ES2274267T3 - Nuevas moleculas multimericas, su procedimiento de preparacion, y su utilizacion para la preparacion de medicamentos. - Google Patents

Abstract

Molécula multimérica, caracterizada porque responde a la siguiente fórmula general: A-Xn en la que: - n es igual a 3, 4, 5 ó 6, - A es un grupo químico, funcionalizado por al menos tres funciones aminas o funciones COOH o funciones SH o funciones S-Npys (S-nitro-piridinasulfenilo) o funciones S-Pys (S-piridinasulfenilo), y es en particular diferente de una proteína, - X representa un grupo -D, -B-D o -B(D)-D'', en el que: * B es un brazo espaciador, * -D y -D'' representan péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada de un ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando, secuencia que es susceptible de interactuar con el receptor, seleccionándose dicho ligando de entre los ligandos de receptores de la superfamilia del TNF, y en particular de entre los ligandos siguientes: EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LTalfa, TNF, LTbeta, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL y TRAIL, caracterizada porque: o bien A es un radical ramificado de simetría C3 de fórmula general siguiente: en la que: * m y m'''' son números enteros comprendidos de 1 a 5, * V representa un grupo -NH- o -CO- que forma un enlace amida con X, * Z representa un átomo de oxígeno o un grupo CH2, * Y representa o bien un átomo de nitrógeno, o bien un grupo R-C- o bien un grupo R-CONH-C-, en los que R puede ser un grupo alquilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquenilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquinilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo arilo con 5 a 12 átomos de carbono, un grupo aralquilo con 5 a 14 átomos de carbono o un grupo heteroarilo con 1 a 10 átomos de carbono, pudiendo estar dichos grupos no sustituidos o sustituidos por 1 a 6 sustituyentes seleccionados de entre los grupos -COOH, -NH2, -CONH2 o alcoxi, o bien A es un radical C3 cíclico que responde a una de las fórmulas generales siguientes: ** ver fórmula** en las que: * Ra representa o bien un grupo -NH- o bien un grupo -CO- que forma un enlace amida con X, * Rb representa la cadena lateral de un aminoácido proteinogénico, * p es un número entero comprendido entre 1 y 4, * q es un número entero comprendido entre 0 y 4, o bien A es un radical ramificado no simétrico que responde a las fórmulas generales siguientes: ** ver fórmula**en las que: * k representa 3, 4, 5 ó 6, * R1 representa o bien un átomo de hidrógeno, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, o bien un grupo RCO-, ROCO- o RNHCO-, siendo R tal como se ha definido anteriormente, * R2 representa o bien un grupo -NH2, o bien un grupo -NHR, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, siendo R tal como se ha definido anteriormente.

Description

Nuevas moléculas multiméricas, su procedimiento de preparación, y su utilización para la preparación de medicamentos.

La invención tiene por objeto nuevas moléculas multiméricas, su procedimiento de preparación, así como su utilización para la preparación de medicamentos.

La invención tiene asimismo por objeto moléculas capaces de activar o inhibir la respuesta inmunitaria.

La importancia del par CD40/CD40L en la respuesta inmunitaria ha llevado a numerosos grupos a utilizar anticuerpos dirigidos frente a esas dos moléculas con fines terapéuticos, con el fin de inhibir o activar el sistema inmunitario. La administración de anticuerpos anti-CD40L ha producido resultados prometedores en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias como la encefalomielitis alérgica experimental murina (un modelo de la esclerosis múltiple humana) (Howard et al., 1999) o en el tratamiento de rechazo de aloinjertos renales en los monos (Kirk et al., 1999). En esos dos casos, los anticuerpos han inhibido una actividad fatal del sistema inmunitario. Por el contrario, la utilización de anticuerpos anti-CD40 agonistas ha permitido por una parte, mejorar fuertemente la respuesta a las vacunas antitumorales peptídicas en el ratón (Diehl et al., 1999) y por otra parte, aumentar la eficacia de las células T CD4^{+} en la lucha contra los tumores murinos (Sotomayor et al., 1999 ; Lode et al., 2000). Se ha puesto en evidencia una regresión tumoral en los modelos murinos tras la inyección de células dendríticas (CD) transformadas por un adenovirus que codifica para CD40L (Kikuchi et al., 2000). Finalmente, una activación de las células dendríticas por la interacción de su molécula CD40 con CD40L puede proteger a los ratones de una infección por un parásito, Trypanosoma cruzi (Chaussabel et al., 1999). En todos estos trabajos, la valencia particular de la molécula CD40L, que se asocia en forma de trímero para formar con el CD40 complejos hexavalentes, hace difícil la producción de anticuerpos funcionales que puedan interferir con las funciones del par CD40/CD40L. El desarrollo de adenovirus que codifican para CD40L responde en parte a este inconveniente. No obstante, su utilización implica problemas en el hombre. En resumen, la valencia particular del sistema hace difícil el descubrimiento de moléculas de síntesis que puedan interferir con la interacción CD40/CD40L.

La solicitud internacional WO 99/52877 da a conocer ligandos agonistas o antagonistas de receptor multimérico que no son anticuerpos, siendo dicho receptor en particular CD40. Los compuestos así obtenidos son ligandos del receptor multimérico y comprenden un compuesto espaciador que está sustituido por al menos dos residuos de enlace del receptor. Dicho compuesto espaciador puede ser cualquier molécula que presente un centro di o trisustituido. No obstante, ese documento D1 da a conocer numerosas moléculas sin definirlas precisamente, por ejemplo, por su fórmula química global, y da a conocer únicamente los espaciadores di o trisustituidos de los compuestos multiméricos sin dar detalles de la estructura precisa de la parte proteica de dichos compuestos multiméricos. Finalmente, los ligandos de CD40 preparados en el marco de ese documento son ligandos diméricos.

El documento D2 da a conocer las interacciones entre CD40L y CD40 en la activación de linfocitos B y T. Así pues, no se refiere para nada a la preparación de un compuesto mimético multimérico sintético de un ligando natural.

La invención tiene por objetivo proporcionar ligandos multiméricos concebidos para interferir en las interacciones proteína-proteína.

La presente invención tiene asimismo por objetivo la preparación de moléculas que pueden interferir con interacciones multivalentes proteínas-proteínas.

La presente invención tiene asimismo por objetivo la preparación de moléculas que pueden modular la actividad de los miembros de las familias del TNF y del TNF-R.

La presente invención tiene por objetivo proporcionar una molécula de síntesis que actúe sobre el sistema CD40/
CD40L.

La presente invención tiene asimismo por objetivo proporcionar moléculas que pueden actuar como adyuvantes o inmunosupresores.

La presente invención se refiere a una molécula multimérica que puede imitar, con una actividad agonista o antagonista, a un ligando multimérico proteico natural.

La presente invención se refiere asimismo a una molécula multimérica que puede producir efectos diferentes de los producidos por el ligando multimérico natural que pertenece a la familia del TNF, pudiendo ser beneficiosos en una patología.

Por "molécula que puede imitar a un ligando con una actividad agonista", se denomina a una molécula que puede reproducir una parte o la totalidad de funciones del ligando natural.

Por "molécula que puede imitar a un ligando con una actividad antagonista", se denomina a moléculas, una molécula que puede inhibir una parte o la totalidad de las funciones del ligando natural.

Por "ligando multimérico proteico natural", se denomina cualquier proteína activa sobre su receptor en forma multimérica, es decir, homo-dimérica, homo-trimérica, homo-tetramérica, homo-oligomérica, para una autounión no covalente.

La presente invención se refiere a una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, que puede imitar a un ligando de receptor de la superfamilia del TNF.

La "superfamilia del TNF" denomina a una familia de moléculas que presentan características estructurales o funcionales próximas a las del TNF, estando esas moléculas esencialmente implicadas en la respuesta inmunitaria.

Según un modo de realización ventajoso de la invención, la molécula multimérica de la invención se caracteriza porque el ligando es un ligando de la molécula CD40.

La molécula CD40 es una molécula transmembrana de 48 kDa que pertenece a la superfamilia de los "receptores del TNF". Ésta se expresa de manera constitutiva por las células presentadoras de antígeno tales como las células dendríticas, los monocitos y los linfocitos B. Ésta interactúa de manera trivalente con el CD40L (CD154) expresado en las células T activadas, los leucocitos (monocitos/macrófagos, células NK, basófilos, eosinófilos), las plaquetas activadas así como en células no hematopoyéticas (células musculares lisas, células epiteliales, células endoteliales). En la superficie de esas células diferentes, puede inducirse su expresión y es persistente al contrario de lo que ocurre con su expresión en las células T activadas que sólo es transitoria. La interacción CD40/CD40L es central en el desarrollo y el control de las respuestas inmunitarias humorales y celulares.

La presente invención se refiere a una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, caracterizada porque responde a la fórmula general siguiente:

A-X_{n}

en la que:

-

n es igual a 3, 4, 5 ó 6,

-

A es un grupo químico, funcionalizado por al menos tres funciones aminas o funciones COOH,

-

X representa un grupo -D, -B-D o -B(D)-D’, en el que:

\text{*}

B es un brazo espaciador,

\text{*}

-D y -D’ son péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada del ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando, la cual es susceptible de interactuar con el receptor.

El grupo químico A es un grupo químico funcionalizado de tal forma que permite el enlace con el grupo X. A se designa asimismo "molécula núcleo" ("molécule coeur").

Por "molécula núcleo", se denomina a un grupo químico que presenta un papel central en la presentación de los n grupos X en la molécula multimérica.

Por "brazo espaciador", se denomina a una cadena orgánica utilizada para alejar el grupo D a la distancia deseada de A.

Por "péptidos o pseudopéptidos", se denomina a un encadenamiento de residuos de aminoácidos naturales o no naturales, unidos entre sí por enlaces amida. Un pseudopéptido se obtiene por sustitución de uno o varios enlaces amida en el péptido por un enlace químico de naturaleza diferente.

Por "secuencia derivada del ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando", se define una secuencia peptídica que pertenece a la secuencia primaria del ligando y cuyo número de aminoácidos está comprendido entre 3 y 10, y cuyos estudios estructurales (difracción de rayos X, resonancia magnética nuclear, modelización molecular, mutagénesis dirigida) han mostrado que al menos uno de los aminoácidos que la componen se encuentra en interacción no covalente (enlace de hidrógeno, interacción catión-pi, puente salino, interacción hidrófoba, van der Waals) con un residuo de aminoácido del receptor.

La presente invención se refiere asimismo a una molécula multimérica, caracterizada porque responde a la fórmula general siguiente:

A-X_{n}

\newpage

en la que:

-

n es igual a 3, 4, 5 ó 6,

-

A es un grupo químico, funcionalizado por al menos tres funciones aminas o funciones COOH o funciones SH o funciones S-Npis (S-nitro-piridinasulfenilo) o funciones S-Pis (S-piridinasulfenilo), y es en particular diferente de una proteína,

-

X representa un grupo -D, -B-D o -B(D)-D’, en el que:

\text{*}

B es un brazo espaciador,

\text{*}

-D y -D’ representan péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada de un ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando, secuencia que es susceptible de interactuar con el receptor, seleccionándose dicho ligando de entre los ligandos de receptores de la superfamilia del TNF, y en particular de entre los ligandos siguientes: EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1 BBL, CD27L, LT\alpha, TNF, LT\beta, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL y TRAIL.

La presente invención se refiere asimismo a una molécula multimérica, caracterizada porque responde a la fórmula general siguiente:

A-X_{n}

en la que:

-

n es igual a 3, 4, 5 ó 6,

-

A es un grupo químico, funcionalizado por al menos tres funciones aminas o funciones COOH, y es en particular diferente de una proteína,

-

X representa un grupo -D, -B-D o -B(D)-D’, en el que:

\text{*}

B es un brazo espaciador,

\text{*}

-D y -D’ representan péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada de un ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando, secuencia que es susceptible de interactuar con el receptor, seleccionándose dicho ligando de entre los ligandos de receptores de la superfamilia del TNF, y en particular de entre los ligandos siguientes: EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LT\alpha, TNF, LT\beta, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL y TRAIL.

