CD137はまた、CD4+CD25+制御性T細胞、ナチュラルキラー(NK)およ
びNK-T細胞、単球、好中球ならびに樹状細胞上でも発現される。その天然リガンド、
CD137Lは、B細胞、単球/マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞で記
載されている(Watts et al.Annu.Rev.Immunol,23:2
3-68(2005))。そのリガンドと相互作用すると、CD137は、増加したTC
R誘導T細胞増殖、サイトカイン産生、機能的成熟および延長したCD8+T細胞生存を
もたらす(Nam et al,Curr.Cancer Drug Targets,
5:357-363(2005),Watts et d-l.,Annu.Rev.I
mmunol,23:23-68(2005))。
CD137LまたはCD137に対するアゴニストモノクローナル抗体(mAb)によ
るCD137を通したシグナル伝達は、増加したTCR誘導T細胞増殖、サイトカイン産
生および機能的成熟、ならびに延長したCD8+T細胞生存をもたらす。これらの効果は
、(1)NF-κB、c-Jun NH2末端キナーゼ/ストレス活性化プロテインキナ
ーゼ(JNK/SAPK)およびp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAP
K)シグナル伝達経路の活性化、ならびに(2)抗アポトーシスおよび細胞周期関連遺伝
子発現の制御に起因する。
るCD137を通したシグナル伝達は、増加したTCR誘導T細胞増殖、サイトカイン産
生および機能的成熟、ならびに延長したCD8+T細胞生存をもたらす。これらの効果は
、(1)NF-κB、c-Jun NH2末端キナーゼ/ストレス活性化プロテインキナ
ーゼ(JNK/SAPK)およびp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAP
K)シグナル伝達経路の活性化、ならびに(2)抗アポトーシスおよび細胞周期関連遺伝
子発現の制御に起因する。
CD137とCD137Lの両方が欠損したマウスで実施された実験が、完全コンピテ
ントT細胞応答の生成におけるCD137共刺激の重要性をさらに実証している。
ントT細胞応答の生成におけるCD137共刺激の重要性をさらに実証している。
IL-2およびIL-15活性化NK細胞はCD137を発現し、アゴニストmAbに
よるCD137のライゲーションはNK細胞増殖およびIFN-γ分泌を刺激するが、そ
の細胞溶解活性は刺激しない。
よるCD137のライゲーションはNK細胞増殖およびIFN-γ分泌を刺激するが、そ
の細胞溶解活性は刺激しない。
さらに、CD137刺激NK細胞は、インビトロで活性化T細胞の拡大を促進する。
その共刺激機能によって、CD137に対するアゴニストmAbは、心臓および皮膚同
種移植片の拒絶を促進し、確立された腫瘍を根絶し、一次抗ウイルスCD8+T細胞応答
を広げ、T細胞の細胞溶解能力を増加させることが示されている。これらの研究は、CD
137シグナル伝達が、腫瘍および感染症に対する免疫を増強し得るT細胞機能を促進す
るという考え方を裏付ける。
種移植片の拒絶を促進し、確立された腫瘍を根絶し、一次抗ウイルスCD8+T細胞応答
を広げ、T細胞の細胞溶解能力を増加させることが示されている。これらの研究は、CD
137シグナル伝達が、腫瘍および感染症に対する免疫を増強し得るT細胞機能を促進す
るという考え方を裏付ける。
一実施形態では、第1のペプチドリガンドがCD137結合二環式ペプチドリガンドを
含む。
含む。
CD137結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することに
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1712589.9号および同第
1802934.8号に開示されている。
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1712589.9号および同第
1802934.8号に開示されている。
一実施形態では、CD137結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii(配列番号1);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号3);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii(配列番号4);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号5);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号6);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle
]Ciii(配列番号7);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]C
iii(配列番号8);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii(配列番
号9);および
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][
dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii](配列番号10)
;
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、Nleはノルロイシンを表し、tBuAlaはt-ブチル-アラニンを表し、P
YAは4-ペンチン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii(配列番号1);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号3);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii(配列番号4);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号5);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号6);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle
]Ciii(配列番号7);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]C
iii(配列番号8);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii(配列番
号9);および
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][
dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii](配列番号10)
;
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、Nleはノルロイシンを表し、tBuAlaはt-ブチル-アラニンを表し、P
YAは4-ペンチン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
言及され得る1つの特定の実施形態では、CD137結合二環式ペプチドリガンドが、
アミノ酸配列:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii(配列番号1);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、Nleはノルロイシンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
アミノ酸配列:
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii(配列番号1);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、Nleはノルロイシンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
さらなる実施形態では、CD137結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾および
C末端修飾を含み、
Ac-A-(配列番号1)-Dap(以下、BCY7732と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号1)-Dap(PYA)(以下、BCY7741と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(以下、BCY9172と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(PYA)(以下、BCY11014と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号4)-Dap(以下、BCY8045と呼ぶ);
Ac-(配列番号5)-A(以下、BCY8919と呼ぶ);
Ac-(配列番号6)-A(以下、BCY8920と呼ぶ);
Ac-(配列番号7)-A(以下、BCY8927と呼ぶ);
Ac-(配列番号8)-A(以下、BCY8928と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号9)-A(以下、BCY7744と呼ぶ);および
Ac-[dA]-(配列番号10)-[dA]-NH2(以下、BCY11506と呼ぶ
);
(式中、Acはアセチル基を表し、Dapはジアミノプロピオン酸を表し、PYAは4-
ペンチン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
C末端修飾を含み、
Ac-A-(配列番号1)-Dap(以下、BCY7732と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号1)-Dap(PYA)(以下、BCY7741と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(以下、BCY9172と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(PYA)(以下、BCY11014と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号4)-Dap(以下、BCY8045と呼ぶ);
Ac-(配列番号5)-A(以下、BCY8919と呼ぶ);
Ac-(配列番号6)-A(以下、BCY8920と呼ぶ);
Ac-(配列番号7)-A(以下、BCY8927と呼ぶ);
Ac-(配列番号8)-A(以下、BCY8928と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号9)-A(以下、BCY7744と呼ぶ);および
Ac-[dA]-(配列番号10)-[dA]-NH2(以下、BCY11506と呼ぶ
);
(式中、Acはアセチル基を表し、Dapはジアミノプロピオン酸を表し、PYAは4-
ペンチン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
言及され得るさらなる実施形態では、CD137結合二環式ペプチドリガンドが、N末
端修飾およびC末端修飾を含み、
Ac-A-(配列番号1)-Dap(以下、BCY7732と呼ぶ);
(式中、Acはアセチル基を表し、Dapはジアミノプロピオン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
端修飾およびC末端修飾を含み、
Ac-A-(配列番号1)-Dap(以下、BCY7732と呼ぶ);
(式中、Acはアセチル基を表し、Dapはジアミノプロピオン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
第2のペプチドリガンド
本明細書における「がん細胞」という用語への言及は、がんに関与することが知られて
いる任意の細胞を含む。がん細胞は、細胞分裂の制御を担う遺伝子が損傷を受けた場合に
作り出される。発癌は、増殖と細胞死との間の正常なバランスを狂わせる、正常細胞の遺
伝物質の突然変異およびエピ変異(epimutation)によって引き起こされる。
これにより、制御されない細胞分裂および体内での自然選択によるこれらの細胞の進化が
もたらされる。細胞の制御されない、通常は急速な増殖は、良性または悪性腫瘍(がん)
をもたらし得る。良性腫瘍は、体の他の部分に広がらず、他の組織に侵入もしない。悪性
腫瘍は、他の器官に侵入し、遠隔位置に広がり(転移)、生命を脅かし得る。
本明細書における「がん細胞」という用語への言及は、がんに関与することが知られて
いる任意の細胞を含む。がん細胞は、細胞分裂の制御を担う遺伝子が損傷を受けた場合に
作り出される。発癌は、増殖と細胞死との間の正常なバランスを狂わせる、正常細胞の遺
伝物質の突然変異およびエピ変異(epimutation)によって引き起こされる。
これにより、制御されない細胞分裂および体内での自然選択によるこれらの細胞の進化が
もたらされる。細胞の制御されない、通常は急速な増殖は、良性または悪性腫瘍(がん)
をもたらし得る。良性腫瘍は、体の他の部分に広がらず、他の組織に侵入もしない。悪性
腫瘍は、他の器官に侵入し、遠隔位置に広がり(転移)、生命を脅かし得る。
一実施形態では、がん細胞が、HT1080、SC-OV-3、PC3、H1376、
NCI-H292、LnCap、MC38、4T1-D02およびRKO腫瘍細胞から選
択される。
NCI-H292、LnCap、MC38、4T1-D02およびRKO腫瘍細胞から選
択される。
一実施形態では、がん細胞上に存在する成分がEphA2である。
Eph受容体チロシンキナーゼ(Eph)は、チロシン残基上でタンパク質をリン酸化
するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ(RTK)の大きなグループに属する。Ep
hおよびその膜結合エフリンリガンド(エフリン)は、細胞位置決めおよび組織編成を制
御する(Poliakov et al.(2004)Dev Cell 7,465-
80)。機能的および生化学的Eph応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態で起こ
る(Stein et al.(1998) Genes Dev 12,667-67
8)。
するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ(RTK)の大きなグループに属する。Ep
hおよびその膜結合エフリンリガンド(エフリン)は、細胞位置決めおよび組織編成を制
御する(Poliakov et al.(2004)Dev Cell 7,465-
80)。機能的および生化学的Eph応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態で起こ
る(Stein et al.(1998) Genes Dev 12,667-67
8)。
数あるパターニング機能の中でも、様々なEphおよびエフリンが、血管の発達におい
て役割を果たすことが示されている。EphB4およびエフリン-B2のノックアウトは
、毛細血管床を血管に再構築する能力の欠如(Poliakov et al.、上記)
および胚性致死をもたらす。いくつかのEph受容体およびエフリンの持続的発現は、新
たに形成された成人微小血管でも観察されている(Brantley-Sieders
et al.(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42;Ad
ams(2003)J Anat 202,105-12)。
て役割を果たすことが示されている。EphB4およびエフリン-B2のノックアウトは
、毛細血管床を血管に再構築する能力の欠如(Poliakov et al.、上記)
および胚性致死をもたらす。いくつかのEph受容体およびエフリンの持続的発現は、新
たに形成された成人微小血管でも観察されている(Brantley-Sieders
et al.(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42;Ad
ams(2003)J Anat 202,105-12)。
成人におけるいくつかのエフリンおよびその受容体の脱制御された再出現が、腫瘍浸潤
、転移および血管新生に寄与することも観察されている(Nakamoto et al
.(2002)Microsc Res Tech 59,58-67;Brantle
y-Sieders et al.、上記)。さらに、いくつかのEphファミリーメン
バーが、様々なヒト腫瘍由来の腫瘍細胞上で過剰発現されることが分かっている(Bra
ntley-Sieders et al.、上記;Marme(2002)Ann H
ematol 81 Suppl 2,S66;Booth et al.(2002)
Nat Med 8,1360-1)。
、転移および血管新生に寄与することも観察されている(Nakamoto et al
.(2002)Microsc Res Tech 59,58-67;Brantle
y-Sieders et al.、上記)。さらに、いくつかのEphファミリーメン
バーが、様々なヒト腫瘍由来の腫瘍細胞上で過剰発現されることが分かっている(Bra
ntley-Sieders et al.、上記;Marme(2002)Ann H
ematol 81 Suppl 2,S66;Booth et al.(2002)
Nat Med 8,1360-1)。
EPH受容体A2(エフリンA型受容体2)は、ヒトでは、EPHA2遺伝子によって
コードされるタンパク質である。
コードされるタンパク質である。
Eph2は、通常は疾患進行、転移および予後不良と相関して、ヒトの複数のがん、例
えば、乳がん(Zelinski et al(2001)Cancer Res.61
,2301-2306;Zhuang et al(2010)Cancer Res.
70,299-308;Brantley-Sieders et al(2011)P
LoS One 6,e24426)、肺がん(Brannan et al(2009
)Cancer Prev Res (Phila)2,1039-1049;Kinc
h et al(2003)Clin Cancer Res.9,613-618;G
uo et al(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、
胃がん(Nakamura et al(2005)Cancer Sci.96,42
-47;Yuan et al(2009)Dig Dis Sci 54,2410-
2417)、膵臓がん(Mudali et al(2006)Clin Exp Me
tastasis 23,357-365)、前立腺がん(Walker-Daniel
s et al(1999)Prostate 41,275-280)、肝臓がん(Y
ang et al(2009)Hepatol Res.39,1169-1177)
および膠芽腫(Wykosky et al(2005)Mol Cancer Res
.3,541-551;Li et al(2010)Tumour Biol.31,
477-488)で上方制御される。
えば、乳がん(Zelinski et al(2001)Cancer Res.61
,2301-2306;Zhuang et al(2010)Cancer Res.
70,299-308;Brantley-Sieders et al(2011)P
LoS One 6,e24426)、肺がん(Brannan et al(2009
)Cancer Prev Res (Phila)2,1039-1049;Kinc
h et al(2003)Clin Cancer Res.9,613-618;G
uo et al(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、
胃がん(Nakamura et al(2005)Cancer Sci.96,42
-47;Yuan et al(2009)Dig Dis Sci 54,2410-
2417)、膵臓がん(Mudali et al(2006)Clin Exp Me
tastasis 23,357-365)、前立腺がん(Walker-Daniel
s et al(1999)Prostate 41,275-280)、肝臓がん(Y
ang et al(2009)Hepatol Res.39,1169-1177)
および膠芽腫(Wykosky et al(2005)Mol Cancer Res
.3,541-551;Li et al(2010)Tumour Biol.31,
477-488)で上方制御される。
がん進行におけるEphA2の完全な役割は依然として定義されていないが、腫瘍細胞
成長、生存、浸潤および血管新生を含むがん進行の多数の段階での相互作用についての証
拠が存在する。EphA2発現の下方制御は、腫瘍がん細胞増殖を抑制し(Binda
et al(2012)Cancer Cell 22,765-780)、EphA2
遮断は、VEGF誘導細胞遊走(Hess et al(2001)Cancer Re
s.61,3250-3255)、出芽および血管新生(Cheng et al(20
02)Mol Cancer Res.1,2-11;Lin et al(2007)
Cancer 109,332-40)ならびに転移進行(Brantley-Sied
ers et al (2005)FASEB J.19,1884-1886)を阻害
する。
成長、生存、浸潤および血管新生を含むがん進行の多数の段階での相互作用についての証
拠が存在する。EphA2発現の下方制御は、腫瘍がん細胞増殖を抑制し(Binda
et al(2012)Cancer Cell 22,765-780)、EphA2
遮断は、VEGF誘導細胞遊走(Hess et al(2001)Cancer Re
s.61,3250-3255)、出芽および血管新生(Cheng et al(20
02)Mol Cancer Res.1,2-11;Lin et al(2007)
Cancer 109,332-40)ならびに転移進行(Brantley-Sied
ers et al (2005)FASEB J.19,1884-1886)を阻害
する。
EphA2との抗体薬物複合体は、ラットおよびマウス異種移植片モデルで腫瘍成長を
有意に減少させることが示されており(Jackson et al(2008)Can
cer Research 68,9367-9374)、同様のアプローチがヒトで試
みられているが、治療に関連する有害事象のために治療を中断しなければならなかった(
Annunziata et al(2013)Invest New drugs 3
1,77-84)。
有意に減少させることが示されており(Jackson et al(2008)Can
cer Research 68,9367-9374)、同様のアプローチがヒトで試
みられているが、治療に関連する有害事象のために治療を中断しなければならなかった(
Annunziata et al(2013)Invest New drugs 3
1,77-84)。
一実施形態では、第2のペプチドリガンドがEphA2結合二環式ペプチドリガンドを
含む。
含む。
EphA2結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することに
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1721259.8号および同第
1804102.0号に開示されている。
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1721259.8号および同第
1804102.0号に開示されている。
一実施形態では、EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(配列番号2)
;および
CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii(配列番号11);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HyPはヒドロキシプロリンを表し、dDはD配置のアスパラギン酸を表し、H
Argはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(配列番号2)
;および
CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii(配列番号11);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HyPはヒドロキシプロリンを表し、dDはD配置のアスパラギン酸を表し、H
Argはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
言及され得る一実施形態では、EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配
列:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(配列番号2)
;
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HyPはヒドロキシプロリンを表し、dDはD配置のアスパラギン酸を表し、H
Argはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
列:
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(配列番号2)
;
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HyPはヒドロキシプロリンを表し、dDはD配置のアスパラギン酸を表し、H
Argはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
さらなる実施形態では、EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾を含み
、
A-HArg-D-(配列番号2)(以下、BCY9594と呼ぶ);
[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)(以下、BC
Y6099と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)
(以下、BCY6169と呼ぶ);および
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(配列番号11)(以下、BC
Y8941と呼ぶ);
(式中、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表し、B-Alaはβ-アラニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
、
A-HArg-D-(配列番号2)(以下、BCY9594と呼ぶ);
[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)(以下、BC
Y6099と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)
(以下、BCY6169と呼ぶ);および
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(配列番号11)(以下、BC
Y8941と呼ぶ);
(式中、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表し、B-Alaはβ-アラニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
言及され得るさらなる実施形態では、EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、N末
端修飾を含み、
A-HArg-D-(配列番号2)(以下、BCY9594と呼ぶ)
(式中、HArgはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
端修飾を含み、
A-HArg-D-(配列番号2)(以下、BCY9594と呼ぶ)
(式中、HArgはホモアルギニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分がPD-L1である。
プログラム細胞死1リガンド1(PD-L1)は、マウス染色体19およびヒト染色体
9上のCD274遺伝子によってコードされる290アミノ酸I型膜貫通タンパク質であ
る。PD-L1発現は、慢性感染症、例えば、慢性ウイルス感染症(例えば、中でもHI
V、HBV、HCVおよびHTLVを含む)、慢性細菌感染症(例えば、中でもヘリコバ
クター・ピロリ(Helicobacter pylori)を含む)および慢性寄生生
物感染症(例えば、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)を含
む)に関与する免疫応答の回避に関与する。PD-L1発現は、T細胞、B細胞、マクロ
ファージ、樹状細胞、ならびに内皮細胞、肝細胞、筋細胞および胎盤を含む非造血細胞を
含むいくつかの組織および細胞型で検出されている。
9上のCD274遺伝子によってコードされる290アミノ酸I型膜貫通タンパク質であ
る。PD-L1発現は、慢性感染症、例えば、慢性ウイルス感染症(例えば、中でもHI
V、HBV、HCVおよびHTLVを含む)、慢性細菌感染症(例えば、中でもヘリコバ
クター・ピロリ(Helicobacter pylori)を含む)および慢性寄生生
物感染症(例えば、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)を含
む)に関与する免疫応答の回避に関与する。PD-L1発現は、T細胞、B細胞、マクロ
ファージ、樹状細胞、ならびに内皮細胞、肝細胞、筋細胞および胎盤を含む非造血細胞を
含むいくつかの組織および細胞型で検出されている。
PD-L1発現は、抗腫瘍免疫活性の抑制にも関与している。腫瘍は、宿主T細胞によ
って認識され得る抗原を発現するが、腫瘍の免疫学的排除はまれである。この失敗の一部
は、腫瘍微小環境による免疫抑制のためである。多くの腫瘍でのPD-L1発現が、この
抑制環境の構成要素であり、他の免疫抑制シグナルと合わせて作用する。PD-L1発現
は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上
皮、頭頚部を含む多種多様な固形腫瘍上で、インサイチューで示されている(Brown
JA et al.2003 Immunol.170:1257-66;Dong
H et al.2002 Nat.Med.8:793-800;Hamanishi
J,et al.2007 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104
:3360-65;Strome SE et al.2003 Cancer Res
.63:6501-5;Inman BA et al.2007 Cancer 10
9:1499-505;Konishi J et al.2004 Clin.Can
cer Res.10:5094-100;Nakanishi J et al.20
07 Cancer Immunol.Immunother.56:1173-82;
Nomi T et al.2007 Clin.Cancer Res.13:215
1-57;Thompson RH et al.2004 Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 101:17174-79;Wu C et al.2006
Acta Histochem.108:19-24)。さらに、PD-L1の受容体、
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1およびCD279としても知られている)の発
現が、腫瘍浸潤リンパ球で上方制御されており、これも、腫瘍免疫抑制に寄与している(
Blank C et al.2003 Immunol.171:4574-81)。
最も重要なことに、腫瘍上のPD-L1発現を疾患転帰と関連付ける研究は、PD-L1
発現が、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび膵臓がんにおいて予後不
良と強く相関していることを示している(Hamanishi J et al.200
7 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:3360-65;Inm
an BA et al.2007 Cancer 109:1499-505;Kon
ishi J et al.2004 Clin.Cancer Res.10:509
4-100;Nakanishi J et al.2007 Cancer Immu
nol.Immunother.56:1173-82;Nomi T et al.2
007 Clin.Cancer Res.13:2151-57;Thompson
RH et al.2004 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101
:17174-79;Wu C et al.2006 Acta Histochem
.108:19-24)。さらに、これらの研究は、腫瘍上のより高レベルのPD-L1
発現が、腫瘍段階の前進およびより深い組織構造への侵入を促進し得ることを示唆してい
る。
って認識され得る抗原を発現するが、腫瘍の免疫学的排除はまれである。この失敗の一部
は、腫瘍微小環境による免疫抑制のためである。多くの腫瘍でのPD-L1発現が、この
抑制環境の構成要素であり、他の免疫抑制シグナルと合わせて作用する。PD-L1発現
は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上
皮、頭頚部を含む多種多様な固形腫瘍上で、インサイチューで示されている(Brown
JA et al.2003 Immunol.170:1257-66;Dong
H et al.2002 Nat.Med.8:793-800;Hamanishi
J,et al.2007 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104
:3360-65;Strome SE et al.2003 Cancer Res
.63:6501-5;Inman BA et al.2007 Cancer 10
9:1499-505;Konishi J et al.2004 Clin.Can
cer Res.10:5094-100;Nakanishi J et al.20
07 Cancer Immunol.Immunother.56:1173-82;
Nomi T et al.2007 Clin.Cancer Res.13:215
1-57;Thompson RH et al.2004 Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 101:17174-79;Wu C et al.2006
Acta Histochem.108:19-24)。さらに、PD-L1の受容体、
プログラム細胞死タンパク質1(PD-1およびCD279としても知られている)の発
現が、腫瘍浸潤リンパ球で上方制御されており、これも、腫瘍免疫抑制に寄与している(
Blank C et al.2003 Immunol.171:4574-81)。
最も重要なことに、腫瘍上のPD-L1発現を疾患転帰と関連付ける研究は、PD-L1
発現が、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび膵臓がんにおいて予後不
良と強く相関していることを示している(Hamanishi J et al.200
7 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:3360-65;Inm
an BA et al.2007 Cancer 109:1499-505;Kon
ishi J et al.2004 Clin.Cancer Res.10:509
4-100;Nakanishi J et al.2007 Cancer Immu
nol.Immunother.56:1173-82;Nomi T et al.2
007 Clin.Cancer Res.13:2151-57;Thompson
RH et al.2004 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101
:17174-79;Wu C et al.2006 Acta Histochem
.108:19-24)。さらに、これらの研究は、腫瘍上のより高レベルのPD-L1
発現が、腫瘍段階の前進およびより深い組織構造への侵入を促進し得ることを示唆してい
る。
PD-1経路はまた、血液悪性腫瘍においても役割を果たすことができる。PD-L1
は、多発性骨髄腫細胞上で発現されるが、正常な形質細胞上では発現されない(Liu
J et al.2007 Blood 110:296-304)。PD-L1は、い
くつかの原発性T細胞リンパ腫、特に未分化大細胞型Tリンパ腫上で発現される(Bro
wn JA et al,2003 Immunol.170:1257-66)。PD
-1は、血管免疫芽球性リンパ腫のT細胞上で高度に発現され、PD-L1は、関連する
濾胞樹状細胞ネットワーク上で発現される(Dorfman DM et al.200
6 Am.J.Surg.Pathol.30:802-10)。結節性リンパ球優位型
ホジキンリンパ腫では、リンパ球性または組織球性(L&H)細胞に関連するT細胞がP
D-1を発現する。PD-1連結によって誘導される遺伝子の読み取りを使用したマイク
ロアレイ解析は、腫瘍関連T細胞が、ホジキンリンパ腫で、インサイチューでPD-1シ
グナルに応答していることを示唆している(Chemnitz JM et al.20
07 Blood 110:3226-33)。PD-1およびPD-L1は、HTLV
-1媒介成人T細胞白血病およびリンパ腫においてCD4 T細胞上で発現される(Sh
imauchi T et al.2007 Int.J.Cancer 121:25
85-90)。これらの腫瘍細胞は、TCRシグナルに対して低反応性である。
は、多発性骨髄腫細胞上で発現されるが、正常な形質細胞上では発現されない(Liu
J et al.2007 Blood 110:296-304)。PD-L1は、い
くつかの原発性T細胞リンパ腫、特に未分化大細胞型Tリンパ腫上で発現される(Bro
wn JA et al,2003 Immunol.170:1257-66)。PD
-1は、血管免疫芽球性リンパ腫のT細胞上で高度に発現され、PD-L1は、関連する
濾胞樹状細胞ネットワーク上で発現される(Dorfman DM et al.200
6 Am.J.Surg.Pathol.30:802-10)。結節性リンパ球優位型
ホジキンリンパ腫では、リンパ球性または組織球性(L&H)細胞に関連するT細胞がP
D-1を発現する。PD-1連結によって誘導される遺伝子の読み取りを使用したマイク
ロアレイ解析は、腫瘍関連T細胞が、ホジキンリンパ腫で、インサイチューでPD-1シ
グナルに応答していることを示唆している(Chemnitz JM et al.20
07 Blood 110:3226-33)。PD-1およびPD-L1は、HTLV
-1媒介成人T細胞白血病およびリンパ腫においてCD4 T細胞上で発現される(Sh
imauchi T et al.2007 Int.J.Cancer 121:25
85-90)。これらの腫瘍細胞は、TCRシグナルに対して低反応性である。
動物モデルでの研究が、腫瘍上のPD-L1がT細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻
害し、ある場合には、腫瘍特異的T細胞死の増加をもたらすことを実証している(Don
g H et al.2002 Nat.Med.8:793-800;Hirano
F et al.2005 Cancer Res.65:1089-96)。腫瘍関連
APCはまた、PD-1:PD-L1経路を利用して抗腫瘍T細胞応答を制御することも
できる。腫瘍関連骨髄DCの集団でのPD-L1発現は、腫瘍環境因子によって上方制御
される(Curiel TJ et al.2003 Nat.Med.9:562-6
7)。B16黒色腫の腫瘍流入領域リンパ節中の形質細胞様樹状細胞(DC)は、制御性
T細胞の抑制活性を強力に活性化するIDOを発現する。IDOで処理された制御性T細
胞の抑制活性には、IDO発現DCとの細胞接触が必要であった(Sharma MD
et al.2007 Clin.Invest.117:2570-82)。
害し、ある場合には、腫瘍特異的T細胞死の増加をもたらすことを実証している(Don
g H et al.2002 Nat.Med.8:793-800;Hirano
F et al.2005 Cancer Res.65:1089-96)。腫瘍関連
APCはまた、PD-1:PD-L1経路を利用して抗腫瘍T細胞応答を制御することも
できる。腫瘍関連骨髄DCの集団でのPD-L1発現は、腫瘍環境因子によって上方制御
される(Curiel TJ et al.2003 Nat.Med.9:562-6
7)。B16黒色腫の腫瘍流入領域リンパ節中の形質細胞様樹状細胞(DC)は、制御性
T細胞の抑制活性を強力に活性化するIDOを発現する。IDOで処理された制御性T細
胞の抑制活性には、IDO発現DCとの細胞接触が必要であった(Sharma MD
et al.2007 Clin.Invest.117:2570-82)。
一実施形態では、第2のペプチドリガンドがPD-L1結合二環式ペプチドリガンドを
含む。
含む。
PD-L1結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することに
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1820956.9号および同第
1820969.2号に開示されている。
より本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1820956.9号および同第
1820969.2号に開示されている。
一実施形態では、PD-L1二環式ペプチドリガンドが、
Ci[HArg]DWCiiHWTFSHGHPCiii(配列番号12);
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii(配列番号13);および
CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii(配列番号14);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
Ci[HArg]DWCiiHWTFSHGHPCiii(配列番号12);
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii(配列番号13);および
CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii(配列番号14);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
さらなる実施形態では、PD-L1結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾および
/またはC末端修飾を含み、
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号12)(以下、BCY893
8と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(配列番号13)(以下、BC
Y10043と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号13)-[Sar10]-[K(PYA)](以下、BCY
10044と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号14)(以下、BCY10045と呼ぶ);および
Ac-SDK-(配列番号14)-PSH(以下、BCY10861と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
/またはC末端修飾を含み、
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号12)(以下、BCY893
8と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(配列番号13)(以下、BC
Y10043と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号13)-[Sar10]-[K(PYA)](以下、BCY
10044と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号14)(以下、BCY10045と呼ぶ);および
Ac-SDK-(配列番号14)-PSH(以下、BCY10861と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分がネクチン-4である。
ネクチン-4は、4つのメンバーを含むタンパク質のネクチンファミリーに属する表面
分子である。ネクチンは、発達および成人期中の上皮、内皮、免疫および神経細胞のため
の極性、増殖、分化および遊走などの様々な生物学的過程において重要な役割を果たす細
胞接着分子である。これらは、ヒトにおけるいくつかの病理学的過程に関与する。これら
は、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび麻疹ウイルスの主な受容体である。ネ
クチン-1(PVRL1)またはネクチン-4(PVRL4)をコードする遺伝子の突然
変異は、他の異常に関連する外胚葉性異形成症候群を引き起こす。ネクチン-4は、胎児
発生中に発現される。成人組織では、その発現が、ファミリーの他のメンバーの発現より
も制限される。ネクチン-4は、乳癌、卵巣癌および肺癌のそれぞれ50%、49%およ
び86%における腫瘍関連抗原であり、ほとんど予後不良の腫瘍上にある。その発現は、
対応する正常組織では検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン-4が、主にトリプルネガ
ティブおよびERBB2+癌で発現される。これらのがんを有する患者の血清では、ネク
