CN115819618B - 一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂pancid及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用,属于细胞调控技术领域。为了提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂,用于光调控胞内蛋白功能。本发明提供的诱导剂是由一个纳米抗体和一个光笼保护的小分子配体偶联及与胞内递送模组连接而成的。在诱导剂进入细胞之后,在光照下光笼保护基被脱除,释放出有活性的纳米抗体—小分子配体偶联物,进而诱导胞内二聚化而实现光调控胞内进程。
Description
技术领域
本发明属于细胞调控技术领域,具体涉及一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID及其应用。
背景技术
光调控细胞进程具有无与伦比的时间分辨率和空间分辨率,尤其适合调控和解析快速动态的胞内进程以及实现亚细胞分辨率的胞内进程的调控。目前与之最相近的技术是化学光遗传技术(chemo-optogenetics,COG)包括光激活的化学诱导二聚化技术(photoactivatable chemically induced dimerization,PA-CID)等。化学诱导二聚化如图1中的A所示,是通过一个容易穿膜的化学小分子在胞内引起两个蛋白的二聚化进而调控诸多胞内进程的;而光激活的化学诱导二聚化技术如图1中的B所示是通过对化学小分子进行结构修饰,使之接上一个光笼保护基团,光笼保护基团使得这个二聚化小分子暂时不能诱导蛋白质的二聚,而在光照之后,光笼保护基在光照下被脱除,释放出具有活性的二聚化CID分子进而诱导胞内蛋白的二聚从而实现对胞内进程的光调控。化学光遗传的概念更广一些,但是本质上也是基于光响应的化学小分子结合对细胞的遗传修饰而实现对细胞进程的光调控,化学光遗传技术可以认为是化学版本的光遗传(optogenetics)技术。光激活的化学诱导二聚化方法是化学光遗传技术的重要组成部分。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂,用于光调控荧光蛋白嵌合体的胞内功能。所谓偶联物(conjugates),一般指生物大分子与化学小分子相连接的产物,例如在本发明中就是指生物分子纳米抗体(>10kD)与小分子配体相连接的产物。
本发明提供一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂(photoactivatablenanobody-conjugate inducers of dimerization,PANCID),所述诱导剂PANCID是由以下部件组成:胞内递送模组、连接子、纳米抗体、小分子配体和光笼结构。其中光笼保护的小分子配体与纳米抗体偶联之后能够具有诱导胞内蛋白二聚的作用,即诱导纳米抗体所结合的靶标蛋白与小分子配体所结合的蛋白标签的二聚化,这个二聚化过程可以被用于调控诸多胞内进程和细胞活性;而胞内递送模组和连接子的作用是使纳米抗体偶联物能够良好地穿膜进入细胞内,进而能够实现对细胞内(胞内)进程的调控;光笼的作用使让小分子配体暂时不能结合相应的蛋白标签,而只有等光笼脱除,小分子配体复原,进而能够诱导胞内二聚化。诱导胞内二聚化是一种通用型的调控细胞进程和蛋白功能的策略,例如前面所提到的CID技术,以及光遗传二聚化工具等等。
进一步地限定,所述胞内递送模组、连接子、纳米抗体、小分子配体和光笼结构的连接方式为:光笼引入小分子配体上而得到光笼保护的小分子配体,之后再与纳米抗体连接获得偶联物,最后胞内递送模组通过连接子与偶联物连接。
进一步地限定,所述纳米抗体为荧光蛋白纳米抗体或者结合细胞内蛋白靶标的纳米抗体。
进一步地限定,所述小分子配体为蛋白标签结合配体。
进一步地限定,所述小分子配体为TMP。
进一步地限定,所述光笼结构为Nvoc基团。
进一步地限定,所述胞内递送模组为环状跨膜肽。
进一步地限定,所述连接子为肽键、硫醚键、二硫键、酰胺键或PEG链。
本发明提供一种上述的诱导剂PANCID的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下:
步骤S1:合成含有能与蛋白连接的光笼保护的小分子配体;
步骤S2:将步骤S1获得的光笼保护的配体与纳米抗体连接获得偶联了光笼保护的配体的纳米抗体偶联物;
步骤S3:将胞内递送模组与步骤S2获得的纳米抗体偶联物相连接,获得光控诱导剂PANCID。
本发明提供上述的诱导剂PANCID在光调控细胞进程中的应用。
有益效果:在本发明中,引入了光激活的小分子—纳抗偶联物诱导的二聚化(PANCID)技术。PANCID诱导剂包含一个纳米抗体和一个光笼保护的小分子配体偶联而成的基本骨架。由于纳米抗体偶联物本身一般无法进细胞,不能诱导胞内的二聚化过程,所以这个偶联物还携带一个环状跨膜肽的递送模组。环状跨膜肽能够让偶联物高效穿过细胞膜,规避溶酶体途径。环状跨膜肽已经被证明能够高效地将生物大分子如纳米抗体递送进细胞。如图3所示,环状跨膜肽跟纳抗偶联物可以通过二硫键相连,在PANCID诱导剂顺利进入细胞之后,在胞内还原性环境下,二硫键很容易被还原断裂,释放走环状跨膜肽。最后在光照下光笼保护基被脱除,释放出有活性的纳米抗体—小分子配体偶联物,进而诱导胞内二聚化而实现光调控胞内进程。