La expresión "-D y -D’ que corresponden a una secuencia derivada de un ligando, secuencia que es susceptible de interactuar con el receptor" puede definirse como sigue: las secuencias -D y -D’ se seleccionan de la base de datos estructurales disponibles (difracción de rayos X o modelización molecular y mutagénesis dirigida) por su implicación en la interacción con el receptor correspondiente. Así en la proteína natural, todos o parte de los residuos de esas secuencias se encuentra en interacción (enlace de hidrógeno, enlace hidrófobo, enlace H, enlace catión-Pi, puentes salinos, interacciones de van der Waals) con una parte del o de los receptores correspondientes. No obstante, los péptidos aislados -D o -D’ pueden presentar afinidades por el receptor demasiado débiles como para medirse. La ganancia de afinidad la aportará la multimerización tal como se da a conocer en la presente invención.

Los ligandos de la superfamilia del TNF se seleccionan de la lista proporcionada por Locksley et al. (2001) y, en particular, son los siguientes:

1

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Según un modo de realización ventajoso de la presente invención, la molécula de la invención se caracteriza porque -D y -D’ representan péptidos derivados del ligando del receptor CD40 humano o murino (CD40L), perteneciendo dichos péptidos a la secuencia primaria del ligando CD40L de CD40 y cuyo número de aminoácidos está comprendido entre 3 y 10.

Una molécula multimérica ventajosa de la invención es una molécula multimérica caracterizada porque A presenta una simetría C_{3}.

Se define a una molécula de simetría C_{3} de la siguiente manera: una molécula pertenece al grupo C_{3} si posee un eje de orden 3 (véase la definición en "Physical Chemistry", PW Atkins, Oxford University Press, 1998, pág. 430).

La presente invención se refiere a una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, caracterizada porque:

\bullet o bien A es un radical ramificado de simetría C_{3} de fórmula general siguiente:

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2

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en la que:

\text{*}

m y m’ son números enteros comprendidos de 1 a 5,

\text{*}

V representa un grupo -NH- o -CO- que forma un enlace amida con X,

\text{*}

Z representa un átomo de oxígeno o un grupo CH_{2},

\text{*}

Y representa o bien un átomo de nitrógeno, o bien un grupo R-C- o bien un grupo R-CONH-C-, en los que R puede ser un grupo alquilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquenilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquinilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo arilo con 5 a 12 átomos de carbono, un grupo aralquilo con 5 a 14 átomos de carbono o un grupo heteroarilo con 1 a 10 átomos de carbono, pudiendo sustituirse o no sustituirse dichos grupos por 1 a 6 sustituyentes seleccionados de entre los grupos -COOH, -NH_{2}, -CONH_{2} o alcoxi,

\newpage

\bullet o bien A es un radical C_{3} cíclico que responde a una de las fórmulas generales siguientes:

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3

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4

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5

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6

7

en las que:

\text{*}

R_{a} representa o bien un grupo -NH- o bien un grupo -CO- que forma un enlace amida con X,

\text{*}

R_{b} representa la cadena lateral de un aminoácido proteinogénico,

\text{*}

p es un número entero comprendido entre 1 y 4,

\text{*}

q es un número entero comprendido entre 0 y 4,

\bullet o bien A es un radical ramificado no simétrico que responde a las fórmulas generales siguientes:

8

en las que:

\text{*}

k representa 3, 4, 5 ó 6,

\text{*}

R^{1} representa o bien un átomo de hidrógeno, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, o bien un grupo RCO-, ROCO- o RNHCO-, siendo R tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria,

\text{*}

R^{2} representa o bien un grupo -NH_{2}, o bien un grupo -NHR, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, siendo R tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria,

-

B responde a una de las fórmulas generales siguientes:

9

en las que:

\text{*}

Y representa una cadena alquilo C_{1}-C_{10} o un grupo alquinilo o alquenilo o arilo o aralquilo o heteroarilo,

\text{*}

R^{3} representa o bien un grupo -NH- cuando V o R_{a} es un grupo -CO-, o bien un grupo -CO- cuando V o R_{a} es un grupo -NH-,

\text{*}

R^{4} y R^{5} representan independientemente entre sí un grupo -CO- o un grupo -NH-,

-

-D y -D’ son péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada del ligando que se encuentra en interacción con el receptor.

La presente invención se refiere asimismo a una molécula tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, caracterizada porque -D y -D’ representan residuos derivados del ligando del receptor CD40 humano o murino (CD40L), seleccionados de entre los siguientes:

Lys^{143}-Gly-Tyr^{145}, Tyr^{145}-Gly-Lys^{143},

Lys^{143}-Gly-Tyr-Tyr^{146}, Tyr^{146}-Tyr-Gly-Lys^{143},

Lys-Pro-Arg, Lys-\Psi(CH_{2}NH)Pro-Arg,

Arg^{200}-Phe-Glu-Arg-Ile-Leu-Leu-Arg^{207},

Arg^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg-Glu-Phe-Arg^{200},

Arg^{200}-Phe-Glu-Arg-Ile^{204}, Ile^{204}-Arg-Glu-Phe-Arg^{200},

Arg^{203}-Ile-Leu-Leu-Arg^{207}, Arg^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg^{203},

Cys^{218}-Gly-Gln-Gln-Ser-Ile^{223}, Ile^{223}-Ser-Gln-Gln-Gly-Cys^{218},

Gly^{200}-Ser-Glu-Arg-Ile-Leu-Leu-Lys^{207},

Lys^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg-Glu-Ser-Gly^{200},

Gly^{200}-Ser-Glu-Arg-Ile^{204}, Ile^{204}-Arg-Glu-Ser-Gly^{200},

Arg^{203}-Ile-Leu-Leu-Lys^{207}, Lys^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg^{203},

Cys^{218}-Glu-Gln-Gln-Ser-Val^{223}, Val^{223}-Ser-Gln-Gln-Glu-Cys^{218},

o de entre péptidos híbridos constituidos por al menos dos aminoácidos consecutivos de dos de las secuencias definidas anteriormente en la presente memoria, en particular los péptidos de secuencias Arg^{203}-Ile^{204}-Tyr^{145}-Tyr^{146} o Arg^{203}-Ile^{204}-Tyr^{146}-Tyr^{145}-Gly^{144}-Lys^{143},

o de entre fragmentos de las secuencias mencionadas anteriormente,

pudiendo ser los aminoácidos de manera indiferente de configuración L o D.

Según un modo de realización ventajoso de la presente invención, la molécula tal como se ha definido anteriormente se caracteriza porque A responde a una de las fórmulas siguientes:

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10

11

en las que i representa un número entero superior o igual a 1.

Una molécula ventajosa de la presente invención es una molécula tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, de fórmula siguiente: H-Lys-Gly-Tyr-Tyr,

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La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende, a título de principio activo una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere asimismo a una composición vacunal, caracterizada porque comprende, a título de principio activo una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en asociación con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización de moléculas multiméricas tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican la inhibición o la activación de la respuesta inmunitaria.

La respuesta inmunitaria debe inhibirse en el curso de las enfermedades inflamatorias (reumatismos inflamatorios), de las enfermedades autoinmunitarias, de las reacciones de hipersensibilidad en general y de las alergias en particular, de los rechazos de injertos, de las reacciones del injerto contra el huésped.

La respuesta inmunitaria debe activarse en las vacunaciones en general, en la inmunoterapia de cánceres, en las enfermedades bacterianas y virales que inducen una inmunosupresión (sarampión, SIDA, virus del herpes, citomegalovirus...).

La presente invención se refiere asimismo a la utilización tal como se mencionó anteriormente en la presente memoria, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican la inhibición de la respuesta inmunitaria, tales como los rechazos de injertos o las enfermedades autoinmunitarias.

Las enfermedades que implican la inhibición de la respuesta inmunitaria que comprenden las enfermedades autoinmunitarias tales como la diabetes, la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico o la artritis reumatoide, los rechazos de injertos, en particular en el marco de aloinjertos, de xenoinjertos o las reacciones del injerto contra el huésped, así como las reacciones de hipersensibilidades tales como las alergias, en particular el fiebre del heno y las dermatitis atópicas, o los granulomas.

Los compuestos según la presente invención, utilizados en el marco de la inhibición de la respuesta inmunitaria, pueden administrarse por vía intravenosa, por las vías mucosas (orales, aéreas, nasales, vaginales), por vía subcutánea, intradérmica o epicutánea.

La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto según la presente invención, para el tratamiento de patologías que implican la inhibición de la respuesta inmunitaria, compuesto que está presente en la composición farmacéutica en cantidades tales que puede administrarse a razón de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 5 mg por día y por individuo.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican el aumento de la respuesta inmunitaria, tales como los cánceres o las infecciones parasitarias, bacterianas o virales.

Los casos que implican la activación de la respuesta inmunitaria comprenden las vacunaciones en general, en particular las vacunas contra la gripe o contra las enfermedades infantiles, la inmunoterapia de los cánceres, en particular en el marco de los melanomas o de cánceres con metástasis, o las enfermedades bacterianas o virales que inducen una inmunosupresión, en particular en el marco del sarampión, de SIDA, de virus del herpes o de citomegalovirus.

Los compuestos según la presente invención, utilizados en el marco de la activación de la respuesta inmunitaria, pueden administrarse por vía intravenosa, por las vías mucosas por (orales, aéreas, nasales, vaginales), por vía subcutánea, intradérmica o epicutánea.

La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto según la presente invención, para el tratamiento de patologías que implican la activación de la respuesta inmunitaria, compuesto que está presente en la composición farmacéutica en cantidades tales que puede administrarse a razón de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 5 mg por día y por individuo.

La presente invención se refiere asimismo a la utilización tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades no relacionadas con el sistema inmunitario, tales como los linfomas, la aterosclerosis o las trombosis.

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación sobre soporte sólido de una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en la cual A es un radical C_{3} cíclico y responde a una de las fórmulas Ia, Ib, II, VIb, VIc o VId tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, estando dicho procedimiento caracterizado comprende las etapas siguientes:

-

formar un precursor lineal de A, precursor que está constituido por un encadenamiento de aminoácidos que forma una cadena peptídica en crecimiento, sintetizada mediante ciclos sucesivos de acoplamiento entre residuos de aminoácidos N-protegidos, de los cuales tres llevan un grupo R_{a} de tipo amina, y la función amina de la cadena peptídica en crecimiento, y de desprotección, estando unido el primer residuo de aminoácido sobre un soporte sólido,

-

ciclizar el precursor lineal de A protegido mencionado anteriormente,

-

escindir los grupos protectores citados anteriormente, para liberar las funciones aminas protegidas citadas anteriormente,

-

acoplar las tres funciones aminas liberadas con un brazo espaciador B N-protegido,

-

desproteger el brazo espaciador B y acoplar las funciones aminas liberadas del brazo espaciador B, con un péptido D ya formado o formado in situ por la unión secuencial de residuos de aminoácidos que corresponden al péptido D, y

-

escindir la molécula del soporte sólido, tras la supresión de todos los grupos protectores presentes en las cadenas laterales funcionalizadas del péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica según la invención.