チン-4の可溶型の検出が、予後不良に関連している。血清ネクチン-4のレベルは、転
移進行中に増加し、治療後に減少する。これらの結果は、ネクチン-4が、がんの治療の
信頼できる標的となり得ることを示唆している。したがって、いくつかの抗ネクチン-4
抗体が先行技術で記載されている。特に、エンホルツマブベドチン(ASG-22ME)
は、ネクチン-4を標的とする抗体薬物複合体(ADC)であり、固形腫瘍を患っている
患者の治療について現在臨床的に調査されている。
分子である。ネクチンは、発達および成人期中の上皮、内皮、免疫および神経細胞のため
の極性、増殖、分化および遊走などの様々な生物学的過程において重要な役割を果たす細
胞接着分子である。これらは、ヒトにおけるいくつかの病理学的過程に関与する。これら
は、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび麻疹ウイルスの主な受容体である。ネ
クチン-1(PVRL1)またはネクチン-4(PVRL4)をコードする遺伝子の突然
変異は、他の異常に関連する外胚葉性異形成症候群を引き起こす。ネクチン-4は、胎児
発生中に発現される。成人組織では、その発現が、ファミリーの他のメンバーの発現より
も制限される。ネクチン-4は、乳癌、卵巣癌および肺癌のそれぞれ50%、49%およ
び86%における腫瘍関連抗原であり、ほとんど予後不良の腫瘍上にある。その発現は、
対応する正常組織では検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン-4が、主にトリプルネガ
ティブおよびERBB2+癌で発現される。これらのがんを有する患者の血清では、ネク
チン-4の可溶型の検出が、予後不良に関連している。血清ネクチン-4のレベルは、転
移進行中に増加し、治療後に減少する。これらの結果は、ネクチン-4が、がんの治療の
信頼できる標的となり得ることを示唆している。したがって、いくつかの抗ネクチン-4
抗体が先行技術で記載されている。特に、エンホルツマブベドチン(ASG-22ME)
は、ネクチン-4を標的とする抗体薬物複合体(ADC)であり、固形腫瘍を患っている
患者の治療について現在臨床的に調査されている。
一実施形態では、第2のペプチドリガンドがネクチン-4結合二環式ペプチドリガンド
を含む。
を含む。
ネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用すること
により本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1810250.9号、同第1
815684.4号および同第1818499.4号に開示されている。
により本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1810250.9号、同第1
815684.4号および同第1818499.4号に開示されている。
一実施形態では、ネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドが、
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配
列番号15;以下、BCY8116と呼ぶ);
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]
Ciii(配列番号16;以下、BCY11415と呼ぶ);および
CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DW
STP[HyP]WCiii(配列番号17);
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配列番号18;以下
、BCY11414と呼ぶ);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、1Nalは1-ナフチルアラニンを表し、HArgはホモアルギニンを表し、H
yPはヒドロキシプロリンを表し、Sar10は10個のサルコシン単位を表し、B-A
laはβ-アラニンを表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配
列番号15;以下、BCY8116と呼ぶ);
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]
Ciii(配列番号16;以下、BCY11415と呼ぶ);および
CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DW
STP[HyP]WCiii(配列番号17);
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配列番号18;以下
、BCY11414と呼ぶ);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、1Nalは1-ナフチルアラニンを表し、HArgはホモアルギニンを表し、H
yPはヒドロキシプロリンを表し、Sar10は10個のサルコシン単位を表し、B-A
laはβ-アラニンを表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
さらなる実施形態では、ネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドが、場合により、N
末端修飾を含み、
配列番号15(以下、BCY8116と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号15)(以下、BCY884
6と呼ぶ);
配列番号16(以下、BCY11415と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号16)(以下、BCY119
42と呼ぶ);
Ac-(配列番号17)(以下、BCY8831と呼ぶ);および
配列番号18(以下、BCY11414と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
末端修飾を含み、
配列番号15(以下、BCY8116と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号15)(以下、BCY884
6と呼ぶ);
配列番号16(以下、BCY11415と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号16)(以下、BCY119
42と呼ぶ);
Ac-(配列番号17)(以下、BCY8831と呼ぶ);および
配列番号18(以下、BCY11414と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む。
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分が前立腺特異的膜抗原(PSMA)であ
る。
る。
前立腺特異的膜抗原(PSMA)(グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCP
II)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAAL
ADaseI)およびNAAGペプチダーゼとしても知られている)は、ヒトでは、FO
LH1(葉酸ヒドロラーゼ1)遺伝子によってコードされる酵素である。ヒトGCPII
は、750アミノ酸を含み、重さがおよそ84kDaである。
II)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAAL
ADaseI)およびNAAGペプチダーゼとしても知られている)は、ヒトでは、FO
LH1(葉酸ヒドロラーゼ1)遺伝子によってコードされる酵素である。ヒトGCPII
は、750アミノ酸を含み、重さがおよそ84kDaである。
ヒトPSMAは、前立腺で高度に、ほとんどの他の組織よりもおよそ100倍高く発現
される。いくつかの前立腺がんでは、PSMAが、2番目に多く上方制御される遺伝子産
物であり、非がん性前立腺細胞のレベルよりも8~12倍増加している。この高い発現の
ために、PSMAは、いくつかのがんの療法および画像化のための潜在的なバイオマーカ
ーとして開発されている。ヒト前立腺がんでは、より高度に発現している腫瘍は、進行ま
での時間が速く、再発を患う患者の割合が高いことを伴う。
される。いくつかの前立腺がんでは、PSMAが、2番目に多く上方制御される遺伝子産
物であり、非がん性前立腺細胞のレベルよりも8~12倍増加している。この高い発現の
ために、PSMAは、いくつかのがんの療法および画像化のための潜在的なバイオマーカ
ーとして開発されている。ヒト前立腺がんでは、より高度に発現している腫瘍は、進行ま
での時間が速く、再発を患う患者の割合が高いことを伴う。
一実施形態では、第2のペプチドリガンドがPSMA結合二環式ペプチドリガンドを含
む。
む。
PSMA結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することによ
り本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1810318.4号、同第181
0325.9号および同第1820325.7号に開示されている。
り本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第1810318.4号、同第181
0325.9号および同第1820325.7号に開示されている。
リンカー
第1のペプチドリガンドを、任意の適切なリンカーを介して第2のペプチドリガンドに
コンジュゲートすることができることが理解されるだろう。典型的には、前記リンカーの
設計は、2つの二環式ペプチドが、単独で、または両標的受容体に同時に結合している間
にそれぞれの標的に邪魔されずに結合することができるように提供されるようなものとな
る。さらに、リンカーは、所望の機能的帰結をもたらす標的細胞間の適切な距離を維持し
ながら、両標的に同時に結合することを許すべきである。リンカーの特性を、所望の機能
的帰結を最適化するために、長さ、剛性または可溶性を増加させるよう調節することがで
きる。リンカーを、2つ以上の二環が同じ標的に付着することを許すよう設計することも
できる。いずれかの結合ペプチドの結合価を増加させることが、標的細胞に対するヘテロ
タンデムの親和性を増加させるのに役立ち得る、または標的受容体の一方もしくは両方の
オリゴマー化を誘導するのに役立ち得る。
第1のペプチドリガンドを、任意の適切なリンカーを介して第2のペプチドリガンドに
コンジュゲートすることができることが理解されるだろう。典型的には、前記リンカーの
設計は、2つの二環式ペプチドが、単独で、または両標的受容体に同時に結合している間
にそれぞれの標的に邪魔されずに結合することができるように提供されるようなものとな
る。さらに、リンカーは、所望の機能的帰結をもたらす標的細胞間の適切な距離を維持し
ながら、両標的に同時に結合することを許すべきである。リンカーの特性を、所望の機能
的帰結を最適化するために、長さ、剛性または可溶性を増加させるよう調節することがで
きる。リンカーを、2つ以上の二環が同じ標的に付着することを許すよう設計することも
できる。いずれかの結合ペプチドの結合価を増加させることが、標的細胞に対するヘテロ
タンデムの親和性を増加させるのに役立ち得る、または標的受容体の一方もしくは両方の
オリゴマー化を誘導するのに役立ち得る。
一実施形態では、リンカーが、以下の配列、-CH2-、-PEG5-、-PEG10
-、-PEG12-、-PEG23-、-PEG24-、-PEG15-Sar5-、-
PEG10-Sar10-、-PEG5-Sar15-、-PEG5-Sar5-、-B
-Ala-Sar20-、-B-Ala-Sar10-PEG10-、-B-Ala-S
ar5-PEG15-およびB-Ala-Sar5-PEG5-から選択される。
-、-PEG12-、-PEG23-、-PEG24-、-PEG15-Sar5-、-
PEG10-Sar10-、-PEG5-Sar15-、-PEG5-Sar5-、-B
-Ala-Sar20-、-B-Ala-Sar10-PEG10-、-B-Ala-S
ar5-PEG15-およびB-Ala-Sar5-PEG5-から選択される。
適切なリンカーの構造的表現を以下に詳述する。
ヘテロタンデム複合体
1つの具体的な実施形態では、第1のペプチドリガンドが、TATA足場に結合したC
D137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TATA足場
に結合したEphA2結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複合体が
1つの具体的な実施形態では、第1のペプチドリガンドが、TATA足場に結合したC
D137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TATA足場
に結合したEphA2結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複合体が
ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体BCY7985は、PEG12を介してEphA
2特異的ペプチドBCY6169のN末端PYA基に連結されたCD137特異的ペプチ
ドBCY7859からなる(図2に絵によって示される)。
2特異的ペプチドBCY6169のN末端PYA基に連結されたCD137特異的ペプチ
ドBCY7859からなる(図2に絵によって示される)。
CD137はホモ三量体タンパク質であり、天然リガンドCD137Lは、免疫細胞上
で発現されるまたは分泌されるホモ三量体として存在する。CD137の生物学は、免疫
細胞でCD137活性を誘導するための多量体化に高度に依存する。CD137多量体化
をもたらす1つの方法は、別の細胞上に存在する特異的受容体との相互作用を通したCD
137特異的アゴニストの細胞架橋を通したものである。
で発現されるまたは分泌されるホモ三量体として存在する。CD137の生物学は、免疫
細胞でCD137活性を誘導するための多量体化に高度に依存する。CD137多量体化
をもたらす1つの方法は、別の細胞上に存在する特異的受容体との相互作用を通したCD
137特異的アゴニストの細胞架橋を通したものである。
EphA2は、腫瘍細胞上で高度に発現され、エフリン-Aリガンドによるこの受容体
チロシンキナーゼのオリゴマー化が、その活性化を駆動する。理論によって拘束されるも
のではないが、本発明者らは、1つのCD137特異的ペプチドにカップリングした1つ
のEphA2特異的ペプチドからなるEphA2-CD137ヘテロタンデムが、CD1
37を架橋するよう作用すると考えている。どうやらCD137が、腫瘍細胞などの細胞
上で、EphA2の存在下で多量体化および活性化されるようである。これにより、局所
腫瘍環境でのCD137免疫細胞活性化が駆動されるだろう(図1)。
チロシンキナーゼのオリゴマー化が、その活性化を駆動する。理論によって拘束されるも
のではないが、本発明者らは、1つのCD137特異的ペプチドにカップリングした1つ
のEphA2特異的ペプチドからなるEphA2-CD137ヘテロタンデムが、CD1
37を架橋するよう作用すると考えている。どうやらCD137が、腫瘍細胞などの細胞
上で、EphA2の存在下で多量体化および活性化されるようである。これにより、局所
腫瘍環境でのCD137免疫細胞活性化が駆動されるだろう(図1)。
この仮説を、本明細書に記載されるCD137細胞活性レポーターアッセイで試験し、
結果を図3で本明細書において示すと、BCY7985が、EphA2発現HT1080
細胞の存在下、Promega CD137ルシフェラーゼレポーターアッセイ(CS1
96008)でCD137細胞活性の強力な誘導を示したことが分かる。
結果を図3で本明細書において示すと、BCY7985が、EphA2発現HT1080
細胞の存在下、Promega CD137ルシフェラーゼレポーターアッセイ(CS1
96008)でCD137細胞活性の強力な誘導を示したことが分かる。
1つの代替の具体的な実施形態では、第1のペプチドリガンドが、TATA足場に結合
したCD137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TAT
A足場に結合したネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム
複合体が、
したCD137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TAT
A足場に結合したネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム
複合体が、
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、1つのCD137特異的ペプ
チドにカップリングした1つのネクチン-4特異的ペプチドからなるネクチン-4-CD
137ヘテロタンデムが、EphA2について前に記載されるのと同様に、CD137を
架橋するよう作用すると考えている。
チドにカップリングした1つのネクチン-4特異的ペプチドからなるネクチン-4-CD
137ヘテロタンデムが、EphA2について前に記載されるのと同様に、CD137を
架橋するよう作用すると考えている。
一実施形態では、ネクチン-4-CD137ヘテロタンデムが、BCY11857、B
CY11858および/またはBCY11859のうちのいずれか1つまたは複数以外で
ある。
CY11858および/またはBCY11859のうちのいずれか1つまたは複数以外で
ある。
1つの代替の具体的な実施形態では、第1のペプチドリガンドが、TATA足場に結合
したCD137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TAT
A足場に結合したPD-L1結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複
合体が、
したCD137結合二環式ペプチドリガンドを含み、第2のペプチドリガンドが、TAT
A足場に結合したPD-L1結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複
合体が、
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、1つのCD137特異的ペプ
チドにカップリングした1つのPD-L1特異的ペプチドからなるPD-L1-CD13
7ヘテロタンデムが、EphA2について前に記載されるのと同様に、CD137を架橋
するよう作用すると考えている。
チドにカップリングした1つのPD-L1特異的ペプチドからなるPD-L1-CD13
7ヘテロタンデムが、EphA2について前に記載されるのと同様に、CD137を架橋
するよう作用すると考えている。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、ペプチ
ド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の分野などの当業
者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。引用することにより本明細書の一
部をなすものとする、標準的な技術が、分子生物学、遺伝子および生化学方法に使用され
る(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har
bor,NY;Ausubel et al.,Short Protocols in
Molecular Biology(1999)4th ed.,John Wil
ey&Sons,Inc.参照)。
ド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の分野などの当業
者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。引用することにより本明細書の一
部をなすものとする、標準的な技術が、分子生物学、遺伝子および生化学方法に使用され
る(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A La
boratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har
bor,NY;Ausubel et al.,Short Protocols in
Molecular Biology(1999)4th ed.,John Wil
ey&Sons,Inc.参照)。
命名法
番号付け
本発明の化合物内のアミノ酸残基位置に言及する場合、システイン残基(Ci、Cii
およびCiii)は不変であるため番号付けから省かれるので、配列番号1内のアミノ酸
残基の番号付けは、
Ci-I1-E2-E3-G4-Q5-Y6-Cii-F7-A8-D9-P10-Y1
1-[Nle]12-Ciii(配列番号1)
と呼ばれる。
番号付け
本発明の化合物内のアミノ酸残基位置に言及する場合、システイン残基(Ci、Cii
およびCiii)は不変であるため番号付けから省かれるので、配列番号1内のアミノ酸
残基の番号付けは、
Ci-I1-E2-E3-G4-Q5-Y6-Cii-F7-A8-D9-P10-Y1
1-[Nle]12-Ciii(配列番号1)
と呼ばれる。
本明細書の目的のために、全ての二環式ペプチドは、TBMB(1,3,5-トリス(
ブロモメチル)ベンゼン)または1,1’,1’’-(1,3,5-トリアジナン-1,
3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(1,1',1''-(1,3,5-triazinane-1,3
,5-triyl)triprop-2-en-1-one:TATA)で環化され、三置換構造をもたらすと仮定さ
れる。TBMBおよびTATAによる環化は、Ci、CiiおよびCiiiで起こる。
ブロモメチル)ベンゼン)または1,1’,1’’-(1,3,5-トリアジナン-1,
3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(1,1',1''-(1,3,5-triazinane-1,3
,5-triyl)triprop-2-en-1-one:TATA)で環化され、三置換構造をもたらすと仮定さ
れる。TBMBおよびTATAによる環化は、Ci、CiiおよびCiiiで起こる。
分子フォーマット
二環コア配列へのN末端伸長またはC末端伸長は、配列の左側または右側に付加され、
ハイフンによって分離される。例えば、N末端βAla-Sar10-Ala尾部は、
βAla-Sar10-A-(配列番号X)として表される。
二環コア配列へのN末端伸長またはC末端伸長は、配列の左側または右側に付加され、
ハイフンによって分離される。例えば、N末端βAla-Sar10-Ala尾部は、
βAla-Sar10-A-(配列番号X)として表される。
逆ペプチド配列
Nair et al(2003)J Immunol 170(3),1362-1
373の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列が、そのレトロインベルソ
型(retro-inverso form)でも有用性を見出すと想定される。例えば
、配列が逆にされ(すなわち、N末端がC末端になる、および逆もまた同様である)、そ
の立体化学も同様に逆にされる(すなわち、D-アミノ酸がL-アミノ酸になる、および
逆もまた同様である)。
Nair et al(2003)J Immunol 170(3),1362-1
373の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列が、そのレトロインベルソ
型(retro-inverso form)でも有用性を見出すと想定される。例えば
、配列が逆にされ(すなわち、N末端がC末端になる、および逆もまた同様である)、そ
の立体化学も同様に逆にされる(すなわち、D-アミノ酸がL-アミノ酸になる、および
逆もまた同様である)。
ペプチドリガンド
本明細書で言及されるペプチドリガンドは、分子足場に共有結合したペプチドを指す。
典型的には、このようなペプチドは、足場との共有結合を形成することができる2つ以上
の反応性基(すなわち、システイン残基)、およびペプチドが足場に結合している場合に
、ループを形成するので、ループ配列と呼ばれる、前記反応性基の間に定められる配列を
含む。この場合、ペプチドは、少なくとも3つのシステイン残基(本明細書ではCi、C
iiおよびCiiiと呼ばれる)を含み、足場上に少なくとも2つのループを形成する。
本明細書で言及されるペプチドリガンドは、分子足場に共有結合したペプチドを指す。
典型的には、このようなペプチドは、足場との共有結合を形成することができる2つ以上
の反応性基(すなわち、システイン残基)、およびペプチドが足場に結合している場合に
、ループを形成するので、ループ配列と呼ばれる、前記反応性基の間に定められる配列を
含む。この場合、ペプチドは、少なくとも3つのシステイン残基(本明細書ではCi、C
iiおよびCiiiと呼ばれる)を含み、足場上に少なくとも2つのループを形成する。
薬学的に許容される塩
塩形態が本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及が、前記リガンドの塩形態
を含むことが理解されるだろう。
塩形態が本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及が、前記リガンドの塩形態
を含むことが理解されるだろう。
本発明の塩は、Pharmaceutical Salts:Properties,
Selection,and Use,P. Heinrich Stahl(Edit
or),Camille G.Wermuth(Editor),ISBN:3-906
39-026-8,Hardcover,388pages,August 2002に
記載される方法などの従来の化学的方法によって塩基性部分または酸性部分を含む親化合
物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態
または遊離塩基形態を、水もしくは有機溶媒または2者の混合物中、適切な塩基または酸
と反応させることによって調製することができる。
Selection,and Use,P. Heinrich Stahl(Edit
or),Camille G.Wermuth(Editor),ISBN:3-906
39-026-8,Hardcover,388pages,August 2002に
記載される方法などの従来の化学的方法によって塩基性部分または酸性部分を含む親化合
物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態
または遊離塩基形態を、水もしくは有機溶媒または2者の混合物中、適切な塩基または酸
と反応させることによって調製することができる。
酸付加塩(一塩または二塩)は、無機と有機の両方の、多種多様な酸で形成され得る。
酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコ
ルビン酸(例えば、L-アスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、
安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)樟脳酸、カンファースルホン酸
、(+)-(1S)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリ
ル酸、ケイヒ酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-二スルホン
酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル
酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、D-グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D-グ
ルクロン酸)、グルタミン酸(例えば、L-グルタミン酸)、α-オキソグルタル酸、グ
リコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸(例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸)、
イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン
酸、マレイン酸、リンゴ酸、(-)-L-リンゴ酸、マロン酸、(±)-DL-マンデル
酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-二スルホン
酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュ
ウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L-ピログルタミン
酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、
タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシレ
ン酸および吉草酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂からなる群から選
択される酸で形成される一塩または二塩が挙げられる。
酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコ
ルビン酸(例えば、L-アスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、
安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)樟脳酸、カンファースルホン酸
、(+)-(1S)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリ
ル酸、ケイヒ酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-二スルホン
酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル
酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、D-グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D-グ
ルクロン酸)、グルタミン酸(例えば、L-グルタミン酸)、α-オキソグルタル酸、グ
リコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸(例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸)、
イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン
酸、マレイン酸、リンゴ酸、(-)-L-リンゴ酸、マロン酸、(±)-DL-マンデル
酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-二スルホン
酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュ
ウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L-ピログルタミン
酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、
タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシレ
ン酸および吉草酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂からなる群から選
択される酸で形成される一塩または二塩が挙げられる。
塩の1つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、
乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸
、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸(メシル酸)、エタンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラク
トビオン酸から形成される塩からなる。1つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は
酢酸塩である。
乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸
、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸(メシル酸)、エタンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラク
トビオン酸から形成される塩からなる。1つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は
酢酸塩である。
化合物がアニオン性である、またはアニオン性になり得る官能基を有する(例えば、-
COOHは-COO-になり得る)場合、塩が有機塩基または無機塩基で形成され、適切
なカチオンを生成し得る。適切な無機カチオンの例としては、それだけに限らないが、L
i+、Na+およびK+などのアルカリ金属イオン、Ca2+およびMg2+などのアル
カリ土類金属カチオン、ならびにAl3+またはZn+などの他のカチオンが挙げられる
。適切な有機カチオンの例としては、それだけに限らないが、アンモニウムイオン(すな
わち、NH4 +)および置換アンモニウムイオン(例えば、NH3R+、NH2R2 +、
NHR3 +、NR4 +)が挙げられる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は
、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルア
ミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタ
ノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグル
ミンおよびトロメタミン、ならびにリジンおよびアルギニンなどのアミノ酸から誘導され
るものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、N(CH3)4 +である。
COOHは-COO-になり得る)場合、塩が有機塩基または無機塩基で形成され、適切
なカチオンを生成し得る。適切な無機カチオンの例としては、それだけに限らないが、L
i+、Na+およびK+などのアルカリ金属イオン、Ca2+およびMg2+などのアル
カリ土類金属カチオン、ならびにAl3+またはZn+などの他のカチオンが挙げられる
。適切な有機カチオンの例としては、それだけに限らないが、アンモニウムイオン(すな
わち、NH4 +)および置換アンモニウムイオン(例えば、NH3R+、NH2R2 +、
NHR3 +、NR4 +)が挙げられる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は
、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルア
ミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタ
ノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグル
ミンおよびトロメタミン、ならびにリジンおよびアルギニンなどのアミノ酸から誘導され
るものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、N(CH3)4 +である。
本発明の化合物がアミン官能基を含む場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法に
従って、アルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。このよう
な第四級アンモニウム化合物は、本発明の範囲内である。
従って、アルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。このよう
な第四級アンモニウム化合物は、本発明の範囲内である。
修飾誘導体
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理
解されるだろう。このような適切な修飾誘導体の例としては、N末端修飾および/または
C末端修飾;1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然アミノ酸残基によ
る置き換え(1つまたは複数の極性アミノ酸残基の1つまたは複数の等価または等電子ア
ミノ酸による置き換え;1つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然等価または等
電子アミノ酸による置き換えなど);スペーサー基の付加;1つまたは複数の酸化感受性
アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換え;1つまたは複数
のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、1つまたは複数のL-アミノ酸残基の1つま
たは複数のD-アミノ酸残基による置き換え;二環式ペプチドリガンド内の1つまたは複
数のアミド結合のN-アルキル化;1つまたは複数のペプチド結合の代理結合による置き
換え;ペプチド骨格長の修飾;1つまたは複数のアミノ酸残基のα-炭素上の水素の別の
化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸/アスパラギン酸およびチロシン
などのアミノ酸の、前記アミノ酸を官能化するための適切なアミン、チオール、カルボン
酸およびフェノール-反応性試薬による修飾、ならびにそれぞれ、官能化に適した直交性
反応基、例えば、アジドを導入するアミノ酸、またはアルキンによる官能化を可能にする
アルキン基保有アミノ酸、またアジド保有部分の導入または置き換えから選択される1つ
または複数の修飾が挙げられる。
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理
解されるだろう。このような適切な修飾誘導体の例としては、N末端修飾および/または
C末端修飾;1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非天然アミノ酸残基によ
る置き換え(1つまたは複数の極性アミノ酸残基の1つまたは複数の等価または等電子ア
ミノ酸による置き換え;1つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然等価または等
電子アミノ酸による置き換えなど);スペーサー基の付加;1つまたは複数の酸化感受性
アミノ酸残基の1つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換え;1つまたは複数
のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、1つまたは複数のL-アミノ酸残基の1つま
たは複数のD-アミノ酸残基による置き換え;二環式ペプチドリガンド内の1つまたは複
数のアミド結合のN-アルキル化;1つまたは複数のペプチド結合の代理結合による置き
換え;ペプチド骨格長の修飾;1つまたは複数のアミノ酸残基のα-炭素上の水素の別の
化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸/アスパラギン酸およびチロシン
などのアミノ酸の、前記アミノ酸を官能化するための適切なアミン、チオール、カルボン
酸およびフェノール-反応性試薬による修飾、ならびにそれぞれ、官能化に適した直交性
反応基、例えば、アジドを導入するアミノ酸、またはアルキンによる官能化を可能にする
アルキン基保有アミノ酸、またアジド保有部分の導入または置き換えから選択される1つ
または複数の修飾が挙げられる。
一実施形態では、修飾誘導体がN末端修飾および/またはC末端修飾を含む。さらなる
実施形態では、修飾誘導体が、適切なアミノ反応性化学を使用したN末端修飾、および/
または適切なカルボキシ反応性化学を使用したC末端修飾を含む。さらなる実施形態では
、前記N末端修飾またはC末端修飾が、それだけに限らないが、細胞傷害剤、放射性キレ
ート剤または発色団を含むエフェクター基の付加を含む。
実施形態では、修飾誘導体が、適切なアミノ反応性化学を使用したN末端修飾、および/
または適切なカルボキシ反応性化学を使用したC末端修飾を含む。さらなる実施形態では
、前記N末端修飾またはC末端修飾が、それだけに限らないが、細胞傷害剤、放射性キレ
ート剤または発色団を含むエフェクター基の付加を含む。
さらなる実施形態では、修飾誘導体がN末端修飾を含む。さらなる実施形態では、N末
端修飾がN末端アセチル基を含む。この実施形態では、N末端システイン基(本明細書で
Ciと呼ばれる基)が、ペプチド合成中に無水酢酸または他の適切な試薬でキャッピング
されて、N末端アセチル化された分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼ
にとっての潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドの分解の可能
性を回避する。
端修飾がN末端アセチル基を含む。この実施形態では、N末端システイン基(本明細書で
Ciと呼ばれる基)が、ペプチド合成中に無水酢酸または他の適切な試薬でキャッピング
されて、N末端アセチル化された分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼ
にとっての潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドの分解の可能
性を回避する。
代替実施形態では、N末端修飾が、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環式
ペプチドの標的に対する効力の保持を促進する分子スペーサー基の付加を含む。
ペプチドの標的に対する効力の保持を促進する分子スペーサー基の付加を含む。
さらなる実施形態では、修飾誘導体がC末端修飾を含む。さらなる実施形態では、C末
端修飾がアミド基を含む。この実施形態では、C末端システイン基(本明細書でCiii
と呼ばれる基)が、ペプチド合成中にアミドとして合成されて、C末端アミド化された分
子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼにとっての潜在的な認識点を除
去するという利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性を減少させる。
端修飾がアミド基を含む。この実施形態では、C末端システイン基(本明細書でCiii
と呼ばれる基)が、ペプチド合成中にアミドとして合成されて、C末端アミド化された分
子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼにとっての潜在的な認識点を除
去するという利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性を減少させる。
一実施形態では、修飾誘導体が、1つまたは複数のアミノ酸残基の1つまたは複数の非
天然アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによっ
て認識されず、標的効力に対する有害効果も有さない等価/等電子側鎖を有する非天然ア
ミノ酸が選択され得る。
天然アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによっ
て認識されず、標的効力に対する有害効果も有さない等価/等電子側鎖を有する非天然ア
ミノ酸が選択され得る。
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解性加水分解がコンフォメーション的お
よび立体的に妨げられるように、拘束されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用
され得る。特に、これらは、プロリン類似体、嵩高い側鎖、Cα-二置換誘導体(例えば
、アミノイソ酪酸、Aib)およびシクロアミノ酸、アミノシクロプロピルカルボン酸で
ある単純な誘導体に関する。
よび立体的に妨げられるように、拘束されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用
され得る。特に、これらは、プロリン類似体、嵩高い側鎖、Cα-二置換誘導体(例えば
、アミノイソ酪酸、Aib)およびシクロアミノ酸、アミノシクロプロピルカルボン酸で
ある単純な誘導体に関する。
一実施形態では、修飾誘導体がスペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修
飾誘導体が、N末端システイン(Ci)および/またはC末端システイン(Ciii)に
対するスペーサー基の付加を含む。
飾誘導体が、N末端システイン(Ci)および/またはC末端システイン(Ciii)に
対するスペーサー基の付加を含む。
一実施形態では、修飾誘導体が、1つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の1つまた
は複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換えを含む。さらなる実施形態では、修飾誘導
体が、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置き換えを含む
。この実施形態は、結果として生じる二環式ペプチドリガンドの薬学的安定性プロファイ
ルを改善するという利点を提供する。
は複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換えを含む。さらなる実施形態では、修飾誘導
体が、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置き換えを含む
。この実施形態は、結果として生じる二環式ペプチドリガンドの薬学的安定性プロファイ
ルを改善するという利点を提供する。
一実施形態では、修飾誘導体が、1つまたは複数の荷電アミノ酸残基の1つまたは複数
の疎水性アミノ酸残基による置き換えを含む。代替実施形態では、修飾誘導体が、1つま
たは複数の疎水性アミノ酸残基の1つまたは複数の荷電アミノ酸残基による置き換えを含
