JP2005522420A - アンギオテンシンi変換酵素(ace)のc末端活性部位の選択的阻害のためのホスフィン酸シュードペプチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒトのアンギオテンシンI変換酵素(ACE)のC末端活性部位を選択的に阻害する、すなわちACEのN末端活性部位に影響を与えないための、医薬生成物の調製のためのホスフィン酸シュードペプチド誘導体の使用に関する。
こうした医薬生成物は、ヒトの様々な心臓血管病理の予防及び治療において使用して良い。
本発明はまた、新規なホスフィン酸シュードペプチド誘導体、これらを含有する製薬組成物、及び前記ホスフィン酸シュードペプチド誘導体の調製方法にも関する。
アンギオテンシンI変換酵素(ACE)は、動脈圧の制御において、及び心臓血管組織の様々な生理学的機能のホメオスタシスにおいて、中心的な成分である。これらの作用は、部分的には、
・不活性ペプチドであるアンギオテンシンIの、ACEを用いるC末端の開裂を経る、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンIIの成熟、及び
・ACEを経る、強力な血管拡張薬であるブラジキニンの分解、
に依存しているようである。
・不活性ペプチドであるアンギオテンシンIの、ACEを用いるC末端の開裂を経る、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンIIの成熟、及び
・ACEを経る、強力な血管拡張薬であるブラジキニンの分解、
に依存しているようである。
動脈高血圧及び心臓組織疾患もまた、様々な血管収縮性ホルモンの調節悪化から生じる。血管収縮薬と血管拡張薬との間の平衡を、後者のために再構築することは、動脈高血圧及び心臓組織疾患を改善させるためのヒトの臨床治療において使用される医薬生成物の主たる治療目的の一つである。従って、アンギオテンシンIIの生成を防止し、且つブラジキニンを増強することによって、ACEの阻害がこれらの目的に向けて如何に関与しうるかが理解される。参考文献[1]及び[2]に記載の通り、ACE阻害剤は、ヒトの臨床治療において、動脈高血圧を軽減するためのみならず、心臓組織の機能を維持するためにも使用される。
ACEのクローニングに続いてその基本構造を決定することにより、驚くべきことに、参考文献[3]に記載のように、この酵素中に二つの活性部位の存在が示された。部位指向性変異誘発を経て、二つの活性部位が完全に機能性であること、すなわちACEの生理学的基質、例えばアンギオテンシンI及びブラジキニンを開裂可能であることを証明することができた(参考文献[4]及び[5])。
ACEについて20年以上も行われた全ての研究にも関わらず、祖先遺伝子の複製から生じる哺乳類のACE中の二つの活性部位の存在が、特定の機能的役割に相当するか否かは依然知られていない。しかしながら、ヒトでは、生体内において、ペプチドAc-SDKP(N-アセチル Ser-Asp-Lys-Pro)は本質的にACEのN末端活性部位を経て開裂されるとの最近の発見は、ACEの活性部位それぞれに別個の機能的役割があるという説を支持する(参考文献[6])
Dzan V.J., 2001, Hypertension 37, 1047-1052
Dzan V.J., 2001, Hypertension 37, 1047-1052
これらに鑑みて、研究者等は、ACEの各部位の生体内での機能的役割を確立することのできる道具を供給するために、ACEの二つの活性部位を高度に選択的に識別することのできる阻害剤の開発を試みている。これに関して、臨床研究において今日まで使用されている全ての阻害剤は、混合ACE阻害剤、即ちACEの二つの仮性部位を同時にブロックする阻害剤であることを強調することが重要である。
ACEのN末端部位を選択的にブロックする第一の阻害剤であるRX407は、ホスフィン酸シュードペプチドであるが、これは最近開発された(参考文献[7]及び[8])。この阻害剤は、ラット及びマウス内では代謝されないものであるが、更にまた、マウス内では生体内でペプチドN-アセチル Ser-Asp-Lys-Pro(Ac-SDKP)の分解を阻害することができる(参考文献[9])。従って、RX407を注入すれば、ACEのN末端部位のブロックにより、Ac-SDKPの生体内分解が防止されるであろう。
この阻害剤は、前記動物において前臨床研究の対象を形成するが、これは、化学療法治療の際に造血組織を保護するためにその有用性を示す傾向がある。
しかしながら、ACEのC末端部位と本質的に相互作用することによってACEの二つの活性部位を識別することのできる阻害剤は、今日までに開示されていない。しかしながら、こうした阻害剤が入手可能となることが望ましい。その理由は、実験的及び臨床的研究におけるこれらの価値の他にも、これらは、標準的な混合ACE阻害剤に対して、ACEのN末端部位の活性、例えばペプチドAc-SDKPの代謝と関連する生理学的機能を妨げないという主要な利点を有するであろう。
ホスフィン酸ペプチドが、ACEが属するペプチダーゼ群である亜鉛金属ペプチダーゼを非常に強力に阻害することのできる化合物の一般的な群を表すことは、参考文献[9]乃至[16]に見られるように証明されている。これらの化合物においては、PO2 -基の役割はこれらの酵素の活性部位に位置する亜鉛原子と相互作用することである。