\newpage

Los compuestos que comprenden un grupo A cíclico que presenta una simetría C_{3} y que responde a las fórmulas generales Ia, Ib, II, VIb, VIc o VId se obtienen mediante síntesis sobre soporte sólido según el procedimiento descrito anteriormente en la presente memoria. En primer lugar se construye el grupo A sobre soporte sólido mediante síntesis de su precursor lineal y ciclización. Así, un primer residuo de aminoácido, en el que la función ácida se protege convenientemente (éster de alilo por ejemplo), se une sobre el soporte mediante una reacción de aminación reductora, utilizando una resina funcionalizada por un aldehído (resinas comerciales). El precursor lineal de A se une a continuación mediante ciclos sucesivos de acoplamiento (tradicionalmente en síntesis de péptido) con un aminoácido N-protegido (N-Fmoc-Xaa-OH por ejemplo, representando Xaa un aminoácido o un péptido en crecimiento cualquiera) y de desprotección (piperidina al 20% en DMF para la escisión de un grupo Fmoc). Las técnicas de lavado y de filtración de la resina así como de desprotección del grupo Fmoc son las que se utilizan normalmente en síntesis peptídica en fase sólida. Los tres aminoácidos que llevan una cadena R_{a} (véanse las fórmulas Ia, Ib o II) se funcionalizan en su cadena lateral por una función amina que está protegida por un grupo protector ortogonal a los otros (TEOC o metiltritilo, por ejemplo). Al final de la unión, el último grupo N-protector se escinde (en presencia de piperidina al 20% en DMF en el caso de un grupo Fmoc) y la protección del éster C-terminal se escinde. Entonces el precursor lineal se somete a ciclización de "cabeza a cola" ("head to tail") en presencia de un reactivo de acoplamiento (tradicional en síntesis peptídica) y de una base terciaria tal como DIEA o colidina, por ejemplo. La reacción de ciclización puede seguirse mediante una prueba colorimétrica tal como la prueba de Kaiser (Kaiser et al., 1970). Al final de la ciclización, se escinden los grupos protectores de aminoácidos que presentan una función amina protegida y el brazo espaciador, convenientemente protegido (Fmoc-Ahx (ácido 6-aminohexanoico)-COOH, por ejemplo), se acopla en presencia de un agente de acoplamiento en las tres funciones aminas libres. A la salida de este acoplamiento, el grupo protector del brazo espaciador se escinde y el péptido D se une mediante procedimientos clásicos de síntesis peptídica. Al final de la síntesis y una vez se quita el último grupo protector, se escinde la molécula de la resina, por ejemplo, mediante tratamiento con ácido trifluoroacético, se liofiliza tras la precipitación con éter y se purifica mediante HPLC preparatoria en fase inversa sobre una columna C18 por ejemplo.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación en disolución de una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en la que A es un radical C_{3} cíclico y responde a una de las fórmulas Ia, Ib, II, VIb, VIc o VId tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

formar un precursor lineal de A, precursor que está constituido por un encadenamiento de aminoácidos que forman una cadena peptídica en crecimiento, sintetizada mediante ciclos sucesivos de acoplamiento entre residuos de aminoácidos N-protegidos, de los cuales tres que llevan un grupo R_{a} de tipo amina, y la función amina de la cadena peptídica en crecimiento, y de desprotección,

-

ciclizar el precursor lineal de A protegido mencionado anteriormente,

-

escindir los grupos protectores citados anteriormente, para liberar las funciones aminas protegidas citadas anteriormente,

-

acoplar las tres funciones aminas liberadas con un péptido -D-B que corresponde a un brazo espaciador B unido a un péptido D protegido,

-

desproteger los grupos protectores presentes en el péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica según la invención.

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en la que A es un radical C_{3} ramificado y responde a una de las fórmulas IV, V, VI o VIa tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

acoplar las tres funciones aminas del radical A de fórmula IV, V, VI o VIa con un brazo espaciador B protegido,

-

desproteger el brazo espaciador B,

-

unir el brazo espaciador B desprotegido con aminoácidos protegidos que entran en la constitución de un péptido D, mediante ciclos sucesivos de acoplamiento, de purificación y de desprotección de aminoácidos mencionados anteriormente,

-

desproteger el último aminoácido que entra en la constitución del péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica según la invención.

Los compuestos de la invención que comprenden un grupo A que es un radical ramificado de simetría C_{3}, y que corresponde en particular a las fórmulas IV, V, VI o VIa, pueden sintetizarse en fase sólida o en disolución según el procedimiento detallado a continuación en la presente memoria.

\newpage

Cuando el radical A se funcionaliza por funciones aminas, el brazo espaciador convenientemente protegido (Boc-Ahx-OH, por ejemplo) se acopla en presencia de un reactivo de acoplamiento según los procedimientos de síntesis peptídica sobre las tres funciones aminas de A. A la salida de ese acoplamiento, cuya reacción puede seguirse por una cromatografía en capa fina, el producto se aísla y se purifica en una columna de sílice según las técnicas tradicionales de síntesis orgánica. El grupo Boc se escinde a continuación por el ácido trifluoroacético, y el péptido D se forma en disolución mediante etapas sucesivas de acoplamiento, purificación y desprotección del grupo Boc. Al final de la síntesis, los grupos protectores sobre las cadenas laterales se escinden o bien mediante hidrogenación catalítica o bien mediante tratamiento con ácido fluorhídrico HF. A continuación, la molécula trimérica se purifica mediante HPLC preparatoria en fase inversa sobre una columna C18, por ejemplo.

Cuando el radical A se funcionaliza por funciones ácidos carboxílicos, el brazo espaciador convenientemente protegido (hexametilendiamina mono protegida por un grupo Boc, por ejemplo) se acopla en presencia de un reactivo de acoplamiento según los procedimientos de síntesis peptídica en las tres funciones de ácido carboxílico de A. A la salida de ese acoplamiento, cuya reacción puede seguirse mediante cromatografía en capa fina, el producto se aísla y se purifica en una columna de sílice según las técnicas tradicionales de síntesis orgánica. El grupo Boc se escinde a continuación por el ácido trifluoroacético, y el péptido D se forma en disolución mediante etapas sucesivas de acoplamiento, purificación y desprotección del grupo Boc. Al final de la síntesis, los grupos protectores sobre las cadenas laterales se escinden o bien por hidrogenación catalítica o bien por tratamiento con ácido fluorhídrico HF. A continuación, la molécula trimérica se purifica mediante HPLC preparatoria en fase inversa sobre una columna C18, por ejemplo.

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación sobre soporte sólido de una molécula multimérica tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria, en la cual A es un radical ramificado no simétrico que responde a una de las fórmulas VII o VIII tal como se han definido anteriormente en la presente memoria, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

injertar una lisina sobre un soporte sólido, estando protegidas cada una de las dos funciones aminas de la lisina, respectivamente en posición \alpha y \varepsilon, respectivamente por grupos protectores diferentes y ortogonales,

-

alargar la cadena peptídica formada a partir de la lisina, a la longitud deseada, por acoplamientos y desprotecciones sucesivas

\text{*}

bien únicamente de las funciones aminas en posición \alpha con el fin de obtener el radical A de fórmula VII, con funciones aminas protegidas en posición \varepsilon,

\text{*}

bien únicamente de las funciones aminas en posición \varepsilon con el fin de obtener el radical A de fórmula VIII, con funciones aminas protegidas en posición \alpha,

-

acoplar las funciones aminas desprotegidas en posición \varepsilon en el radical A de fórmula VII o en posición \alpha en el radical A de fórmula VIII, con un brazo B protegido,

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unir el brazo espaciador B desprotegido con un péptido D ya formado o formado in situ por la unión secuencial de los residuos de aminoácidos que corresponden al péptido D, y

-

escindir la molécula así obtenida del soporte sólido, tras la supresión de todos los grupos protectores presentes en las cadenas laterales funcionalizadas del péptido D.

Los compuestos de la invención que comprenden un grupo A que es un radical ramificado no simétrico, pueden sintetizarse en fase sólida según el procedimiento detallado a continuación en la presente memoria.

Se utiliza una resina Fmoc-Xaa-Wang (Xaa puede ser cualquier aminoácido o péptido en crecimiento) o una resina Fmoc-Rink-amida comercial. Tras la escisión del grupo Fmoc con piperidina al 25% en DMF (dimetilformamida)
(2 x 15 min), se activa el aminoácido, que lleva la cadena amina funcionalizada, convenientemente protegida de manera ortogonal en particular por un grupo Fmoc o un grupo Mtt (metiltritilo) en el caso de una función amina (Fmoc-Lys(Mtt)-OH, por ejemplo), con un agente de acoplamiento en presencia de una base terciaria y se acopla sobre la resina. El grupo Mtt o Fmoc se escinde selectivamente por tratamiento con una disolución (6 ml) de 85% de diclorometano (DCM), 10% de triisopropilsilano (TIS), 5% de ácido trifluoroacético (TFA) (3 x 3 min) (caso del Mtt), o de piperidina al 25% en DMF (caso del Fmoc). La cadena se alarga a la longitud deseada (siendo k un número entero comprendido entre 3 y 6) por acoplamientos y desprotecciones sucesivas utilizando el mismo aminoácido (Fmoc-Lys(Mtt)-OH, por ejemplo). Tras la desprotección del último grupo Fmoc o Mtt, se escinde el resto de grupos protectores (Mtt o Fmoc) y el brazo espaciador convenientemente protegido (Fmoc-Ahx-COOH por ejemplo) se acopla en presencia de un agente de acoplamiento sobre las funciones aminas libres. A la salida de ese acoplamiento, se escinde el grupo protector del brazo espaciador y se forma el péptido D mediante procedimientos tradicionales de síntesis peptídica. Al final de la síntesis y una vez quitado el último grupo protector, se escinde el péptido de la resina (tratamiento con ácido trifluoroacético, por ejemplo), se liofiliza tras la precipitación con éter y se purifica mediante HPLC preparatoria en fase inversa sobre una columna C18, por ejemplo.

Descripción de las figuras

La figura 1A representa el modelo molecular del complejo trivalente CD40-CD40L.

La figura 1B representa residuos de CD40L situados en la superficie de contacto y esenciales en la interacción con CD40. Los residuos marcados con una estrella pertenecen a la segunda subunidad CD40L que forma la superficie de contacto.

La figura 2 representa la estructura de los ligandos triméricos de la invención.

Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D representan la expresión de CD95 en la superficie de células del linfoma de Burkitt BL41 en el momento de la interacción CD40-CD40L, medida mediante citometría de flujo. Las superficies en gris representan el control isotípico y la curva en gris claro representa la fluorescencia proporcional a la cantidad de anti-CD95 fijado sobre las células.

La figura 3A representa la expresión de CD95 cuando las células BL41 mencionadas anteriormente (5.10^{5}/ml) se incuban con fibroblastos 3T6 no transfectados.

La figura 3B representa la expresión de CD95 cuando las células BL41 mencionadas anteriormente (5.10^{5}/ml) se incuban con fibroblastos 3T6 transfectados por CD40L.

La figura 3C representa la expresión de CD95 cuando las células BL41 mencionadas anteriormente (5.10^{5}/ml) se incuban con fibroblastos 3T6 no transfectados, en presencia de anticuerpos anti-CD40L.

La figura 3D representa la expresión de CD95 cuando las células BL41 mencionadas anteriormente (5.10^{5}/ml) se incuban con fibroblastos 3T6 transfectados por CD40L, en presencia de anticuerpos anti-CD40L.

La figura 4A representa la inhibición de la incorporación de timidina tritiada de células del linfoma de Burkitt BL41 (4.10^{5} células/ml) tras 24 h de cultivo en presencia de diferentes concentraciones de ligandos (L4, L7, L7-1, L7-2 o L7-3) o de CD40L soluble (CD40Ls). Las columnas negras corresponden a una concentración igual a 50 \muM; las columnas con trazos horizontales corresponden a una concentración igual a 5 \muM; las columnas blancas corresponden a una concentración igual a 0,5 \muM; las columnas grises corresponden a una concentración igual a 100 nM y las columnas cuadriculadas corresponden a una concentración igual a 50 nM.

La timidina tritiada se añadió a una concentración de 1 \muci/pocillos (0,8.10^{5} células/pocillos) durante las 8 últimas horas del cultivo y la incorporación de timidina tritiada medida con la ayuda de un contador \beta en centelleo gaseoso.

La figura 4B representa el porcentaje de apoptosis específica de células del linfoma de Burkitt BL41 (4.10^{5} células/ml) tras 24 h de cultivo en presencia de diferentes concentraciones de ligandos L4, L4bis, L8, L7, L9 y L11. Las columnas negras corresponden a una concentración igual a 50 \muM; las columnas blancas corresponden a una concentración igual a 25 \muM; las columnas con trazos horizontales corresponden a una concentración igual a 12,5 \muM y las columnas con trazos oblicuos corresponden a una concentración igual a 6 \muM.

La apoptosis se mide en citometría de flujo tras el marcado con la anexina V FITC y yoduro de propidio. Las células marcadas con anexina V sola o con la anexina V y el yoduro de propidio se consideran como apoptóticas. El porcentaje de apoptosis específica se calcula por la fórmula siguiente:

[(% de apoptosis con el ligando - % de apoptosis sin el ligando)/(100 - % de apoptosis sin el ligando)] x 100

La figura 5A representa el porcentaje de ratones MRL^{-lpr} (Koopman et al., 1998) vivos de diferentes edades tras la inyección intravenosa de 100 \mul/ratón de PBS que contiene o no 100 \mug de ligando L4. Las inyecciones tuvieron lugar a la edad de 7, 9 y 11 semanas. La curva en trazo continuo corresponde a una inyección de PBS sin el ligando L4 y la curva en trazo punteado corresponde a una inyección de PBS con el ligando L4.