む。荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しいバランスが、二環式ペプチドリガン
ドの重要な特性である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に影
響を及ぼし、よって、血漿中の遊離の利用可能な画分の濃度に影響を及ぼす一方、荷電ア
ミノ酸残基(特に、アルギニン)は、ペプチドと細胞表面上のリン脂質膜の相互作用に影
響を及ぼし得る。この2つは組み合わさって、ペプチド薬物の半減期、分布容積および曝
露に影響を及ぼし得るので、臨床的エンドポイントに従って調整することができる。さら
に、荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しい組み合わせおよび数は、注射部位で
の刺激を減少させ得る(ペプチド薬物が皮下投与されている場合)。
の疎水性アミノ酸残基による置き換えを含む。代替実施形態では、修飾誘導体が、1つま
たは複数の疎水性アミノ酸残基の1つまたは複数の荷電アミノ酸残基による置き換えを含
む。荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しいバランスが、二環式ペプチドリガン
ドの重要な特性である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に影
響を及ぼし、よって、血漿中の遊離の利用可能な画分の濃度に影響を及ぼす一方、荷電ア
ミノ酸残基(特に、アルギニン)は、ペプチドと細胞表面上のリン脂質膜の相互作用に影
響を及ぼし得る。この2つは組み合わさって、ペプチド薬物の半減期、分布容積および曝
露に影響を及ぼし得るので、臨床的エンドポイントに従って調整することができる。さら
に、荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しい組み合わせおよび数は、注射部位で
の刺激を減少させ得る(ペプチド薬物が皮下投与されている場合)。
一実施形態では、修飾誘導体が、1つまたは複数のL-アミノ酸残基の1つまたは複数
のD-アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態は、立体障害およびD-アミノ
酸がβターンコンフォメーションを安定化する傾向によってタンパク質分解安定性を増加
させると考えられる(Tugyi et al(2005)PNAS,102(2),4
13-418)。
のD-アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態は、立体障害およびD-アミノ
酸がβターンコンフォメーションを安定化する傾向によってタンパク質分解安定性を増加
させると考えられる(Tugyi et al(2005)PNAS,102(2),4
13-418)。
一実施形態では、修飾誘導体が、任意のアミノ酸残基の除去およびアラニンによる置換
を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位(複数可)を除去するという
利点を提供する。
を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位(複数可)を除去するという
利点を提供する。
上記修飾の各々が、ペプチドの効力または安定性を計画的に改善するのに役立つことに
留意すべきである。修飾に基づくさらなる効力改善は、
- より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低い解離速度をもた
らす疎水性部分を組み込むこと;
- 長期のイオン相互作用を利用して、より速い会合速度およびより高い親和性をもたら
す荷電基を組み込むこと(例えば、Schreiber et al,Rapid,el
ectrostatically assisted association of
proteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-
31参照);および
- 例えば、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、アミノ酸の側鎖を正し
く拘束すること、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、骨格のねじれ角を
拘束すること、および同一の理由で追加の環化を分子に導入することによって、追加の拘
束をペプチドに組み込むこと
という機構を通して達成され得る(概要については、Gentilucci et al
,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,31
85-203,およびNestor et al,Curr.Medicinal Ch
em(2009),16,4399-418参照)。
留意すべきである。修飾に基づくさらなる効力改善は、
- より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低い解離速度をもた
らす疎水性部分を組み込むこと;
- 長期のイオン相互作用を利用して、より速い会合速度およびより高い親和性をもたら
す荷電基を組み込むこと(例えば、Schreiber et al,Rapid,el
ectrostatically assisted association of
proteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-
31参照);および
- 例えば、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、アミノ酸の側鎖を正し
く拘束すること、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、骨格のねじれ角を
拘束すること、および同一の理由で追加の環化を分子に導入することによって、追加の拘
束をペプチドに組み込むこと
という機構を通して達成され得る(概要については、Gentilucci et al
,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,31
85-203,およびNestor et al,Curr.Medicinal Ch
em(2009),16,4399-418参照)。
同位体変種
本発明は、1つまたは複数の原子が、同じ原子番号を有するが、天然で通常見られる原
子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられ
ている、本発明の全ての薬学的に許容される(放射性)同位体標識ペプチドリガンド、お
よび関連する(放射性)同位体を保持することができる金属キレート基が結合している(
「エフェクター」と呼ばれる)本発明のペプチドリガンド、および一定の官能基が関連す
る(放射性)同位体または同位体標識官能基で共有結合的に置き換えられている、本発明
のペプチドリガンドを含む。
本発明は、1つまたは複数の原子が、同じ原子番号を有するが、天然で通常見られる原
子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられ
ている、本発明の全ての薬学的に許容される(放射性)同位体標識ペプチドリガンド、お
よび関連する(放射性)同位体を保持することができる金属キレート基が結合している(
「エフェクター」と呼ばれる)本発明のペプチドリガンド、および一定の官能基が関連す
る(放射性)同位体または同位体標識官能基で共有結合的に置き換えられている、本発明
のペプチドリガンドを含む。
本発明のペプチドリガンドに含めるのに適した同位体の例としては、2H(D)および
3H(T)などの水素の同位体、11C、13Cおよび14Cなどの炭素の同位体、36
Clなどの塩素の同位体、18Fなどのフッ素の同位体、123I、125Iおよび13
1Iなどのヨウ素の同位体、13Nおよび15Nなどの窒素の同位体、15O、17Oお
よび18Oなどの酸素の同位体、32Pなどのリンの同位体、35Sなどの硫黄の同位体
、64Cuなどの銅の同位体、67Gaまたは68Gaなどのガリウムの同位体、90Y
などのイットリウムの同位体、ならびに177Luなどのルテニウムの同位体、ならびに
213Biなどのビスマスの同位体が挙げられる。
3H(T)などの水素の同位体、11C、13Cおよび14Cなどの炭素の同位体、36
Clなどの塩素の同位体、18Fなどのフッ素の同位体、123I、125Iおよび13
1Iなどのヨウ素の同位体、13Nおよび15Nなどの窒素の同位体、15O、17Oお
よび18Oなどの酸素の同位体、32Pなどのリンの同位体、35Sなどの硫黄の同位体
、64Cuなどの銅の同位体、67Gaまたは68Gaなどのガリウムの同位体、90Y
などのイットリウムの同位体、ならびに177Luなどのルテニウムの同位体、ならびに
213Biなどのビスマスの同位体が挙げられる。
本発明の一定の同位体標識ペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んだもの
は、薬物および/または基質組織分布研究において、ならびに疾患組織上のネクチン-4
標的の存在および/または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチ
ドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間
の複合体の形成を検出または特定するために使用することができるという点で、有用な診
断特性をさらに有することができる。検出または特定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光
物質、発光物質(例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンお
よびルシフェラーゼ)等などの標識剤で標識された化合物を使用することができる。放射
性同位体トリチウム、すなわち、3H(T)および炭素-14、すなわち、14Cが、組
み込みの容易さおよび迅速な検出手段を考慮して、この目的に特に有用である。
は、薬物および/または基質組織分布研究において、ならびに疾患組織上のネクチン-4
標的の存在および/または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチ
ドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間
の複合体の形成を検出または特定するために使用することができるという点で、有用な診
断特性をさらに有することができる。検出または特定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光
物質、発光物質(例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンお
よびルシフェラーゼ)等などの標識剤で標識された化合物を使用することができる。放射
性同位体トリチウム、すなわち、3H(T)および炭素-14、すなわち、14Cが、組
み込みの容易さおよび迅速な検出手段を考慮して、この目的に特に有用である。
重水素、すなわち、2H(D)などのより重い同位体による置換は、より大きな代謝安
定性に起因する一定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増加または投与量要求の
減少を与えることができ、よって、状況によって好まれ得る。
定性に起因する一定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増加または投与量要求の
減少を与えることができ、よって、状況によって好まれ得る。
11C、18F、15Oおよび13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、標的占有
率を調査するためのポジトロン断層法(Positron Emission Topo
graphy)(PET)で有用となり得る。
率を調査するためのポジトロン断層法(Positron Emission Topo
graphy)(PET)で有用となり得る。
本発明のペプチドリガンドの同位体標識化合物は、一般に、当業者に知られている従来
技術によって、または前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用
して付随する実施例に記載されるのと同様の方法によって調製することができる。
技術によって、または前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用
して付随する実施例に記載されるのと同様の方法によって調製することができる。
分子足場
分子足場は、例えば、国際公開第2009/098450号およびその中に引用される
参考文献、特に国際公開第2004/077062号および国際公開第2006/078
161号に記載される。
分子足場は、例えば、国際公開第2009/098450号およびその中に引用される
参考文献、特に国際公開第2004/077062号および国際公開第2006/078
161号に記載される。
前記文献に言及されるように、分子足場は、小有機分子などの小分子であり得る。
一実施形態では、分子足場が高分子であり得る。一実施形態では、分子足場が、アミノ
酸、ヌクレオチドまたは炭水化物で構成される高分子である。
酸、ヌクレオチドまたは炭水化物で構成される高分子である。
一実施形態では、分子足場が、ポリペプチドの官能基(複数可)と反応して、共有結合
を形成することができる反応性基を含む。
を形成することができる反応性基を含む。
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボ
ン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、
ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと結合を形成する化学基を
含み得る。
ン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、
ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと結合を形成する化学基を
含み得る。
一実施形態では、分子足場が、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン、特に1,3,
5-トリアクリロイルヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン(「TATA」)またはそ
の誘導体を含み得る、またはからなり得る。
5-トリアクリロイルヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン(「TATA」)またはそ
の誘導体を含み得る、またはからなり得る。
一実施形態では、分子足場が2,4,6-トリス(ブロモメチル)メシチレンである。
この分子は、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン(TBMB)と類似であるが
、ベンゼン環に結合した3つの追加のメチル基を含む。これは、追加のメチル基がポリペ
プチドとのさらなる接点を形成し、よって、追加の構造上の拘束を加え得るという利点を
有する。
この分子は、1,3,5-トリス(ブロモメチル)ベンゼン(TBMB)と類似であるが
、ベンゼン環に結合した3つの追加のメチル基を含む。これは、追加のメチル基がポリペ
プチドとのさらなる接点を形成し、よって、追加の構造上の拘束を加え得るという利点を
有する。
本発明の分子足場は、本発明のコードされるライブラリーのポリペプチドの官能基が、
分子足場と共有結合的連結を形成することを可能にする化学基を含む。前記化学基は、ア
ミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、
アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキ
ルおよびハロゲン化アシルを含む広範囲の官能基から選択される。
分子足場と共有結合的連結を形成することを可能にする化学基を含む。前記化学基は、ア
ミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、
アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキ
ルおよびハロゲン化アシルを含む広範囲の官能基から選択される。
システインのチオール基と反応するために分子足場上で使用され得る足場反応性基は、
ハロゲン化アルキル(またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも呼ばれる)であ
る。
ハロゲン化アルキル(またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも呼ばれる)であ
る。
例としては、ブロモメチルベンゼン(TBMBによって例示される足場反応性基)また
はヨードアセトアミドが挙げられる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカッ
プリングするために使用される他の足場反応性基は、マレイミド、αβ不飽和カルボニル
含有化合物およびα-ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明で分子足場として
使用され得るマレイミドの例としては、トリス-(2-マレイミドエチル)アミン、トリ
ス-(2-マレイミドエチル)ベンゼン、トリス-(マレイミド)ベンゼンが挙げられる
。αβ不飽和カルボニル含有化合物の例は、1,1’,1’’-(1,3,5-トリアジ
ナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)(Ange
wandte Chemie,International Edition(2014
),53(6),1602-1606)である。α-ハロメチルカルボニル含有化合物の
例は、N,N’,N’’-(ベンゼン-1,3,5-トリイル)トリス(2-ブロモアセ
トアミド)である。セレノシステインも、システインと同様の反応性を有し、同じ反応に
使用することができる天然アミノ酸である。よって、文脈が別のことを示唆しない限り、
システインが言及される場合はいつでも、セレノシステインで置換することが典型的に許
容される。
はヨードアセトアミドが挙げられる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカッ
プリングするために使用される他の足場反応性基は、マレイミド、αβ不飽和カルボニル
含有化合物およびα-ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明で分子足場として
使用され得るマレイミドの例としては、トリス-(2-マレイミドエチル)アミン、トリ
ス-(2-マレイミドエチル)ベンゼン、トリス-(マレイミド)ベンゼンが挙げられる
。αβ不飽和カルボニル含有化合物の例は、1,1’,1’’-(1,3,5-トリアジ
ナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)(Ange
wandte Chemie,International Edition(2014
),53(6),1602-1606)である。α-ハロメチルカルボニル含有化合物の
例は、N,N’,N’’-(ベンゼン-1,3,5-トリイル)トリス(2-ブロモアセ
トアミド)である。セレノシステインも、システインと同様の反応性を有し、同じ反応に
使用することができる天然アミノ酸である。よって、文脈が別のことを示唆しない限り、
システインが言及される場合はいつでも、セレノシステインで置換することが典型的に許
容される。
合成
本発明のペプチドは、標準的な技術によって合成的に製造され、引き続いてインビトロ
で分子足場と反応し得る。これを実施する場合、標準的な化学が使用され得る。これによ
り、さらなる下流の実験または検証のために可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる
。このような方法は、Timmerman et al(上記)に開示されるような従来
の化学を使用して達成することができるだろう。
本発明のペプチドは、標準的な技術によって合成的に製造され、引き続いてインビトロ
で分子足場と反応し得る。これを実施する場合、標準的な化学が使用され得る。これによ
り、さらなる下流の実験または検証のために可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる
。このような方法は、Timmerman et al(上記)に開示されるような従来
の化学を使用して達成することができるだろう。
よって、本発明はまた、本明細書に示される、選択されるポリペプチドまたはコンジュ
ゲートの製造であって、以下で説明される任意のさらなるステップを含む製造に関する。
一実施形態では、これらのステップが、化学合成によって調製された最終生成物ポリペプ
チド/コンジュゲートに行われる。
ゲートの製造であって、以下で説明される任意のさらなるステップを含む製造に関する。
一実施形態では、これらのステップが、化学合成によって調製された最終生成物ポリペプ
チド/コンジュゲートに行われる。
コンジュゲートまたは複合体を製造する場合、場合により、目的のポリペプチド中のア
ミノ酸残基を置換してもよい。
ミノ酸残基を置換してもよい。
ペプチドを伸長して、例えば、別のループを組み込み、よって、複数の特異性を導入す
ることもできる。
ることもできる。
ペプチドを伸長するために、標準的な固相または液相化学を使用して、直交的に保護さ
れた(orthogonally protected)リジン(および類似体)を使用
して、ペプチドをそのN末端もしくはC末端で、またはループ内で化学的に簡単に伸長す
ることができる。標準的な(バイオ)コンジュゲーション技術を使用して、活性化もしく
は活性化可能なN末端またはC末端を導入することができる。あるいは、例えば、(Da
wson et al.1994.Synthesis of Proteins by
Native Chemical Ligation.Science 266:77
6-779)に記載されるように、フラグメント縮合もしくは天然化学ライゲーションに
よって、または(Chang et al.Proc Natl Acad Sci U
S A.1994 Dec 20;91(26):12544-8もしくはHikar
i et al Bioorganic&Medicinal Chemistry L
etters Volume 18,Issue 22,15 November 20
08,Pages 6000-6003)に記載されるサブチリガーゼ(subtili
gase)を使用して、酵素によって、付加を行うことができる。
れた(orthogonally protected)リジン(および類似体)を使用
して、ペプチドをそのN末端もしくはC末端で、またはループ内で化学的に簡単に伸長す
ることができる。標準的な(バイオ)コンジュゲーション技術を使用して、活性化もしく
は活性化可能なN末端またはC末端を導入することができる。あるいは、例えば、(Da
wson et al.1994.Synthesis of Proteins by
Native Chemical Ligation.Science 266:77
6-779)に記載されるように、フラグメント縮合もしくは天然化学ライゲーションに
よって、または(Chang et al.Proc Natl Acad Sci U
S A.1994 Dec 20;91(26):12544-8もしくはHikar
i et al Bioorganic&Medicinal Chemistry L
etters Volume 18,Issue 22,15 November 20
08,Pages 6000-6003)に記載されるサブチリガーゼ(subtili
gase)を使用して、酵素によって、付加を行うことができる。
あるいは、ジスルフィド結合を通したさらなるコンジュゲーションによって、ペプチド
を伸長または修飾することができる。これは、第1および第2のペプチドが、細胞の還元
環境内で一度に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、
分子足場(例えば、TBMB)を第1のペプチドの化学合成中に添加して、3つのシステ
イン基と反応させることができ;次いで、さらなるシステインまたはチオールを第1のペ
プチドのNまたはC末端に付加して、結果としてこのシステインまたはチオールのみを第
2のペプチドの遊離システインまたはチオールと反応させて、ジスルフィド連結二環式ペ
プチド-ペプチドコンジュゲートを形成することができるだろう。
を伸長または修飾することができる。これは、第1および第2のペプチドが、細胞の還元
環境内で一度に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、
分子足場(例えば、TBMB)を第1のペプチドの化学合成中に添加して、3つのシステ
イン基と反応させることができ;次いで、さらなるシステインまたはチオールを第1のペ
プチドのNまたはC末端に付加して、結果としてこのシステインまたはチオールのみを第
2のペプチドの遊離システインまたはチオールと反応させて、ジスルフィド連結二環式ペ
プチド-ペプチドコンジュゲートを形成することができるだろう。
同様の技術を2つの二環式および二重特異性高分子の合成/カップリングに等しく適用
すると、四重特異性分子が潜在的に作成される。
すると、四重特異性分子が潜在的に作成される。
さらに、N末端もしくはC末端で、または側鎖を介してカップリングする適切な化学を
使用して、他の官能基またはエフェクター基の付加を同様に達成することができる。一実
施形態では、いずれの実態の活性も阻害しないようにカップリングが行われる。
使用して、他の官能基またはエフェクター基の付加を同様に達成することができる。一実
施形態では、いずれの実態の活性も阻害しないようにカップリングが行われる。
医薬組成物
本発明のさらなる態様によると、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合
わせて、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によると、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合
わせて、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含む医薬組成物が提供される。
一般的に、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と合わせて、精
製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水お
よび/または緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール性/水性の溶液、エマルジョン
または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキスト
ロース、デキストロースならびに塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液が含まれる。懸
濁液中にポリペプチド複合体を保持するために必要な場合、適切な生理学的に許容される
アジュバントがカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびア
ルギン酸塩などの増粘剤から選択され得る。
製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水お
よび/または緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール性/水性の溶液、エマルジョン
または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキスト
ロース、デキストロースならびに塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液が含まれる。懸
濁液中にポリペプチド複合体を保持するために必要な場合、適切な生理学的に許容される
アジュバントがカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびア
ルギン酸塩などの増粘剤から選択され得る。
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、流体および栄養素
補液ならびに電解質補液が含まれる。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガ
スなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる(Mack(1982)Rem
ington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed
ition)。
補液ならびに電解質補液が含まれる。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガ
スなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる(Mack(1982)Rem
ington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed
ition)。
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、または他の薬剤と合わ
せて使用され得る。これらは、抗体、抗体フラグメント、およびシクロスポリン、メトト
レキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンなどの様々な免疫療法薬、および免疫
毒素を含むことができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンド、または投与前に
プールされているか否かにかかわらず、様々な標的リガンドを使用して選択されるポリペ
プチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組み合わせ
と合わせた、様々な細胞傷害剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。
せて使用され得る。これらは、抗体、抗体フラグメント、およびシクロスポリン、メトト
レキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンなどの様々な免疫療法薬、および免疫
毒素を含むことができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンド、または投与前に
プールされているか否かにかかわらず、様々な標的リガンドを使用して選択されるポリペ
プチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組み合わせ
と合わせた、様々な細胞傷害剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののいずれか
であり得る。療法のために、本発明のペプチドリガンドを、標準的な技術に従って、任意
の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺
経路を介して、または適切には、カテーテルによる直接注入によるものを含む任意の適切
な様式によることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物が吸入によって投与さ
れる。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁
忌薬、ならびに臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに依存する。
であり得る。療法のために、本発明のペプチドリガンドを、標準的な技術に従って、任意
の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺
経路を介して、または適切には、カテーテルによる直接注入によるものを含む任意の適切
な様式によることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物が吸入によって投与さ
れる。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁
忌薬、ならびに臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに依存する。
本発明のペプチドリガンドを、貯蔵のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成
することができる。この技術は有効であることが示されており、当技術分野で既知の凍結
乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成が、様々な程度の
活性損失をもたらす可能性があり、そのレベルを上向きに調整して補わなければならない
場合があることが当業者によって理解される。
することができる。この技術は有効であることが示されており、当技術分野で既知の凍結
乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成が、様々な程度の
活性損失をもたらす可能性があり、そのレベルを上向きに調整して補わなければならない
場合があることが当業者によって理解される。
本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、予防的および/または治
療的処置のために投与することができる。一定の治療用途では、選択される細胞の集団の
少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺傷またはいくつかの他の測定可能なパラメータ
を達成するのに十分な量が、「治療上有効用量」として定義される。この投与量を達成す
るのに必要な量は、疾患の重症度、および患者自身の免疫系の全体的な状態に依存するが
、一般的に、体重1キログラム当たり0.005~5.0mgの選択されるペプチドリガ
ンドに及び、0.05~2.0mg/kg/投与の用量がより一般的に使用される。予防
的用途では、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様のま
たはわずかに低い投与量で投与され得る。
療的処置のために投与することができる。一定の治療用途では、選択される細胞の集団の
少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺傷またはいくつかの他の測定可能なパラメータ
を達成するのに十分な量が、「治療上有効用量」として定義される。この投与量を達成す
るのに必要な量は、疾患の重症度、および患者自身の免疫系の全体的な状態に依存するが
、一般的に、体重1キログラム当たり0.005~5.0mgの選択されるペプチドリガ
ンドに及び、0.05~2.0mg/kg/投与の用量がより一般的に使用される。予防
的用途では、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様のま
たはわずかに低い投与量で投与され得る。
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物の選択標的細胞集団の変
更、不活性化、殺傷または除去を助けるために予防的および治療的設定で利用され得る。
さらに、本明細書に記載されるペプチドリガンドは、細胞の不均一集合物から標的細胞集
団を殺傷する、枯渇させる、または有効に除去するために体外でまたはインビトロで選択
的に使用され得る。標準的な技術に従って、哺乳動物由来の血液を選択されるペプチドリ
ガンドと体外で組み合わせ、それによって不要な細胞を殺傷する、または哺乳動物に戻す
ために血液から除去することができる。
更、不活性化、殺傷または除去を助けるために予防的および治療的設定で利用され得る。
さらに、本明細書に記載されるペプチドリガンドは、細胞の不均一集合物から標的細胞集
団を殺傷する、枯渇させる、または有効に除去するために体外でまたはインビトロで選択
的に使用され得る。標準的な技術に従って、哺乳動物由来の血液を選択されるペプチドリ
ガンドと体外で組み合わせ、それによって不要な細胞を殺傷する、または哺乳動物に戻す
ために血液から除去することができる。
治療的使用
本発明のさらなる態様によると、がんを予防、抑制または治療するのに使用するための
、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
本発明のさらなる態様によると、がんを予防、抑制または治療するのに使用するための
、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
治療(または阻害)され得るがん(およびその良性対応物)の例としては、それだけに
限らないが、上皮由来の腫瘍(腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌および他の癌腫を含む様々
な型の腺腫および癌腫)、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管(食道、胃(胃の)、
小腸、結腸、直腸および肛門を含む)、肝臓(肝細胞癌)、胆嚢および胆道系、膵外分泌
部、腎臓、肺(例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮
腫)、頭頚部(例えば、舌、頬側口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および
副鼻腔のがん)、卵巣、輸卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内
膜、甲状腺(例えば、甲状腺濾胞癌)、副腎、前立腺、皮膚および付属器(例えば、黒色
腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、角化棘細胞腫、異形成母斑)の癌;血液悪性腫瘍(すなわ
ち、白血病、リンパ腫)ならびに血液悪性腫瘍およびリンパ系統の関連する状態(例えば
、急性リンパ性白血病[ALL]、慢性リンパ性白血病[CLL]、B細胞リンパ腫、例
えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫[DLBCL]、濾胞性リンパ腫、バーキットリ
ンパ腫、マントル細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー[NK
]細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性免疫グロ
ブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫および移植後リンパ増殖性障害)、ならびに血液
悪性腫瘍および骨髄系統の関連する状態(例えば、急性骨髄性白血病[AML]、慢性骨
髄性白血病[CML]、慢性骨髄単球性白血病[CMML]、好酸球増加症候群、骨髄増
殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖症
候群、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病)を含む前悪性血液障害および境界領域
悪性障害;間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、
線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユー
イング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、ならび
に隆起性皮膚線維肉腫;中枢および末梢神経系の腫瘍(例えば、星細胞腫、神経膠腫およ
び神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン腫);内分泌腫瘍(例えば、
下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺髄
様癌);眼および付属器腫瘍(例えば、網膜芽細胞腫);生殖細胞および絨毛性腫瘍(例
えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌);ならびに小児およ
び胎児性腫瘍(例えば、髄芽腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍および原始神経外胚葉性
腫瘍);あるいは患者を悪性腫瘍に感受性にしておく、先天的なまたはその他の症候群(
例えば、色素性乾皮症)が挙げられる。
限らないが、上皮由来の腫瘍(腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌および他の癌腫を含む様々
な型の腺腫および癌腫)、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管(食道、胃(胃の)、
小腸、結腸、直腸および肛門を含む)、肝臓(肝細胞癌)、胆嚢および胆道系、膵外分泌
部、腎臓、肺(例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮
腫)、頭頚部(例えば、舌、頬側口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および
副鼻腔のがん)、卵巣、輸卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内
膜、甲状腺(例えば、甲状腺濾胞癌)、副腎、前立腺、皮膚および付属器(例えば、黒色
腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、角化棘細胞腫、異形成母斑)の癌;血液悪性腫瘍(すなわ
ち、白血病、リンパ腫)ならびに血液悪性腫瘍およびリンパ系統の関連する状態(例えば
、急性リンパ性白血病[ALL]、慢性リンパ性白血病[CLL]、B細胞リンパ腫、例
えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫[DLBCL]、濾胞性リンパ腫、バーキットリ
ンパ腫、マントル細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー[NK
]細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性免疫グロ
ブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫および移植後リンパ増殖性障害)、ならびに血液
悪性腫瘍および骨髄系統の関連する状態(例えば、急性骨髄性白血病[AML]、慢性骨
髄性白血病[CML]、慢性骨髄単球性白血病[CMML]、好酸球増加症候群、骨髄増
殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖症
候群、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病)を含む前悪性血液障害および境界領域
悪性障害;間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、
線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユー
イング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、ならび
に隆起性皮膚線維肉腫;中枢および末梢神経系の腫瘍(例えば、星細胞腫、神経膠腫およ
び神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン腫);内分泌腫瘍(例えば、
下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺髄
様癌);眼および付属器腫瘍(例えば、網膜芽細胞腫);生殖細胞および絨毛性腫瘍(例
えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌);ならびに小児およ
び胎児性腫瘍(例えば、髄芽腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍および原始神経外胚葉性
腫瘍);あるいは患者を悪性腫瘍に感受性にしておく、先天的なまたはその他の症候群(
例えば、色素性乾皮症)が挙げられる。
さらなる実施形態では、がんが、非ホジキンリンパ腫(NHL)、バーキットリンパ腫
(BL)、多発性骨髄腫(MM)、B細胞性慢性リンパ性白血病(B-CLL)、B細胞
性およびT細胞性急性リンパ性白血病(ALL)、T細胞リンパ腫(TCL)、急性骨髄
性白血病(AML)、有毛細胞白血病(HCL)、ホジキンリンパ腫(HL)および慢性
骨髄性白血病(CML)から選択されるものなどの血液悪性腫瘍から選択される。
(BL)、多発性骨髄腫(MM)、B細胞性慢性リンパ性白血病(B-CLL)、B細胞
性およびT細胞性急性リンパ性白血病(ALL)、T細胞リンパ腫(TCL)、急性骨髄
性白血病(AML)、有毛細胞白血病(HCL)、ホジキンリンパ腫(HL)および慢性
骨髄性白血病(CML)から選択されるものなどの血液悪性腫瘍から選択される。
本明細書における「予防」という用語への言及は、疾患の誘導前の保護組成物の投与を
伴う。「抑制」は、誘導イベント後であるが、疾患の臨床的出現前の組成物の投与を指す
。「治療」は、疾患症状が明らかになった後の保護組成物の投与を伴う。
伴う。「抑制」は、誘導イベント後であるが、疾患の臨床的出現前の組成物の投与を指す
。「治療」は、疾患症状が明らかになった後の保護組成物の投与を伴う。
疾患に対する保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニン
グするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用
は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能にすることができるポ
リペプチドリガンドの開発を可能にする本発明によって促進される。
グするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用
は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能にすることができるポ
リペプチドリガンドの開発を可能にする本発明によって促進される。
本発明を、以下の実施例を参照して、以下でさらに説明する。
[実施例1]
リンカーの合成
COM128
リンカーの合成
COM128
1-アミン(117.66mg、1.18mmol、1.0当量)、EDCI(270.