PO2 -基の存在の他にも、残基P2、P1、P1'、およびP2'の化学的性質が、特定のホスフィン酸ペプチドと所定の亜鉛金属ペプチダーゼとの間の相互作用の選択性を保証するための決定的役割を果たす(参考文献[8]、[12]、及び[13]を参照のこと)。従って、P2、P1、P1'、およびP2'位にある非常に特定的な残基の存在によって、選択的な阻害剤を得ることが可能になり、これは所定の亜鉛金属ペプチダーゼのみを阻害する。こうした選択性は、これらの阻害剤の生体内での使用の状況において、必須の因子となりうる。特に、所定の阻害剤の生体内毒性は、主に、所定のターゲットに対する選択性が欠けていることによるのであろうことが推定される。
これらの原理により、ACEのC末端部位を選択的にブロックすることのできる阻害剤の探索は、ホスフィン酸化合物の群中から、ACEのC末端部位と選択的に相互作用する性能を阻害剤に付与する、P1、P1'、およびP2'位に位置する特定残基を同定することからなる。
この研究により、ホスフィン酸シュードペプチド中のシュードプロリン残基の存在が、ACEのC末端部位の選択的阻害剤を得るための必須の要因を構成するとの発見に至った。
従って、本発明の一つの主題は、下式(I)のアミノ酸配列を含む少なくとも1つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体:
[式中、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
はまたPro(プロリン)残基を形成していてもよく、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
の、アンギオテンシンI変換酵素のC末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用である。
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
の、アンギオテンシンI変換酵素のC末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用である。
この配列中、PO2基は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオン、例えばK+、Na+、NH4 +、または他のあらゆる薬理学的に許容される金属もしくは非金属のイオンと会合してPO2 -形態であって良い。水中では荷電した基は解離するため、カウンターイオンの性質は無関係である。
PO2基はまた、生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルの形態であっても良い。この場合は、シュードペプチドはプロドラッグタイプのものであり、且つエステルの生体内加水分解の後には、これはシュードペプチドの活性形態を生成する。
R5に使用して良いこのタイプの基は、特に参考文献[20]に記載されている。
挙げることのできるこうした基の例は、下式に相当する基である。
これらの式中、t-Buは、tert-ブチル基を表す。
本発明の特定の実施態様の一つによれば、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、下式(II):
[式中、
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
はまたPro残基を形成していてもよく、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、以上に定義される通りである]
に相当する。
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、以上に定義される通りである]
に相当する。
上記式において、R2及びR3は天然もしくは非天然のアミノ酸、例えばシュードアミノ酸の側鎖を表す。
天然のアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ニトロフェニルアラニン、ホモアルギニン、チアゾリジン、及びデヒドロプロリンから選択して良い。
シュードアミノ酸は、アミノ官能基もしくはカルボニル官能基が別の化学基で置換されたアミノ酸と定義して良い。
上記式(II)において、R1基はペプチド化学におけるアミン官能基にとっての一般的な保護基であってよい。こうした保護基は、当業者には良く知られ、また示されており、例えば「有機合成における保護基」第2版、T.W.Green及びP.G. M. Wuts, John Wiley & Sons, Inc., 309-315頁[17]と題される本にある通りである。本発明において使用して良いこうした基の例としては、アセチル基及びベンジルカルボニル基を挙げて良い。
R1はまた、上述のもの等の一般的な保護基でその末端アミノ官能基が保護された、天然もしくは非天然のアミノ酸またはペプチドを表しても良い。
本発明によれば、以下に見られるように、ACEのC末端活性部位に対する選択性を得るためには、シュードプロリン残基の存在が必須である。しかし、R2及びR3中に存在する側鎖の性質もまた、本発明によって使用される誘導体の、ACEのN末端及びC末端部位との相互作用の選択性において重要な役割を果たす。