La figura 5B representa el porcentaje de ratones MRL^{-lpr} que presentan anticuerpos anti-ADN (evaluado por una prueba de ELISA) en su suero con diferentes edades tras el mismo tratamiento que en la figura 5A. Las columnas blancas corresponden a una inyección de PBS sin el ligando L4 y las columnas negras corresponden a una inyección de PBS con el ligando L4.

La figura 5C representa el porcentaje de ratones MRL^{-lpr} que presentan una proteinuria positiva en sus orinas con diferentes edades tras el mismo tratamiento que en la figura 5A. Las columnas blancas corresponden a una inyección de PBS sin el ligando L4 y las columnas negras corresponden a una inyección de PBS con el ligando L4.

* La totalidad de ratones tratados por el ligando L4 murieron.

Preparación de compuestos L1, L2, L3 y L4 A) Preparación del compuesto L1

El compuesto L1 responde a la fórmula siguiente:

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Se sintetizó el compuesto L1 en fase sólida sobre una resina Wang-Ala-Fmoc comercial sobre una escala de 200 \mumol. Tras la escisión del grupo Fmoc con 25% de piperidina en DMF (dimetilformamida) (2 x 15 min), se acopló el aminoácido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (3 equivalentes) activado con Bop (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio) (3 equivalentes), HOBt (1-hidroxibenzotriazol) (3 equivalentes) y DIEA (diisopropiletilamina) (9 equivalentes) en DMF a la resina (2 x 15 min). Las técnicas de lavado y de filtración de la resina, así como de desprotección del grupo Fmoc son las corrientemente utilizadas en la síntesis peptídica en fase sólida. Se escindió el grupo Mtt (4-metiltritilo) con una disolución (6 ml) del 85% de DCM (diclorometano), 10% de TIS (triisopropilsilano), 5% de TFA (ácido trifluoroacético) (3 x 3 min). Se acoplaron el segundo y el tercero Fmoc-Lys(Mtt)-OH con la misma estrategia y las mismas cantidades de reactivos anteriores de la presente memoria. Se acopló la cuarta lisina en forma de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH. Tras la desprotección del grupo Fmoc con piperidina al 25% en DMF (2 x 15 min), se acoplaron los aminoácidos Fmoc-Arg(Pbf)-OH y Fmoc-Pro-OH (15 equivalentes) activados con Bop (15 equivalentes), HOBt (15 equivalentes) y DIEA (45 equivalentes) en DMF durante 15 minutos (cada acoplamiento se repite 2 veces). El enlace amida reducido entre la lisina y la prolina se formó sobre la resina utilizando la reacción de afinación reductora del aldehído Boc-Lys(Boc)-CHO (2,5 equivalentes) en presencia de NaBH_{3}CN (2,5 equivalentes) en DMF que contiene un 1% de ácido acético (2 x 1 h). Se escindió el producto de la resina con una disolución (5 ml) del 80% de TFA, 10% de DCM, 10% de TIS durante 2 horas. Tras la precipitación en el éter frío, se liofilizó el producto bruto en una mezcla H_{2}O/acetonitrilo/ácido acético (80/15/5). Se controló el producto mediante espectrometría de masas (MALDI-EM (Matrix assisted laser desorption ionisation mass spectrometry)) y HPLC analítica y se purificó mediante HPLC preparatoria sobre columna C18 utilizando un gradiente de acetonitrilo en agua.

B) Preparación del compuesto L2

El compuesto L2 responde a la fórmula siguiente:

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El compuesto L2 se sintetizó como L1 hasta la cuarta lisina. Tras la desprotección del grupo Fmoc con 25% de piperidina en DMF (2 x 15 min), se acetilaron los grupos aminados libres con una disolución de anhídrido acético (1 ml) en DCM (2 ml) en presencia de DIEA (1 ml) durante 15 minutos. Se escindió el producto de la resina con una disolución (5 ml) del 80% de TFA, 10% de DCM, 10% de TIS durante 2 horas. Tras la precipitación en éter frío, se liofilizó el producto bruto en una mezcla de H_{2}O/acetonitrilo/ácido acético (80/15/5). Se controló el producto mediante espectrometría de masas (MALDI-EM) y HPLC analítica y se purificó mediante HPLC preparatoria sobre columna C18 utilizando un gradiente de acetonitrilo en agua.

C) Preparación del compuesto L3

El compuesto L3 responde a la fórmula siguiente:

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El compuesto L3 se sintetizó como L1 hasta la cuarta lisina. Tras la desprotección del grupo Fmoc con 25% piperidina en DMF (2 x 15 min), se acoplaron los aminoácidos Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH y Fmoc-Lys(Boc)-OH (15 equivalentes) activados con Bop (15 equivalentes), HOBt (15 equivalentes) y DIEA (45 equivalentes) en DMF durante 15 minutos (cada acoplamiento se repitió 2 veces). Se escindió el producto de la resina con una disolución (5 ml) del 80% de TFA, 10% de DCM, 10% de TIS durante 2 horas. Tras la precipitación en el éter frío, se liofilizó el producto bruto en una mezcla H_{2}O/acetonitrilo/ácido acético (80/15/5). Se controló el producto mediante espectrometría de masas (MALDI-EM) y HPLC analítica y se purificó mediante HPLC preparatoria sobre columna C18 utilizando un gradiente de acetonitrilo en agua.

D) Preparación de los compuestos L4 y L4bis

El compuesto L4 responde a la fórmula siguiente:

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El compuesto L4bis responde a la fórmula siguiente:

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1) Preparación de sintones a) Boc-(D)Ala-OAll

Se disolvió el aminoácido Boc-D-Ala-OH (1,89 g, 10 mmol) en 70 ml de ACN (acetonitrilo) y se enfrió la disolución a 0ºC. Tras haber añadido 1,5 ml (1,2 equivalentes) de DBU (1,8-diazabiciclo[5,4,0]undecen-7-eno), se añadió gota a gota una disolución de bromuro de alilo (0,72 ml, 1 equivalente), en 10 ml de acetonitrilo, durante aproximadamente 15 minutos. La reacción, seguida mediante cromatografía en capa fina (CCF) transcurrió a temperatura ambiente durante 21 horas. Tras la evaporación del acetonitrilo, se disolvió el producto bruto en acetato de etilo y se lavó la disolución orgánica con NaHCO_{3} al 5%, H_{2}O, KHSO_{4} 1N y H_{2}O. Tras el secado sobre Na_{2}SO_{4} y la evaporación de la fase orgánica, se recuperó el producto en forma de aceite con un rendimiento del 73%. El producto se caracterizó mediante espectroscopia RMN y FT-IR, y se utilizó para la reacción siguiente sin purificaciones posteriores.

b) HCl x H-(D)Ala-OAll

Se disolvió el aminoácido Boc-D-Ala-OAll (1,67 g; 7,3 mmol) en una disolución de 5 ml de HCl (4 M) en dioxano bajo atmósfera de argón durante 30 minutos. Se siguió la reacción mediante CCF. Tras la evaporación de la disolución ácida, se obtuvo el producto sólido a vacío con un rendimiento del 90%. El producto se caracterizó mediante espectroscopia de RMN et FT-IR, y se utilizó para la reacción siguiente sin purificaciones posteriores.

c) Fmoc-Lys(Mtt)-OAll

Se disolvió el aminoácido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (625 mg, 1 mmol) en 5 ml de diclorometano (DCM) en presencia de HOBt (1 equivalente) y EDC x HCl (EDC: metyoduro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (1,1 equivalentes). Tras 5 minutos, se añadieron alcohol alílico (1 equivalente) y DMAP (4-dimetilaminopiridina) (0,1 equivalentes). Tras 27 horas, se añadieron 0,5 equivalentes de HOBt, EDC x HCl, alcohol alílico y 0,1 equivalentes de DMAP. La reacción transcurrió en total durante 44 horas. Tras la evaporación del diclorometano, se disolvió el producto bruto en acetato de etilo y se lavó la disolución orgánica con NaHCO_{3} al 5%, H_{2}O, KHSO_{4} 1N y H_{2}O. Tras el secado sobre Na_{2}SO_{4} y la evaporación de la fase orgánica, se recuperó el producto en forma de aceite con un rendimiento del 94%. El producto se caracterizó mediante espectroscopia de RMN y FT-IR, y se utilizó para la reacción siguiente sin purificaciones posteriores.

d) H-Lys(Mtt)-OAll

Se disolvió Fmoc-Lys(Mtt)-OAll (240 mg, 0,36 mmol) en 20% de DEA (dietilamina) en DCM (10 ml). La reacción, seguida mediante CCF, transcurrió durante 5 horas tras haber añadido otros 3 ml de DEA. Tras la evaporación de la disolución, se disolvió el producto bruto en dietiléter y se extrajo con una disolución de KHSO_{4} 1 N. Se basificó la disolución ácida con NaHCO_{3} sólido y volvió a extraerse el producto con acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con H_{2}O, se secó sobre N_{2}SO_{4} y se evaporó. El producto se recuperó en forma de aceite con un rendimiento cuantitativo, y se utilizó para la reacción siguiente.

2) Aminación reductora sobre soporte sólido

Se realizó la reacción de aminación reductora en fase sólida sobre una resina 2-(3,5-dimetoxi-4-formilfenoxi)etilpoliestireno comercial, sobre una escala de 62 \mumol. Se disolvieron HCl x H-D-Ala-OAll (10 equivalentes) y NaBH_{3}CN (10 equivalentes) en DMF y se añadieron a la resina. La reacción, seguida mediante espectrometría de FT-IR, transcurrió durante 24 horas con agitación.

3) Preparación del dipéptido lineal, precursor de L4 y L4bis

Se disolvió el aminoácido Fmoc-Lys(Mtt)-OH (5 equivalentes) en 1 ml de diclorometano en presencia de colidina (14 equivalentes) y se activó con trifosgeno (1,65 equivalentes) durante 1 minuto. A continuación, se añadió la disolución a la resina (62 \mumol) y la reacción de acoplamiento transcurrió durante 30 minutos. Se lavó la resina exhaustivamente con DCM, con DMF y se secó con éter.

4) Preparación del tripéptido lineal precursor de L4 y L4bis

Se trató el conjugado dipéptido-resina (62 \mumol) con Pd(Ph_{3})_{4} (2 equivalentes), disuelto en 2 ml de una disolución de DCM:AcOH (ácido acético):NMM (N-metilmorfolina) con una razón de 1850:100:50 durante 6 h en argón. Se siguió la reacción mediante espectrometría de FT-IR. A continuación, al aminoácido H-Lys(Mtt)-OAll (5,8 equivalentes), disuelto en 1,5 ml de DMF y 600 \mul de DCM, se le añadieron HATU [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluranio] (4 equivalentes) HOAt (7-azabenzotriazol) (4 equivalentes), CuCl_{2} (0,5 equivalentes) y colidina (9 equivalentes). Se añadió la disolución a la resina (62 \mumol) y la reacción de acoplamiento transcurrió durante 2 horas. La resina se lavó exhaustivamente con DMF, con DCM, con metanol, se secó con éter y se controló mediante espectrofotometría de FT-IR.