这个PANCID技术相比于光激活的CID技术有多个优点。首先它可以直接对广泛使用的荧光蛋白所融合的蛋白进行调控,不需要引入额外的结合标签,因而PANCID技术本身就具有通用性。引入额外的融合标签不仅更为费时费力,而且额外的融合标签可能也会对待调控蛋白产生不良影响,例如可能由于由位阻效应使待调控的蛋白的功能失活。目前荧光蛋白已经被广泛应用于生物学和生物医学等研究中,作为一种荧光标签不可或缺,所以很多融合了荧光蛋白的质粒、细胞系等等都能够直接获取,甚至基因编辑的稳转细胞系乃至模式动物都是现成的。因而PANCID手段可以对融合了荧光蛋白的靶标蛋白直接调控,是该技术的一个显著特点。此外,PANCID这种方式还可以实现对内源蛋白的直接光调控,而这个对于光激活的CID技术而言是难以直接实现的,这是因为光激活的CID技术需要遗传修饰而让蛋白接上一个亲和标签,所以不可以直接光调控内源蛋白的功能。
光遗传学也是一个光调控细胞进程的技术。显而易见,光遗传学也不可以直接调控荧光蛋白的功能,而是需要额外引入一个光响应的植物光受体或者其它的光敏蛋白。此外,光遗传学技术尽管被广泛使用,其本身也有诸多缺点的。例如其所诱导的二聚化的动态范围偏窄,其光调控的光谱与不少荧光蛋白的吸收光谱重叠,进而限制了多色成像。另外,大部分光遗传二聚化工具本质上还是调控ON和OFF两种状态间的一种平衡,换句话说是一种上调和下调的过程,还不是真正的激活和去激活的过程,因此不管是光激活还是光去激活都会有不少的背景活性。而PANCID技术基本上可以规避所有这些缺点。由于PANCID技术基于抗体和抗原之间的相互做作用,这种互作具有很高的特异性和亲和力,因此能够实现最彻底的光调控,以及极少的脱靶效应。
附图说明
图1:化学诱导的二聚化和光激活的化学诱导的二聚化的原理示意图;其中,A是化学诱导的二聚化,B是光激活的化学诱导的二聚化。
图2:PANCID光激活二聚化诱导剂的结构示意图,包含纳米抗体结合部,光笼保护的小分子配体,胞内递送模组和连接子四个部分。
图3:PANCID二聚化纳抗偶联物在进入细胞后诱导临近效应和调控胞内进程的原理图;
图4:CysTMP(Nvoc)的化学结构式和Cys-cR10*的化学结构式;其中,A是:CysTMP(Nvoc)的化学结构式,B是:CysTMP(Nvoc)的化学结构式的简写示意图;C是Cys-cR10*的化学结构式,D是Cys-cR10*的简写示意图。
图5:通过表达蛋白连接EPL以及二硫键化反应制备cRGTN的流程图和结果图,A为通过表达蛋白连接EPL以及二硫键化反应制备cRGTN的流程图,B为EPL连接反应的产物胶图,C为SEC纯化的胶图,D为终产物cRGTN的胶图。
图6:cRGTN可以实现光激活诱导mScarlet-eDHFR在细胞里的定位过程;其中,A为用于细胞转染的双顺反质粒的基因元件示意图,B为cRGTN的结构示意图,C为cRGTN进入细胞之后,通过光激活将mScarlet-eDHFR从胞浆定位到线粒体表面的EGFP-mito的示意图,D为光激活的细胞共聚焦显微成像示意图。
图7:cRGTN可以实现光激活Rac1所诱导的细胞伪足形成过程;其中,A为原理示意图,其中Rac1是Rac1Q61LΔCAAX的缩写,表示缺乏了CAAX序列(ΔCAAX),具有活性的突变体(Q61L突变)的Rac1蛋白;B为cRGTN进入细胞之后,通过光激活将EGFP-Rac1Q61LΔCAAX从胞浆定位到细胞膜,进而激活细胞伪足(细胞变大,并产生膜皱褶)的共聚焦显微照片;C为光激活之前,光激活7.5s后,以及光激活120s后的激光共聚焦显微照片;D为显示光激活细胞伪足之后细胞覆盖面积增加。
图8:cRGTN可以实现光激活Tiam1蛋白;其中,A为原理示意图,其中Tiam1代表Tiam1(DHPH),即Tiam1的DHPH结构域,它是Rac1的GTP交换因子(GEF因子),当它被定位到细胞膜表面之后,就能够激活Rac而产生相应的信号级联转导过程,B为cRGTN进入细胞之后,通过光激活将mCherry-eDHFR-Tiam1从胞浆定位到细胞膜的共聚焦显微照片,C为光激活之前(Pre),光激活25s后,以及光激活120s后的激光共聚焦显微照片,显示出跟光激活Rac1不一样的调控效果,D显示细胞膜的局部区域,细胞膜产生了小泡,意味着这个光调控过程可能还产生了细胞凋亡迹象。
图9:cRGTN可以实现局部光激活Rac1在细胞膜的功能,诱导局部的细胞伪足形成;其中,A为原理示意图,B为cRGTN进入细胞之后,通过局部光激活将EGFP-Rac1Q61LΔCAAX从胞浆定位到细胞膜的某一区域,进而激活该区域的细胞伪足形成(细胞变大,并产生膜皱褶)的共聚焦显微照片,C为光激活之前,光激活15s后,以及光激活120s后的激光共聚焦显微照片,D为显示光激活细胞伪足之后的局部区域细胞覆盖面积增加,同时产生细胞皱褶;
图10:制备合成新的调控红色荧光蛋白mCherry的PANCID二聚化诱导剂—cR10*-RBP-TMP(Nvoc),即cRRTN,用于光调控蛋白到mCherry-mito所在细胞器上的定位过程,说明cRRTN可以实现光调控mCherry蛋白与eDHFR之间的二聚化过程;其中,A为cRRTN的结构示意图,B为cRRTN进入细胞之后,通过光激活将EGFP-eDHFR从胞浆定位到线粒体表面的mCherry-mito的示意图,C为光激活的细胞共聚焦显微成像示意图。
具体实施方式
Cys-TMP(Nvoc)的合成与表征:
反应流程式1.Synthetic schemetoward Cys-TMP(Nvoc).Abbreviations:DIEA,N,N-diisopropylethylamine;RT,room temperature;ON,overnight;TFA,trifluoroacetic acid;DCM,dichloromethane;HBTU,2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate;DMF,N,N-dimethylformamide;TIS,triisopropylsilane.