ACEのC末端部位の阻害に関する優れた結果が、R2基がベンジル、メチル、またはフェニルエチル基を表す、すなわちフェニルアラニン、アラニン、及びホモフェニルアラニンの側鎖である、シュードペプチドを用いて得られている。
R3については、優れた結果は、R3がアラニン、アルギニン、またはトリプトファンの側鎖を表す場合に、または配列-NH-CH(R3)-CO-がPro残基を表す場合に得られている。
一般的に、R4及びR5は水素原子を表す。
一般的に、R4及びR5は水素原子を表す。
本発明の好ましい実施態様の一つによれば、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、下式に相当する。
本発明によって使用して良いホスフィン酸シュードペプチド誘導体は、アンギオテンシンI変換酵素のC末端活性部位を選択的に阻害することができ、したがって、ヒトの動脈圧及び心臓血管機能のホメオスタシスの制御における中心的な役割を担う、アンギオテンシンIIの生体内での生理学的濃度を制御できるが、ブラジキニンの代謝またはペプチドAc-SDKPの代謝を妨げることのないことが判明している。
従って、医薬生成物中における有効成分としてのこれらの使用は、ヒトの心臓血管病理、とりわけブラジキニンがあまり作用しないと考えられる、例えばアテローム性動脈硬化症などの病理の予防及び治療に多数の応用を見出すはずである。
その使用が本発明によって企図されるホスフィン酸シュードペプチド誘導体の中には、文献に記載されたことのないものもある。
したがって、本発明の主題はまた、式(I)のアミノ酸配列を含むホスフィン酸シュードペプチド誘導体であり、式中、
式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
はPro残基:
を形成し、
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
これらの誘導体の中で、とりわけ好ましいのは、上記式(II)に相当するものであり、式中、
・R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
はPro残基:
を形成し、
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
・R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
本発明の主題はまた、上記の式(II)に相当する少なくとも1つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体を含む薬理組成物であり、式中、
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
はPro残基:
を形成し、
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
・R2は、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、
・下式の配列:
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す。
この組成物中では、ホスフィン酸シュードペプチド誘導体は好ましくは下式:
に相当する。
上記の記載に関して、こうした薬理組成物は、とりわけヒトの様々な心臓血管病理の予防及び治療に多数の応用を見出すはずである。
上記の記載に関して、こうした薬理組成物は、とりわけヒトの様々な心臓血管病理の予防及び治療に多数の応用を見出すはずである。
上記式(II)に相当するホスフィン酸シュードペプチド誘導体であって、R4及びR5が水素原子を表すものは、以下の工程を含む方法を経て調製して良い。
1)式(III):
[式中、R1及びR2は上記定義通りである]
の化合物を、下式(IV):
[式中、Acはアセチル基を表し、Etはエチル基を表す]
の化合物と反応させて下式(V):
の化合物を得る工程;
2)化合物(V)を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって、化合物(V)を化合物(VI):
に変換する工程;
3)化合物(VI)のヒドロキシル基を保護基R5、例えばアダマンチル基Adで保護して、下式(VII):
の化合物を得る工程;
4)化合物(VII)を鹸化して、下式(VIII):
の化合物を得る工程;
5)下式(VIII)の化合物を下式(IX)または(X):
[式中、
R3は上記の定義通りである]
のアミノ酸とカップリングさせる工程;更に
6)保護基Adを除去する工程。
1)式(III):
の化合物を、下式(IV):
の化合物と反応させて下式(V):
2)化合物(V)を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって、化合物(V)を化合物(VI):
3)化合物(VI)のヒドロキシル基を保護基R5、例えばアダマンチル基Adで保護して、下式(VII):
4)化合物(VII)を鹸化して、下式(VIII):
5)下式(VIII)の化合物を下式(IX)または(X):
R3は上記の定義通りである]
のアミノ酸とカップリングさせる工程;更に