4mg、1.41mmol、1.2当量)、HOBt(190.6mg、1.41mmo
l、1.2当量)の混合物をDCM(20mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に
溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~25℃で1時間攪拌した。LC-MS
は、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:677.3
3、実測m/z:678.2([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。
溶媒を蒸発させて、化合物2(600mg、粗)を白色固体として得た。
化合物2(600.0mg、885.3μmol、1.0当量)、N-エチルエタンア
ミン(1.29g、15.19mmol、1.50mL、17.2当量)の混合物をDC
M(3mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰
囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されてい
ることを示し、所望のm/z(計算MW:455.51、実測m/z:456.3([M
+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物3(40
0mg、粗)を無色の油状物として得た。化合物3(150.0mg、329.3μmo
l、1.0当量)、化合物4(320.1mg、329.3μmol、1.0当量)、H
ATU(125.2mg、329.3μmo、1.0当量)、DIEA(42.6mg、
329.3μmol、57.4μL、1.0当量)の混合物をDMF(2mL、予め脱気
し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で2攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z(計算MW:1408.76、実測m/z:705.3([M/2+H]+))を有す
る1つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物5(400mg、粗)を黄色
の油状物として得た。
ミン(1.29g、15.19mmol、1.50mL、17.2当量)の混合物をDC
M(3mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰
囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されてい
ることを示し、所望のm/z(計算MW:455.51、実測m/z:456.3([M
+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物3(40
0mg、粗)を無色の油状物として得た。化合物3(150.0mg、329.3μmo
l、1.0当量)、化合物4(320.1mg、329.3μmol、1.0当量)、H
ATU(125.2mg、329.3μmo、1.0当量)、DIEA(42.6mg、
329.3μmol、57.4μL、1.0当量)の混合物をDMF(2mL、予め脱気
し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で2攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z(計算MW:1408.76、実測m/z:705.3([M/2+H]+))を有す
る1つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物5(400mg、粗)を黄色
の油状物として得た。
化合物5(400mg、283.77μmol、1.0当量)をDMF(4mL、予め
脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、引き続いてピペリジン(862.2mg、1
0.13mmol、1mL、35.7当量)を添加し、次いで、混合物を、N2雰囲気下
、25~30℃で15分間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全に消費されているこ
とを示し、所望のm/z(計算MW:1187.37、実測m/z:594.4([M/
2+H]+、1187.4[M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。溶媒
を蒸発させて、COM128(250mg、粗)を無色の油状物として得た。
脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、引き続いてピペリジン(862.2mg、1
0.13mmol、1mL、35.7当量)を添加し、次いで、混合物を、N2雰囲気下
、25~30℃で15分間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全に消費されているこ
とを示し、所望のm/z(計算MW:1187.37、実測m/z:594.4([M/
2+H]+、1187.4[M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。溶媒
を蒸発させて、COM128(250mg、粗)を無色の油状物として得た。
COM129
ミン(162.1mg、1.62mmol、1.1当量)、EDCI(338.6mg、
1.77mmol、1.2当量)、HOBt(238.7mg、1.77mmol、1.
2当量)の混合物をDCM(5mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次
いで、混合物を、N2雰囲気下、20~25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物
1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1033.14、実測
m/z:1033.2([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混
合物を数滴の1M HClで処理し、有機層を減圧下で蒸発させて、溶媒を除去した。化
合物2(1.1g、粗)を黄色の油状物として得た。
化合物2(1.1g、1.06mmol、1当量)、N-エチルエタンアミン(3.8
9g、53.24mmol、5.48mL、50当量)の混合物をDCM(5mL、予め
脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~2
5℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(計算MW:810.90、実測m/z:810.9([M+H]+))を有
する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で蒸発させ、化合物3(810m
g、粗)を白色固体として得た。
9g、53.24mmol、5.48mL、50当量)の混合物をDCM(5mL、予め
脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~2
5℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(計算MW:810.90、実測m/z:810.9([M+H]+))を有
する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で蒸発させ、化合物3(810m
g、粗)を白色固体として得た。
化合物3(810.0mg、998.9μmol、1.0当量)、化合物4(810.
7mg、1.10mmol、1.1当量)、HATU(455.8mg、1.20mmo
l、1.2当量)、DIEA(258.2mg、2.00mmol、348.0μL、2
.0当量)の混合物をDMF(2mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、
次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2攪拌した。LC-MSは、化合物3
が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1530.72、実測m
/z:765.5([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混
合物を数滴の1M HClで処理し、有機層を回収し、減圧下で蒸発させて、溶媒を除去
した。化合物5(1.1g、粗)を黄色固体として得た。
7mg、1.10mmol、1.1当量)、HATU(455.8mg、1.20mmo
l、1.2当量)、DIEA(258.2mg、2.00mmol、348.0μL、2
.0当量)の混合物をDMF(2mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、
次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2攪拌した。LC-MSは、化合物3
が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1530.72、実測m
/z:765.5([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混
合物を数滴の1M HClで処理し、有機層を回収し、減圧下で蒸発させて、溶媒を除去
した。化合物5(1.1g、粗)を黄色固体として得た。
化合物5(1g、653.29μmol、1当量)をDCM(10mL、予め脱気し、
N2で3回パージした)に溶解し、引き続いてピペリジン(2.39g、32.66mm
ol、3.36mL、50当量)を添加し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(計算MW:1308.47、実測m/z:1308.4([M+H]+))
を有する1つの主ピークが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件:A相:H2
O中0.075%TFA、B相:MeCN、カラム:Luna 200*25mm 10
μm、C18、110AおよびGemin150*30mm、C18、5μm、110A
、接続、50℃)によって精製した。COM129(700mg、463.72μmol
、収率70.98%)を黄色固体として得た。
N2で3回パージした)に溶解し、引き続いてピペリジン(2.39g、32.66mm
ol、3.36mL、50当量)を添加し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(計算MW:1308.47、実測m/z:1308.4([M+H]+))
を有する1つの主ピークが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件:A相:H2
O中0.075%TFA、B相:MeCN、カラム:Luna 200*25mm 10
μm、C18、110AおよびGemin150*30mm、C18、5μm、110A
、接続、50℃)によって精製した。COM129(700mg、463.72μmol
、収率70.98%)を黄色固体として得た。
COM130
1-アミン(24.53mg、245.02μmol、1.1当量)、EDCI(51.
24mg、267.30μmol、1.2当量)、HOBt(36.12mg、267.
30μmol、1.2当量)の混合物をDCM(3mL、予め脱気し、N2で3回パージ
した)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~25℃で1時間攪拌した。L
C-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:138
8.53、実測m/z:694.7([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検
出された。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物2(200mg
、144.04μmol、収率64.66%)を白色固体として得た。
化合物2(200mg、144.04μmol、1.0当量)、N-エチルエタンアミ
ン(210.7mg、2.88mmol、297μL、20.0当量)の混合物をDCM
(3mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲
気下、20~25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されている
ことを示し、所望のm/z(MW:1166.29、実測m/z:1166.3([M+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を蒸発させ、化合物3(1
50mg、粗)を黄色の油状物として得た。
ン(210.7mg、2.88mmol、297μL、20.0当量)の混合物をDCM
(3mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲
気下、20~25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されている
ことを示し、所望のm/z(MW:1166.29、実測m/z:1166.3([M+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を蒸発させ、化合物3(1
50mg、粗)を黄色の油状物として得た。
化合物3(150mg、128.61μmol、1.0当量)、化合物4(75mg、
144.91μmol、1.13当量)、HATU(58.7mg、154.34μmo
l、1.2当量)およびDIEA(33.24mg、257.23μmol、44.80
μL、2.0当量)の混合物をDMF(5mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に
溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~25℃で2時間攪拌した。LC-MS
は、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:1665.84
、実測m/z:833.2([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された
。溶媒を減圧下で除去し、化合物5(300mg、粗)を黄色の油状物として得た。
144.91μmol、1.13当量)、HATU(58.7mg、154.34μmo
l、1.2当量)およびDIEA(33.24mg、257.23μmol、44.80
μL、2.0当量)の混合物をDMF(5mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に
溶解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、20~25℃で2時間攪拌した。LC-MS
は、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:1665.84
、実測m/z:833.2([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された
。溶媒を減圧下で除去し、化合物5(300mg、粗)を黄色の油状物として得た。
粗化合物5(300mg、DMF 10mLに溶解した)に、ピペリジン(2mL)を
添加し、混合物を30℃で2時間攪拌した。LCMSは、所望のm/z(MW:1443
.60 実測m/z:722.7([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出
されることを示した。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。COM13
0(140mg、58.19μmol、収率32.31%、純度60%)を白色固体とし
て得た。
添加し、混合物を30℃で2時間攪拌した。LCMSは、所望のm/z(MW:1443
.60 実測m/z:722.7([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出
されることを示した。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。COM13
0(140mg、58.19μmol、収率32.31%、純度60%)を白色固体とし
て得た。
COM131
1-アミン(117.7mg、1.18mmol、1.0当量)、HOBt(190.6
mg、1.41mmol、1.2当量)、EDCI(270.4mg、1.41mmol
、1.2当量)の混合物をDCM(20mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶
解し、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは
、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:677.75
、実測m/z:678.2([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反
応混合物を数滴の1M HClで処理し、有機層を回収し、減圧下で蒸発させた。化合物
2(600.0mg、粗)を白色固体として得た。
化合物2(600.0mg、885.2μmol、1.0当量)をDMF(3mL、予
め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、ピペリジン(1.29g、15.
19mmol、1.50mL、17.2当量)を添加し、混合物を、N2雰囲気下、25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z(計算MW:455.51、実測m/z:456.3([M+H]+))
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によっ
て精製し、化合物3(400.0mg、879.1μmol)を無色の油状物として得た
。
め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、ピペリジン(1.29g、15.
19mmol、1.50mL、17.2当量)を添加し、混合物を、N2雰囲気下、25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z(計算MW:455.51、実測m/z:456.3([M+H]+))
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によっ
て精製し、化合物3(400.0mg、879.1μmol)を無色の油状物として得た
。
化合物3(250.0mg、548.83μmol、1.0当量)、化合物4(284
.1mg、548.83μmol、1当量)、HATU(229.6mg、603.72
μmol、1.1当量)、DIEA(141.9mg、1.10mmol、191.19
μL、2.0当量)のDCM(20mL、予め脱気し、N2で3回パージした)中混合物
、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化
合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:955.06、実
測m/z:955.6([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物
を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物5(400.0mg、419.
1μmol)を白色固体として得た。化合物5(400.0mg、418.82μmol
、1.0当量)の混合物をDMF(4mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解
し、次いで、ピペリジン(862.2mg、10.13mmol、1mL、24.2当量
)を添加し、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、
化合物5が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:732.83 実測
m/z:733.3([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物を
分取HPLC(TFA条件)によって精製し、COM131(200mg、272.9μ
mol)を無色の油状物として得た。
.1mg、548.83μmol、1当量)、HATU(229.6mg、603.72
μmol、1.1当量)、DIEA(141.9mg、1.10mmol、191.19
μL、2.0当量)のDCM(20mL、予め脱気し、N2で3回パージした)中混合物
、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化
合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:955.06、実
測m/z:955.6([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物
を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物5(400.0mg、419.
1μmol)を白色固体として得た。化合物5(400.0mg、418.82μmol
、1.0当量)の混合物をDMF(4mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解
し、次いで、ピペリジン(862.2mg、10.13mmol、1mL、24.2当量
)を添加し、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、
化合物5が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:732.83 実測
m/z:733.3([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物を
分取HPLC(TFA条件)によって精製し、COM131(200mg、272.9μ
mol)を無色の油状物として得た。
COM470
31mg、164.82μmol、1.1当量)のDMF(6mL)中溶液に、HATU
(85.40mg、224.75μmol、1.5当量)およびDIEA(19.37m
g、149.83μmol、26.10μL、1.0当量)を添加した。混合物を25~
30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し、
所望のm/z(MW:1814.99、実測m/z:908.2([M/2+H]+))
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して
、残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物2(54
mg、29.75μmol、収率19.86%)を白色固体として得た。
化合物2(54mg、29.8μmol、1.0当量)のDMF(2mL)中溶液に、
ピペリジン(61mg、715μmol、71μL、24.0当量)を添加した。混合物
を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(MW:1592.75 実測m/z:796.27([M/2+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒
を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。C
OM470(40mg、25.11μmol、収率84.41%)を白色固体として得た
。
ピペリジン(61mg、715μmol、71μL、24.0当量)を添加した。混合物
を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(MW:1592.75 実測m/z:796.27([M/2+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒
を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。C
OM470(40mg、25.11μmol、収率84.41%)を白色固体として得た
。
COM471
3.21mmol、2.6当量)の混合物をDCM(20mL)に溶解し、引き続いて(
284.0mg、1.48mmol、1.2当量)、HOBt(200.2mg、1.4
8mmol、1.20当量)を添加した。混合物を25℃で2時間攪拌した。LC-MS
は、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1021.
49、実測m/z:1022.2([M+H]+))を有する1つのピークが検出された
。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。残留物を分取HPLC(TFA条件
)によって精製した。化合物3(0.900g、880.53μmol、収率71.30
%)を白色固体として得た。
化合物3(500.0mg、489.19μmol、1.0当量)、化合物4(257
.6mg、489.19μmol、1.0当量)の混合物をDCM(5mL)に溶解し、
引き続いてHOBt(132.2mg、978.37μmol、2.0当量)、EDCI
(187.6mg、978.37μmol、2.0当量)を添加した。混合物を25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MW:1529.80 実測m/z:765.9([M/2+H]+))を
有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、
残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物3(420
mg、246.94μmol、収率50.48%)を無色の油状物として得た。
.6mg、489.19μmol、1.0当量)の混合物をDCM(5mL)に溶解し、
引き続いてHOBt(132.2mg、978.37μmol、2.0当量)、EDCI
(187.6mg、978.37μmol、2.0当量)を添加した。混合物を25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MW:1529.80 実測m/z:765.9([M/2+H]+))を
有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、
残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物3(420
mg、246.94μmol、収率50.48%)を無色の油状物として得た。
化合物5(420mg、274.38μmol、1.0当量)をDMF(4mL)に溶
解し、引き続いてピペリジン(865.2mg、10.16mmol、1mL、37当量
)を添加した。混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全
に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1308.48、実測m/z:
654.8([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。粗生成物を分
取HPLC(TFA条件)によって精製した。COM471(386mg、265.50
μmol、収率96.76%)を無色の油状物として得た。
解し、引き続いてピペリジン(865.2mg、10.16mmol、1mL、37当量
)を添加した。混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物5が完全
に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1308.48、実測m/z:
654.8([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。粗生成物を分
取HPLC(TFA条件)によって精製した。COM471(386mg、265.50
μmol、収率96.76%)を無色の油状物として得た。
COM472
g、839.43μmol、1.0当量)およびDIEA(217.0mg、1.68m
mol、292.4μL、2.0当量)の混合物をDMF(2mL)に溶解し、次いで、
HATU(319.2mg、839.4μmol、1.0当量)を混合物に添加した。次
いで、混合物を25℃で30分間攪拌した。TLC(DCM:CH3OH=10:1、R
f=0.24)は、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成され
たことを示した。溶媒を蒸発させて、化合物3(0.45g、339.75μmol、収
率40.47%、粗)を無色の油状物として得て、これをさらに精製することなく次のス
テップに使用した。
化合物3(450.0mg、339.75μmol、1.0当量)をDMF(8mL)
に溶解し、引き続いてピペリジン(2mL)を添加した。混合物を25℃で15分間攪拌
した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望の(計算MW:
1102.27、実測m/z:552.1([M/2+H]+))を有する1つの主ピー
クが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(3
70.0mg、335.67μmol、収率98.80%)を無色の油状物として得た。
に溶解し、引き続いてピペリジン(2mL)を添加した。混合物を25℃で15分間攪拌
した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望の(計算MW:
1102.27、実測m/z:552.1([M/2+H]+))を有する1つの主ピー
クが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(3
70.0mg、335.67μmol、収率98.80%)を無色の油状物として得た。
COM126(60mg、54.45μmol、1.0当量)、化合物4(15.5m
g、81.68μmol、1.5当量)のDMF(5mL)中溶液に、HATU(31m
g、81.68μmol、1.5当量)およびDIEA(10.5mg、61.68μm
ol、15μL、1.5当量)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-M
Sは、COM126が完全に消費されていることを示し、所望の1つの主ピークが検出さ
れた。混合物を蒸発させて、溶媒を除去し、化合物5(30mg、粗)を無色の油状物と
して得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
g、81.68μmol、1.5当量)のDMF(5mL)中溶液に、HATU(31m
g、81.68μmol、1.5当量)およびDIEA(10.5mg、61.68μm
ol、15μL、1.5当量)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-M
Sは、COM126が完全に消費されていることを示し、所望の1つの主ピークが検出さ
れた。混合物を蒸発させて、溶媒を除去し、化合物5(30mg、粗)を無色の油状物と
して得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
化合物5(30mg、23.57μmol、1.0当量)をDCM(4.5mL)に溶
解し、次いで、TFA(0.5mL)を添加し、混合物を25~30℃で2時間攪拌した
。LC-MSは、化合物5が完全に消費されていることを示し、所望の1つの主ピークが
検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。COM472(1
0mg、8.52μmol)を白色固体として得た。
解し、次いで、TFA(0.5mL)を添加し、混合物を25~30℃で2時間攪拌した
。LC-MSは、化合物5が完全に消費されていることを示し、所望の1つの主ピークが
検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。COM472(1
0mg、8.52μmol)を白色固体として得た。
COM473
、449.96μmol、1.0当量)、HOBt(122mg、899.93μmol
、2.0当量)、EDCI(173mg、899.93μmol、2.0当量)の混合物
をDCM(10mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、混合物を
、N2雰囲気下、20~25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費
されていることを示し、所望の(MW:955.06、実測m/z:955.3([M+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒
を除去した。混合物を減圧下で蒸発させ、化合物3(300mg、粗)を黄色の油状物と
して得た。
化合物3(300mg、314.12μmol、1.0当量)をDMF(4mL)に溶
解し、次いで、ピペリジン(1mL)を添加し、混合物を20~25℃で1時間攪拌した
。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:7
32.83、実測m/z:733.2([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出
された。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。COM473(160m
g、218.33μmol、収率69.51%)を無色の油状物として得た。
解し、次いで、ピペリジン(1mL)を添加し、混合物を20~25℃で1時間攪拌した
。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:7
32.83、実測m/z:733.2([M+H]+))を有する1つの主ピークが検出
された。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。COM473(160m
g、218.33μmol、収率69.51%)を無色の油状物として得た。
[実施例2]
EphA2/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY9173
EphA2/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY9173
0mg、499.47μmol、2.01当量)をDMF(5mL)に溶解し、DIEA
(48.11mg、372.24μmol、64.84μL、1.5当量)を添加し、次
いで、混合物を30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に消費
されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2721.12、実測m/z:136
0.9([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取
HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(284mg、101.10μmol
、収率40.74%、純度96.87%)を白色固体として得た。
この反応を並行して2つの独立した容器で実施した。1つの容器について、化合物2(
100mg、36.75μmol、1.0当量)およびBCY6169(120mg、3
6.78μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)10mLに溶
解し、次いで、CuSO4(0.4M、91.9μL、1.0当量)、VcNa(0.4
M、183.8μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、91.9μL、1.0
当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。こ
こでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、40
℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること、および所
望のm/z(計算MW:5983.85、実測m/z:997.6600([M/6+H
]+)および1197.2300([M/5+H]+))を有する1つの主ピークを示し
た。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY9173(218
mg、34.97μmol、収率47.58%、純度96%)を白色固体として得た。
BCY7985
0mg、583μmol)のDMA(4.5mL)およびDCM(1.5mL)中溶液に
、EDCI(89.3mg、466μmol)を添加し、20℃で16時間攪拌した。B
CY7732(855mg、388μmol)のDMA 5mL中混合物を含有する別の
50mL丸底フラスコに、DIEA(186mg、1.44mmol、250μL)を添
加し、10分間攪拌した。次いで、初期反応混合物をフラスコに添加し、20℃でさらに
5時間、さらに攪拌した。LC-MS(ES8396-307-P1B1)は、BCY7
732が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する1つの主ピークが検出さ
れた。得られた反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製して、化合物
BCY7859(621mg、200μmol、収率51.6%、TFA塩)を白色固体
として得た。
BCY6169を調製する一般的な手順
EA(36.6mg、283μmol、49.3μL)を添加し、10分間攪拌した。そ
の後、PYA-NHS(36.8mg、189μmol)を添加し、20℃でさらに15
時間、さらに攪拌した。LC-MSは、BCY6099が完全に消費されていることを示
し、所望の質量を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(中性
条件)によって精製して、化合物BCY6169(299mg、86.2μmol、収率
91.5%)を白色固体として得た。
BCY7985を調製する一般的な手順
、77.1μmol)の窒素によって2時間パージされたDMF(5mL)中溶液に、ア
スコルビン酸水溶液(0.8M、963μL)を添加し、引き続いて窒素雰囲気下でCu
SO4水溶液(0.8M、289μL)を添加した。次いで、混合物を20℃で2時間攪
拌した。LC-MSは、BCY6169が完全に消費されていることを示し、所望の質量
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によっ
て直接精製して、化合物BCY7985(283mg、43.4μmol、収率56.3
%、TFA)を白色固体として得た。
BCY8942
3mL)およびDCM(1mL)中溶液に、HOSu(32.2mg、280μmol、
1.5当量)を添加し、攪拌した。次いで、EDCI(42.9mg、224μmol、
1.2当量)を混合物に添加し、20℃でさらに7時間、さらに攪拌した。LCMSは、
活性化エステルが完全に形成されていることを示した。DMA(3mL)中BCY804
5(410mg、186μmol、1.0当量)を含む別のフラスコに、DIEA(12
0mg、932μmol、162μL、5.0当量)を添加し、攪拌し、次いで、活性化
エステルを添加し、混合物を20℃で18時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/zを
有する1つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を真空中で濃縮して、DC
Mを除去した。得られた混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製して、BCY
8940(190mg、67.2μmol、収率36.1%)を白色固体として得た。
BCY8942を調製する一般的な手順
9(30.0mg、9.19μmol、1.0当量)のDMF(2.0mL)中溶液に、
(2R)-2-[(1S)-1,2-ジヒドロキシエチル]-3,4-ジヒドロキシ-2
H-フラン-5-オン(1.0M、92.0μL)およびCuSO4(1.0M、27.