TMP-Bu-NHBoc(4):将TMP-OH(400mg,1.44mmol)与(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(383.4mg,1.52mmol)、NaI(216mg,1.44mmol)以及Cs2CO3(985.8mg,3.02mmol)合并混合于一个置有一个磁力搅拌子的双口圆底烧瓶中,之后加入无水DMF(7.2mL,0.1M)作为溶剂。反应混合物于室温搅拌过夜以完成反应。减压旋干DMF溶剂(2mbar,50℃),之后再进行后处理。旋干后的粗产物分配进EtOAc/Na2CO3(aq)中,分出有机层,之后水层再用EtOAc萃取两次。合并所有的有机层,用少量体积的饱和氯化钠水溶液洗两次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩,硅胶柱层析(DCM:MeOH 15:1)得到370mg淡黄色固体(4),产率57%。TLC(HCl3:MeOH 6:1)Rf0.4;1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ7.50(s,1H),6.80(t,J=5.88Hz,2H),6.54(s,2H),6.15(s,br,2H),5.75(s,br,2H),3.76(t,2H,J=6.15),3.70(s,6H),3.51(s,2H),2.94(q,J=6.54Hz,2H),1.55(m,2H),1.50(m,2H),1.37(s,9H);13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):δ162.27,161.96,155.62,155.13,152.87,135.62,134.8,105.91,105.82,77.33,72.04,55.83,39.58,32.97,28.30,27.04,26.13;HRMS(ESI):C22H34N5O5 +[M+H]+,calcd.448.2560,found448.2559.
N4-NvocTMP-NHBoc(5):将TMP-Bu-NHBoc(370mg,0.83mmol)、Nvoc-Cl(250.6mg,0.91mmol)以及DIEA(117.3mg,1.82mmol)合并混合于一个置有一个磁力搅拌子的双口圆底烧瓶中,之后加入无水DCM(8.3mL,0.1M)作为溶剂。反应混合物于室温搅拌过夜以完成反应。减压旋干DCM溶剂后进行后处理。将旋干后的粗产物分配进EtOAc/Na2CO3(aq)中,分出有机层,之后水层再用EtOAc萃取两次。合并所有的有机层,用少量体积的饱和氯化钠水溶液洗两次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩,梯度硅胶柱层析(MeOH:DCM依次1%,3%)得到78.4mg淡黄色固体(5),产率14%。TLC(DCM:MeOH 20:1)Rf 0.3;1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ9.78(s,1H),8.03(s,1H),7.72(s,1H),7.22(s,1H),6.79(t,J=5.76Hz,1H),6.47(s,1H),6.41(s,1H),5.41(s,2H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.72(s,2H),3.70(t,J=6.48Hz,2H),3.64(s,6H),2.93(q,J=6.42Hz,2H),1.53(m,2H),1.47(m,2H),1.36(s,9H);13C-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ170.38,162.47,160.20,156.52,155.61,153.38,152.89,152.68,147.87,139.33,135.54,134.80,126.98,114.76,110.84,108.19,105.62,77.32,71.99,63.22,59.79,56.22,56.12,55.67,39.58,33.36,28.29,27.03,26.11,20.80,14.11;HRMS(ESI):C32H43N6O11 +[M+H]+,calcd.687.2990,found 687.2990.
NvocTMP-PEG8-NHBoc(8):首先需要进行Boc基团脱保护而得到中间产物NvocTMP-NH2·nTFA。向NvocTMP-NHBoc(95.3mg,0.14mmol)中按2:1的比例依次加入无水DCM(2mL)和TFA(1mL)于室温搅拌反应20min以完成脱保护。减压浓缩除去大部分DCM和TFA,再真空干燥。然后向固体粗产物中加入少量甲醇,再用真空泵抽干,如此重复3次以尽量除去残余的TFA,无需后续纯化以定量收率得到122.5mg黄色粉末状固体中间产物(可计算出n=2.6),无需进一步纯化即可直接用于下步偶联反应。之后将NvocTMP-NH2.nTFA(122mg,0.14mmol)、Boc-NH-PEG8-COOH(118.7mg,0.219mmol)和HBTU(87.2mg,0.23mmol)合并混合于一个放有一个磁力搅拌子的双颈圆底烧瓶中,加入无水DMF(2.1mL,0.1M)作为溶剂,最后加入DIEA(107.8mg,142μL,0.836mmol),反应混合物于室温搅拌过夜以完成反应。减压旋干DMF溶剂(2mbar,50℃),之后进行后处理。旋干后的产物分配进EtOAc/Na2CO3(aq)中,分出有机层,之后水层再用EtOAc萃取两次。合并所有的有机层,用少量体积的饱和氯化钠水溶液洗两次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩,硅胶柱层析(DCM:MeOH 30:1冲出杂点,20:1得到产物)得到119mg黄色油状产物(8),产率77%。TLC(DCM:MeOH 15:1)Rf 0.3;1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ9.78(s,1H),8.02(s,1H),7.81(t,J=5.76Hz,1H),7.72(s,1H),7.22(s,1H),6.76(t,J=5.76Hz,1H),6.48(s,2H),6.42(s,2H),5.76(s,2H),5.41(s,2H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.71(s,2H),3.70(t,J=6.3Hz,2H),3.64(s,6H),3.58(t,J=6.96Hz,2H),3.45-3.52(m,28H),3.36(t,J=6.18Hz,2H),3.05(t,m,4H),2.29(t,J=6.0Hz,2H),1.55(m,2H),1.51(m,2H),1.36(s,9H);13C-NMR(DMDO-d6,151MHz):δ169.85,162.42,160.11,156.56,155.60,153.39,152.91,152.67,147.88,139.35,135.54,134.81,126.97,114.74,110.87,108.19,105.63,77.60,71.91,69.79,69.74,69.69,69.54,69.52,69.18,66.92,63.23,56.22,56.13,55.68,38.18,36.18,33.35,28.24,27.11,25.69;HRMS(ESI):C51H80N7O20 +[M+H]+,calcd.1110.5458,found 1110.5455.