6)保護基Adを除去する工程。
この方法によれば、シュードプロリンを含む式(VIII)のホスフィン酸ブロックがまず合成され、その後このホスフィン酸ブロックの所望のアミノ酸とのペプチドカップリングが行われる。
有利には、ペプチドカップリング工程5)は、そのN末端がFmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)基で予め保護された、式(IX)または(X)のアミノ酸で置換された樹脂を固相として使用する固相ペプチド合成によって行われる。
必要であれば、式(II)においてR5が水素原子を表すシュードペプチドのホスフィン酸官能基は、その後適当な試薬と反応させることによってエステル化または塩化されていて良い。
エステル化は、式R5OH(式中、R5が生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す)のアルコールとのカップリングによって、例えば参考文献[20]に記載の方法(方法A)を用いて得てよい。
エステル化はまた、R5X(式中、R5が生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す)のハロゲン化物との反応によって行って良い。この反応は、参考文献[20]に記載の方法(方法B)を用い、アルカリ条件下で行って良い。
このエステル化を実行する前に、シュードペプチドのカルボン酸官能基を、適当な保護基で保護するが、これは標準的な技術を用いて後に除去する。
式(II)(式中、R5が水素原子である)のシュードペプチドのホスフィン酸官能基を塩化して、この水素原子を薬理学的に許容されるカウンターイオンで置き換えることが望ましい場合には、シュードペプチドをこのカウンターイオンを含む適当な塩基、例えばNaOH、KOH、またはNH4OHと反応させる。
シュードペプチドの末端カルボキシル基を塩化するためには、水素原子を薬理学的に許容冴えるカウンターイオンで置き換えるために、同様の技術を使用して良い。
本発明の別の特徴は、本発明によるシュードペプチド誘導体を調製するための、及びこれらの特性を示すための実施例に関する以下の記載を、添付の図面を参照して読むに従って一層明らかになるであろう。
言うまでもないが、以下の記載は、例示目的で与えられるものであり、本発明の主題に如何なる限定を加えるものでもない。
ホスフィン酸シュードペプチドの合成を、図1に記載された合成スキームに従って行った。
(実施例1:化合物6aの調製)
1)化合物1aの調製
このアミノホスフィン酸酸誘導体を、Baylis[18]に記載の操作に従って調製すると、Baylis[18]に報告されるプロトコルによる再結晶を経て、R配置のエナンチオマーが得られる。
1)化合物1aの調製
このアミノホスフィン酸酸誘導体を、Baylis[18]に記載の操作に従って調製すると、Baylis[18]に報告されるプロトコルによる再結晶を経て、R配置のエナンチオマーが得られる。
3)化合物3aの調製
化合物1a(3.2g、10mmol)とヘキサメチルジシラザン(10.5mL、50mmol)とのアルゴン気流下の混合物を、110℃にて3時間に亘って加熱する。化合物2(5.5g、12mmol)をこの温度で加え、この溶液を4時間に亘り90℃にて撹拌する。この溶液を70℃に冷却し、ここに10mLの無水エタノールEtOHを滴下し、この号物を70℃で30分間に亘り撹拌する。溶媒を蒸発除去した後、残渣を5%のNaHCO3(10mL)及び5mLのヘキサン中に溶解させる。酢酸エチルEtOAcで3回抽出(3×5mL)した後、溶媒を蒸発除去して、粗製生成物を得る。クロロホルム/メタノール/酢酸の混合物(7/0.3/0.3)を移動相として使用してシリカカラムで精製すると、4gの純粋化合物3aが、白色固体の形態で得られる(収率89%)。
化合物1a(3.2g、10mmol)とヘキサメチルジシラザン(10.5mL、50mmol)とのアルゴン気流下の混合物を、110℃にて3時間に亘って加熱する。化合物2(5.5g、12mmol)をこの温度で加え、この溶液を4時間に亘り90℃にて撹拌する。この溶液を70℃に冷却し、ここに10mLの無水エタノールEtOHを滴下し、この号物を70℃で30分間に亘り撹拌する。溶媒を蒸発除去した後、残渣を5%のNaHCO3(10mL)及び5mLのヘキサン中に溶解させる。酢酸エチルEtOAcで3回抽出(3×5mL)した後、溶媒を蒸発除去して、粗製生成物を得る。クロロホルム/メタノール/酢酸の混合物(7/0.3/0.3)を移動相として使用してシリカカラムで精製すると、4gの純粋化合物3aが、白色固体の形態で得られる(収率89%)。
I及びIIの表示は、別々のジアステレオ異性体に相当する。
(元素分析)
理論値:
C:61.80%、H:6.27%、N:3.00%。
実測値:
C:61.89%、H:6.23%、N:2.98%。
理論値:
C:61.80%、H:6.27%、N:3.00%。
実測値:
C:61.89%、H:6.23%、N:2.98%。
4)化合物4aの調製
化合物3a(1.4g、3.06mmol)及びNiCl2/6H2O(1.09g、9.2mmol)を、THF(12.4mL)/メタノール(73.7mL)の混合物中に溶解させる。NaBH4(0.58g、15.4mmol)をこの溶液に少量ずつ、−30℃にて30分間に亘って添加する。この混合物を更に10分間−30℃にて撹拌する。溶媒を蒸発除去し、生成物をEtOAc(25mL)及び1NのHCl(20mL、pH1)の混合物で抽出する。