6μL)を添加し、窒素雰囲気下、20℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY61
69が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:6089.91 実
測m/z:1218.4([M/5+H]+)、1016.0([M/6+H]+)、8
70.7([M/7+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取
HPLC(TFA条件)によって精製して、化合物BCY8942(15.4mg、2.
46μmol、収率26.8%、純度97.3%)を白色固体として得た。
BCY8943
チド;100mg、32.9μmol)のDMA(2mL)中溶液に、DIEA(12.
8mg、98.7μmol、17.2μL)を添加し、10分間攪拌した。次いで、(2
,5-ジオキソピロリジン-1-イル)ペンタ-4-イノエート(12.8mg、65.
8μmol)を混合物に添加し、引き続いて20℃で16時間さらに攪拌した。LC-M
Sは、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:3119
.60、実測m/z:1040.5([M/3+H]+)を有する1つの主ピークが検出
された。混合物を分取HPLC(中性条件)によって精製して、化合物BCY8941(
90.0mg、28.9μmol、収率87.7%)を白色固体として得た。
BCY8943を調製する一般的な手順
4.2μmol)およびBCY8941(42.0mg、13.5μmol)のDMSO
(2mL、窒素によって1時間予めパージされた)中溶液に、(2R)-2-[(1S)
-1,2-ジヒドロキシエチル]-3,4-ジヒドロキシ-2H-フラン-5-オン(1
.0M、270μL)およびCuSO4(1.0M、80.9μL)を添加した。混合物
を窒素で3回パージし、15℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8941が完全
に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:5946.77、実測m/z:
1190.2([M/5+H]+)、991.5([M/6+H]+)、849.9([
M/7+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(A
:H2O中0.075%TFA、B:ACN)によって精製して、化合物BCY8943
(11.5mg、1.90μmol、収率14.1%、純度98.1%)を白色固体とし
て得た。
BCY9647
2mg、85.3μmol、1.5当量)のDCM(0.5mL)中溶液に、TEA(8
.65mg、11.9μL、1.5当量)を添加した。混合物を25℃で1時間攪拌した
。LC-MSは、COM134が完全に消費されていることを示し、所望の質量(計算M
W:691.72、実測m/z:692.3([M+H]+)および709.3([M+
NH4]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮し、次
いで、凍結乾燥して、粗化合物2(30.5mg、粗)を白色として得た。
化合物3を調製する手順
6mg、1,0当量)およびDIEA(5.61mg、7.55μL、3.0当量)を添
加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されて
いることを示し、所望のm/z(計算MW:3735.28 実測m/z:1245.9
([M/3+H]+)および934.5([M/4+H]+))を有する1つの主ピーク
が検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相
HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(34mg、収率62.96%、純
度100%)を白色固体として得た。
BCY9647を調製する手順
10.08μmol、1.11当量)およびTHPTA(0.4M、11.4μL、0.
5当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パ
ージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、11.4μL、0.5当量)およ
びVcNa(0.4M、22.8μL、1当量)をN2下で添加した。0.2M NH4
HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpH
を8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていること、および所望
のm/z(計算MW:6016.82、実測m/z:1204.1([M/5+H]+)
、1003.5([M/6+H]+)、860.3([M/7+H]+)を有する1つの
主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。B
CY9647(31.2mg、収率54.67%、純度95.96%)を白色固体として
得た。
BCY9648
g、40.94μmol、1.5当量)のDCM(0.5mL)中溶液に、TEA(4.
14mg、40.94μmol、5.70μL、1.5当量)を添加した。混合物を25
~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、COM135が完全に消費されていることを
示し、所望の質量[計算MW:1264.41、実測m/z:1281.4([M+NH
4]+)、649.8([M/2+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反
応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(
TFA条件)によって精製して、化合物2(18mg、14.2μmol、収率52.1
4%)を得た。
化合物3を調製する手順
6099(23mg、7.23μmol、1.02当量)およびDIEA(2.76mg
、21.35μmol、3.72μL、3.0当量)を添加した。混合物を30℃で2時
間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z
(計算MW:4307.96 実測m/z:1436.9([M/3+H]+)、107
7.9([M/4+H]+)、862.5([M/5+H]+))を有する1つの主ピー
クが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆
相HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(14.6mg、収率47.61
%、純度100%)を白色固体として得た。
BCY9648を調製する手順
、3.73μmol、1.1当量)およびTHPTA(0.4M、4.3μL、0.5当
量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パージ
した)に溶解し、次いで、CuSO4(.4M、4.3μL、0.5当量)およびVcN
a(0.4M、8.6μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO
3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に
調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で12
時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていること、および所望のm/
z(MW:6589.50、実測m/z:1098.8([M/6+H]+)、942.
1([M/7+H]+)、824.6([M/8+H]+))を有する1つの主ピークを
示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY964
8(14.7mg、収率63.34%、純度96.22%)を白色固体として得た。
BCY9655
g、124.03μmol、1.25当量)のDCM(0.5mL)中溶液に、TEA(
15.34mg、151.59μmol、21.10μL、1.5当量)を添加した。混
合物を25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:1352.4
8、実測m/z:676.8([M/2+H]+)、1369.3([M+NH4]+)
)を有する1つの新たなピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮し
て、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製し
た。化合物2(14mg、8.99μmol、収率8.90%、純度86.86%)を無
色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
、5.03μmol、1.0当量)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(2.01m
g、15.53μmol、2.70μL)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した
。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW
:4396.02、実測m/z:879.8([M/5+H]+)および1099.8(
[M/4+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧
下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(0.1%TFA条件)によって
精製した。化合物3(11.8mg、収率48.29%、純度93.11%)を白色固体
として得た。
BCY9655を調製する手順
mg、3.07μmol、1.14当量)およびTHPTA(0.4M、6.8μL、1
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、6.8μL、1.0当量)およびV
cNa(0.4M、13.6μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4
HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpH
を8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていること、および所望
のm/z(計算MW:6677.57、実測m/z:1113.7([M/6+H]+)
、954.7([M/7+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分
取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9655(1.9mg、0.2
6μmol、収率9.65%、純度91.15%)を白色固体として得た。
BCY9656
mg、34.39μmol、1.5当量)のDCM(3mL)中溶液に、TEA(3.5
mg、34.39μmol、4.8μL、1.5当量)を添加した。混合物を脱気し、N
2で3回パージし、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25℃で1時間攪拌した。LC-
MSは、COM129が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1
473.58、実測m/z:737.3([M/2+H]+))を有する1つの主ピーク
が検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物
を分取HPLC(中性条件)によって精製して、化合物2(12.3mg、8.35μm
ol、収率36.41%)を白色固体として得た。
化合物3を調製する手順
0mg、3.14μmol、0.5当量)のDMF(3mL)中溶液に、TEA(0.7
mg、6.93μmol、1μL、1.1当量)を添加した。混合物を脱気し、N2で3
回パージし、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で1時間攪拌した。LC-
MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:451
7.12、実測m/z:1129.8([M/4+H]+)、904.1([M/5+H
]+)、753.7([M/6+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応
混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条
件)によって精製した。化合物3(12mg、収率72.36%、純度85.58%)を
白色固体として得た。
BCY9656を調製する手順
、2.63μmol、1.08当量)およびTHPTA(0.4M、6.1μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、6.1μL、1.0当量)およびV
cNa(0.4M、12.2μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4
HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpH
を8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望
のm/z(計算MW:6798.66、実測m/z:1133.8([M/6+H]+)
、971.9([M/7+H]+)、850.7([M/8+H]+))を有する1つの
主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した
。BCY9656(6.8mg、収率37.36%、純度90.97%)を白色固体とし
て得た。
BCY9657
mg、31.17μmol、1.5当量)のDCM(3mL)中溶液に、TEA(3.2
mg、31.17μmol、4.4μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30
℃で1時間攪拌した。LC-MSは、COM130が完全に消費されていることを示し、
所望のm/z(計算MW:1608.7、実測m/z:804.8([M/2+H]+)
)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、
化合物2(7.9mg、粗)を白色固体として得た。
化合物3を調製する手順
mg、5.03μmol、1.02当量)のDMF(1mL)中溶液に、DIEA(1.
9mg、14.73μmol、2.6μL、3.0当量)を添加した。混合物を30℃で
2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm
/z(計算MW:4652.25、実測m/z:1551.3([M/3+H]+)、1
163.6([M/4]+)、931.1([M/5+H]+、776.1([M/6+
H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し
て、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3
(13.3mg、2.86μmol、収率53.22%、純度91.42%)を白色固体
として得た。
BCY9657を調製する手順
mg、3.07μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、7.5μL、1
.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回
パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7.5μL、1.0当量)およ
びVcNa(0.4M、15μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4
HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpH
を8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望
のm/z[MW:6933.78、実測m/z:1156.7([M/6+H]+)、9
91.4([M/7+H]+)、867.4([M/8+H]+)]を有する1つの主ピ
ークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。B
CY9657(8.4mg、収率40.21%、純度94.9%)を白色固体として得た
。
BCY9658
5.0mg、272.87μmol、1.2当量)のDCM(5mL)中溶液に、TEA
(36.4mg、359.23μmol、50.0μL、1.6当量)を添加した。混合
物を25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW:897.93
実測920.3([M+Na+])を有する1つの主ピークが検出されることを示した
。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPL
C(TFA条件)によって精製した。化合物2(35mg、33.74μmol、収率1
4.81%、純度86.56%)を無色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
mg、16.65μmol、1.0当量)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(6.
48mg、65.05μmol、50.1μL、4.0当量)を添加した。混合物を30
℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望
のm/z(MW:3941.47 実測m/z:986.0([M/4+H]+))を有
する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得
た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。[BCY6099]-[
COM131](5mg、収率50.48%、純度94.96%)を白色固体として得た
。
BCY9658を調製する手順
9.20μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、22.2μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、22.2μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、44.4μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[MW:6223.01 実測m/z:1038.0([M/6+H]+)お
よび889.8([M/8+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合
物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9658(13.2mg
、収率21.54%、純度90.16%)を白色固体として得た。
BCY9659
8mg、78.34μmol、1.2当量)のDCM(5mL)中溶液に、TEA(36
.4mg、359.23μmol、50μL、5.5当量)を添加した。混合物を25℃
で1時間攪拌した。所望のm/z(MW:471.46、実測m/z:489.2([M
+NH4]+))を有するLC-MSの1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧
下で濃縮して、化合物2(26mg、粗)の無色の油状物を得た。
化合物3を調製する手順
.33mg、7.07μmol、1.5当量)のDMF(3mL)中溶液に、TEA(0
.7mg、6.93μmol、1μL、1.5当量)を添加した。混合物を30℃で2時
間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z
(MW:3515.01、実測m/z:1172.1([M/3+H]+) 879.5
([M/4+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減
圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製し
た。化合物3(12.7mg、3.26μmol、収率69.23%、純度90.3%)
を白色固体として得た。
BCY9659を調製する手順
0mg、2.98μmol、1.03当量)およびTHPTA(1.3mg、2.99μ
mol、1.03当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し
、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7.3μL、1.
0当量)およびVcNa(0.4M、14.6μL、2.0当量)をN2下で添加した。
0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって
、この溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気
下、25~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されている
ことを示し、所望のm/z[MW:5796.54 実測m/z:1159.8([M/
5+H]+) 966.7([M/6+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された
。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9659(6
.2mg、1.06μmol、収率36.58%、純度98.86%)を白色固体として
得た。
BCY9758
mg、3.54μmol、1.0当量)のDMF(3mL)中溶液に、DIEA(0.9
mg、7.07μmol、1.2μL、2.0当量)を添加した。混合物を25~30℃
で20分間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW:4481.11、実測m/z
:1101.3([M/4+H]+))を有する1つのピークが検出されることを示した
。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、化合物2(15mg、粗)を白
色固体として得た。
BCY9758を調製する手順
74mg、6.69μmol、2.0当量)のDMF(3mL)中溶液に、DIEA(0
.9mg、7.07μmol、1.2μL、2.1当量)を添加した。混合物を25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MW:6567.48、実測m/z:1095.1([M/6+H])、9
38.8([M/7+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾
過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によっ
て精製した。BCY9758(5.8mg、収率24.26%、純度91.97%)を白
色固体として得た。
BCY10568
29.6mg、40.01μmol、1.04当量)をDMSO(1mL)に溶解した。
次いで、溶液にDIPEA(7.46mg、55.71μmol、10.0μl、1.5
当量)を添加し、次いで、混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BC
Y8919の大部分が消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2705.
16、実測m/z:1353.1([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出
された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(18.6
mg、6.86μmol、収率17.83%、純度99.76%)を白色固体として得た
。
BCY10568を調製する手順
.0mg、3.36μmol、1.01当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、8.3μL、1.0当量)、VcNa
(1.4mg、7.06μmol、2.1当量)およびTHPTA(1.4mg、3.2
2μmol、1.0当量)を添加した。最後に、0.4M NH4HCO3を添加して、
pHを8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物
を、N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費さ
れていること、および所望のm/z(計算MW:5967.90、実測m/z:995.
00([M/5+H]+)および1194.70([M/6+H]+))を有する1つの
主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY1
0568(13.4mg、2.16μmol、収率69.44%、純度96.3%)を白
色固体として得た。
BCY10570
mg、20.25μmol、1.2当量)のDMSO(2mL)中溶液に、DIEA(3
.36mg、25.96μmol、4.5μL、1.5当量)を添加した。混合物を30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY8920が完全に消費されていることを示
し、所望のm/z(計算MW:2763.2、実測m/z:689.07([M/4-H
+]))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を
除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。
化合物2(22.8mg、8.15μmol、収率47.09%、純度98.78%)を
白色固体として得た。
BCY10570を調製する手順
mg、2.17μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mL
に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.4μL、1.0当量)、VcNa(0.
4M、10.8μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、5.4μL、1.0当
量)を添加した。最後に、0.2M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。
ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、3
0℃で4時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MS:6025.93、実測m/z:1004.56([M/6+H]+)
および861.48([M/7+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応
混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条
件)によって精製した。BCY10570(7.2mg、1.17μmol、収率53.
90%、純度97.95%)を白色固体として得た。
BCY10574
g、27.75μmol、1.02当量)のDMSO(1mL)中溶液に、DIEA(5
.25mg、40.61μmol、7.07μL、1.5当量)を添加した。混合物を2
5~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY9594が完全に消費されているこ
とを示し、所望のm/z(計算MW:2718.13、実測m/z:906.04([M
/3+H]+)、1359.07([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出
された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取
HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(42.6mg、15.67μmo
l、収率57.89%、純度100%)を白色固体として得た。
BCY10574を調製する手順
7.87μmol、1.07当量)およびTHPTA(0.4M、18.4μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、18.4μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、36.8μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(計算MW:4877.68、実測m/z:1219.42([M/4+H]
+)および975.54([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。
反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY10574(1
7.6mg、3.41μmol、収率46.29%、純度94.40%)を白色固体とし
て得た。
BCY10575
、27.75μmol、1.02当量)のDMSO(1mL)中溶液に、DIEA(5.
25mg、40.61μmol、7.07μL、1.5当量)を添加した。混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z[計算MW:2718.13 実測m/z:906.04([M/3+H
]+)および1359.07([M/2+H]+)]を有する1つの主ピークが検出され
た。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HP
LC(TFA条件)によって精製した。化合物2(42.6mg、15.67μmol、
収率57.89%、純度100%)を白色固体として得た。
BCY10575を調製する手順
7.67μmol、1.04当量)およびTHPTA(0.4M、18.4μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、18.4μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、36.8μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[計算MW:4935.71、実測m/z:1234.59([M/4+H]
+)および987.71([M/5+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。
反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY10575(1
2mg、2.37μmol、収率32.27%、純度97.67%)を白色固体として得
た。
BCY10576
54mg、12.81μmol、1.02当量)のDMSO(1mL)中溶液に、DIE
A(2.42mg、18.74μmol、3.3μL、1.5当量)を添加した。混合物
を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z[計算MW:2718.13、実測m/z:906.45([M/
3+H]+)および1359.50([M/2+H]+)]を有する1つの主ピークが検
出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分
取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(16mg、5.80μmol、
収率46.42%、純度98.54%)を白色固体として得た。
BCY10576を調製する手順
.6mg、6.25μmol、1.0当量)およびTHPTA(0.4M、1.8μL、
2.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3
回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、15.6μL、1.0当量)
およびVcNa(0.4M、1.84μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M
NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶
液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25
~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2の大部分が消費されていることを
示し、所望のm/z[計算MW:4893.63、実測m/z:1224.7([M/4
+H]+)および980.01([M/6+H]+)]を有する1つの主ピークが検出さ
れた。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY1057
6(20.5mg、4.13μmol、収率66.02%、純度98.57%)を白色固
体として得た。
BCY10577
、EDCI(8.5mg、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg
、49.5μmol、1.0当量)を添加した。混合物を25~30℃で30分間攪拌し
た。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成されたこ
とを示した。次いで、BCY9172(53mg、25.29μmol、0.47当量)
およびDIEA(3.27mg、25.29μmol、4.4μL、0.47当量)を反
応混合物に添加した。混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY9
172が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:2178.46、実測
m/z:1089.5700([(M/2+H+]))を有する1つの主ピークが検出さ
れた。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を
分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物2(30mg、13.77μmol
、収率54.45%、純度100%)を白色固体として得た。
BCY10577を調製する手順
95mg、10.10μmol、1.1当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、23μL、1当量)、VcNa(0.
4M、46μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、23μL、1.0当量)を
添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは全
ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、30℃で4時
間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z
(計算MS:5441.20、実測m/z:1361.8([M/4+H]+))を有す
る1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た
。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。BCY10577(16.
2mg、2.98μmol、収率32.43%)を白色固体として得た。
[実施例3]
ネクチン-4/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY8854
ネクチン-4/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY8854
チド;300mg、102μmol、1.0当量)のDMA(3mL)中溶液に、DIE
A(52.5mg、406μmol、70.8μL、4.0当量)を添加し、10分間攪
拌した。次いで、(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)ペンタ-4-イノエート(
25.8mg、132μmol、1.3当量)をここに添加し、混合物を20℃でさらに
16時間、さらに攪拌した。LC-MSは、BCY8234が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(計算MW:3034.43、実測m/z:1011.8([M/
3+H]+)、1517.0([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出され
た。反応混合物を分取HPLC(中性条件)によって精製して、化合物BCY8846(
290mg、95.6μmol、収率94.1%)を白色固体として得た。
BCY8854を調製する一般的な手順
溶液に、BCY7859(BCY7985に記載されるように調製され得る;220mg
、77.8μmol、1.0当量)を添加し、引き続いて(2R)-2-[(1S)-1
,2-ジヒドロキシエチル]-3,4-ジヒドロキシ-2H-フラン-5-オン(0.8
0M、963μL、1.0当量)およびCuSO4(0.80M、289μL、0.3当
量)を添加した。混合物を20℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8846が完
全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:5861.59、実測m/z
:837.9([M/7+H]+)、977.6([M/6+H]+)、1173.3(
[M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC
(A:H2O中0.075%TFA、B:ACN)によって精製して、化合物BCY88
54(292mg、46.8μmol、収率60.8%、純度95.9%、TFA)を白
色固体として得た。
BCY9350
プチド;20.0mg、6.77μmol、1.0当量)のDMA(1mL)中溶液に、
DIEA(4.37mg、33.9μmol、5.90μL、5.0当量)および(2,
5-ジオキソピロリジン-1-イル)ペンタ-4-イノエート(2.64mg、13.5
μmol、2.0当量)を添加し、25℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY8
782が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:3034.43、
実測m/z:1012.1[M/3+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反
応混合物を分取HPLC(中性条件)によって精製して、BCY11942(20.0m
g、6.00μmol、収率88.6%、純度91.0%)を白色固体として得た。
BCY9350を調製する一般的な手順
(BCY7985に記載されるように調製され得る;20.5mg、7.25μmol、
1.1当量)のDMF(1mL)中溶液に、(2R)-2-[(1S)-1,2-ジヒド
ロキシエチル]-3,4-ジヒドロキシ-2H-フラン-5-オン(0.4M、330μ
L、20.0当量)を添加し、CuSO4(0.4M、98.9μL、6.0当量)を混
合物に添加した。混合物を25℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8782-P
YAが完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:5861.59、実
測m/z:1173.3[M/5+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反応
混合物を分取HPLC(A:H2O中0.075%TFA、B:ACN)によって精製し
て、BCY9350(14.5mg、2.40μmol、収率36.5%、純度97.2
%)を白色固体として得た。
BCY9351
33μmol、1.01当量)およびBCY8846(10.0mg、3.30μmol
、1.0当量)のDMF(1mL)中溶液に、窒素雰囲気下で、Vc(0.4M、165
μL、20.0当量)およびCuSO4(0.4M、49.4μL、6.0当量)を添加
した。混合物を25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、BCY8940が完全に消費さ
れていることを示し、所望のm/z(計算MW:5861.59、実測m/z:975.
4[M/6+H]+、1172.3[M/5+H]+)を有する1つの主ピークが検出さ
れた。反応混合物を分取HPLC(A:H2O中0.075%TFA、B:ACN)によ
って精製して、BCY9351(5.30mg、0.904μmol、収率26.3%、
純度96.0%)を白色固体として得た。
BCY9399
45μmol)のDCM(0.5mL)中溶液に、TEA(8.65mg、85.45μ
mol、11.9μL)を添加した。混合物を25℃で1時間攪拌した。LC-MSは、
COM134が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:691.7
2、実測m/z:692.3([M+H]+)および709.3([M+NH4]+))
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して
、残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製した。化合物2(30
.5mg)を無色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
68μmol)のDMF(1mL)中溶液に、DIEA(8.41mg、65.05μm
ol、11.33μL)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、
化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:2725.1 実測
m/z:1362.7([M/2+H]+)、909.0([M/3+H]+))を有す
る1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た
。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(20mg、収率
33.41%、純度98.71%)を白色固体として得た。
BCY9399を調製する手順
0mg、5.70μmol、1.01当量)およびTHPTA(0.4M、13.4μL
、1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で
3回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、13.4μL、1.0当量
)およびVcNa(0.4M、26.8μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2
M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この
溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、2
5~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを
示し、所望のm/z[MW:5006.64 実測m/z:834.9([M/6+H]
+)、1002.3([M/5+H]+)、1252.4([M/4+H]+)]を有す
る1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接
精製した。BCY9399(9.1mg、収率27.20%、純度96.29%)を白色
固体として得た。
BCY9400
.29μmol)、化合物1(8.3mg、40.94μmol)のDCM(2mL)中
溶液に、TEA(4.14mg、40.94μmol、5.7μL)を添加した。次いで
、反応混合物を25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、COM135が完全に消
費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1264.40、実測m/z:12
81.4([M+NH4]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減
圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性条件)に
よって精製して、化合物2(18mg)を白色固体として得た。
化合物を調製する手順
2μmol)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(1.4mg、10.68μmol
、1.9μL)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2
が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:3297.78、実測m/z
:1099.7([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合
物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)
によって精製した。化合物3(19.5mg、5.91μmol、収率33.41%、純
度83.07%)を白色固体として得た。
BCY9400を調製する手順
μmol、1.01当量)およびTHPTA(0.4M、15μL、1当量)の混合物を
t-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し
、次いで、CuSO4(0.4M、15μL、1当量)およびVcNa(0.4M、30
μL、2当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH
/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色
になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で12時間攪拌した。LC-MS
は、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z[MW:5579.31
実測m/z:930.5([M/6+H]+)、1116.6([M/5+H]+)]
を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によっ
て直接精製した。BCY9400(13.9mg、2.33μmol、収率27.20%
、純度93.56%)を白色固体として得た。
BCY9401
2.96μmol、1.05当量)のDCM(2mL)中溶液に、TEA(4.8mg、
47.09μmol、6.6μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30℃で2
時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z(MW:1757.86 実測m/z:879.10([M/2+H]+))を有する
1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物
を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(0.02g
、6.56μmol、収率20.91%、純度57.7%)を白色固体として得た。
化合物4を調製する手順
1.51μmol、1.01当量)のDMF(4mL)中溶液に、DIEA(2.2mg
、17.07μmol、2.97μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望
のm/z(MW:3791.23、実測m/z:1263.2([M/3+H]+))を
有する1つの主ピークが検出された。反応物を分取HPLC(中性条件)によって直接精
製した。化合物4(10mg、2.43μmol、収率21.33%、純度92%)を無
色の油状物として得た。
BCY9401を調製する手順
g、2.77μmol、1.0当量)およびTHPTA(0.4M、6.7μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、6.7μL、1.0当量)およびV
cNa(0.4M、13.4μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4
HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpH
を8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃
で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物4が完全に消費されていることを示し、所望
のm/z[MW:MW:6072.77、実測m/z:1012.00([M/6+H]
+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)
によって直接精製した。BCY9401(8.4mg、1.56μmol、収率59.3
1%、純度95.52%)を白色固体として得た。
BCY9403
ニルクロロホルメート(16.2mg、80.25μmol、1.05当量)のDCM(
10mL)中溶液に、TEA(11.6mg、114.64μmol、16.0μL、1
.5当量)を添加した。混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、COM
471が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:1473.58、実測
m/z:736.83([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反
応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(
TFA条件)によって精製した。化合物2(62.8mg、42.67μmol、収率5
5.84%、純度48.37%)を白色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
、29.18μmol、1.0当量)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(5.66
mg、43.77μmol、7.62μL、1.5当量)を添加した。混合物を40℃で
12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望の
m/z(MW:3506.95、実測m/z:1168.58([M/3+H]+))を
有する1つの主ピークが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製
した。化合物3(20mg、5.42μmol、収率18.57%、純度95.04%)
を白色固体として得た。
BCY9403を調製する手順
3mg、2.99μmol、1.1当量)およびTHPTA(0.4M、7μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7μL、1.0当量)およびVcN
a(0.4M、14μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3
(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調
整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で12時
間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z
[MW:5788.49、実測m/z:1157.00([M/5+H]+)および96
4.60([M/6+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分
取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9403(2.1mg、0.3
4μmol、収率11.93%、純度93.80%)を白色固体として得た。
BCY9405
2μmol)のDCM(4mL)中溶液に、TEA(5.8mg、57.14μmol、
8μL)を添加した。混合物を25℃で2時間攪拌した。LC-MSは、COM472が
完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:1338.45、実測m/z:
686.23([M/2+NH4+]))を有する1つの主ピークが検出された。反応混
合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(中性
条件)によって精製した。化合物2(20mg、14.94μmol、収率39.2%)
を無色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
17.93μmol)のDMF(4mL)中溶液に、DIEA(1.9mg、14.94
μmol、2.6μL)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、
化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:3371.82、実
測m/z:1123.94([M/3+H+]))を有する1つの主ピークが検出された
。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(T
FA条件)によって精製した。化合物3(10mg、収率99.07%、純度19.66
%)を白色固体として得た。
BCY9405を調製する手順
mg、3.26μmol、1.1当量)およびTHPTA(1.3mg、2.97μmo
l、1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2
で3回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7.5μL、1.0当量
)およびVcNa(0.4M、151μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M
NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶
液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25
~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示
し、所望のm/z[MW:5653.36、実測m/z:1130.47([M/5+H
]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件
)によって直接精製した。BCY9405(7.8mg、収率46.08%、純度97.