5) Preparación del hexapéptido cíclico L4 y L4bis

Tras la desprotección del grupo Fmoc con 25% de piperidina en DMF (2 x 15 min), se acoplaron los aminoácidos Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH y Fmoc-D-Ala-OH (5 equivalentes) activados con Bop (5 equivalentes), HOBt (5 equivalentes) y DIEA (15 equivalentes) en DMF durante 1 hora (cada acoplamiento se repitió 2 veces). El grupo alilo se escindió con Pd(Ph_{3})_{4} (2 equivalentes), disuelto en 2 ml de una disolución de DCM:AcOH:NMM con una razón de 1850:100:50 durante 6 h en argón. El grupo Fmoc se escindió con una disolución al 25% de piperidina en DMF (2 x 15 min). El derivado de hexapéptido-resina lineal con los extremos N- y C-terminales libres se sometió a ciclización en presencia de HOAt (4 equivalentes), DIC (diisopropilcarbodiimida) (4,4 equivalentes) en una disolución de DMF/DCM 5:2 (2,1 ml) durante 3 horas. El grupo Mtt se escindió con una disolución (2 ml) del 85% de DCM, 10% de TIS, 5% de TFA (3 x 2 min). Se acoplaron los aminoácidos Fmoc-Ahx-OH (H-Ahx-OH: ácido 6-aminohexanoico), Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH y Fmoc-Lys(Boc)-OH (15 equivalentes) activados con Bop (15 equivalentes), HOBt (15 equivalentes) y DIEA (45 equivalentes) en DMF durante 1 hora (cada acoplamiento se repitió 2 veces). El péptido cíclico se escindió de la resina con una disolución (3 ml) del 90% de TFA, 5% de H_{2}O, 5% de TIS durante 2 horas. Se repitió la escisión una segunda vez en las mismas condiciones durante 3 horas. Tras la precipitación en éter frío, se obtuvo a la vez el producto L4 y el subproducto L4bis que, a continuación, se liofilizaron en una mezcla H_{2}O/acetonitrilo/ácido acético (80/15/5). Se controlaron los productos mediante espectrometría de masas (MALDI-EM) y HPLC analítica, se purificaron y se separaron mediante HPLC preparatoria sobre columna C_{18} utilizando un gradiente de acetonitrilo en agua.

E) Preparación del compuesto L7

El ligando L7 responde a la fórmula siguiente:

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Esquema de reacción

Preparación del monómero 6 (producto intermedio)

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a. Se disolvieron 2 g (1 eq.) de tris(hidroximetil)aminometano 1 en THF con agitación y se añadió un 40% de KOH acuoso y, a continuación, se añadieron 4,34 ml (4 eq.) de acrilonitrilo. Se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente con agitación durante 24 horas. Tras la evaporación de una parte del THF, se añadió agua y, a continuación, se extrajo con diclorometano (DCM), se secó sobre sulfato de sodio. Tras haber eliminado el disolvente por evaporación, se obtuvo el producto bruto 2. A continuación, se purificó mediante cromatografía (EA/HEX/MeOH =
3,5/3,5/1). Masa: 2,5 g; rendimiento: 54%.

b. Se disolvieron 2 g (1 eq.) del compuesto 2 en THF con agitación, y se enfriaron con un baño de hielo. Se disolvieron 2,14 g (1,5 eq.) de (Boc)_{2}O en THF en otro frasco, que, a continuación, se añadieron lentamente al medio de reacción, tras haber añadido 2,3 ml (1,5 eq.) de DIEA en el medio de reacción. Se conservó el conjunto a temperatura ambiente y con agitación durante la noche. Tras la evaporación de una parte del THF, se añadió acetato de etilo y se lavó secuencialmente con KHSO_{4} (1 N) H_{2}O, NaHCO_{3} (est.) y NaCl (est.). A continuación, se purificó el producto 3 mediante cromatografía (DCM/EA = 10/1). Peso: 2,39 g; rendimiento: 71%.

c. Se disolvió el compuesto 3 en MeOH/CHCl_{3} (55/1). Se añadió un 10% de PtO_{2} y, a continuación, se barrió el frasco con hidrógeno y se mantuvo en atmósfera de hidrógeno durante la noche. Tras la filtración y la evaporación del disolvente, se obtuvo el compuesto 4 y se secó a vacío.

d. Se disolvió el compuesto 4 en agua con agitación. Se añadieron 6 eq. de NaHCO_{3} en forma de polvo. Se disolvieron 3,6 eq. de FmocOSu en THF y se añadieron a la mezcla de reacción. La reacción duró 4 horas y, a continuación, se evaporó el THF. Se extrajo la mezcla restante con DCM y, a continuación, se lavó la fase orgánica con una disolución 1 N de KHSO_{4}. Tras el secado sobre sulfato de sodio, se eliminó el disolvente por evaporación. Se purificó el compuesto final mediante cromatografía (acetato de etilo/Hexano/ácido acético = 3/7/0,5).

e. Se disolvió el compuesto 5 en TFA puro con agitación durante 30 minutos y, a continuación, se retiró el TFA por evaporación para dar el compuesto 6 (monómero). El rendimiento global de las dos últimas etapas es del 73,3%.

Las reacciones sobre resinas se realizaron en una jeringuilla con agitación.

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f. Se hinchó la resina amida de Rink R-1 con una carga de 0,62 mmol/g en dimetilformamida (DMF). Se retiró el grupo Fmoc mediante piperidina al 25%/DMF. La reacción se realizó dos veces y cada vez durante 20 minutos.

g. Se hinchó la resina R-2 en DCM y se añadieron 10 eq. de ácido succínico y 1 eq. de piridina. Se continuó la reacción hasta que la prueba con ninhidrina fue negativa. Se filtró la resina y se lavó DCM y DMF.

h. Se hinchó la resina R-3 con DMF y, a continuación, se añadieron secuencialmente 6 eq. de compuesto 6 (monómero 1), 5 eq. de BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio), 5 eq. de HoBt (1-hidroxibenzotriazol) y 15 eq. de DIEA (diisopropiletilamina). Seis horas más tarde, se filtró la resina y se lavó con DMF, DCM, éter y se secó a vacío para dar R-4. La carga es de 0,24 mmol/g tras dosificación UV cuantitativa del grupo fluorenilo, y la conversión global es del 84%.

i. Se retiró el grupo Fmoc mediante piperidina al 25%/DMF para dar R-5. La reacción se realizó dos veces y cada vez durante 20 minutos.

j. Se hinchó la resina R-5 en DMF. Se añadieron y acoplaron 15 eq. de ácido Fmoc-6-aminocaproico, 15 eq. de BOP, 15 eq. de HoBt y 60 eq. de DIEA durante 4 h para dar R-6. La reacción se verificó mediante la prueba de la ninhidrina.

k. Se retiró el grupo Fmoc mediante piperidina al 25%/DMF. Se disolvieron 15 eq. de Fmoc-Xaa-OH, 15 eq. de BOP y 15 eq. de HoBt en DMF y, a continuación, se añadió la disolución a la resina, tras haber añadido 60 eq. de DIEA. Para cada aminoácido, la reacción de acoplamiento se realizó dos veces y cada vez durante 30 minutos. Finalmente, la resina R-7 se verificó mediante la prueba de la ninhidrina.

l. Se escindió el péptido sintetizado con TFA/H_{2}O (95/5) durante 30 minutos y, a continuación, se filtró la resina. Se recuperó la disolución y se precipitó en éter frío. Tras haber retirado el éter, se secó el péptido final L7 y se purificó mediante HPLC y se analizó mediante espectrometría de masas.

Se sintetizaron análogos de L-7 siguiendo el mismo esquema de síntesis pero cambiando la secuencia peptídica para la interacción con CD40:

Se trata de la secuencia acetilada: Ac-Lys-Gly-Tyr-Tyr- para dar la construcción L7-1

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y de la secuencia invertida: H-Tyr-Tyr-Gly-Lys- para dar la construcción L7-2

29

o de una modificación del brazo espaciador: sustitución del ácido aminohexanoico por una glicina: L7-3

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F) Preparación del compuesto L11

El ligando L11 responde a la fórmula siguiente:

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Esquema de reacciones

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a) ácido Fmoc-6-aminocaproico, DIEA, DCM; b) piperidina al 25%/DMF;

c) Fmoc-Xaa-OH BOP, HoBt, DIEA, DMF; d) 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol/DCM (60/40)

1) Preparación del pentapéptido protegido: Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Ahx-OH

Las reacciones sobre resina se realizaron en una jeringuilla y con agitación.

Se lavaron 1,5 g (1 eq.) de resina de 2-clorotritilcloruro (R1-A) (0,96 mmol/g) dos veces con DCM destilado en una jeringuilla con agitación. Se preparó y añadió una mezcla de 1,02 g (2 eq.) de ácido Fmoc-6-aminocaproico y 1,5 ml (6 eq.) de DIEA en DCM a la resina. Tres horas después, se filtró la resina y se lavó con DCM. Ésta se hinchó de nuevo en metanol con agitación durante 1 hora. A continuación se filtró y se lavó con DMF, IpOH (isopropanol), DCM, éter. A continuación se secó a vacío para dar R-2A.

Se trató la resina R-2A con una disolución de piperidina al 25%/DMF durante 20 minutos y a continuación se filtró la resina para dar R-3A y se recuperó la disolución. Se realizó la reacción dos veces. La carga de la resina 2 era de 0,6 mmol/g por dosis UV cuantitativa de la disolución recuperada y la conversión de la reacción de acoplamiento fue del 81%.

Procedimiento general para el acoplamiento de los aminoácidos: se disolvieron 5 eq. de Fmoc-Xaa-OH, 5 eq. de BOP y 5 eq. de HoBt en DMF y a continuación se añadió la mezcla a la resina que se hinchó previamente en DMF. Se añadieron 15 eq. de DIEA en el sistema de reacción. Se realizó la reacción de acoplamiento dos veces y cada vez durante 30 minutos. Se sometió a prueba la resina por la prueba de la ninhidrina.

Tras repetir estos procedimientos de desprotección y de acoplamiento utilizando los aminoácidos necesarios para la síntesis del péptido, se obtuvo la resina R-4A.

Se puso la resina R-4A en una jeringuilla. Se añadió una mezcla de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y DCM (60/40) a la resina. Se mantuvo la jeringuilla con agitación durante 2 horas y a continuación se filtró la resina y se recuperó la disolución. Tras la evaporación del disolvente, se precipitó el producto restante en éter frío y a continuación se purificó mediante HPLC para dar 1-A.

2) Se trató el péptido 1-A con TFA en presencia de agua y de triisopropilsilano (95:5:5) para dar L11 que se precipitó en éter frío, se centrifugó, liofilizó y purificó mediante HPLC en fase inversa (RP-HPLC).

G) Preparación del compuesto L9 1) Preparación de Z-beta-Lys(Boc)-OH (4B) y Z-beta-Lys(Boc)-OMe (5B)

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a) EtOCOCl, NMM, THF; b) CH_{2}N_{2}/Et_{2}O; c) CF_{3}COOAg, NMM, THF/H_{2}O al 10% d) yodometano, K_{2}CO_{3}, acetonitrilo

a) Se disolvieron 40 mmol (1 eq.) de Z-Lys(Boc)OH en 100 ml de THF con agitación. Se añadieron 5,27 ml (1,2 eq.) de NMM, a continuación se enfrió la mezcla de reacción a -20ºC. Se disolvieron 4,59 ml (1,2 eq.) de cloroformiato de etilo en 30 ml de THF, y a continuación se añadió la totalidad gota a gota en el sistema de reacción. Se mantuvo la mezcla de reacción que contenía 2-B en frío durante 20 minutos más.

b) Preparación de diazometano:

Se disolvieron 7,76 g de KOH en una mezcla de 12,5 ml de agua, 10 ml de éter y 35 ml de 2-(2-etoxietoxi)etanol con agitación. Se calentó a 75ºC. Se disolvieron 15,52 g de diazald (N-metil-N-nitroso-p-toluenosulfonamida; Aldrich) en 140 ml de éter y se añadió la totalidad gota a gota en la mezcla de reacción. Se condensó el diazometano así producido a -75ºC en un baño de hielo en acetona. Se añadió la disolución en éter de diazometano así producida a la disolución de reacción de 2-B y, a continuación, se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió 1 ml de etilamina (EA) y a continuación una gran cantidad de NaHCO_{3} (est.). Tras la separación de las fases orgánica y acuosa, se lavó la fase orgánica dos veces con NaHCO_{3} y una vez con NaCl (est). Tras secarla sobre sulfato de sodio, se evaporó el disolvente y se secó la diazocetona 3-B así producida a vacío. Masa: 15,4 g; rendimiento: 95%.

c) Reacción de transposición:

Se disolvieron 7 g (1 eq.) de la diazocetona 3-B en una mezcla de 110 ml de THF y 18 ml de agua con agitación protegida de la luz y se enfrió el conjunto a -20ºC. Se añadieron 435 mg (0,11 eq.) de benzoato de plata y 6,07 ml (2,5 eq.) de trietilamina. Se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Se evaporó una parte del THF, se añadieron 20 ml de éter que se extrajo varias veces con NaHCO_{3}. Se combinó la fase acuosa y se acidificó a pH 3 con polvo de KHSO_{4}. Se extrajo la disolución con DCM y se secó sobre sulfato de sodio. Tras evaporar el disolvente, se secó el producto final 4-B a vacío. Masa: 5 g; rendimiento: 73%.

d) Se disolvieron 1,67 g (1 eq.) de aminoácido \beta 4-B tal como se obtuvo anteriormente en acetonitrilo y se enfrió el conjunto a 0ºC con un baño de hielo. Al cabo de una hora, se añadieron 1,32 ml (5 eq.) de yodometano. Se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se evaporó el acetonitrilo y se añadió acetato de etilo, que se lavó secuencialmente con NaHCO_{3} (st.), KHSO_{4} (1 N) y NaCl (est.). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio y se eliminó el disolvente mediante evaporación para dar 5-B. Masa: 1,53 g; rendimiento: 88%.