BocCys(Trt)-COOSu(11):将BocCys(Trt)-COOH(464mg,1mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺NHS(127mg,1.1mmol)、HBTU(417mg,1.1mmol)和DIEA(206mg,273μL,1.6mmol)合并混合于一个放有一个磁力搅拌子的双口圆底烧瓶中,之后加入无水DCM(10mL,0.1M)作为溶剂。反应混合物于室温搅拌过夜以完成反应。减压旋干DMF溶剂(2mbar,50℃),之后进行后处理。旋干后的产物分配进EtOAc/Na2CO3(aq)中,分出有机层,之后水层再用EtOAc萃取两次。所有有机层合并,用少量体积的饱和氯化钠水溶液洗两次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩,硅胶柱层析(cyclohexane:EtOAc 2:1)得到412mg白色固体(11),产率77%。TLC(cyclohexane:EtOAc 2:1)Rf 0.4;1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ7.70(d,J=8.28Hz,1H),7.38-7.30(m,12H),7.26(m,3H),3.90(m,1H),2.75(s,4H),2.73(m,1H),2.48(m,1H),1.38(s,9H);13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):δ169.69,167.09,154.88,143.98,129.06,128.22,126.96,78.99,66.95,51.70,32.30,28.07,27.56,26.36,25.42,20.79;HRMS(ESI):C31H32N2O6SNa+[M+Na]+,calcd.583.1879,found 583.1877.
BocCys(Trt)-PEG8-TMP(Nvoc)(12):首先需要进行脱保护而得到中间体NvocTMP-PEG8-NH2·nTFA。通过向NvocTMP-NHBoc(110.2mg,0.1mmol)中按2:1的比例依次加入无水DCM(2mL)和TFA(1mL),于室温反应20min以完成脱保护反应,旋干浓缩,再向反应混合物中加入少量甲醇,用真空泵抽干,如此重复3次以尽量除去多余的TFA,以定量收率得到116.2mg黄色油状中间产物(可计算出n=1.4),无需进一步纯化即可用于后续偶联反应。之后将Nvoc-TMP-PEG8-NH2·nTFA(50mg,0.039mmol)、BocCys(Trt)-COOSu(27.5mg,0.049mmol)合并混合于一个放有一个磁力搅拌子的双口圆底烧瓶中,加入无水THF(0.86mL)作为溶剂,最后加入DIEA(22.19mg,0.172mmol)。反应混合物于室温搅拌过夜以完成反应。减压旋干THF溶剂(2mbar,40℃),之后进行后处理。旋干后的产物分配进EtOAc/Na2CO3(aq)中,分出有机层,之后水层再用EtOAc萃取两次。所有有机层合并,用少量体积的饱和氯化钠水溶液洗两次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩,硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 5:1)得到38.2mg淡黄色固体(12),产率67%。TLC(EtOAc:MeOH 5:1):Rf~0.3.1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ9.78(s,1H),8.02(s,1H),7.81(t,J=5.64Hz,1H),7.76(t,J=6.36Hz,1H),7.72(s,1H),7.34-7.30(m,6H),7.29-7.26(m,6H),7.26-7.21(m,4H),6.90(d,J=8.58Hz,1H),6.47(s,2H),6.41(s,2H),5.41(s,2H),3.91(m,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),3.72(s,2H),3.71-3.68(m,2H),3.64(s,6H),3.57(t,J=6.42Hz,2H),3.52-3.43(m,32H),3.17(m,1H),3.11(m,1H),3.06(q,J=6.30Hz,2H),2.28(m,2H),1.54(m,2H),1.52(m,2H),1.36(s,9H);13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):δ170.12,169.85,162.47,160.19,156.53,154.91,153.39,152.91,152.69,147.88,144.34,139.34,135.55,134.81,129.11,128.07,126.98,126.78,114.76,110.86,109.19,105.63,78.37,71.92,69.79,69.74,69.69,69.63,69.55,68.89,66.92,65.86,63.23,59.80,56.23,56.13,55.68,53.39,38.68,38,19,36.18,34.06,33.36,28.15,27.12,25.69;HRMS(ESI):C73H99N8O21S+[M+H]+,calcd.1455.6645,found1455.6636.
Cys-TMP(Nvoc)·nTFA(1):向BocCys(Trt)-PEG8-TMP(Nvoc)(26mg,0.018mmol)中加入TFA(2mL)和2.5%v的三异丙基硅烷TIPS(50μL)于室温反应1.5h。反应完成后减压旋干,再向反应混合物中加入少量甲醇,溶解后用真空泵抽干以带出TFA等挥发性组分,如此重复3次以尽量除去过量的TFA。抽干后的产物分配进EtOAc/ddH2O中,分出水层,之后水层再用EtOAc萃洗两次,得到16.2mg浅黄色蜡状固体产物(1)(以n=1.5计算),产率71%。1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ10.17(s,1H),8.57(t,J=5.64Hz,1H),8.27(br,3H,-NH3 +),8.01(s,1H),7.83(m,1H),7.73(s,1H),7.51(br,2H),7.26(s,1H),6.61(s,0.25×2H),6.48(s,0.75×2H),5.46(s,2H),3.95(t,J=5.34Hz,1H),3.88(s,3H),3.86(s,3H),3.78(br,2H),3.73(m,2H),3.72(s,2H),3.66(s,6H),3.58(t,J=6.54Hz,2H),3.52-3.44(m,30H),3.36(m,1H),3.25(m,1H),3.07(m,2H),2.91(br,1H),2.29(t,J=6.48Hz,2H),1.56(m,2H),1.53(m,2H);13C-NMR(DMSO-d6,151Hz):δ169.91,166.79,164.08,154.39,153.35,153.09,153.02,151.67,148.09,139.63,135.05,134.22,132.89,126.28,113.90,111.54,108.94,108.26,106.24,105.89,71.95,69.80,69.75,69.70,69.63,69.55,68.76,66.93,63.77,56.31,56.17,55.93,55.76,53.93,38.94,38.19,36.18,32.68,32.13,30.49,27.13,25.71,25.20,24.31;HRMS(ESI):C49H77N8O19S+[M+H]+,calcd.1113.5026,found 1113.5034.