8%)を白色固体として得た。
BCY9406
フェニル)カルボノクロリダート(36.4mg、180.59μmol、1.02当量
)のDCM(3mL)中溶液に、TEA(27.0mg、266.09μmol、37μ
L、1.5当量)を添加した。混合物を35℃で2時間攪拌した。LC-MSは、COM
473が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:897.93、実測m
/z:897.65([M+H]+)、914.60([M+NH4]+))を有する1
つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を
得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(90mg、9
5.87μmol、収率54.04%、純度95.65%)を無色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
1.51μmol、1.03当量)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(2.16m
g、16.71μmol、2.91μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW:2931.30、実測m/
z:977.00([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出されることを示
した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC
(FTA条件)によって精製した。化合物3(15mg、5.12μmol、収率45.
79%、純度99.66%)を白色固体として得た。
BCY9406を調製する手順
5.26μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、12.8μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、12.8μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、25.6μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[MW:5212.84 実測m/z:1042.74([M/4+H]+)
]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によ
って直接精製した。BCY9406(14.4mg、2.57μmol、収率50.21
%、純度93.01%)を白色固体として得た。
BCY9407
64.50μmol、1.28当量)、DIEA(9.80mg、75.80μmol、
13.20μL、1.5当量)のDCM(5mL)中溶液を脱気し、N2で3回パージし
、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、C
OM128が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:1352.4
8、実測m/z:676.7([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出され
た。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HP
LC(TFA条件)によって精製した。化合物2(12mg、8.87μmol、収率1
7.56%)を無色の油状物として得た。
[BCY8116]-[COM128]を調製する手順
、5.06μmol、1.0当量)、DIEA(2.01mg、15.53μmol、2
.70μL、3.0当量)のDMF(3mL)中溶液を脱気し、N2で3回パージし、次
いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、所望の
m/z(計算MW:3385.85、実測m/z:1129.3([M/3+H]+))
を有する1つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮
して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。[BC
Y8116]-[COM128](15.6mg、4.46μmol、収率86.13%
、純度96.75%)を白色固体として得た。
BCY9407を調製する手順
量)、BCY7741(11mg、4.82μmol、1.05当量)およびTHPTA
(0.8M、5.8μL、1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2m
L、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、1
1.6μL、1.0当量)およびVcNa(0.4M、23.2μL、2.0当量)をN
2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加
することによって、この溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合
物を、N2雰囲気下、25~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(
計算MW:5667.39、実測m/z:945.6([M/6+H]+)および113
4.2([M/5+H]+))を有する1つのピークが検出されることを示した。反応混
合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9407(1.3mg
、0.23μmol、収率4.33%、純度86.90%)を白色固体として得た。
BCY9408
0mg、74.42μmol、2.1当量)のDCM(5mL)中溶液に、TEA(5.
5mg、53.88μmol、7.5μL、1.5当量)を添加し、次いで、混合物を、
N2雰囲気下、25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、COM129が完全に消
費されていることを示し、所望のm/z(MW:1473.58、実測m/z:737.
3([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で
濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によっ
て精製した。化合物2(9mg、6.11μmol、収率17.01%、純度95.76
%)を白色固体として得た。
化合物3を調製する手順
.3mg、6.11μmol、1.0当量)のDMF(3mL)中溶液に、DIEA(2
.4mg、18.32μmol、3.2μL、3.0当量)を添加した。全ての溶媒を脱
気し、N2で3回パージし、次いで、混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で1時間攪
拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(M
W:3506.95、実測m/z:877.4([M/4+H]+)およびm/z:11
69.6([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾
過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)によっ
て精製した。化合物3(7.2mg、2.05μmol、収率31.93%、純度95%
)を白色固体として得た。
BCY9408を調製する手順
g、2.19μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、5.1μL、1.
0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パ
ージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.1μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、10.2μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[MW:5788.49 実測m/z:968.9([M/6+H]+)およ
び1158.0([M/5+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合
物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9408(3.1mg、
4.97e-1μmol、収率24.23%、純度92.87%)を白色固体として得た
。
BCY9409
7μmol)のDCM(3mL)中溶液に、TEA(3.15mg、31.17μmol
、4.34μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30℃で1時間攪拌した。L
C-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(MW:160
8.70 実測m/z:804.8([M/2+H]+)を有する1つの主ピークが検出
された。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、凍結乾燥して、化合物2(10.2mg
、粗)を白色固体として得た。
化合物3を調製する手順
、6.22μmol)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(0.8mg、6.22μ
mol、1.1μL、1.0当量)を添加した。混合物を30℃で2時間攪拌した。LC
-MSは、所望のm/z(MW:3642.08、実測m/z:1214.4([M/3
+H]+)を検出した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成
物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(15.0mg、4.12
μmol、収率62.94%、純度95%)を白色固体として得た。
BCY9409を調製する手順
4.38μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、10.3μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、10.3μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、20.6μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[MW:5923.61、実測m/z:988.2([M/6+H]+)]を
有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって
直接精製した。BCY9409(3.1mg、0.52μmol、収率12.62%、純
度90.89%)を白色固体として得た。
BCY9410
5.0mg、272.87μmol、1.2当量)のDCM(5mL)中溶液に、TEA
(36.4mg、359.23μmol、50.0μL、1.6当量)を添加した。混合
物を25~30℃で1時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW:897.93
実測920.3([M+Na+])を有する1つの主ピークが検出されることを示した
。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPL
C(TFA条件)によって精製した。化合物2(35mg、33.74μmol、収率1
4.81%、純度86.56%)を無色の油状物として得た。
化合物3を調製する手順
mg、22.09μmol、1.0当量)のDMF(2mL)中溶液に、DIEA(8.
64mg、66.82μmol、11.64μL、3.0当量)を添加した。混合物を3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MW:2931.32、実測m/z:977.7([M+H]+))を有す
る1つの主ピークが検出された。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した
。化合物3(40mg、13.08μmol、収率58.7%、純度95.82%)を白
色固体として得た。
BCY9410を調製する手順
、15.34μmol、1.17当量)およびTHPTA(0.4M、34μL、1.0
当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パー
ジした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、34μL、1.0当量)およびVc
Na(0.4M、68μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO
3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に
調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30℃で12
時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z[MW:5212.85、実測m/z:1043.2([M/5+H]+)]を有する
1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精
製した。BCY9410(38.6mg、6.78μmol、収率49.71%、純度9
1.6%)を白色固体として得た。
BCY9411
5μmol、1.22当量)のDCM(5mL)中溶液に、TEA(2.8mg、24.
48μmol、3.4μL、1.5当量)を添加した。混合物を25℃で1時間攪拌した
。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:471.46、実測m/z:489.2([
M+NH4]+))を有する1つのピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧
下で濃縮して、溶媒を除去し、次いで、凍結乾燥して、化合物2(8mg、粗)を白色固
体として得た。
化合物3を調製する手順
0mg、4.6μmol、1.0当量)のDMF(5mL)中溶液に、DIEA(0.7
mg、6.90μmol、1μL、1.5当量)を添加した。混合物を30℃で2時間攪
拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計
算MW:2504.83、実測m/z:1252.3([M/2+H]+))を有する1
つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗
生成物を逆相HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(4.2mg、1.5
1μmol、収率32.78%、純度90%)を白色固体として得た。
BCY9411を調製する手順
g、1.75μmol、1.05当量)およびTHPTA(0.04M、84μL、2.
0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3回パ
ージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.04M、84μL、2.0当量)および
VcNa(0.04M、168μL、4.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25~30
℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z[MW:4786.37、実測m/z:1596.2([M/3+H]+)、
1196.9([M/4+H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物
を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY9411(4.1mg、0
.86μmol、収率50.20%、純度98.26%)を白色固体として得た。
BCY9759
g、3.54μmol、1.0当量)のDMF(3mL)中溶液に、DIEA(0.9m
g、7.07μmol、1.2μL、2.0当量)を添加した。混合物を0℃で20分間
攪拌した。LC-MSは、NHS基が脱落している化合物2に対応する質量(計算MW:
3470.95、加水分解MW:3373.81、実測m/z:1125.0([M/3
+H]+)を検出した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、化合物2
(15mg、粗)を白色固体として得た。
BCY9759を調製する手順
7mg、5.76μmol、1.0当量)のDMF(3mL)中溶液に、DIEA(1.
5mg、11.52μmol、2.0μL、2.0当量)を添加した。混合物を25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所
望のm/z(MW:5557.3、実測m/z:927.0([M/6+H]+)および
1112.2([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物
を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相HPLC(TFA条件)に
よって精製した。BCY9759(2.3mg、収率6.92%、純度96.29%)を
白色固体として得た。
BCY10000
370mg、499.47μmol、2.01当量)をDMF(5mL)に溶解し、次い
で、混合物にDIEA(48.11mg、372.24μmol、64.84μL、1.
5当量)を添加し、30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に
消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2721.12、実測m/z:1
360.9([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を
分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(284mg、101.10μm
ol、収率40.74%、純度96.87%)を白色固体として得た。
BCY10000を調製する手順
142mg、52.18μmol、1.0当量)およびBCY8846(157mg、5
1.74μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)10mLに溶
解し、次いで、CuSO4(0.4M、130.5μL、1.0当量)、VcNa(0.
4M、261.0μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、130.5μL、1
.0当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した
。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、
30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z(計算MW:5755.54、実測m/z:959.60([M/6+H
]+)および1151.55([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出され
た。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY10000(31
4.9mg、51.99μmol、収率49.82%、純度95.03%)を白色固体と
して得た。
BCY10567
22.2mg、30.01μmol、1.04当量)をDMSO(1mL)に溶解した。
溶液にDIPEA(5.6mg、43.28μmol、7.6μl、1.5当量)を添加
し、次いで、混合物を25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8919が
完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2705.16、実測m/
z:1353.15([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応
混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(BCY8919-PE
G12-N3、18.5mg、6.77μmol、収率23.47%、純度99.04%
)を白色固体として得た。
BCY10567を調製する手順
化合物2(9.0mg、3.33μmol、1.0当量)およびBCY8846(10
.1mg、3.33μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2
mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、8.3μL、1.0当量)、VcN(1
.3mg、6.56μmol、2.0当量)およびTHPTA(1.4mg、3.22μ
mol、1.0当量)を添加した。最後に、0.4M NH4HCO3を添加して、pH
を8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、
N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されて
いること、および所望のm/z(計算MS:5739.58、実測m/z:956.75
([M/6+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(
TFA条件)によって精製し、BCY10567(6.85mg、1.18μmol、収
率35.48%、純度98.91%)を白色固体として得た。
BCY10569
(16.0mg、21.6μmol、1.15当量)およびDIEA(5.0μL、28
.0μmol、1.5当量)の混合物をDMFに溶解した。LC-MSが、所望のm/z
(計算MW:2763.2、実測m/z:912.17([(M-28)/2+H]+)
を有する1つの主ピークが検出されることを示すまで、反応混合物を40℃で1時間攪拌
した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得て、引き続
いて分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(23.4mg、8.47
μmol、収率45.25%、純度99.0%)を白色固体として得た。
BCY10569を調製する手順
g、1.9μmol、1.05当量)およびTHPTA(1.0mg、2.3μmol、
1.3当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3
回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.0μL、1.0当量)お
よびVcNa(0.4M、5.0μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M N
H4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液の
pHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で
2時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm
/z(計算MW:5797.62、実測m/z:1160.7([M/5+H]+)を有
する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得
た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY10569(5.7
mg、1.18μmol、収率52.25%、純度96.16%)を白色固体として得た
。
BCY10571
.0mg、27.75μmol、1.0当量)を最初にDMSO(1mL)に溶解し、次
いで、混合物にDIEA(5.4mg、41.43μmol、7.22μL、1.5当量
)を添加した。混合物を30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW
:2489.82、実測m/z:1245.1700([M/2+H]+))を有する1
つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し
て、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(
48mg、19.28μmol、収率69.80%、純度100%)を白色固体として得
た。
BCY10571を調製する手順
10mg、4.02μmol、1.0当量)およびBCY8927(9mg、4.17μ
mol、1.04当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに溶解し、次い
で、CuSO4(0.4M、10.0μL、1.0当量)、VcNa(0.4M、20.
1μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、10.0μL、1当量)を添加した
。最後に、0.4M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは全ての
溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、30℃で4時間攪
拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(M
W:4649.36、実測m/z:1162.57([M/4+H]+)、1549.6
9([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物を分取HPLC
(TFA条件)によって精製した。BCY10571(13mg、2.79μmol、収
率34.88%、純度96.48%)を白色固体として得た。
BCY10572
.0mg、27.75μmol、1.0当量)を最初にDMSO(1mL)に溶解し、次
いで、混合物にDIEA(5.4mg、41.43μmol、7.22μL、1.5当量
)を添加した。混合物を30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(MW
:2489.82、実測m/z:1245.1700([M/2+H]+))を有する1
つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し
て、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(
48mg、19.28μmol、収率69.80%、純度100%)を白色固体として得
た。
BCY10572を調製する手順
10mg、4.02μmol、1.0当量)およびBCY8928(9mg、4.06μ
mol、1.01当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに溶解し、次い
で、CuSO4(0.4M、10.1μL、1当量)、VcNa(0.4M、20.2μ
L、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、10.1μL、1.0当量)を添加した
。最後に、0.4M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは全ての
溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、30℃で4時間攪
拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(M
W:4707.40、実測m/z:1568.29([M/3+H]+)および1176
.83([M/4+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧
下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)に
よって精製した。BCY10572(21mg、4.46μmol、収率55.7%、純
度97.51%)を白色固体として得た。
BCY10573
、16.19μmol、1当量)のDMSO(1mL)中溶液に、DIEA(3.12m
g、24.17μmol、4.21μL、1.5当量)を添加した。混合物を25~30
℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8116の大部分が消費されていることを示
し、所望のm/z(計算MW:2489.82、実測m/z:1245.37([M/2
+H]+)および830.25([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出さ
れた。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取H
PLC(TFA条件)によって精製した。化合物2(26.8mg、10.76μmol
、収率66.81%、純度100%)を白色固体として得た。
BCY10573を調製する手順
0mg、6.21μmol、1.03当量)およびTHPTA(0.4M、15.1μL
、1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で
3回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、15.1μL、1.0当量
)およびVcNa(0.4M、30.2μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2
M NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この
溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、2
5~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを
示し、所望のm/z[MW:4665.32、実測m/z:1167.50([M/4+
H]+)]を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条
件)によって直接精製した。BCY10573(11.5mg、2.42μmol、収率
40.14%、純度98.11%)を白色固体として得た。
BCY10578
g、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg、49.5μmol、
1.0当量)と混合することによって活性化した。混合物を25~30℃で30分間攪拌
した。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成された
ことを示した。次いで、化合物BCY9172(80.0mg、38.18μmol、0
.8当量)およびDIEA(6.3mg、8.5μL、49.5μmol、1.0当量)
をこの混合物に添加し、LC-MSが、所望のm/z(計算MW:2178.46、実測
m/z:1089.44([M/2+H]+)を有する1つの主ピークが検出されること
を示すまで、40℃で1時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を
除去し、残留物を得て、引き続いて分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合
物2(15mg、6.88μmol、収率18.66%、純度73.3%)を白色固体と
して得た。
BCY10578を調製する手順
g、4.6μmol、1.0当量)およびTHPTA(2.0mg、4.6μmol、1
.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回
パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、12μL、1.0当量)および
VcNa(0.4M、24μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4H
CO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを
8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間
攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(
計算MW:5212.88、実測m/z:1304.2([M/4+H]+))を有する
1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。
粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY10578(13.78
mg、2.64μmol、収率58.66%、純度96.23%)を白色固体として得た
。
BCY10917
10.5mg、14.17μmol、1.07当量)をDMF(1mL)に溶解した。溶
液にDIPEA(2.6mg、20.09μmol、3.5μl、1.5当量)を添加し
、次いで、混合物を30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、BCY8831が完全に
消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:3635.16 実測m/z:1
212.0([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を
分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(22.0mg、5.83μmo
l、収率43.85%、純度96.39%)を白色固体として得た。
BCY10917を調製する手順
化合物2(10.0mg、2.75μmol、1.0当量)およびBCY11014(
5.98mg、2.75μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1
)2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、13.7μL、2.0当量)、Vc
Na(1.1mg、5.55μmol、2.0当量)およびTHPTA(1.2mg、2
.76μmol、1.0当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、
pHを8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物
を、N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費さ
れていること、および所望のm/z(計算MW:5810.66 実測m/z:1163
.0([M/5+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分取HPL
C(TFA条件)によって精製し、BCY10917(6.4mg、1.07μmol、
収率39.03%、純度97.49%)を白色固体として得た。
BCY11020
.9mg、9.02μmol、1.09当量)をDMF(1mL)に溶解した。溶液にD
IPEA(1.6mg、12.46μmol、2.2μl、1.5当量)を添加し、次い
で、混合物を35℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8831が完全に消費され
ていることを示し、所望のm/z(計算MW:3326.79 実測m/z:1109.
66([M/3+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取H
PLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(7.3mg、2.09μmol、収率
25.20%、純度95.41%)を白色固体として得た。
BCY11020を調製する手順
.8mg、2.19μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2
mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.5μL、1.0当量)、VcNa(
1.0mg、5.05μmol、2.3当量)およびTHPTA(1.0mg、2.30
μmol、1.0当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを
8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N
2雰囲気下、30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されてい
ることを示し、所望のm/z(計算MW:5502.29、実測m/z:1101.74
([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPL
C(TFA条件)によって精製し、BCY11020(3.3mg、0.577μmol
、収率26.30%、純度96.24%)を白色固体として得た。
BCY11373
、EDCI(8.5mg、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg
、49.5μmol、1.0当量)を添加した。混合物を25~30℃で30分間攪拌し
た。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成されたこ
とを示した。次いで、この混合物0.3mLにBCY8116(30.0mg、13.8
1μmol、0.28当量)およびDIEA(2.4μL、13.81μmol、0.2
8当量)を添加し、25~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8116が完
全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2255.53、実測m/z
:1128.34([M/2+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。次いで、
反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取HPLC
(TFA条件)によって精製した。化合物2(21mg、8.9μmol、収率64.4
3%、純度95.56%)を白色固体として得た。
BCY11373を調製する手順
、2.22μmol、1.0当量)およびTHPTA(1.0mg、2.30μmol、
1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3
回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.6μL、1.0当量)お
よびVcNa(0.4M、5.6μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M N
H4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液の
pHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で
2時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm
/z(計算MW:4415.07、実測m/z:1471.5([M/3+H]+および
1103.8([M/4+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を
濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によ
って精製し、BCY11373(4.9mg、1.03μmol、収率46.26%、純
度92.4%)を白色固体として得た。
BCY11374
、2.22μmol、1.0当量)、BCY8928(4.9mg、2.22μmol、
1.0当量)およびTHPTA(1.0mg、2.30μmol、1.0当量)の混合物
をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解
し、次いで、CuSO4(0.4M、5.6μL、1.0当量)およびVcNa(0.4
M、5.6μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:1
t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整すると
、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間攪拌した。LC
-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:44
73.11、実測m/z:1491.5([M/3+H]+および1118.5([M/
4+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮
して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY1
1374(4.1mg、1.27μmol、収率38.04%、純度92.0%)を白色
固体として得た。
BCY11375
ol、1.0当量)、BCY11014(4.8mg、2.22μmol、1.0当量)
およびTHPTA(0.5mg、2.30μmol、1.0当量)の混合物をt-BuO
H/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶解し、次いで、
CuSO4(0.4M、5.6μL、1.0当量)およびVcNa(0.4M、5.6μ
L、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:1 t-BuO
H/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄
色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間攪拌した。LC-MSは、い
くつかの所望のm/z(計算MW:4431.03、実測m/z:1107.59([M
/4+H]+および1477.90([M/3+H]+)を検出した。反応混合物を濾過
し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって
精製し、BCY11375(6mg、1.31μmol、収率59.13%、純度96.
8%)を白色固体として得た。
BCY11616
(6.0mg、13.88μmol、1.0当量)およびDIEA(2.4μL、13.
82μmol、1.0当量)の混合物をDMFに溶解した。LC-MSが、化合物1が完
全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2489.82、実測m/z
:1245.4([M/2+H]+)を有する1つの主ピークが検出されるまで、反応混
合物を40℃で1時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し
、残留物を得て、引き続いて分取HPLC(TFA条件)によって精製した。化合物3(
27mg、10.29μmol、収率74.52%、純度94.9%)を白色固体として
得た。
BCY11616を調製する手順
2.21μmol、1.1当量)およびTHPTA(1.0mg、2.30μmol、1
.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回
パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.0μL、1.0当量)およ
びVcNa(0.4M、5.0μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH
4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のp
Hを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2
時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z(計算MW:4827.46、実測m/z:1207.12([M/4+H]+)を有
する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得
た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11616(4.7
mg、1.0μmol、収率48.48%、純度94.7%)を白色固体として得た。
BCY11617
、2.01μmol、1.0当量)、BCY11506(5.2mg、2.21μmol
、1.1当量)およびTHPTA(1.0mg、2.30μmol、1.1当量)の混合
物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶
解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.0μL、1.0当量)およびVcNa(0.
4M、5.0μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:
1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整する
と、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間攪拌した。L
C-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:4
828.45、実測m/z:1206.97([M/4+H]+)および965.91(
[M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧
下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、
BCY11617(3.2mg、0.63μmol、収率31.37%、純度95.05
%)を白色固体として得た。
BCY11857
(13.0mg、30.06μmol、1.03当量)をMeCN/H2O(1:1)2
mLに溶解した。NaHCO3(0.4M)でpHを8に調整し、次いで、混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:2381.72、
実測m/z:1191.07([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出され
ることを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(
38.0mg、15.9μmol、収率54.71%、純度97.35%)を白色固体と
して得た。
BCY11857を調製する手順
1.5mg、4.92μmol、1.2当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、11.0μL、1.0当量)、VcN
a(2.0mg、10μmol、2.4当量)およびTHPTA(2.0mg、4.6μ
mol、1.1当量)を添加した。最後に、0.2M NH4HCO3を添加して、pH
を8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、
N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されて
いること、および所望のm/z(計算MW:4719.37、実測m/z:1180.2
4([M/4+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC
(TFA条件)によって精製し、BCY11857(10.3mg、2.18μmol、
収率51.90%、純度96.02%)を白色固体として得た。
BCY11858
(13.0mg、30.06μmol、1.03当量)をMeCN/H2O(1:1)2
mLに溶解した。NaHCO3(0.4M)でpHを8に調整し、次いで、混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:2381.72、
実測m/z:1191.07([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出され
ることを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(
38.0mg、15.9μmol、収率54.71%、純度97.35%)を白色固体と
して得た。
BCY11858を調製する手順
2.0mg、9.92μmol、1.1当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、21.0μL、1.0当量)、VcN
a(4.0mg、20.19μmol、2.4当量)およびTHPTA(4.0mg、9
.20μmol、1.1当量)を添加した。最後に、0.4M NH4HCO3を添加し
て、pHを8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混
合物を、N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消
費されていること、および所望のm/z(計算MW:4599.30、実測m/z:92
0.38([M/5+H]+)、1150.79([M/4+H]+)、1533.35
([M/3+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(
TFA条件)によって精製し、BCY11858(16.9mg、3.67μmol、収
率43.43%、純度99.25%)を白色固体として得た。
BCY11859
(6.0mg、30.06μmol、1.0当量)をMeCN/H2O(1:1)2mL
に溶解した。NaHCO3(0.4M)でpHを8に調整し、次いで、混合物を25~3
0℃で2時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:2489.82、実測
m/z:1245.18([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出されるこ
とを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(24
.0mg、9.63μmol、収率69.7%、純度99.28%)を白色固体として得
た。
BCY11859を調製する手順
1.0mg、9.47μmol、1.1当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、21.0μL、1.0当量)、VcN
a(4.0mg、2.5当量)およびTHPTA(4.0mg、1.1当量)を添加した
。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは全ての溶媒
を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、30℃で16時間攪拌
した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること、および所望のm/z(計算
MW:4707.40、実測m/z:941.7([M/5+H]+)、1176.9(
[M/4+H]+)、1569.6([M/3+H]+))を有する1つの主ピークを示
した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11859(1
9.2mg、4.01μmol、収率49.87%、純度98.22%)を白色固体とし
て得た。
[実施例4]
PD-L1/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY8939
PD-L1/CD137結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
BCY8939
0mg、583μmol)のDMA(4.5mL)およびDCM(1.5mL)中溶液に
、EDCI(89.3mg、466μmol)を添加し、20℃で16時間攪拌した。L
CMSは、所望の中間体が完全に形成されていることを示した。BCY7732(854
.97mg、388.37μmol、1当量)およびDIEA(186mg、1.44m
mol、250μL)を混合物に添加し、20℃でさらに5時間、さらに攪拌した。LC
-MSは、BCY7732が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する1つ
の主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製して、
化合物BCY7859(621mg、200.58μmol、収率51.65%、純度9
5%、TFA)を白色固体として得た。計算MW:2817.16、実測m/z:942
.7[M/3+H]+。
BCY8939を調製する一般的な手順
mg、10.0μmol)のDMF(2mL)中溶液に、(2R)-2-[(1S)-1
,2-ジヒドロキシエチル]-3,4-ジヒドロキシル-2H-フラン-5-オン(1M
、100μL)およびCuSO4(1M、30.0μL)を添加し、窒素雰囲気下、20
℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY7859が完全に消費されていることを示し
、所望の質量を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA
条件)によって精製して、化合物BCY8939(16.1mg、2.72μmol、収
率27.1%、純度98.3%)を白色固体として得た。計算MW:5823.49、実
測m/z:1165.4[M/5+H]+、971.0[M/6+H]+、832.9[
M/7+H]+
BCY10580
)および化合物1(40.0mg、54.00μmol、1.13当量)に、DIEA(
9.25mg、71.58μmol、12.47μL、1.5当量)を添加した。混合物
を30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に消費されているこ
とを示し、所望のm/z(MW:2721.12、実測m/z:1361.07([(M
/2+H+]))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して
、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取HPLC(中性条件)によって精
製した。化合物2(48mg、17.44μmol、収率45.68%、純度98.87
%)を白色固体として得た。
BCY10580を調製する手順
.1mg、7.35μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2
mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、18.4μL、1.0当量)、VcNa
(0.4M、36.8μL、2.0当量)およびTHPTA(0.4M、18.4μL、
1.0当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整し
た。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下
、30℃で4時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z(MW:5855.74 実測m/z:976.40([M/6+H]+
)および1171.67([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。
残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した。BCY10580(29mg、
4.85μmol、収率65.95%、純度97.879%)を白色固体として得た。
BCY10581
よび化合物1(40.00mg、54.00μmol、1.13当量)に、DIEA(9
.25mg、71.58μmol、12.47μL、1.5当量)を添加した。混合物を
30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(MW:2721.12、実測m/z:1361.07([(M/
2+H+]))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、
溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取HPLC(中性条件)によって精製
した。化合物2(48mg、17.44μmol、収率45.68%、純度98.87%
)を白色固体として得た。
BCY10581を調製する手順
8mg、4.41μmol、1当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに
溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、11.02μL、1当量)、VcNa(0.4
M、22.05μL、2当量)およびTHPTA(0.4M、10.04μL、1当量)
を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは
全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、30℃で4
時間攪拌した。LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/
z(MW:5912.84、実測m/z:985.90([M/6+H]+)および11
83.28([M/5+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。残留物を分取
HPLC(TFA条件)によって精製した。BCY10581(9.3mg、1.47μ
mol、収率33.36%、純度93.541%)を白色固体として得た。
BCY10582
.0mg、54.0μmol、1.13当量)のDMSO(2mL)中溶液に、DIEA
(9.2mg、71.6μmol、12.5μL、1.5当量)を添加した。混合物を3
0℃で12時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に消費されていることを
示し、所望のm/z(計算MW:2721.12、実測m/z:1361.07([M/
2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、
溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取HPLC(TFA条件)によって精製した
。化合物2(37mg、13.60μmol、収率28.49%)を白色固体として得た
。
BCY10582を調製する手順
0mg、6.0μmol、1.01当量)およびTHPTA(0.4M、14.7μL、
1.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、2mL、予め脱気し、N2で3
回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、14.7μL、1.0当量)
およびVcNa(0.4M、29.4μL、2.0当量)をN2下で添加した。0.2M
NH4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶
液のpHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、25
~30℃で12時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていることを示
し、所望のm/z[計算MW:5073.89、実測m/z:1015.24([M/5
+H]+)および1268.97([M/4+H]+)を有する1つの主ピークが検出さ
れた。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって直接精製した。BCY1058
2(10mg、1.92μmol、収率32.58%、純度97.21%)を白色固体と
して得た。
BCY11017
mg、2.59μmol、1.0当量)およびBCY10861(7.03mg、2.5
9μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに溶解し、次
いで、CuSO4(0.4M、13.0μL、2.0当量)、VcNa(1.0mg、5
.03μmol、2.0当量)およびTHPTA(1.1mg、2.53μmol、1.