2) Construcción de la molécula núcleo protegida

Esquema de reacciones

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e) Se disolvieron 765 mg (1 eq.) de compuesto 5-B en etanol con agitación y se añadió un 10% de Pd/C (en peso). Se barrió el frasco con hidrógeno tres veces y se mantuvo bajo una atmósfera de hidrógeno durante 2 horas. Tras filtración, se eliminó el disolvente mediante evaporación y se secó el producto 6-B restante a vacío. Masa: 400 mg; rendimiento: 98%.

f) Se disolvieron 657 mg (1 eq.) de compuesto 4-B en 3 ml de DMF con agitación y a continuación se añadieron secuencialmente 40 mg (1,1 eq.) de compuesto 6-B, 738 mg (1 eq.) de BOP y 726 \mul (2,5 eq.) de DIEA. Dos horas después, se precipitó la mezcla de reacción en NaHCO_{3} (est). Tras filtración, se lavó el sólido con H_{2}O, KHSO_{4}, NaCl (est.) y a continuación se secó a vacío. Masa: 1 g; rendimiento: 84%. Se hidrogenó este compuesto en MeOH para dar 7-B con un rendimiento cuantitativo.

g) Se disolvió 1 equivalente de compuesto 4-B en 3 ml de DMF con agitación y a continuación se añadió secuencialmente 1,1 eq. de compuesto 7-B, 1 eq. de BOP, 2,5 eq. de DIEA. Al cabo de dos horas, se precipitó la mezcla de reacción en NaHCO_{3} (est). Tras filtración, se lavó el sólido con H_{2}O, KHSO_{4}, NaCl (est.) y a continuación se secó a vacío para dar 8-B.

h) Se disolvieron 100 mg de compuesto 8-B en metanol con agitación y se añadió un 10% de Pd/C (en peso). Se barrió el frasco con hidrógeno tres veces y se mantuvo bajo una atmósfera de hidrógeno durante 2 horas. Tras filtración, se eliminó el disolvente mediante evaporación y se secó el producto a vacío para dar 9-B. Masa: 78 mg; rendimiento: 92%.

i) Se disolvieron 78 mg (1 eq.) de compuesto 9-B en metanol y a continuación se añadieron 10 eq. de NaOH acuoso 2N. Se controló la reacción mediante cromatografía en capa fina CCF (disolventes: acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua). Al final de la reacción, se evaporó el metanol y se añadió agua. Se acidificó la mezcla con ácido acético a pH 3 y se formó un precipitado. Se recuperó el sólido mediante filtración y se secó a vacío para dar 10-B. Masa: 50 mg; rendimiento: 65%.

j) Se disolvieron 50 mg (1 eq.) de compuesto 10-B en 3 ml de DMF y se añadieron 42 \mul (3,5 eq.) de DIEA. Se disolvieron 36 mg (1,2 eq.) de BOP en 3 ml de DMF con agitación. Se añadió gota a gota la disolución preparada anteriormente. Se mantuvo la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 días y a continuación se precipitó en NaHCO_{3} (est.). Se recuperó el precipitado y se lavó con H_{2}O/KHSO_{4} y H_{2}O, luego se secó a vacío para dar 11-B. Masa: 37 mg; rendimiento: 76%.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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3) Desprotección de la molécula núcleo y síntesis de L-9

Esquema de reacciones

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a) Se disolvieron 50 mg (1 eq.) de compuesto 11-B en TFA con agitación durante 30 minutos y a continuación se eliminó el TFA mediante evaporación. Se secó el producto a vacío para dar 12-B (denominado asimismo L10).

b) Se disolvió el compuesto 12-B en DMF con agitación. Se añadieron 217 mg (3,3 eq.) del pentapéptido 1-A que se sintetizó en fase sólida tal como se describió anteriormente, 100 mg (3,3 eq.) de BOP, 39,5 \mul (10 eq.) de DIEA en el sistema de reacción. La reacción duró 25 horas y a continuación se precipitó la mezcla de reacción en una gran cantidad de NaHCO_{3} (ac.). Se filtró el precipitado y se lavó con H_{2}O/KHSO_{4}, H_{2}O y etilamina (EA). Se secó el sólido a vacío para dar 13-B. Masa: 153 mg; rendimiento: 69%.

c) El tratamiento de 13-B con TFA facilitó el compuesto del título con un rendimiento cuantitativo. Se obtuvo el compuesto L9 puro mediante purificación por RP-HPLC (cromatografía en fase inversa).

H) Preparación de L12

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a) Se disolvió 1 equivalente de compuesto 8-B en TFA con agitación durante 30 minutos y a continuación se eliminó el TFA mediante evaporación. Se secó el producto a vacío para dar 1-C.

b) Se disolvió el compuesto 1-C en DMF con agitación. Se añadieron 3,3 eq. del pentapéptido 1-A que se sintetizó en fase sólida tal como se describió anteriormente, 3,3 eq. de BOP y 10 eq. de DIEA en el sistema de reacción. La reacción duró 25 horas y a continuación se precipitó la mezcla de reacción en una gran cantidad de NaHCO_{3} (ac.). Se filtró el precipitado y se lavó con H_{2}O/KHSO_{4}, H_{2}O y etilamina. Se secó el sólido a vacío para dar 2-C. Masa: 153 mg; rendimiento: 69%.

c) El tratamiento de 2-C con TFA facilitó el compuesto L-12 con un rendimiento cuantitativo. Se obtuvo el compuesto L-12 puro mediante purificación por cromatografía RP-HPLC.

Pruebas biológicas

Estas pruebas se realizan en 3 fases. En primer lugar se seleccionan los ligandos más interesantes para pruebas sencillas, luego se someten a prueba sus efectos fisiológicos en modelos de activaciones celulares in vitro. Finalmente, se someten a prueba los ligandos más interesantes en modelos murinos in vivo.

I - Selección de los ligandos

Una vez analizada la integridad estructural de estos ligandos, se somete a prueba su enlace sobre moléculas CD40 solubles o de membrana. Para ello, se mide la inhibición del enlace del CD40L soluble sobre la molécula CD40 adsorbida en plástico o presentada por células B normales o transformadas (linfoma de Burkitt). Esta etapa se evalúa con ayuda de una prueba ELISA y de un marcaje en citometría de flujo que permite visualizar el enlace CD40/CD40L.

A continuación, se evalúa la afinidad de estos ligandos por la molécula CD40 con ayuda de un biosensor (BIAcore™). Se sometió a prueba el efecto agonista o antagonista de los ligandos gracias a dos pruebas biológicas sencillas. En la primera, se estudia la expresión de la molécula de membrana CD95 por células B transformadas (linfomas de Burkitt) tras la activación mediante la interacción CD40-CD40L (Schattner et al., 1996). En un modelo de este tipo, se expresa el componente CD40L en fibroblastos transfectados (3T6-CD40L) (Buelens et al., 1997). Se incuban las células del linfoma de Burkitt BL41 con fibroblastos 3T6 no transfectados (figuras 3A y 3C) o con fibroblastos 3T6 transfectados por CD40L (figuras 3B y 3D). Tras 48 h, se evalúa la expresión de CD95 mediante citometría de flujo. Se induce la expresión de CD95 en presencia de CD40L (figura 3B). Un anticuerpo anti-CD40L comercial inhibe las consecuencias de la interacción CD40-CD40L (figura 3D).

La segunda prueba se basa en la propiedad de ciertos linfomas B de dejar de proliferar y entrar en apoptosis durante la reticulación de su molécula CD40 de membrana (Tong et al., 1999). En esta prueba, se incuban las células BL41 con ligandos de CD40 y se mide tras 24 h o bien la inhibición de la proliferación de estas células, estudiando la incorporación de timidina tritiada, o bien el porcentaje de células apoptóticas mediante un estudio en citometría de flujo (figuras 4A y 4B).

Se evalúa el efecto agonista de los ligandos mediante la medición tras la incubación de las células B con los ligandos o bien de la expresión de CD95 en citometría de flujo o bien de la inhibición de la proliferación y/o del aumento de la muerte por apoptosis.

Se evalúa el efecto antagonista mediante la medición de la disminución de la expresión de CD95 inducida por CD40L en presencia de los diferentes ligandos químicos (véase la tabla I). Gracias a estas pruebas, se seleccionan los ligandos más interesantes para evaluar su actividad in vivo e in vitro en modelos más complejos.

A) Principio de las pruebas biológicas 1- Expresión de CD95 inducida por CD40L

Las células de linfomas B expresan la molécula CD95 cuando reciben una señal por medio de la molécula CD40, que expresan de manera constitutiva. Esta señal se aporta generalmente por la molécula CD40L (CD154) expresada por otra célula. Los ligandos antagonistas inhiben el enlace de CD40 sobre CD40L y bloquean por tanto la expresión de CD95. Los ligandos agonistas imitan a molécula CD40L e inducen la expresión de CD95 incluso en ausencia de la célula que expresa CD40L.

Modo operatorio

Se cultivan las células del linfoma de Burkitt BL41 (5.10^{5}/ml) en presencia de fibroblastos 3T6 (10^{5}/ml) transfectados (3T6-CD40L) o no con CD40L (3T6), y se tratan con mitomicina para detener su proliferación. Se añaden los ligandos al comienzo del cultivo a la concentración deseada. Tras 48 h de cultivo, se mide la expresión de la molécula CD95 mediante citometría de flujo. Se diferencian las células BL41 de los fibroblastos utilizando un anticuerpo anti-CD19 (marcador específico de las células B).

Resultados

Las células BL41 cultivadas en presencia de las células 3T6 no expresan la molécula CD95 (figura 3A). Por el contrario, se induce la expresión de CD95 en la superficie de las células BL41 en presencia de células 3T6-CD40L (figura 3B). Un anticuerpo anti-CD40L comercial, que bloquea la interacción CD40/CD40L, inhibe completamente la expresión de CD95 inducida sobre las células BL41 en presencia de las células 3T6-CD40L (figura 3D).

Se inhibe la expresión de CD95 por el ligando L1 a 100 y 50 \muM (tabla 1). El ligando L3, que presenta la misma estructura de núcleo que L1, pero que presenta una secuencia en aminoácidos diferente, inhibe fuertemente la expresión de CD95 inducida por CD40L de 100 a 25 \muM. El ligando L2, que corresponde a la estructura de núcleo de los ligandos L1 y L3, no presenta ningún efecto sobre la expresión de CD95. El ligando L7, constituido por una estructura de núcleo ramificada que lleva la misma secuencia peptídica que L3, no presenta ningún efecto sobre la expresión de CD95 inducida por CD40L. Por el contrario, el ligando L4, que presenta una estructura de núcleo cíclica que lleva 3 ejemplares de la secuencia peptídica que imitan la superficie de contacto CD40-CD40L, inhibe la expresión de CD95 inducida por CD40L para una gama de concentraciones que va de 50 a 0,5 \muM. Por tanto, su actividad es aproximadamente 10 veces más importante que el ligando lineal que presente el mismo péptido (L3). Es interesante observar que la inhibición máxima se obtiene para una concentración de 10 \muM, induciendo la concentración de 50 \muM una mortalidad celular importante (véase la parte 2). El ligando L4 bis que está constituido por la misma molécula núcleo pero que sólo lleva 2 ejemplares de la secuencia peptídica que imitan la superficie de contacto CD40-CD40L sólo inhibe débilmente la expresión de CD95 inducida por CD40L.