质粒构建:克隆所用载体为pTXB1(NEB,N6707S),PEGFP-C1,PmCherry-C1和PmCherry-N1都是从商业购买。
克隆方法为Gibson克隆或T4连接酶连接。通过PCR方式,使用hyPerFUsion高保真聚合酶(APExBIO,Cat#1032),从含有所需基因的质粒中扩增。
mCherry纳米抗体编码基因(RBP),GFP纳米抗体编码基因(GBP)由吉林库美合成。Tiam1(DHPH)基因的质粒模板通过淼灵质粒平台购买(P41110),将DHPH部分PCR扩增即得到Tiam1(DHPH)基因。
限制性内切酶和T4连接酶均购买自New ENGLAND BioLabs(NEB)。
RBP,即mCherry红色荧光蛋白纳米抗体的基因序列:(SEQ ID NO.1)
ATGGCGCAGGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGGCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCGACCTCTGGTTTCACCTTCTCTGACTACGCGATGGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGGGTAAAGAACGTGAATTCGTTGCGGCGATCTCTTGGTCTGGTCACGTTACCGACTACGCGGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCTCGTGACAACGTTAAAAACACCGTTTACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCGGTTTACTCTTGCGCGGCGGCGAAATCTGGTACCTGGTGGTACCAGCGTTCTGAAAACGACTTCGGTTCTTGGGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTTTCTAAAGAAGCGATC
GBP,即GFP绿色荧光蛋白纳米抗体的基因序列:(SEQ ID NO.2)
GTTCAACTGGTTGAATCTGGCGGCGCACTGGTTCAACCGGGCGGTAGTCTGCGTCTGAGTTGCGCAGCATCTGGTTTTCCGGTTAATCGTTATAGCATGCGTTGGTATCGTCAAGCACCGGGTAAAGAACGCGAGTGGGTTGCAGGTATGAGTAGCGCAGGCGATCGTAGTAGTTACGAAGACAGCGTCAAAGGCCGTTTTACCATTAGCCGTGACGACGCACGTAATACCGTTTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCGGAAGACACCGCGGTGTATTATTGCAACGTCAACGTCGGTTTCGAATATTGGGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTTAGCAGT
Tiam1(DHPH)的基因序列:(SEQ ID NO.3)
agacaactctcggatgcagataagctgcgcaaggtgatctgcgagctcctggagacggagcgcacctacgtgaaggatttaaactgtcttatggagagatacctaaagcctcttcaaaaagaaacttttctcacccaggatgagcttgacgtgctttttggaaatttaacggaaatggtagagtttcaagtagaattccttaaaactctagaagatggagtgagactggtacctgatttggaaaagcttgagaaggttgatcaatttaagaaagtgctgttctctctggggggatcattcctgtattatgctgaccgcttcaagctctacagtgccttctgcgccagccacacaaaagttcccaaggtcctggtgaaagccaagacagacacggctttcaaggcattcttggatgcccagaacccgaagcagcagcactcatccacgctggagtcgtacctcatcaagcccatccagaggatcctcaagtacccacttctgctcagggagctgttcgccctgaccgatgcggagagcgaggagcactaccacctggacgtggccatcaagaccatgaacaaggttgccagtcacatcaatgagatgcagaaaatccatgaagagtttggggctgtgtttgaccagctgattgctgaacagactggtgagaaaaaagaggttgcagatctgagcatgggagacctgcttttgcacactaccgtgatctggctgaacccgccggcctcgctgggcaagtggaaaaaggaaccagagttggcagcattcgtcttcaaaactgctgtggtccttgtgtataaagatggttccaaacagaagaagaaacttgtaggatctcacaggctttccatttatgaggactgggaccccttcagatttcgacacatgatccccacggaagcgctgcaggttcgagctttggcgagtgcagatgcagaggcaaatgccgtgtgtgaaattgtccatgtaaaatccgagtctgaagggaggccggagagggtctttcacttgtgctgcagctccccagagagccgaaaggatttcctaaaggctgtgcattcaatcctgcgtgataagcacagaagacagctcctcaaaaccgag
eDHFR的基因序列:(SEQ ID NO.4)
atgatcagtctgattgcggcgttagcggtagatcgcgttatcggcatggaaaacgccatgccgtggtgcctgcctgccgatTGcgcctggtttaaacgcaacaccttaaataaacccgtgattatgggccgccatacctgggaatcaatcggtcgtccgttgccaggacgcaaaaatattatcctcagcagtcaaccgggtacggacgatcgcgtaacgtgggtgaagtcggtggatgaagccatcgcggcgtgtggtgacgtaccagaaatcatggtgattggcggcggtcgcgtttatgaacagttcttgccaaaagcgcaaaaactgtatctgacgcatatcgacgcagaagtggaaggcgacacccatttcccggattacgagccggatgactgggaatcggtattcagcgaattccacgatgctgatgcgcagaactctcacagctattgctttgagattctggagcggcgg
mCherry基因序列:(SEQ ID NO.5)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGG
ATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
HaloTag基因序列:(SEQ ID NO.6)
ATGgcagaaatcggtactggctttccattcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgcatgcactacgtcgatgttggtccgcgcgatggcacccctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcctcctacgtgtggcgcaacatcatcccgcatgttgcaccgacccatcgctgcattgctccagacctgatcggtatgggcaaatccgacaaaccagacctgggttatttcttcgacgaccacgtccgcttcatggatgccttcatcgaagccctgggtctggaagaggtcgtcctggtcattcacgactggggctccgctctgggtttccactgggccaagcgcaatccagagcgcgtcaaaggtattgcatttatggagttcatccgccctatcccgacctgggacgaatggccagaatttgcccgcgagaccttccaggccttccgcaccaccgacgtcggccgcaagctgatcatcgatcagaacgtttttatcgagggtacgctgccgatgggtgtcgtccgcccgctgactgaagtcgagatggaccattaccgcgagccgttcctgaatcctgttgaccgcgagccactgtggcgcttcccaaacgagctgccaatcgccggtgagccagcgaacatcgtcgcgctggtcgaagaatacatggactggctgcaccagtcccctgtcccgaagctgctgttctggggcaccccaggcgttctgatcccaccggccgaagccgctcgcctggccaaaagcctgcctaactgcaaggctgtggacatcggcccgggtctgaatctgctgcaagaagacaacccggacctgatcggcagcgagatcgcgcgctggctgtcgacgctcgagatttcc
CAAX基因序列:(SEQ ID NO.7)
AAGATGAGCAAAGATGGTAAAAAGAAGAAAAAGAAGTCAAAGACAAAGTGTGTAATTATG
NES基因序列:(SEQ ID NO.8)
CTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTG
Rac1Q61L deltaCAAX基因序列:(SEQ ID NO.9)
ATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGGTGGGAGACGGAGCTGTAGGTAAAACTTGCCTACTGATCAGTTACACAACCAATGCATTTCCTGGAGAATATATCCCTACTGTCTTTGACAATTATTCTGCCAATGTTATGGTAGATGGAAAACCGGTGAATCTGGGCTTATGGGATACAGCTGGACTAGAAGATTATGACAGATTACGCCCCCTATCCTATCCGCAAACAGATGTGTTCTTAATTTGCTTTTCCCTTGTGAGTCCTGCATCATTTGAAAATGTCCGTGCAAAGTGGTATCCTGAGGTGCGGCACCACTGTCCCAACACTCCCATCATCCTAGTGGGAACTAAACTTGATCTTAGGGATGATAAAGACACGATCGAGAAACTGAAGGAGAAGAAGCTGACTCCCATCACCTATCCGCAGGGTCTAGCCATGGCTAAGGAGATTGGTGCTGTAAAATACCTGGAGTGCTCGGCGCTCACACAGCGAGGCCTCAAGACAGTGTTTGACGAAGCGATCCGAGCAGTCCTCTGCCCGCCTCCCGTGAAGAAGAGGAAGAGAAAA;
mScarlet基因序列:(SEQ ID NO.10)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGCAGTGATCAAGGAGTTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCTCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAGGGCCTTCATCAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTATAAGCAGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGCCGTGACCGTGACCCAGGACACCTCCCTGGAGGACGGCACCCTGATCTACAAGGTGAAGCTCCGCGGCACCAACTTCCCTCCTGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACAATGGGCTGGGAAGCGTCCACCGAGCGGTTGTACCCCGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACATTAAGATGGCCCTGCGCCTGAAGGACGGCGGCCGCTACCTGGCGGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGATGCCCGGCGCCTACAACGTCGACCGCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAACAGTACGAACGCTCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
mito基因序列:(SEQ ID NO.11)
GAATCCGGTGATGCATCGGGAAGTGGAAGTGGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCAAAACTAATTGCTAAAAGTGCAGAAGACGAAAAAGCGAAGGAAGAACCAGGGAACCATAGGATCGTAATTCTTGCAATGTTAGCTATTGGCGTGTTCTCTTTAGGGGCGCTTATCAAAATTATTCAATTAAGAAAAAATAAT
Rac1Q61LΔCAAX基因序列:(SEQ ID NO.12)
ATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGGTGGGAGACGGAGCTGTAGGTAAAACTTGCCTACTGATCAGTTACACAACCAATGCATTTCCTGGAGAATATATCCCTACTGTCTTTGACAATTATTCTGCCAATGTTATGGTAGATGGAAAACCGGTGAATCTGGGCTTATGGGATACAGCTGGACTAGAAGATTATGACAGATTACGCCCCCTATCCTATCCGCAAACAGATGTGTTCTTAATTTGCTTTTCCCTTGTGAGTCCTGCATCATTTGAAAATGTCCGTGCAAAGTGGTATCCTGAGGTGCGGCACCACTGTCCCAACACTCCCATCATCCTAGTGGGAACTAAACTTGATCTTAGGGATGATAAAGACACGATCGAGAAACTGAAGGAGAAGAAGCTGACTCCCATCACCTATCCGCAGGGTCTAGCCATGGCTAAGGAGATTGGTGCTGTAAAATACCTGGAGTGCTCGGCGCTCACACAGCGAGGCCTCAAGACAGTGTTTGACGAAGCGATCCGAGCAGTCCTCTGCCCGCCTCCCGTGAAGAAGAGGAAGAGAAAA
如下是相关质粒的构建方法列表1。
表1
实施例1.