0当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。
ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、3
5℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること、および
所望のm/z(計算MW:5421.30、実測m/z:1084.7([M/5+H]
+))を有する1つの主ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によ
って精製し、BCY11017(6.6mg、1.17μmol、収率45.24%、純
度96.16%)を白色固体として得た。
BCY11018
mg、2.17μmol、1.0当量)およびBCY10861(5.9mg、2.17
μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに溶解し、次い
で、CuSO4(0.4M、11.0μL、2.0当量)、VcNa(1.0mg、2.
3当量)およびTHPTA(1.1mg、1.0当量)を添加した。最後に、1M NH
4HCO3を添加して、pHを8に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回
パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、35℃で16時間攪拌した。LC-MSは、
化合物2が完全に消費されていること、および所望のm/z(計算MW:5479.34
、実測m/z:1096.40([M/5+H]+))を有する1つの主ピークを示した
。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11018(2.3
mg、0.40μmol、収率18.31%、純度94.73%)を白色固体として得た
。
BCY11019
mg、2.94μmol、1.0当量)およびBCY10861(8.0mg、2.95
μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2mLに溶解し、次い
で、CuSO4(0.4M、14.7μL、2.0当量)、VcNa(1.2mg、6.
05μmol、2.0当量)およびTHPTA(1.3mg、2.99μmol、1.0
当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調整した。こ
こでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲気下、35
℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されていること、および所
望のm/z(計算MW:5437.26、実測m/z:1088.09([M/5+H]
+)および1360.19([M/4+H]+))を有する1つの主ピークを示した。反
応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11019(7.6mg
、1.36μmol、収率46.09%、純度96.95%)を白色固体として得た。
BCY11376
、EDCI(8.5mg、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg
、49.5μmol、1.0当量)を添加した。混合物を25~30℃で30分間攪拌し
た。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成されたこ
とを示した。次いで、この混合物0.2mLにBCY8919(20.0mg、9.62
μmol)およびDIEA(1.7μL、9.62μmol)を添加した。混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8919が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(計算MW:2162.51、実測m/z:1081.8([M/
2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃
縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取HPLC(TFA条件)によって
精製した。化合物2(12mg、5.55μmol、収率56.28%、純度97.54
%)を白色固体として得た。
BCY11376を調製する手順
、1.40μmol、1.0当量)およびTHPTA(1.2mg、2.76μmol、
2.0当量)の混合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3
回パージした)に溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、3.5μL、1.0当量)お
よびVcNa(0.4M、3.5μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M N
H4HCO3(1:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液の
pHを8に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で
2時間攪拌した。LC-MSは、BCY10861が完全に消費されていることを示し、
所望のm/z(計算MW:4878.64、実測m/z:1220.8([M/4+H]
+)を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残
留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11376
(1.9mg、1.0μmol、収率27.01%、純度96.2%)を白色固体として
得た。
BCY11377
、EDCI(8.5mg、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg
、49.5μmol、1.0当量)を添加した。混合物を25~30℃で30分間攪拌し
た。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成されたこ
とを示した。次いで、この混合物0.2mLにBCY8920(20.0mg、9.36
μmol)およびDIEA(1.2mg、9.36μmol)を添加した。混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8920が完全に消費されていること
を示し、所望のm/z(計算MW:2220.54、実測m/z:1110.90([M
/2+H]+)を有する1つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃
縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取HPLC(TFA条件)によって
精製した。化合物2(12mg、5.15μmol、収率56.28%、純度95.3%
)を白色固体として得た。
BCY11377を調製する手順
、1.35μmol、1.0当量)およびTHPTA(0.6mg、1.0当量)の混合
物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に溶
解し、次いで、CuSO4(0.4M、3.4μL、1当量)およびVcNa(0.4M
、3.4μL、1当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1:1 t-
BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整すると、溶液
が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間攪拌した。LC-MS
は、所望のm/z(計算MW:4936.68、実測m/z:1234.9([M/4+
H]+)を有する1つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧
下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、
BCY11377(3.5mg、0.66μmol、収率48.86%、純度93.1%
)を白色固体として得た。
BCY11378
、EDCI(8.5mg、54.8μmol、1.1当量)およびHOSu(5.7mg
、49.5μmol、1.0当量)を添加した。混合物を25~30℃で30分間攪拌し
た。TLCは、化合物1が完全に消費されており、1つの新たなスポットが形成されたこ
とを示した。次いで、この混合物0.2mLをBCY9172(20.0mg、9.54
μmol)およびDIEA(1.7μL、9.62μmol)に添加した。混合物を25
~30℃で2時間攪拌した。LC-MSは、化合物1が完全に消費されていることを示し
、所望のm/z(計算MW:2176.49、実測m/z:1090.0([M/2+H
]+)を有する1つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、
溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取HPLC(TFA条件)によって精製した
。化合物2(20.2mg、7.48μmol、収率78.34%、純度80.57%)
を白色固体として得た。
BCY11378を調製する手順
g、2.30μmol、1.0当量)およびTHPTA(1.0mg、1.0当量)の混
合物をt-BuOH/H2O(1:1、1mL、予め脱気し、N2で3回パージした)に
溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、5.8μL、1.0当量)およびVcNa(0
.4M、5.8μL、1.0当量)をN2下で添加した。0.2M NH4HCO3(1
:1 t-BuOH/H2O中)を滴加することによって、この溶液のpHを8に調整す
ると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、N2雰囲気下、40℃で2時間攪拌した。
LC-MSは、化合物3が完全に消費されていることを示し、所望のm/z(計算MW:
4894.61、実測m/z:1224.3([M/4+H]+)を有する1つの主ピー
クが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分
取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11378(1.2mg、0.34μ
mol、収率10.07%、純度94.3%)を白色固体として得た。
BCY11379
6.3mg、14.57μmol、1.01当量)を、MeCN(1mL)とH2O(1
mL)の混合物に溶解した。溶液に1M NaHCO3を添加して、pHを8に調整し、
次いで、混合物を35℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8919が完全に消費
されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2396.79、実測m/z:119
8.74([M/2+H]+)および799.50([M/4+H]+))を有する1つ
の主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化
合物2(20mg、8.07μmol、収率55.92%、純度96.68%)を白色固
体として得た。
BCY11379を調製する手順
.4mg、1.25μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2
mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7μL、2.24当量)、VcNa(1
mg、5.04μmol、4.03当量)およびTHPTA(1mg、2.30μmol
、1.84当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調
整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲
気下、25~30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2が完全に消費されてい
ること、および所望のm/z(計算MW:5112.93 実測m/z:1022.96
([M/5+H]+)および1278.74([M/4+H]+)を有する1つの主ピー
クを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY1137
9(3.4mg、0.615μmol、収率52.00%、純度97.88%)を白色固
体として得た。
BCY11380
6.1mg、14.11μmol、1.01当量)を、MeCN(1mL)とH2O(1
mL)の混合物に溶解した。溶液に1M NaHCO3を添加して、pHを8に調整し、
次いで、混合物を35℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY8920が完全に消費
されていることを示し、所望のm/z(計算MW:2454.83、実測m/z:122
7.63([M/2+H]+)および818.66([M/3+H]+))を有する1つ
の主ピークが検出された。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、化
合物2(20mg、8.03μmol、収率57.21%、純度98.56%)を白色固
体として得た。
BCY11380を調製する手順
.9mg、1.44μmol、1.0当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)2
mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、8μL、2.24当量)、VcNa(1
mg、5.04μmol、3.52当量)およびTHPTA(1mg、2.30μmol
、1.61当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に調
整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰囲
気下、25~30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、化合物2の大部分が消費されて
いること、および所望のm/z(計算MW:5170.97、実測m/z:1034.2
8([M/5+H]+)および1293.10([M/4+H]+))を有する1つの主
ピークを示した。反応混合物を分取HPLC(TFA条件)によって精製し、BCY11
380(1.6mg、0.296μmol、収率20.77%、純度96.77%)を白
色固体として得た。
BCY11381
6.2mg、14.34μmol、1.0当量)を、MeCN(1mL)とH2O(1m
L)の混合物に溶解した。溶液に1M NaHCO3を添加して、pHを8に調整し、次
いで、混合物を35℃で2時間攪拌した。LC-MSは、BCY9172が完全に消費さ
れていることを示し、所望のm/z(計算MW:2412.75、実測m/z:1206
.72([M/2+H]+))を有する1つの主ピークが検出された。反応混合物を分取
HPLC(TFA条件)によって精製し、化合物2(15mg、6.14μmol、収率
42.87%、純度98.75%)を白色固体として得た。
BCY11381を調製する手順
.4mg、1.25μmol、1.01当量)を最初にt-BuOH/H2O(1:1)
2mLに溶解し、次いで、CuSO4(0.4M、7μL、2.25当量)、VcNa(
1mg、5.04μmol、4.06当量)およびTHPTA(1mg、2.30μmo
l、1.85当量)を添加した。最後に、1M NH4HCO3を添加して、pHを8に
調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、N2で3回パージした。反応混合物を、N2雰
囲気下、25~30℃で16時間攪拌した。LC-MSは、所望のm/z(計算MW:5
128.89、実測m/z:1026.05([M/5+H]+)および1282.50
([M/4+H]+))を有する1つのピークを示した。反応混合物を分取HPLC(T
FA条件)によって精製し、BCY11381(1.6mg、0.295μmol、収率
23.73%、純度94.59%)を白色固体として得た。
[実施例5]
CD137モノクローナル抗体アゴニストの作製
本明細書に提示される実験でCD137他量体と比較するために使用したCD137モ
ノクローナル抗体アゴニストの配列は、米国特許第7288638号に開示された。Ig
G4アイソタイプ抗体を、DNA発現構築物の一過的トランスフェクション後にExpi
CHO Expression System(Thermo Fisher Scie
ntific)を使用して発現させた。抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製し、リン酸緩衝溶液(PBS)pH7.2中で製剤化した。HPLC
-SEC(カラムGF-250、Agilent)を使用した純度分析は、CD137モ
ノクローナル抗体の単量体割合がおよそ95%であることを示した。結合活性分析は、1
μg/ml超の濃度を有するCD137モノクローナル抗体が、CD137を発現するC
HO細胞に結合することができることを示した。ToxinSensor(商標)Chr
omogenic LAL Endotoxin Assay Kit(Genscri
pt)を使用したエンドトキシン分析は、CD137モノクローナル抗体調製物が、7E
U/mg未満のエンドトキシンを含有していることを示した。
CD137モノクローナル抗体アゴニストの作製
本明細書に提示される実験でCD137他量体と比較するために使用したCD137モ
ノクローナル抗体アゴニストの配列は、米国特許第7288638号に開示された。Ig
G4アイソタイプ抗体を、DNA発現構築物の一過的トランスフェクション後にExpi
CHO Expression System(Thermo Fisher Scie
ntific)を使用して発現させた。抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製し、リン酸緩衝溶液(PBS)pH7.2中で製剤化した。HPLC
-SEC(カラムGF-250、Agilent)を使用した純度分析は、CD137モ
ノクローナル抗体の単量体割合がおよそ95%であることを示した。結合活性分析は、1
μg/ml超の濃度を有するCD137モノクローナル抗体が、CD137を発現するC
HO細胞に結合することができることを示した。ToxinSensor(商標)Chr
omogenic LAL Endotoxin Assay Kit(Genscri
pt)を使用したエンドトキシン分析は、CD137モノクローナル抗体調製物が、7E
U/mg未満のエンドトキシンを含有していることを示した。
生物学的データ
1.CD137 Biacore実験説明
Biacore実験を実施して、ヒトCD137タンパク質に結合するヘテロタンデム
ペプチドのka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)値を決定した。組換え
ヒトCD137(R&D systems)をPBSに再懸濁し、製造業者の提案される
プロトコルによって、EZ-Link(商標)スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン試
薬(Thermo Fisher)を使用してビオチン化した。タンパク質を脱塩して、
スピンカラムを使用してカップリングしていないビオチンをPBSに除去した。
1.CD137 Biacore実験説明
Biacore実験を実施して、ヒトCD137タンパク質に結合するヘテロタンデム
ペプチドのka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)値を決定した。組換え
ヒトCD137(R&D systems)をPBSに再懸濁し、製造業者の提案される
プロトコルによって、EZ-Link(商標)スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン試
薬(Thermo Fisher)を使用してビオチン化した。タンパク質を脱塩して、
スピンカラムを使用してカップリングしていないビオチンをPBSに除去した。
ペプチド結合を分析するために、Biacore T200またはBiacore 3
000機器をXanTec CMD500Dチップと共に使用した。ストレプトアビジン
を、泳動緩衝液としてHBS-N(10mM HEPES、0.15M NaCl、pH
7.4)を用いて、25℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定
した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、10μl/分の流速で、1
:1比の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩
酸塩(EDC)/0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を7分注入するこ
とによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を10mM酢
酸ナトリウム(pH4.5)中0.2mg/mlに希釈し、120μlを注入することに
よって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエタノールアミン(pH
8.5)を7分間注入してブロッキングし、ビオチン化CD137を270~1500R
Uのレベルまで捕捉した。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、ペプ
チドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチ
ド濃度は500nMであり、6回さらに2倍または3倍希釈した。SPR分析を、60秒
結合および900秒解離で、90μl/分の流速で、25℃で行った。各サイクル後に、
再生ステップ(10mMグリシンpH2 10μl)を使用した。必要に応じて、DMS
Oを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を使
用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubberソフトウェ
ア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用して、データプ
ロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場合、物質移動効
果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティングした。
000機器をXanTec CMD500Dチップと共に使用した。ストレプトアビジン
を、泳動緩衝液としてHBS-N(10mM HEPES、0.15M NaCl、pH
7.4)を用いて、25℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定
した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、10μl/分の流速で、1
:1比の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩
酸塩(EDC)/0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を7分注入するこ
とによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を10mM酢
酸ナトリウム(pH4.5)中0.2mg/mlに希釈し、120μlを注入することに
よって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエタノールアミン(pH
8.5)を7分間注入してブロッキングし、ビオチン化CD137を270~1500R
Uのレベルまで捕捉した。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、ペプ
チドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチ
ド濃度は500nMであり、6回さらに2倍または3倍希釈した。SPR分析を、60秒
結合および900秒解離で、90μl/分の流速で、25℃で行った。各サイクル後に、
再生ステップ(10mMグリシンpH2 10μl)を使用した。必要に応じて、DMS
Oを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を使
用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubberソフトウェ
ア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用して、データプ
ロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場合、物質移動効
果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティングした。
一定のヘテロタンデムペプチドをこのアッセイで試験し、結果を以下の表1に示す。
2.ネクチン-4 Biacore実験説明
Biacore実験を実施して、ヒトネクチン-4タンパク質(Charles Ri
verから入手)に結合するヘテロタンデムペプチドのka(M-1s-1)、kd(s
-1)、KD(nM)値を決定した。gp67シグナル配列およびC末端FLAGタグを
有するヒトネクチン-4(残基Gly32-Ser349;NCBI参照配列:NP_1
12178.2)を、pFastbac-1にクローニングし、標準的なBac-to-
Bac(商標)プロトコル(Life Technologies)を使用してバキュロ
ウイルスを作製した。27℃でExcell-420培地(Sigma)中1×106個
ml-1のSf21細胞を、P1ウイルスストックで、MOI2で感染させ、上清を72
時間で収穫した。上清を、PBSで洗浄した抗FLAG M2アフィニティーアガロース
樹脂(Sigma)で、4℃で1時間バッチ結合し、その後、樹脂をカラムに移し、PB
Sで広範囲に洗浄した。タンパク質を100μg/ml FLAGペプチドで溶出した。
溶出したタンパク質を2mlに濃縮し、1ml/分で、PBS中S200 Superd
exカラム(GE Healthcare)上にロードした。2ml画分を回収し、ネク
チン-4タンパク質を含有する画分を16mg/mlに濃縮した。
タンパク質を、製造業者の提案されるプロトコルによって、EZ-Link(商標)ス
ルホ-NHS-LC-LC-ビオチン試薬(Thermo Fisher)を使用してP
BS中でランダムにビオチン化した。タンパク質を広範囲に脱塩して、スピンカラムを使
用してカップリングしていないビオチンをPBSに除去した。
ペプチド結合を分析するために、Biacore 3000機器をCM5チップ(GE
Healthcare)と共に使用した。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてH
BS-N(10mM HEPES、0.15M NaCl、pH7.4)を用いて、25
℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定した。手短に言えば、カ
ルボキシメチルデキストラン表面を、10μl/分の流速で、1:1比の0.4M 1-
エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)/0.1
M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を7分注入することによって活性化した。
ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.
5)中0.2mg/mlに希釈し、ストレプトアビジン120μlを注入することによっ
て活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエタノールアミン(pH8.
5)を7分間注入してブロッキングし、ビオチン化ネクチン-4を1200~1800R
Uのレベルまで捕捉した。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、ペプ
チドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチ
ド濃度は100nMであり、6回さらに2倍希釈した。SPR分析を、個々のペプチドに
応じて、60秒結合および400~1200秒解離で、50μl/分の流速で、25℃で
行った。DMSOを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的
な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubb
erソフトウェア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用
して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場
合、物質移動効果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティ
ングした。
Biacore実験を実施して、ヒトネクチン-4タンパク質(Charles Ri
verから入手)に結合するヘテロタンデムペプチドのka(M-1s-1)、kd(s
-1)、KD(nM)値を決定した。gp67シグナル配列およびC末端FLAGタグを
有するヒトネクチン-4(残基Gly32-Ser349;NCBI参照配列:NP_1
12178.2)を、pFastbac-1にクローニングし、標準的なBac-to-
Bac(商標)プロトコル(Life Technologies)を使用してバキュロ
ウイルスを作製した。27℃でExcell-420培地(Sigma)中1×106個
ml-1のSf21細胞を、P1ウイルスストックで、MOI2で感染させ、上清を72
時間で収穫した。上清を、PBSで洗浄した抗FLAG M2アフィニティーアガロース
樹脂(Sigma)で、4℃で1時間バッチ結合し、その後、樹脂をカラムに移し、PB
Sで広範囲に洗浄した。タンパク質を100μg/ml FLAGペプチドで溶出した。
溶出したタンパク質を2mlに濃縮し、1ml/分で、PBS中S200 Superd
exカラム(GE Healthcare)上にロードした。2ml画分を回収し、ネク
チン-4タンパク質を含有する画分を16mg/mlに濃縮した。
タンパク質を、製造業者の提案されるプロトコルによって、EZ-Link(商標)ス
ルホ-NHS-LC-LC-ビオチン試薬(Thermo Fisher)を使用してP
BS中でランダムにビオチン化した。タンパク質を広範囲に脱塩して、スピンカラムを使
用してカップリングしていないビオチンをPBSに除去した。
ペプチド結合を分析するために、Biacore 3000機器をCM5チップ(GE
Healthcare)と共に使用した。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてH
BS-N(10mM HEPES、0.15M NaCl、pH7.4)を用いて、25
℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定した。手短に言えば、カ
ルボキシメチルデキストラン表面を、10μl/分の流速で、1:1比の0.4M 1-
エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)/0.1
M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を7分注入することによって活性化した。
ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.
5)中0.2mg/mlに希釈し、ストレプトアビジン120μlを注入することによっ
て活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエタノールアミン(pH8.