TABLA I % de inhibición de la expresión de CD95 inducida por CD40L tras el tratamiento con

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2- Inducción de la apoptosis de los linfomas B por CD40L

Ciertos linfomas B entran en apoptosis durante la reticulación de su molécula CD40 por un anticuerpo anti-CD40 o por CD40L soluble de manera independiente de la molécula CD95. Esta inducción de apoptosis se traduce por una disminución de la proliferación medida por la incorporación de timidina tritiada. Los ligandos agonistas de CD40 inducen un aumento de la apoptosis y en consecuencia una disminución de la incorporación de timidina tritiada.

Modo operatorio

Se cultivan las células del linfoma de Burkitt BL41 (4,10^{5}/mL) en presencia de los diferentes ligandos a la concentración deseada. Tras 24 h, o bien se incuban las células durante 8 h con timidina tritiada (1 \muci/pocillo) para medir la proliferación o bien se marcan con Anexina V-FITC y yoduro de propidio para evaluar el porcentaje de células apoptóticas mediante citometría de flujo.

Resultados

El ligando L4 (núcleo con estructura cíclica + 3 ejemplares de la secuencia peptídica que imitan la superficie de contacto CD40-CD40L) al igual que la molécula CD40L soluble inhibe muy fuertemente la proliferación de las células BL41. Por el contrario el ligando L7 (núcleo con estructura ramificada que lleva la misma secuencia peptídica que L4) y sus derivados L7-1, L7-2 y L7-3 sólo presentan un pequeño efecto o ninguno sobre la proliferación de las células BL41 (figura 4A).

Esta inhibición de proliferación viene acompañada, para el ligando L4, por un fuerte aumento de la apoptosis cuando el ligando L4bis (estructura de núcleo cíclica + 2 ejemplares de la secuencia peptídica) induce una apoptosis muy débil. El ligando L8 constituido por la estructura de núcleo única o el ligando L11 constituido por la secuencia peptídica única no presentan ningún efecto sobre la muerte por apoptosis de las células BL41 (figura 4B).

El ligando L9 que está constituido por una estructura de núcleo cíclica diferente de la del ligando L4 que lleva 3 ejemplares de la misma secuencia peptídica también induce fuertemente la apoptosis de BL41 (figura 4B).

En conclusión, los ligandos L4 y L9 presentan una actividad agonista e imitan a CD40L.

B) Estudio de la interacción entre CD40 y CD40L y los ligandos L1 a L12 Principio del procedimiento

Biacore3000 es un aparato que permite el estudio de las interacciones entre dos moléculas, basado en la resonancia plasmónica de superficie. Permite medir en tiempo real, y por tanto seguir la cinética de interacción (asociación y disociación) de un analito (que se encuentra en una disolución inyectada) y de un ligando (inmovilizado sobre un microchip que apoya a la medición). Las mediciones cinéticas a diferentes concentraciones de analito permiten calcular las constantes de afinidad de la interacción entre el ligando y los analitos. El microchip contiene cuatro células de medición diferentes, lo que permite comparar directamente una célula de referencia sobre la cual se inmoviliza una proteína no pertinente (proteína que no presenta ninguna afinidad con el ligando estudiado), pero cercana al ligando, con la célula sobre la cual se inmoviliza el ligando.

Modo operatorio

Sobre un microchip se inmovilizan anticuerpos de conejo dirigidos contra la parte constante de inmunoglobulinas de ratón. En la célula de referencia se inmoviliza, con un flujo de 5 \muL/min durante 2 minutos, un anticuerpo monoclonal de ratón de isotipo IgG2a (LG112) a 40 nM; en la célula del ligando se inmoviliza en las mismas condiciones la CD40 recombinante asociado con la parte constante de la cadena pesada de IgG2a de ratón (proteína de fusión muIg CD40 humana, ANCELL Corporation, Bayport, MN).

A continuación se inyecta sobre las dos células (referencia y ligando), como analito, el CD40L (proteína de fusión muCD8 CD154 humana, ANCELL Corporation) a diferentes concentraciones o el CD40L a una concentración de 1 \muM o de 125 nM, en presencia de diferentes concentraciones de ligandos. El flujo en presencia de los analitos es de 10 \muL/min durante 5 minutos para estudiar la asociación, y en ausencia de analitos las condiciones son las mismas para estudiar la disociación.

Con el fin de regenerar las células (es decir, eliminar todas las proteínas adsorbidas de manera no covalente), se inyecta una disolución de 10 mM de HCl a 5 \muL/min durante 1 minuto. A continuación las células están listas para un nuevo análisis.

Resultados

Con el fin de estudiar la constante de afinidad del CD40L por la CD40, se utilizan 4 concentraciones de CD40L de 62,5 a 500 nM. Se calcula la constante de equilibrio a 54 nM.

Para estudiar la asociación con L1, el analito estaba constituido por CD40L a 1 \muM y L1 a 50 \muM. Aunque se observa una inhibición durante los primeros segundos de la interacción, desaparece en el transcurso de los cinco minutos de asociación, haciendo imposible el cálculo de la constante de equilibrio de L1. Por tanto, ésta es superior a 50 \muM.

La asociación de L3 se estudió en presencia de 125 nM de CD40L. El análisis cinético en presencia de 2,5 \muM de L3 facilitó una constante de equilibrio para L3 de 10 \muM.

Se estudió La asociación de L4, L7 (y sus derivados), L8, L9, L11 y L12 en presencia de 100 nM de CD40L. Sólo las moléculas L4 y L9 se fijan sobre CD40 y desplazan a CD40L. El análisis cinético en presencia de 40 y 80 nM de L4 facilitó una constante de equilibrio para L4 de 180 nM. El ligando L4 inhibió el 50% de la fijación de CD40L (CI50) a 80 nM. El ligando L9, sometido a prueba en las mismas condiciones, presenta una CI50 que es inferior a 50 nM, su constante de equilibrio es por tanto inferior a la de L4. Es interesante resaltar que la molécula que es una versión lineal de L9 no se fija a CD40. Estos resultados sugieren que la concepción de ligandos activos de CD40 necesita la utilización de una molécula núcleo (A en la fórmula genera: A-X_{n}) suficientemente rígida y de simetría C3.

II - Pruebas de los ligandos en modelos in vitro

Las células dendríticas inmaduras, diferenciadas in vitro a partir de monocitos humanos, son muy sensibles a CD40L que induce su maduración. Esta maduración viene acompañada (i) por profundas modificaciones fenotípicas, (ii) por una secreción de citocinas y quimiocinas, (iii) por una resistencia a la apoptosis mediada por CD95 (Koppi et al., 1997; Bjorck et al., 1997), (iv) por una longevidad aumentada de las células dendríticas (Miga et al., 1997) y (v) por una capacidad netamente aumentada de las células dendríticas maduras para estimular linfocitos T alogénicos. Se estudia el efecto de estos ligandos sobre las CD. En primer lugar, se estudia, mediante citometría en flujo, la capacidad de los ligandos agonistas potenciales para modificar el fenotipo de las CD inmaduras. Se continúa este estudio intentando poner en evidencia, con ayuda de pruebas ELISA, el inicio por medio de los ligandos agonistas de una secreción de citocinas. Finalmente, se completa esta investigación mediante el estudio de la capacidad de las CD, preincubadas en presencia de moléculas agonistas, para estimular las células T alogénicas. Se evalúa el efecto de los ligandos antagonistas mediante la medición de la disminución de las variaciones, normalmente inducidas por el CD40L, observada al preincubar las CD en presencia de las moléculas antagonistas. El efecto de los ligandos también puede someterse a prueba (i) sobre la conmutación de clases de los linfocitos B, que puede imitarse in vitro mediante activación de células B de las amígdalas por CD40 en presencia de citocinas, y (ii) sobre la diferenciación de los linfocitos T citotóxicos que puede imitarse por una incubación conjunta de células dendríticas activadas por CD40 y de células T precitotóxicas.

III - Pruebas de los ligandos en modelos in vivo

Habiéndose mostrado los ligandos L4 y L9 agonistas, representan puntos interesantes para probar el efecto terapéutico de nuestras moléculas. El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmunitaria sistémica en la cual está bien documentada la importancia de la interacción CD40-CD40L. El tratamiento de ratones con lupus mediante anticuerpos anti-CD40 agonistas acelera fuertemente la enfermedad lúpica. Para someter a prueba el efecto in vivo de los diferentes ligandos, se han inyectado en ratones que desarrollan espontáneamente una enfermedad lúpica que presenta síntomas cercanos a los del lupus eritematosos sistémico humano. Se ha estudiado el efecto de los ligandos sobre el desarrollo de la enfermedad.

Modo operatorio

A ratones MRL-^{lpr} (Koopman et al., 1988) preautoinmunizados (de 5 semanas de edad) se les inyecta por vía intravenosa 100 \muL por ratón de PBS que contiene o no 100 \mug de ligando L4. Se repite la inyección 2 veces con un intervalo de 2 semanas. Se extrae regularmente el suero de estos ratones mediante sangrado retroorbital. Se sigue el desarrollo de la enfermedad lúpica mediante una medición de la proteinuria en la orina, de la presencia de anticuerpos anti-ADN en el suero mediante una prueba ELISA y de la supervivencia de los ratones. Estos dos marcadores son característicos del desarrollo de la enfermedad lúpica en los ratones MRL-^{lpr}.

Resultados

Los ratones tratados por el ligando L4 mueren significativamente (p= 0,0101) más rápido que los ratones tratados por PBS (figura 5A). Esta aceleración de la mortalidad viene acompañada por una aparición más precoz de los anticuerpos anti-ADN en el suero (figura 5B) y de la proteinuria en la orina (figura 5C), lo que muestra que la mortalidad se debe sin duda a una aceleración de la enfermedad lúpica. Estos resultados muestran claramente que el ligando L4 presenta un efecto agonista in vivo.

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<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA)

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<120> NUEVAS MOLÉCULAS MULTIMÉRICAS, SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN, Y SUS UTILIZACIONES PARA LA PREPARACIÓN DE MEDICAMENTOS

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<130> WOB 02 AE CNR MULT

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<140> PCT/FR03/01613

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<141> 2003-05-28

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<150> FR 02/06631

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<151> 2002-05-30

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<160> 23

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 3

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 1

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\sa{Lys Gly Tyr}

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<210> 2

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<211> 3

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\sa{Tyr Gly Lys}

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<210> 3

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Lys Gly Tyr Tyr}

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<210> 4

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 4

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\sa{Tyr Tyr Gly Lys}

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<210> 5

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<211> 3

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Lys Pro Arg}

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<210> 6

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg}

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<210> 7

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Arg Leu Leu Ile Arg Glu Phe Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Phe Arg Glu Arg Ile}

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<210> 9

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 9

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\sa{Ile Arg Glu Phe Arg}

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<210> 10

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 10

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\sa{Arg Ile Leu Leu Arg}

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<210> 11

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 11

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\sa{Arg Leu Leu Ile Arg}

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<210> 12

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 12

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\sa{Cys Gly Gln Gln Ser Ile}

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<210> 13

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 13

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\sa{Ile Ser Gln Gln Glu Gly}

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<210> 14

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 14

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\sa{Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys}

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<210> 15

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\sa{Lys Leu Leu Ile Arg Glu Ser Gly}

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<210> 16

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 16

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\sa{Gly Ser Glu Arg Ile}

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<210> 17

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 17

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\sa{Ile Arg Glu Ser Gly}

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<210> 18

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 18

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\sa{Arg Ile Leu Leu Lys}

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<210> 19

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\sa{Lys Leu Leu Ile Arg}

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<210> 20

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 20

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\sa{Cys Glu Gln Gln Ser Val}

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<210> 21

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 21

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\sa{Val Ser Gln Gln Glu Cys}

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<210> 22

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

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<400> 22

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\sa{Arg Ile Tyr Tyr}

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<210> 23

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> péptido derivado del ligando del receptor CD40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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\sa{Arg Ile Tyr Tyr Gly Lys}