PANCID诱导剂,其结构通式为为图2所示,或者如下通式:胞内递送模组—连接子—纳米抗体—小分子配体—光笼,其中光笼在小分子配体上,胞内递送模组通过连接子连在整个纳米抗体—小分子偶联物上,即既可以连在纳米抗体结合部,也可以连在小分子上,也可以连接纳米抗体与小分子之间的链上。
纳米抗体部分为有先考虑为荧光蛋白纳米抗体,例如绿色荧光蛋白纳米抗体,红色荧光蛋白纳米抗体等等,也可以是结合细胞内其它蛋白靶标的纳米抗体。
小分子配体为能够与蛋白标签相结合的小分子配体,也可以是在活细胞内能够被后修饰应用的,包含但不限定为如下小分子结构:TMP(甲氧苄啶配体)、SNAP-Tag、CLIP-tag、Biotin(生物素)、Desthiobiotin(脱硫生物素)。结构式如下所示:
光笼基团可以诸多通用型的光笼基团,包含而不限定为如下光笼结构:硝基芳基类光笼(如Nvoc光笼)、Coumarin光笼,BODIPY类光笼等;胞内递送模组是环状跨膜肽(cyclic(KrRrRrRrRrRE)-NH2)。连接子既可以是能够在胞内稳定存在的链,如肽键,也可以是在胞内能够缓慢切断的健,如硫醚键,也可以是能够在胞内快速切断的链如二硫键,或硫醚键-S-,或者酰胺键-CONH-或-NHCO-,或其它生物兼容的间如PEG链。
纳米抗体部分是绿色荧光蛋白纳米抗体(GBP)、mCherry红色荧光蛋白纳米抗体(RBP)、或者其它纳米抗体。其中RBP和RBP纳米抗体氨基酸序列如下:
GBP纳米抗体序列:
MPSEKTFKQRRTFEQRVEDVRLIREQHPTKIPVIIERYKGEKQLPVLDKTKFLVPDHVNMSELIKIIRRRLQLNANQAFFLLVNGHSMVSVSTPISEVYESEKDEDGFLYMVYASQETFGMKLSV(SEQ ID NO.13);
RBP纳米抗体序列:
MAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCATSGFTFSDYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGHVTDYADSVKGRFTISRDNVKNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCAAAKSGTWWYQRSENDFGSWGQGTQVTVSKEAI(SEQ IDNO.14);
具体的方法:
1.设计和构建cR10*-GBP-TMP(Nvoc):
首先通过化学合成的方式合成制备两个关键小分子中间体。
第一个是Cys-TMP(Nvoc),化学结构式如图4中的A所示,简写如图4中的B所示,它包含一个半胱氨酸残基,用于通过表达蛋白连接(expressed protein ligation,EPL)的方式将TMP(Nvoc)模组引入到GBP纳米抗体上:首先合成CysTMP(Nvoc)化学小分子,CysTMP(Nvoc)用于将TMP(Nvoc)配体引入到GBP纳米抗体上,Cys-TMP(Nvoc)合成方法如反应流程式1。
第二个是Cys-cR10*这个含有环状十精氨酸的跨膜肽,结构式如图4中的C所示,简写如图4中的D所示,可以将纳米抗体通过非胞吞的形式递送进细胞:Cys-cR10*环状跨膜肽也可通过经典多肽固相合成的方法合成出来,Cys-cR10*包含一个L-Cys残基、一个(Gly)5链、以及cyclic(KrRrRrRrRrRE)环状跨膜肽。
胞内递送模组可以是如下一种:新的环状跨膜肽—cR10*,
Cys-(Gly)n-cyclic(KrRrRrRrRrRE)-NH2,其中n为零或自然数,r:L-Arg,R:L-Arg,其结构
2.表达蛋白GBP-Intein-CBD(I),基于EPL连接反应以及二硫键化反应就可以制备出cR10*-GBP-TMP(Nvoc),简称cRGTN(流程图如图5中的A所示)。
GBP-Intein-CBD(chitin-binding-domain):将GBP插入进pTXB1的载体中的Intein位置的前端,将GBP序列连着Intein序列和CBD序列一并酶切下来而获得的。
具体步骤如下:通过GBP-Intein-CBD(I)与CysTMP(Nvoc)相反应而得到GBP-TMP(Nvoc)偶联物中间体(GTN,III,图5中的B)。这个中间体通过分子筛(SEC)纯化之后(图5中的C),基于二硫键化反应便可以将cR10*胞内递送模组连接到GBP-TMP(Nvoc)上,得到cRGTN产物,即化诱导剂PANCID(图5中的D),这两步反应更为详细的描述如下:
第一步是表达蛋白连接(expressed protein ligation,EPL):CysTMP(Nvoc)跟GBP-intein-CBD(内含肽—几丁质结合域(intein-CBD;CBD:chitin binding domain)标签融合的GFP纳米抗体,通过EPL反应而将TMP配体连接到GBP纳米抗体的C-端得到GBP-TMP(Nvoc),在连接反应过程中CBD标签也会被切除,反式镍柱纯化之后很容易得到纯的GBP-TMP(Nvoc)。
第二步是二硫键化反应:携带了半胱氨酸残基的GBP-TMP(Nvoc)偶联物与Cys-cR10*跨膜肽通过二硫键共价结合,基于二硫键化反应就可构建出cR10*-SS-GBP-TMP(Nvoc)产物,即cRGT,在还原性环境下cR10*容易被切除而得到GBP-TMP(Nvoc)。
更为详细的制备步骤如下:
(1)Ni-NTA IMAC纯化GBP-Intein-CBD,并交换进pH 8.0缓冲液A中(PBS,0.5MNaCl,3%glycerol,含咪唑);
(2)加入pH8.0的MENSNa(2M stock)至终浓度0.4M及pH8.0的MPAA(1.1M stock)至终浓度0.2M;
(3)加入CysTMP(Nvoc)(25mM stock)至终浓度1mM,于冰上孵育1天;次日加入额外的终浓度1mM的CysTMP(Nvoc),于冰上再孵育2天;
(4)Ni-NTA IMAC纯化除去被切掉的intein以及一些未反应的GBP-Intein-CBD;
(5)与用缓冲液A预先平衡过的几丁质树脂(chitin resin)混合孵育,于4度旋转2小时后收集流出液;
(6)通过超滤交换进pH8.3的DTNP缓冲液中(50mM Na2HPO4,0.5M NaCl),加入2当量的TCEP(20mM母液)孵育45min;
(7)加入10当量DTNP(100mM母液)孵育60min,之后超滤3次交换进pH9.0的二硫键化缓冲液(disulfidization buffer:50mM HEPES,0.5M NaCl),超滤除掉过量的DTNP等小分子;