5)を7分間注入してブロッキングし、ビオチン化ネクチン-4を1200~1800R
Uのレベルまで捕捉した。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、ペプ
チドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチ
ド濃度は100nMであり、6回さらに2倍希釈した。SPR分析を、個々のペプチドに
応じて、60秒結合および400~1200秒解離で、50μl/分の流速で、25℃で
行った。DMSOを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的
な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubb
erソフトウェア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用
して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場
合、物質移動効果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティ
ングした。
本発明の一定のヘテロタンデムペプチドを上記のネクチン-4結合アッセイで試験し、
結果を以下の表2に示す。
結果を以下の表2に示す。
3.EphA2 Biacore実験説明
Biacore実験を実施して、ヒトEphA2タンパク質に結合するヘテロタンデム
ペプチドのka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)値を決定した。
EphA2を、タンパク質に対して3倍モル過剰のビオチンを用いて、4mM酢酸ナト
リウム、100mM NaCl、pH5.4中で、1時間、EZ-Link(商標)スル
ホ-NHS-LC-ビオチンを使用してビオチン化した。反応混合物のPBSへの透析後
、Fluorescence Biotin Quantification Kit(
Thermo)を使用して、標識化の程度を決定した。ペプチド結合を分析するために、
Biacore T200機器を、XanTec CMD500Dチップと共に使用した
。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてHBS-N(10mM HEPES、0.1
5M NaCl、pH7.4)を用いて、25℃で標準的なアミンカップリング化学を使
用して、チップに固定した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、10
μl/分の流速で、1:1比の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)/0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NH
S)を7分注入することによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タ
ンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中0.2mg/mlに希釈し、120
μlを注入することによって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエ
タノールアミン(pH8.5):HBS-N(1:1)を7分間注入してブロッキングし
た。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、緩衝液中0.2μMまでの
タンパク質の希釈を使用して、ビオチン化EphA2を500~1500RUのレベルま
で捕捉した。ペプチドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製
し、上位ペプチド濃度は50または100nMであり、6回さらに2倍希釈した。SPR
分析を、60秒結合および900~1200秒解離で、90μl/分の流速で、25℃で
行った。DMSOを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的
な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubb
erソフトウェア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用
して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場
合、物質移動効果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティ
ングした。
Biacore実験を実施して、ヒトEphA2タンパク質に結合するヘテロタンデム
ペプチドのka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)値を決定した。
EphA2を、タンパク質に対して3倍モル過剰のビオチンを用いて、4mM酢酸ナト
リウム、100mM NaCl、pH5.4中で、1時間、EZ-Link(商標)スル
ホ-NHS-LC-ビオチンを使用してビオチン化した。反応混合物のPBSへの透析後
、Fluorescence Biotin Quantification Kit(
Thermo)を使用して、標識化の程度を決定した。ペプチド結合を分析するために、
Biacore T200機器を、XanTec CMD500Dチップと共に使用した
。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてHBS-N(10mM HEPES、0.1
5M NaCl、pH7.4)を用いて、25℃で標準的なアミンカップリング化学を使
用して、チップに固定した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、10
μl/分の流速で、1:1比の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピ
ル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)/0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NH
S)を7分注入することによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タ
ンパク質を10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)中0.2mg/mlに希釈し、120
μlを注入することによって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、1Mエ
タノールアミン(pH8.5):HBS-N(1:1)を7分間注入してブロッキングし
た。緩衝液をPBS/0.05% Tween20に変更し、緩衝液中0.2μMまでの
タンパク質の希釈を使用して、ビオチン化EphA2を500~1500RUのレベルま
で捕捉した。ペプチドの希釈系列を、最終DMSO濃度0.5%で、この緩衝液中で調製
し、上位ペプチド濃度は50または100nMであり、6回さらに2倍希釈した。SPR
分析を、60秒結合および900~1200秒解離で、90μl/分の流速で、25℃で
行った。DMSOを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的
な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Scrubb
erソフトウェア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を使用
して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場
合、物質移動効果を可能にする単純な1:1結合モデルを使用して、データをフィッティ
ングした。
本発明の一定のヘテロタンデムペプチドをEphA2結合アッセイで試験し、結果を以
下の表3に示す。
下の表3に示す。
4.腫瘍細胞とのCD137レポーターアッセイ共培養
1%FBSをRPMI-1640(PromegaキットCS196005の成分)に
添加することによって、R1培地と呼ばれる培養培地を調製する。R1中の試験物の系列
希釈を滅菌96ウェルプレートで調製する。白色細胞培養プレートの指定されたウェルに
対して、1ウェル当たり25μlの試験物またはR1(バックグラウンド対照として)を
使用する。腫瘍細胞*を収穫し、R1培地に400000個細胞/mLの濃度で再懸濁す
る。25(25)μL/ウェルの腫瘍細胞を白色細胞培養プレートで使用する。Jurk
at細胞(PromegaキットCS196005、0.5mL)を水浴中で解凍し、次
いで、5ml予熱R1培地に添加する。25(25)μL/ウェルのJurkat細胞を
白色細胞培養プレートで使用する。細胞および試験物を37℃、5%CO2で6時間イン
キュベートする。6時間の終わりに、75μl/ウェルのBio-Glo(商標)(Pr
omega)を添加し、10分間インキュベートした後、プレートリーダー(Clari
ostar、BMG)で発光を読み取る。細胞(Jurkat細胞+共培養で使用した細
胞株)に対する変化倍率を計算し、対数(アゴニスト)対応答としてGraphPad
Prismでプロットして、EC50(nM)およびバックグラウンドに対する誘導倍率
(最大)を決定する。
1%FBSをRPMI-1640(PromegaキットCS196005の成分)に
添加することによって、R1培地と呼ばれる培養培地を調製する。R1中の試験物の系列
希釈を滅菌96ウェルプレートで調製する。白色細胞培養プレートの指定されたウェルに
対して、1ウェル当たり25μlの試験物またはR1(バックグラウンド対照として)を
使用する。腫瘍細胞*を収穫し、R1培地に400000個細胞/mLの濃度で再懸濁す
る。25(25)μL/ウェルの腫瘍細胞を白色細胞培養プレートで使用する。Jurk
at細胞(PromegaキットCS196005、0.5mL)を水浴中で解凍し、次
いで、5ml予熱R1培地に添加する。25(25)μL/ウェルのJurkat細胞を
白色細胞培養プレートで使用する。細胞および試験物を37℃、5%CO2で6時間イン
キュベートする。6時間の終わりに、75μl/ウェルのBio-Glo(商標)(Pr
omega)を添加し、10分間インキュベートした後、プレートリーダー(Clari
ostar、BMG)で発光を読み取る。細胞(Jurkat細胞+共培養で使用した細
胞株)に対する変化倍率を計算し、対数(アゴニスト)対応答としてGraphPad
Prismでプロットして、EC50(nM)およびバックグラウンドに対する誘導倍率
(最大)を決定する。
共培養に使用した腫瘍細胞型は、以下の表4に示されるように、ヘテロタンデムに特異
的な腫瘍標的に依存する。
的な腫瘍標的に依存する。
EphA2-CD137ヘテロタンデムBCY7985が、EphA2発現HT108
0細胞の存在下、Promega CD137ルシフェラーゼレポーターアッセイでCD
137細胞活性の強力な誘導を示したことを示すデータが図3に示される。HT1080
細胞の非存在下では、ヘテロタンデムによるCD137誘導はない。
0細胞の存在下、Promega CD137ルシフェラーゼレポーターアッセイでCD
137細胞活性の強力な誘導を示したことを示すデータが図3に示される。HT1080
細胞の非存在下では、ヘテロタンデムによるCD137誘導はない。
EphA2/CD137ヘテロタンデムがCD137レポーターアッセイで強力なCD
137活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株(A549および
SC-OV-3:EphA2高およびLNCaP:EphA2低)上の腫瘍標的発現レベ
ルに依存することを示すデータが図4に示される。
137活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株(A549および
SC-OV-3:EphA2高およびLNCaP:EphA2低)上の腫瘍標的発現レベ
ルに依存することを示すデータが図4に示される。
ネクチン-4/CD137ヘテロタンデムがCD137レポーターアッセイで強力なC
D137活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株(HT1376
:ネクチン-4高およびNCI-H292:ネクチン-4中)上の腫瘍標的発現レベルに
依存することを示すデータが図6に示される。
D137活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株(HT1376
:ネクチン-4高およびNCI-H292:ネクチン-4中)上の腫瘍標的発現レベルに
依存することを示すデータが図6に示される。
PD-L1/CD137ヘテロタンデムが、PD-L1発現細胞株の存在下、CD13
7レポーターアッセイでCD137の強力な活性化を誘導することを示すデータが図9に
示される。様々な細胞株との共培養においてCD137レポーターアッセイでヘテロタン
デムペプチドによって誘導されるEC50(nM)および誘導倍率の概要を以下の表5に
報告する。
7レポーターアッセイでCD137の強力な活性化を誘導することを示すデータが図9に
示される。様々な細胞株との共培養においてCD137レポーターアッセイでヘテロタン
デムペプチドによって誘導されるEC50(nM)および誘導倍率の概要を以下の表5に
報告する。
5.初代ヒトT細胞-A549共培養(腫瘍細胞殺傷)
3人の健康なドナーからPBMCを単離し、2つの濃度で、抗CD3刺激の存在下、2
つの規定比で、Nuclight Red標識腫瘍標的細胞(ヒト肺癌細胞A549(登
録商標)、ATCC CLL-185(商標))に添加した。腫瘍細胞:PBMC共培養
物を3つの濃度で、リード二環と共にインキュベートした。直接的な腫瘍細胞への細胞傷
害性を検出するために、全ての試験条件を、刺激されたPBMCの非存在下で、腫瘍細胞
に蒔いた。経時的に生存Nucelight red陽性腫瘍細胞を計数することによっ
て、腫瘍殺傷を評価した。さらに、カスパーゼ3/7色素を使用して、アポトーシス性腫
瘍細胞を特定した。リアルタイム生細胞蛍光イメージングを可能にするIncuCyte
S3機械を使用して、培養物を分析した。共培養物を72時間画像化した。各条件を3
連で確立した。
3人の健康なドナーからPBMCを単離し、2つの濃度で、抗CD3刺激の存在下、2
つの規定比で、Nuclight Red標識腫瘍標的細胞(ヒト肺癌細胞A549(登
録商標)、ATCC CLL-185(商標))に添加した。腫瘍細胞:PBMC共培養
物を3つの濃度で、リード二環と共にインキュベートした。直接的な腫瘍細胞への細胞傷
害性を検出するために、全ての試験条件を、刺激されたPBMCの非存在下で、腫瘍細胞
に蒔いた。経時的に生存Nucelight red陽性腫瘍細胞を計数することによっ
て、腫瘍殺傷を評価した。さらに、カスパーゼ3/7色素を使用して、アポトーシス性腫
瘍細胞を特定した。リアルタイム生細胞蛍光イメージングを可能にするIncuCyte
S3機械を使用して、培養物を分析した。共培養物を72時間画像化した。各条件を3
連で確立した。
EphA2/CD137ヘテロタンデムが、初代ヒトT細胞およびがん細胞共培養アッ
セイで腫瘍細胞への細胞殺傷を誘導することを実証するデータが図5に示される。抗CD
137 mAbアゴニストを対照として使用する。
セイで腫瘍細胞への細胞殺傷を誘導することを実証するデータが図5に示される。抗CD
137 mAbアゴニストを対照として使用する。
6.ヒトPBMC-4T1共培養(サイトカイン放出)アッセイ
マウス乳腺腫瘍細胞株4T1-1(4T1-親)およびマウスネクチン-4過剰発現4
T1(4T1-D02)を、10%熱失活ウシ胎児血清、100I.U/mlペニシリン
および100I.U/ストレプトマイシン、20mM HEPES、1×非必須アミノ酸
および2mM L-グルタミンを補充したRPMI1640(RPMI作業培地)で培養
した。健康なヒトドナー由来の凍結PBMCを解凍し、室温PBS中で1回洗浄し、次い
で、RPMI作業培地に再懸濁した。腫瘍細胞およびPBMC共培養物について、100
00個PBMCおよび2000個腫瘍細胞(5:1)を混合し、384ウェルプレートの
各ウェルに蒔いた。ヒトPBMCを刺激するために、125ng/mlの可溶性抗CD3
mAb(クローンOKT3)を0日目に培養物に添加した。試験化合物、対照化合物ま
たはビヒクル対照をそれぞれのウェルに添加し、1ウェル当たりの最終体積を100μl
にした。プレートを5%CO2で、37℃細胞培養インキュベーターで最大3日間インキ
ュベートした。上清を刺激48時間後に回収し、HTRFアッセイを使用して、ヒトIL
-2およびIFNγを検出した。ExcelまたはPrismソフトウェアを使用して生
データを分析して、標準曲線を作成して、タンパク質濃度を内挿した。データは、2連で
、実験で試験した3人の異なるドナーのPBMCを使用した1つの試験を表す。
マウス乳腺腫瘍細胞株4T1-1(4T1-親)およびマウスネクチン-4過剰発現4
T1(4T1-D02)を、10%熱失活ウシ胎児血清、100I.U/mlペニシリン
および100I.U/ストレプトマイシン、20mM HEPES、1×非必須アミノ酸
および2mM L-グルタミンを補充したRPMI1640(RPMI作業培地)で培養
した。健康なヒトドナー由来の凍結PBMCを解凍し、室温PBS中で1回洗浄し、次い
で、RPMI作業培地に再懸濁した。腫瘍細胞およびPBMC共培養物について、100
00個PBMCおよび2000個腫瘍細胞(5:1)を混合し、384ウェルプレートの
各ウェルに蒔いた。ヒトPBMCを刺激するために、125ng/mlの可溶性抗CD3
mAb(クローンOKT3)を0日目に培養物に添加した。試験化合物、対照化合物ま
たはビヒクル対照をそれぞれのウェルに添加し、1ウェル当たりの最終体積を100μl
にした。プレートを5%CO2で、37℃細胞培養インキュベーターで最大3日間インキ
ュベートした。上清を刺激48時間後に回収し、HTRFアッセイを使用して、ヒトIL
-2およびIFNγを検出した。ExcelまたはPrismソフトウェアを使用して生
データを分析して、標準曲線を作成して、タンパク質濃度を内挿した。データは、2連で
、実験で試験した3人の異なるドナーのPBMCを使用した1つの試験を表す。
図7に示されるデータは、ネクチン-4/CD137ヘテロタンデムがPBMC-4T
1共培養アッセイで堅牢なIL-2およびIFN-γサイトカイン分泌を誘導することを
実証している。BCY9350およびBCY9351は、それぞれネクチン-4およびC
D137についての非結合対照である。
1共培養アッセイで堅牢なIL-2およびIFN-γサイトカイン分泌を誘導することを
実証している。BCY9350およびBCY9351は、それぞれネクチン-4およびC
D137についての非結合対照である。
ヒトPBMC-4T1共培養(サイトカイン放出)アッセイで選択されたネクチン-4
/CD137ヘテロタンデムペプチドによって誘導されるEC50(nM)および最大I
FN-γサイトカイン分泌(pg/ml)の概要を以下の表6に報告する。
/CD137ヘテロタンデムペプチドによって誘導されるEC50(nM)および最大I
FN-γサイトカイン分泌(pg/ml)の概要を以下の表6に報告する。
7.エキソビボ培養プロトコル
Discovery Life Sciences(DLS)製の初代患者由来腫瘍細
胞を、Benzonaseを新たに添加した10mL予熱洗浄培地中で穏やかに解凍する
。Greiner製の3Dスフェロイドキット(カタログ番号655840)を使用して
、培養中の細胞を2日間維持する。手短に言えば、腫瘍細胞を、血球計数器を使用してト
リパンブルーで計数する。細胞を1500rpmで5分間遠心分離して洗浄し、ペレット
を、1×106個細胞当たり100μLのN3Dナノシャトルに再懸濁する。これらを磁
性にするために、細胞を1500rpmで5分間遠心沈殿し、再懸濁する;このプロセス
を合計4回繰り返す。最後の遠心後、細胞を適量の新鮮な肺DTC培地(DLS)に再懸
濁して、100μL/ウェルで1ウェル当たり50000~100000個の細胞を得る
。Greiner製のセルリペレント(cell-repellent)96ウェルプレ
ート(カタログ番号655976)をこの実験に使用する。目に見える細胞塊または細胞
片が存在する場合、試料を蒔く前に70~100μmフィルターに適用する。1試料当た
り少なくとも50000個の細胞を0日目のフローサイトメトリーパネルのために取って
おき、これらの細胞を染色し、固定し、後のフロー分析のために4℃で保管する。対照/
試験化合物希釈物を、肺DTC培地中2倍で別々のプレートに調製し、100μL/ウェ
ルのこれらの2×薬物溶液をプレートマップによって記載されるようにウェルに添加する
。次いで、アッセイプレートを、37℃、5%CO2の加湿チャンバー中、96ウェル磁
気スフェロイドドライブに置く。24時間で、磁気スフェロイドドライブを除去する。4
8時間で、培地をサイトカイン分析のために回収し、細胞を2日目のフローサイトメトリ
ーパネルのために回収する。Luminexリーダーで、R&D systems製のカ
スタムビルドサイトカイン/ケモカインパネル(IP-10、グランザイムB、IFNγ
、IL-2、IL-6、TNFα、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、MCP-1
、IL-10、MIG)を使用して、サイトカインを定量化する。フローパネル:0日目
=生/死、CD45、EpCAM、ネクチン4、CD3、CD4、CD8、CD137;
2日目=生/死、CD45、EpCAM、ネクチン4、CD3、CD8、Ki67、およ
び計数ビーズ。フローデータをFlowjoソフトウェアで分析する。
Discovery Life Sciences(DLS)製の初代患者由来腫瘍細
胞を、Benzonaseを新たに添加した10mL予熱洗浄培地中で穏やかに解凍する
。Greiner製の3Dスフェロイドキット(カタログ番号655840)を使用して
、培養中の細胞を2日間維持する。手短に言えば、腫瘍細胞を、血球計数器を使用してト
リパンブルーで計数する。細胞を1500rpmで5分間遠心分離して洗浄し、ペレット
を、1×106個細胞当たり100μLのN3Dナノシャトルに再懸濁する。これらを磁
性にするために、細胞を1500rpmで5分間遠心沈殿し、再懸濁する;このプロセス
を合計4回繰り返す。最後の遠心後、細胞を適量の新鮮な肺DTC培地(DLS)に再懸
濁して、100μL/ウェルで1ウェル当たり50000~100000個の細胞を得る
。Greiner製のセルリペレント(cell-repellent)96ウェルプレ
ート(カタログ番号655976)をこの実験に使用する。目に見える細胞塊または細胞
片が存在する場合、試料を蒔く前に70~100μmフィルターに適用する。1試料当た
り少なくとも50000個の細胞を0日目のフローサイトメトリーパネルのために取って
おき、これらの細胞を染色し、固定し、後のフロー分析のために4℃で保管する。対照/
試験化合物希釈物を、肺DTC培地中2倍で別々のプレートに調製し、100μL/ウェ
ルのこれらの2×薬物溶液をプレートマップによって記載されるようにウェルに添加する
。次いで、アッセイプレートを、37℃、5%CO2の加湿チャンバー中、96ウェル磁
気スフェロイドドライブに置く。24時間で、磁気スフェロイドドライブを除去する。4
8時間で、培地をサイトカイン分析のために回収し、細胞を2日目のフローサイトメトリ
ーパネルのために回収する。Luminexリーダーで、R&D systems製のカ
スタムビルドサイトカイン/ケモカインパネル(IP-10、グランザイムB、IFNγ
、IL-2、IL-6、TNFα、IL-8、MIP-1a、MIP-1b、MCP-1
、IL-10、MIG)を使用して、サイトカインを定量化する。フローパネル:0日目
=生/死、CD45、EpCAM、ネクチン4、CD3、CD4、CD8、CD137;
2日目=生/死、CD45、EpCAM、ネクチン4、CD3、CD8、Ki67、およ
び計数ビーズ。フローデータをFlowjoソフトウェアで分析する。
図8に示されるデータは、ネクチン-4/CD137ヘテロタンデムが、初代患者由来
肺腫瘍のエキソビボ培養物中で標的依存性サイトカイン放出を誘導することを実証してい
る。BCY10572の処理によって、患者由来試料において、いくつかの免疫マーカー
(ビヒクルに対して正規化)およびCD8+ki67+T細胞%のネクチン-4依存性変
化が誘導された。
肺腫瘍のエキソビボ培養物中で標的依存性サイトカイン放出を誘導することを実証してい
る。BCY10572の処理によって、患者由来試料において、いくつかの免疫マーカー
(ビヒクルに対して正規化)およびCD8+ki67+T細胞%のネクチン-4依存性変
化が誘導された。
8.SDラットにおけるCD137二重特異性の薬物動態
雄SDラットに、25mMヒスチジンHCl、10%スクロース pH7に製剤化され
た2mg/kgの各二環多量体を投与した。各時点で、顎下または伏在静脈を介して、連
続出血(約80μL血液/時点)を実施した。全ての血液試料を直ちに抗凝固剤として2
μL K2-EDTA(0.5M)を含有する予冷マイクロ遠心チューブに移し、湿潤氷
上に置いた。血液試料を、およそ4℃、3000gでの遠心分離によって、血漿のために
直ちに処理した。内部標準を含む沈殿剤を直ちに血漿に添加し、十分混合し、12000
rpm、4℃で10分間遠心分離した。上清を予め標識したポリプロピレンマイクロ遠心
チューブに移し、次いで、ドライアイス上で急速凍結した。試料を分析まで必要に応じて
70℃以下で保管した。上清試料7.5μLを、正イオンモードでOrbitrap Q
Exactiveを使用して、LC-MS/MS分析のために直接注入して、二環多量
体の濃度を決定した。Phoenix WinNonlin 6.3ソフトウェアプログ
ラムを使用して、非コンパートメントアプローチによって時間に対する血漿濃度データを
分析した。C0、Cl、Vdss、T1/2、AUC(0-last)、AUC(0-i
nf)、MRT(0-last)、MRT(0-inf)および時間に対する血漿濃度プ
ロファイルのグラフを報告した。
雄SDラットに、25mMヒスチジンHCl、10%スクロース pH7に製剤化され
た2mg/kgの各二環多量体を投与した。各時点で、顎下または伏在静脈を介して、連
続出血(約80μL血液/時点)を実施した。全ての血液試料を直ちに抗凝固剤として2
μL K2-EDTA(0.5M)を含有する予冷マイクロ遠心チューブに移し、湿潤氷
上に置いた。血液試料を、およそ4℃、3000gでの遠心分離によって、血漿のために
直ちに処理した。内部標準を含む沈殿剤を直ちに血漿に添加し、十分混合し、12000
rpm、4℃で10分間遠心分離した。上清を予め標識したポリプロピレンマイクロ遠心
チューブに移し、次いで、ドライアイス上で急速凍結した。試料を分析まで必要に応じて
70℃以下で保管した。上清試料7.5μLを、正イオンモードでOrbitrap Q
Exactiveを使用して、LC-MS/MS分析のために直接注入して、二環多量
体の濃度を決定した。Phoenix WinNonlin 6.3ソフトウェアプログ
ラムを使用して、非コンパートメントアプローチによって時間に対する血漿濃度データを
分析した。C0、Cl、Vdss、T1/2、AUC(0-last)、AUC(0-i
nf)、MRT(0-last)、MRT(0-inf)および時間に対する血漿濃度プ
ロファイルのグラフを報告した。
図10は、SDラット(n=3)における2mg/kg IV投与からのBCY105
72およびBCY10000の時間に対する血漿濃度の曲線を示す。実験からの薬物動態
パラメータは、表7に示される通りである。
72およびBCY10000の時間に対する血漿濃度の曲線を示す。実験からの薬物動態
パラメータは、表7に示される通りである。
Claims (29)
- (a)免疫細胞上に存在する成分に結合する第1のペプチドリガンドであって、
(b)がん細胞上に存在する成分に結合する第2のペプチドリガンドにリンカーを介し
てコンジュゲートされた、第1のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも2つのループ配列によって分離された、少
なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも2つのポリペプチドル
ープが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成
する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記免疫細胞が、白血球;リンパ球(例えば、Tリンパ球もしくはT細胞、B細胞また
はナチュラルキラー細胞);CD8またはCD4;CD8;樹状細胞、濾胞樹状細胞およ
び顆粒球から選択される、請求項1に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 免疫細胞上に存在する前記成分がCD137である、請求項1または2に記載のヘテロ
タンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記第1のペプチドリガンドがCD137結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項
1から3のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記CD137結合二環式ペプチドリガンドが、
CiIEEGQYCiiFADPY[Nle]Ciii(配列番号1);
Ci[tBuAla]PE[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号3);
CiIEEGQYCiiF[D-Ala]DPY[Nle]Ciii(配列番号4);
Ci[tBuAla]PK[D-Ala]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号5);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys]PYCiiFADPY[Nle]Ciii(配
列番号6);
Ci[tBuAla]P[K(PYA)][D-Ala]PYCiiFADPY[Nle
]Ciii(配列番号7);
Ci[tBuAla]PE[D-Lys(PYA)]PYCiiFADPY[Nle]C
iii(配列番号8);
CiIEE[D-Lys(PYA)]QYCiiFADPY(Nle)Ciii(配列番
号9);および
[dCi][dI][dE][dE][K(PYA)][dQ][dY][dCii][
dF][dA][dD][dP][dY][dNle][dCiii](配列番号10)
;
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、Nleはノルロイシンを表し、tBuAlaはt-ブチル-アラニンを表し、P
YAは4-ペンチン酸を表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項4に記載の
ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記CD137結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾およびC末端修飾を含み、
Ac-A-(配列番号1)-Dap(以下、BCY7732と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号1)-Dap(PYA)(以下、BCY7741と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(以下、BCY9172と呼ぶ);
Ac-(配列番号3)-Dap(PYA)(以下、BCY11014と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号4)-Dap(以下、BCY8045と呼ぶ);
Ac-(配列番号5)-A(以下、BCY8919と呼ぶ);
Ac-(配列番号6)-A(以下、BCY8920と呼ぶ);
Ac-(配列番号7)-A(以下、BCY8927と呼ぶ);
Ac-(配列番号8)-A(以下、BCY8928と呼ぶ);
Ac-A-(配列番号9)-A(以下、BCY7744と呼ぶ);および
Ac-[dA]-(配列番号10)-[dA]-NH2(以下、BCY11506と呼ぶ
);
(式中、Acはアセチル基を表し、Dapはジアミノプロピオン酸を表し、PYAは4-
ペンチン酸を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項5に記載のヘテロタンデム二環式ペプチ
ド複合体。 - 前記がん細胞が、HT1080、SC-OV-3、PC3、H1376、NCI-H2
92、LnCap、MC38およびRKO腫瘍細胞から選択される、請求項1から6のい
ずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - がん細胞上に存在する前記成分がEphA2である、請求項1から7のいずれか1項に
記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記第2のペプチドリガンドがEphA2結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項
1から8のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(配列番号2)
;および
CiLWDPTPCiiANLHL[HArg]Ciii(配列番号11);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HyPはヒドロキシプロリンを表し、dDはD配置のアスパラギン酸を表し、H
Argはホモアルギニンを表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項9に記載の
ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記EphA2結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾を含み、
A-HArg-D-(配列番号2)(以下、BCY9594と呼ぶ);
[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)(以下、BC
Y6099と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-A-[HArg]-D-(配列番号2)
(以下、BCY6169と呼ぶ);および
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-VGP-(配列番号11)(以下、BC
Y8941と呼ぶ);
(式中、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表し、B-Alaはβ-アラニンを表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項10に記載のヘテロタンデム二環式ペプ
チド複合体。 - BCY9173、BCY7985、BCY8942、BCY8943、BCY9647
、BCY9648、BCY9655、BCY9656、BCY9657、BCY9658
、BCY9659、BCY9758、BCY10568、BCY10570、BCY10
574、BCY10575、BCY10576およびBCY10577から選択されるC
D137/EphA2複合体である、請求項9から11のいずれか1項に記載のヘテロタ
ンデム二環式ペプチド複合体。 - がん細胞上に存在する前記成分がPD-L1である、請求項1から7のいずれか1項に
記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記第2のペプチドリガンドがPD-L1結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項
1から7および13のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記PD-L1結合二環式ペプチドリガンドが、
Ci[HArg]DWCiiHWTFSHGHPCiii(配列番号12);
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii(配列番号13);および
CiSAGWLTMCiiQ[K(PYA)]LHLCiii(配列番号14);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、HArgはホモアルギニンを表し、PYAは4-ペンチン酸を表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項14に記載
のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記PD-L1結合二環式ペプチドリガンドが、N末端修飾および/またはC末端修飾
を含み、
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号12)(以下、BCY893
8と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-SDK-(配列番号13)(以下、BC
Y10043と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号13)-[Sar10]-[K(PYA)](以下、BCY
10044と呼ぶ);
NH2-SDK-(配列番号14)(以下、BCY10045と呼ぶ);および
Ac-SDK-(配列番号14)-PSH(以下、BCY10861と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項15に記載のヘテロタンデム二環式ペプ
チド複合体。 - BCY8939、BCY10580、BCY10581、BCY10582、BCY1
1017、BCY11018、BCY11019、BCY11376、BCY11377
、BCY11378、BCY11379、BCY11380およびBCY11381から
選択されるCD137/PD-L1複合体である、請求項14から16のいずれか1項に
記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - がん細胞上に存在する前記成分がネクチン-4である、請求項1から7のいずれか1項
に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記第2のペプチドリガンドがネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求
項1から7および18のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記ネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドが、
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配
列番号15;以下、BCY8116と呼ぶ);
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]D[dW]STP[HyP][dW]
Ciii(配列番号16;以下、BCY11415と呼ぶ);および
CiP[1Nal][dK](Sar10-(B-Ala))CiiM[HArg]DW
STP[HyP]WCiii(配列番号17);
CiPFGCiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(配列番号18;以下
、BCY11414と呼ぶ);
(式中、Ci、CiiおよびCiiiはそれぞれ第1、第2および第3のシステイン残基
を表し、1Nalは1-ナフチルアラニンを表し、HArgはホモアルギニンを表し、H
yPはヒドロキシプロリンを表し、Sar10は10個のサルコシン単位を表し、B-A
laはβ-アラニンを表す)
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項19に記載
のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記ネクチン-4結合二環式ペプチドリガンドが、場合により、N末端修飾を含み、
配列番号15(以下、BCY8116と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号15)(以下、BCY884
6と呼ぶ);
配列番号16(以下、BCY11415と呼ぶ);
[PYA]-[B-Ala]-[Sar10]-(配列番号16)(以下、BCY119
42と呼ぶ);
Ac-(配列番号17)(以下、BCY8831と呼ぶ);および
配列番号18(以下、BCY11414と呼ぶ);
(式中、PYAは4-ペンチン酸を表し、B-Alaはβ-アラニンを表し、Sar10
は10個のサルコシン単位を表す)
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項20に記載のヘテロタンデム二環式ペプ
チド複合体。 - BCY8854、BCY9350、BCY9351、BCY9399、BCY9400
、BCY9401、BCY9403、BCY9405、BCY9406、BCY9407
、BCY9408、BCY9409、BCY9410、BCY9411、BCY9759
、BCY10000、BCY10567、BCY10569、BCY10571、BCY
10572、BCY10573、BCY10578、BCY10917、BCY1102
0、BCY11373、BCY11374、BCY11375、BCY11616、BC
Y11617、BCY11857、BCY11858およびBCY11859から選択さ
れるCD137/ネクチン-4複合体である、請求項19から21のいずれか1項に記載
のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - がん細胞上に存在する前記成分がPSMAである、請求項1から7のいずれか1項に記
載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記第2のペプチドリガンドがPSMA結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項1
から7および23のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記リンカーが、-CH2-、-PEG5-、-PEG10-、-PEG12-、-P
EG23-、-PEG24-、-PEG15-Sar5-、-PEG10-Sar10-
、-PEG5-Sar15-、-PEG5-Sar5-、-B-Ala-Sar20-、
-B-Ala-Sar10-PEG10-、-B-Ala-Sar5-PEG15-およ
びB-Ala-Sar5-PEG5-から選択される、請求項1から24のいずれか1項
に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記分子足場が1,1’,1’’-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイ
ル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)から選択される、請求項1から25の
いずれか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。 - 前記薬学的に許容される塩が、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アン
モニウム塩から選択される、請求項1から26のいずれか1項に記載のヘテロタンデム二
環式ペプチド複合体。 - 1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、請求項1から27のいず
れか1項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体を含む医薬組成物。 - がんの予防、抑制または治療に使用するための、請求項1から27のいずれか1項に記
載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
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