Claims (16)

1. Molécula multimérica, caracterizada porque responde a la siguiente fórmula general:

A-X_{n}

en la que:

-

n es igual a 3, 4, 5 ó 6,

-

A es un grupo químico, funcionalizado por al menos tres funciones aminas o funciones COOH o funciones SH o funciones S-Npys (S-nitro-piridinasulfenilo) o funciones S-Pys (S-piridinasulfenilo), y es en particular diferente de una proteína,

-

X representa un grupo -D, -B-D o -B(D)-D’, en el que:

\text{*}

B es un brazo espaciador,

\text{*}

-D y –D’ representan péptidos o pseudopéptidos que corresponden a una secuencia derivada de un ligando, seleccionada de entre los residuos que forman la superficie de contacto con el receptor del ligando, secuencia que es susceptible de interactuar con el receptor, seleccionándose dicho ligando de entre los ligandos de receptores de la superfamilia del TNF, y en particular de entre los ligandos siguientes: EDA, CD40L, FasL, OX40L, AITRL, CD30L, VEGI, LIGHT, 4-1BBL, CD27L, LT\alpha, TNF, LT\beta, TWEAK, APRIL, BLYS, RANKL y TRAIL,

caracterizada porque:

\bullet o bien A es un radical ramificado de simetría C_{3} de fórmula general siguiente:

38

en la que:

\text{*}

m y m’ son números enteros comprendidos de 1 a 5,

\text{*}

V representa un grupo -NH- o -CO- que forma un enlace amida con X,

\text{*}

Z representa un átomo de oxígeno o un grupo CH_{2},

\text{*}

Y representa o bien un átomo de nitrógeno, o bien un grupo R-C- o bien un grupo R-CONH-C-, en los que R puede ser un grupo alquilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquenilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo alquinilo con 1 a 10 átomos de carbono, un grupo arilo con 5 a 12 átomos de carbono, un grupo aralquilo con 5 a 14 átomos de carbono o un grupo heteroarilo con 1 a 10 átomos de carbono, pudiendo estar dichos grupos no sustituidos o sustituidos por 1 a 6 sustituyentes seleccionados de entre los grupos -COOH, -NH_{2}, -CONH_{2} o alcoxi,

\bullet o bien A es un radical C_{3} cíclico que responde a una de las fórmulas generales siguientes:

39

40

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41

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42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

43

\newpage

en las que:

\text{*}

R_{a} representa o bien un grupo -NH- o bien un grupo -CO- que forma un enlace amida con X,

\text{*}

R_{b} representa la cadena lateral de un aminoácido proteinogénico,

\text{*}

p es un número entero comprendido entre 1 y 4,

\text{*}

q es un número entero comprendido entre 0 y 4,

\bullet o bien A es un radical ramificado no simétrico que responde a las fórmulas generales siguientes:

44

en las que:

\text{*}

k representa 3, 4, 5 ó 6,

\text{*}

R^{1} representa o bien un átomo de hidrógeno, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, o bien un grupo RCO-, ROCO- o RNHCO-, siendo R tal como se ha definido anteriormente,

\text{*}

R^{2} representa o bien un grupo -NH_{2}, o bien un grupo -NHR, o bien un residuo de aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos proteinogénicos, siendo R tal como se ha definido anteriormente.

2. Molécula multimérica según la reivindicación 1, caracterizada porque B responde a una de las fórmulas generales siguientes:

45

en las que:

\text{*}

Y representa una cadena alquilo C_{1}-C_{10} o un grupo alquinilo o alquenilo o arilo o aralquilo o heteroarilo,

\text{*}

R^{3} representa o bien un grupo -NH- cuando V o R_{a} son un grupo -CO-, o bien un grupo -CO- cuando V o R_{a} son un grupo -NH-,

\text{*}

R^{4} y R^{5} representan independientemente entre sí un grupo -CO- o un grupo -NH-.

3. Molécula según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque -D y –D’ representan péptidos derivados del ligando del receptor CD40 humano o murino (CD40L), perteneciendo dichos péptidos a la secuencia primaria del ligando CD40L de CD40 y cuyo número de aminoácidos está comprendido entre 3 y 10.

4. Molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los péptidos derivados del ligando del receptor CD40 humano o murino (CD40L) se seleccionan de entre los siguientes:

Lys^{143}-Gly-Tyr^{145} (SEC ID nº: 1), Tyr^{145}-Gly-Lys^{143} (SEC ID nº: 2),

Lys^{143}-Gly-Tyr-Tyr^{146} (SEC ID nº: 3), Tyr^{146}-Tyr-Gly-Lys^{143} (SEC ID nº: 4),

Lys-Pro-Arg (SEC ID nº: 5), Lys-\Psi(CH_{2}NH)Pro-Arg,

Arg^{200}-Phe-Glu-Arg-Ile-Leu-Leu-Arg^{207} (SEC ID nº: 6),

Arg^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg-Glu-Phe-Arg^{200} (SEC ID nº: 7),

Arg^{200}-Phe-Glu-Arg-Ile^{204} (SEC ID nº: 8), Ile^{204}-Arg-Glu-Phe-Arg^{200} (SEC ID nº: 9),

Arg^{203}-Ile-Leu-Leu-Arg^{207} (SEC ID nº: 10), Arg^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg^{203} (SEC ID nº: 11),

Cys^{218}-Gly-Gln-Gln-Ser-Ile^{223} (SEC ID nº: 12), Ile^{223}-Ser-Gln-Gln-Gly-Cys^{218} (SEC ID nº: 13),

Gly^{200}-Ser-Glu-Arg-Ile-Leu-Leu-Lys^{207} (SEC ID nº: 14),

Lys^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg-Glu-Ser-Gly^{200} (SEC ID nº: 15),

Gly^{200}-Ser-Glu-Arg-Ile^{204} (SEC ID nº: 16), Ile^{204}-Arg-Glu-Ser-Gly^{200} (SEC ID nº: 17),

Arg^{203}-Ile-Leu-Leu-Lys^{207} (SEC ID nº: 18), Lys^{207}-Leu-Leu-Ile-Arg^{203} (SEC ID nº: 19),

Cys^{218}-Glu-Gln-Gln-Ser-Val^{223} (SEC ID nº: 20),

Val^{223}-Ser-Gln-Gln-Glu-Cys^{218} (SEC ID nº: 21),

o de entre péptidos híbridos constituidos por al menos dos aminoácidos consecutivos de dos de las secuencias definidas anteriormente, en particular los péptidos de secuencias Arg^{203}-Ile^{204}-Tyr^{145}-Tyr^{146} (SEC ID nº: 22) o Arg^{203}-Ile^{204}-Tyr^{146}-Tyr^{145}-Gly^{144}-Lys^{143} (SEC ID nº: 23),

o de entre fragmentos de las secuencias mencionadas anteriormente,

pudiendo ser los aminoácidos de manera indiferente de configuración L o D.

5. Molécula multimérica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque A presenta una simetría C_{3}.

6. Molécula según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque A responde a una de las fórmulas siguientes:

46

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47

en las que i representa un número entero superior o igual a 1.

7. Molécula según una de las reivindicaciones 1 a 6, de fórmula siguiente:

48

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49

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50

51

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52

53

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54

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8. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, una molécula multimérica según una de las reivindicaciones 1 a 7, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Composición vacunal, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, una molécula multimérica según una de las reivindicaciones 1 a 7, en asociación con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

10. Utilización de moléculas multiméricas según una de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican la inhibición o la activación de la respuesta inmunitaria.

11. Utilización según la reivindicación 10, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican la inhibición de la respuesta inmunitaria, tales como los rechazos de injertos o las enfermedades autoinmunitarias.

12. Utilización según la reivindicación 10, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de patologías que implican el aumento de la respuesta inmunitaria, tales como los cánceres o las infecciones parasitarias, bacterianas o virales.

13. Procedimiento de preparación sobre soporte sólido de una molécula multimérica, según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que A es un radical C_{3} cíclico y responde a una de las fórmulas Ia, Ib, II, VIb, VIc o VId tal como se definen en la reivindicación 5, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

formar un precursor lineal de A, precursor que está constituido por un encadenamiento de aminoácidos que forman una cadena peptídica en crecimiento, sintetizada por ciclos sucesivos de acoplamiento entre residuos de aminoácidos N-protegidos, de los cuales tres llevan un grupo R_{a} de tipo amina, y la función amina de la cadena peptídica en crecimiento, y de desprotección, estando el primer residuo de aminoácido unido a un soporte sólido,

-

ciclizar el precursor lineal de A protegido citado anteriormente,

-

escindir los grupos protectores mencionados anteriormente, para liberar las funciones aminas protegidas citadas anteriormente,

-

acoplar las tres funciones aminas liberadas con un brazo espaciador B N-protegido,

-

desproteger el brazo espaciador B y acoplar las funciones aminas liberadas del brazo espaciador B, con un péptido D ya formado o formado in situ mediante la unión secuencial de los residuos de aminoácidos correspondientes al péptido D, y

-

escindir la molécula del soporte sólido, tras la supresión de todos los grupos protectores presentes en las cadenas laterales funcionalizadas del péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Procedimiento de preparación en disolución de una molécula multimérica, según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que A es un radical C_{3} cíclico y responde a una de las fórmulas Ia, Ib, II, VIb, VIc o VId tal como se han definido en la reivindicación 5, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

formar un precursor lineal de A, precursor que está constituido por un encadenamiento de aminoácidos que forman una cadena peptídica en crecimiento, sintetizada por ciclos sucesivos de acoplamiento entre residuos de aminoácidos N-protegidos, de los cuales tres llevan un grupo R_{a} de tipo amina, y la función amina de la cadena peptídica en crecimiento, y de desprotección,

-

ciclizar el precursor lineal de A protegido mencionado anteriormente,

-

escindir los grupos protectores citados anteriormente, para liberar las funciones aminas protegidas citadas anteriormente,

-

acoplar las tres funciones aminas liberadas con un péptido -D-B que corresponde a un brazo espaciador B unido a un péptido D protegido,

-

desproteger los grupos protectores presentes en el péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 7.

15. Procedimiento de preparación de una molécula multimérica según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que A es un radical C_{3} ramificado y responde a una de las fórmulas IV, V, VI o VIa tal como se han definido en la reivindicación 5, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

acoplar las tres funciones aminas del radical A de fórmula IV, V, VI o VIa con un brazo espaciador B protegido,

-

desproteger el brazo espaciador B,

-

unir el brazo espaciador B desprotegido con aminoácidos protegidos que forman parte de la constitución de un péptido D, mediante ciclos sucesivos de acoplamiento, de purificación y de desprotección de los aminoácidos mencionados anteriormente,

-

desproteger el último aminoácido que forma parte de la constitución del péptido D, con el fin de obtener la molécula multimérica tal como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 7.

16. Procedimiento de preparación sobre soporte sólido de una molécula multimérica según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que A es un radical ramificado no simétrico que responde a una de las fórmulas VII o VIII tal como se han definido en la reivindicación 5, estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-

injertar una lisina sobre un soporte sólido, estando cada una de las dos funciones aminas de la lisina, respectivamente en posición \alpha y \varepsilon, protegidas por grupos protectores diferentes y ortogonales,

-

alargar la cadena peptídica formada a partir de la lisina, a la longitud deseada, mediante acoplamientos y desprotecciones sucesivas

\text{*}

o bien únicamente de las funciones aminas en posición \alpha con el fin de obtener el radical A de fórmula VII, con funciones aminas protegidas en posición \varepsilon,

\text{*}

o bien únicamente de las funciones aminas en posición \varepsilon con el fin de obtener el radical A de fórmula VIII, con funciones aminas protegidas en posición \alpha,

-

acoplar las funciones aminas desprotegidas en posición \varepsilon en el radical A de fórmula VII o en posición \alpha en el radical A de fórmula VIII, con un brazo B protegido,

-

unir el brazo espaciador B desprotegido con un péptido D ya formado o formado in situ mediante la unión secuencial de los residuos de aminoácidos correspondientes al péptido D, y

-

escindir la molécula así obtenida del soporte sólido, tras la supresión de todos los grupos protectores presentes en las cadenas laterales funcionalizadas del péptido D.