(8)加入Cys-cR10*(25mM stock in DMSO)至终浓度1mM,冰上孵育30min;
(9)超滤1次将蛋白交换进PBS溶液中,得到cRGT纳抗偶联二聚化药物分子,测定浓度,分装,液氮冷冻后存于-80度冰箱。
实施例2.用cRGTN光调控蛋白质在细胞中的定位
HeLa活细胞转染EGFP-mito-IRES-mCherry-eDHFR质粒,共表达EGFP-mito(线粒体定位)和mScarlet-eDHFR蛋白(胞浆定位),质粒元件示意图如图6中的A所示,cRGTN的结构示意图如图6中的B所示,调控流程原理图如图6中的C所示。加入24μM的cRGTN,孵育约90min。之后用共聚焦显微镜405nm的激光来光激活细胞数次。可以看到,逐次增加光照的量之后,mScarlet-eDHFR被光量依赖地方式定位到线粒体上。当使用4次光激活之后(PA:photoactivation),大部分的mScarlet-eDHFR被定位到了线粒体上(图6中的D所示)。这个实验结果说明cRGTN可以实现光调控mScarlet-eDHFR在细胞中的定位,整个实验流程图和结果如图所示。
实施例3.光调控激活Rac1在细胞膜上的定位过程,实现时间分辨地调控细胞伪足的形成过程
HeLa活细胞中用光激活细胞伪足的形成过程。HeLa活细胞共表达mCherry-eDHFR-CAAX(细胞质膜定位,载体构建表1所示)和EGFP-NES-Rac1Q61LΔCAAX(简称EGFP-Rac1,胞浆定位,载体的构建方法如表1所示),然后用cRGTN处理(24μM,1.5h),整个原理流程图如图7中的A所示。用405nm的激光来光激活整个细胞,可以发现数秒钟之后,Rac1被定位到细胞质膜上,并出现明显的聚集;再接下来,细胞膜皱褶产生,同时细胞出现延申迹象,意味着细胞伪足的形成过程被激发了(图7中的B-C,其中图7中的C是放大的图片以显示更多的细节)。细胞膜的覆盖面积增加(图7中的D),进一步正式细胞伪足形成。
实施例4.光调控激活Tiam1在细胞膜上的定位过程,实现时间分辨地调控Tiam1功能
HeLa活细胞共表达mCherry-eDHFR-Tiam1(整个胞浆定位,载体的构建方法如表1所示的eDHFR-mCherry-Tiam1(DHPH)载体),和EGFP-CAAX(细胞质膜定位,载体的构建方法如表1所示),然后用cRGTN处理(24μM,1.5h),整个原理流程图如图8中的A所示。用405nm的激光照射之后,可以发现mCherry-eDHFR-Tiam1被定位到了细胞膜上,并很快产生了很强的生物学效应,包括细胞边缘出现了突出,显示了有点不同的细胞伪足产生方式,如图所示(图8中的B-C,其中图8中的C是放大的图片以显示更多细节)。
同时也发现,除了产生不一样的细胞伪足之外,细胞还产生了某种凋亡迹象,细胞膜上很快出现了一些小泡(图8中的D)。这些现象表明虽然Tiam1和Rac1都是细胞伪足产生的上游调控因子,但是其下游还对应着不一样的通路。同时这个下游信号响应过程很快速,通过更为快速的光调控手段,Rac1和Tiam1的区别才得以清晰地解析区别开来。
实施例5.时空分辨地调控Rac1在细胞膜上的功能
在此实验过程中,HeLa活细胞共表达mCherry-eDHFR-CAAX(细胞膜上定位)以及EGFP-NES-Rac1Q61LΔCAAX(简称EGFP-Rac1,胞浆定位)。之后,HeLa细胞用cRGTN处理(24μM,1.5h),然后对该细胞的一个局部区域进行光激活,整个原理流程图如图9中的A)所示。可以发现在数秒时间之内,EGFP-Rac1被定位到了细胞的上部区域,并开始缓慢扩散开来(图9中的B-C,其中图9中的C为放大图片以显示更多袭击欸;白色箭头显示定位调控,而黄色箭头显示细胞皱褶产生)。很快,在此区域,细胞膜产生了皱褶(图9中的D),显示出HeLa细胞产生了细胞伪足,而其它区域并无此现象发生。这个实验现象表示cRGTN能够实现时间和空间可辨地调控胞内进程,如图所示(图9)。
实施例6.用cRRTN光调控蛋白质在细胞中的定位
HeLa活细胞共转染mCherry-mito(线粒体定位)和EGFP-eDHFR(胞浆定位)之后,加入24μM的cRRTN(结构示意图如图10中的A所示),孵育约90min,之后用共聚焦显微镜405nm的激光来光激活,整个原理流程图如图10中的B所示。可以看到光照之后,EGFP-eDHFR被定位到线粒体上(图10中的C)。这个实验结果说明cRRTN可以实现光调控mCherry与eDHFR所融合的蛋白的胞内二聚化。
Claims (7)
1.一种光激活的纳抗偶联物二聚化诱导剂PANCID,其特征在于,所述诱导剂PANCID的是由以下成分组成:胞内递送模组、连接子、纳米抗体、光笼保护的小分子配体;所述胞内递送模组、连接子、纳米抗体、光笼保护的小分子配体的连接方式是:光笼保护的小分子配体跟纳米抗体连接获得纳米抗体偶联物,然后将胞内递送模组通过连接子与纳米抗体偶联物相连;
所述小分子配体为蛋白标签结合配体;所述胞内递送模组为环状跨膜肽。
2.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID,其特征在于,所述纳米抗体为荧光蛋白纳米抗体或者结合细胞内蛋白靶标的纳米抗体;所述环状跨膜肽为环状十聚精氨酸,所述环状十聚精氨酸的结构式示意如下:n为零或自然数,
。
3.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID,其特征在于,所述小分子配体为TMP。
4.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID,其特征在于,所述光笼结构为Nvoc基团。
5.根据权利要求1所述的诱导剂PANCID,其特征在于,所述连接子为肽键、硫醚键、二硫键、酰胺键或PEG链。
6.一种权利要求1-5任一项所述的诱导剂PANCID的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下:
步骤S1:合成含有能与蛋白连接的光笼保护的小分子配体;
步骤S2:将步骤S1获得的光笼保护的小分子配体与纳米抗体连接获得偶联了光笼保护的配体的纳米抗体偶联物;
步骤S3:将胞内递送模组与步骤S2获得的纳米抗体偶联物相连接,获得光控诱导剂PANCID。
7.权利要求1-5任一项所述的诱导剂PANCID在以非疾病诊断和治疗为目的光调控细胞进程中的应用。
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