化合物3a(1.4g、3.06mmol)及びNiCl2/6H2O(1.09g、9.2mmol)を、THF(12.4mL)/メタノール(73.7mL)の混合物中に溶解させる。NaBH4(0.58g、15.4mmol)をこの溶液に少量ずつ、−30℃にて30分間に亘って添加する。この混合物を更に10分間−30℃にて撹拌する。溶媒を蒸発除去し、生成物をEtOAc(25mL)及び1NのHCl(20mL、pH1)の混合物で抽出する。
有機相を回収し、水(10mL)で洗った後にNa2SO4で乾燥させる。溶媒を蒸発除去した後、生成物を、クロロホルム/メタノール/酢酸の混合物(7/0.3/0.3)を移動相として使用してシリカカラムで精製する。1.28gの化合物4aが得られる(収率91%)。
ネガティブモード質量スペクトルによる分析(実測質量MH-=458.48、理論質量=459.47)は、化合物4aの化学構造にしたがうものである。
(元素分析)
理論値:
C:61.78%、H:6.63%、N:3.00%。
実測値:
C:61.98%、H:6.31%、N:3.08%。
理論値:
C:61.78%、H:6.63%、N:3.00%。
実測値:
C:61.98%、H:6.31%、N:3.08%。
5)化合物5aの調製
化合物4aのアダマンチル化を、Yiotakisら[14]によって記載されるプロトコルに従って行う。
化合物4aのアダマンチル化を、Yiotakisら[14]によって記載されるプロトコルに従って行う。
1-アダマンチルブロミド(538mg、2.5mmol)およびAg2O(577mg)を、5等分に分け、1時間かけて化合物4a(1.03g、2.24mmol)のクロロホルム中の溶液に加える。2時間後、0.5当量のAdBrと0.5当量のAg2Oとを加え、混合物を10時間還流させる。溶媒を蒸発除去した後、粗製生成物を、クロロホルム/イソプロパノールの混合物(9.8/0.2)を移動相として使用してシリカカラムで精製する。化合物5aが、純粋形態で、96%の収率で得られる(1.27g)。
質量スペクトルによる分析(ポジティブモード):実測質量MH+=594.21、理論質量=593.1。
質量スペクトルによる分析(ポジティブモード):実測質量MH+=594.21、理論質量=593.1。
(元素分析)
理論値:
C:67.76%、H:7.53%、N:2.32%。
実測値:
C:67.49%、H:7.58%、N:2.24%。
理論値:
C:67.76%、H:7.53%、N:2.32%。
実測値:
C:67.49%、H:7.58%、N:2.24%。
6)化合物6aの調製
メタノール(20mL)中の化合物5a(1.1g、1.85mmol)を希釈した後、4NのNaOHを2mL加える。6時間撹拌した後、反応をTLCでモニターすることにより出発物質の鹸化の完了を確認する。溶媒を蒸発除去した後、生成物を水の混合物(10mL)にとり、次いでEtOAc(15mL)を添加し、更に1NのHClを用いてpH1に酸化する。残渣を有機相にとり、抽出操作を二度繰り返す。混合有機相をNa2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発除去する。純粋化合物6aが、収率94%で得られる(0.98g)。
質量スペクトル(ポジティブモード)による分析(実測質量MH+=566.15、理論質量=565.26)。
メタノール(20mL)中の化合物5a(1.1g、1.85mmol)を希釈した後、4NのNaOHを2mL加える。6時間撹拌した後、反応をTLCでモニターすることにより出発物質の鹸化の完了を確認する。溶媒を蒸発除去した後、生成物を水の混合物(10mL)にとり、次いでEtOAc(15mL)を添加し、更に1NのHClを用いてpH1に酸化する。残渣を有機相にとり、抽出操作を二度繰り返す。混合有機相をNa2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発除去する。純粋化合物6aが、収率94%で得られる(0.98g)。
質量スペクトル(ポジティブモード)による分析(実測質量MH+=566.15、理論質量=565.26)。
(元素分析)
理論値:
C:67.95%、H:7.13%、N:2.48%。
実測値:
C:67.64%、H:7.30%、N:3.08%。
理論値:
C:67.95%、H:7.13%、N:2.48%。
実測値:
C:67.64%、H:7.30%、N:3.08%。
(実施例2:化合物6bの調製
[18]に記載の操作に従って調製される化合物1bから出発し、実施例1と同様の操作に従って、化合物6bを調製する。
化合物6bの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た:理論質量=579.27、実測質量MH+=580.29。
[18]に記載の操作に従って調製される化合物1bから出発し、実施例1と同様の操作に従って、化合物6bを調製する。
化合物6bの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た:理論質量=579.27、実測質量MH+=580.29。
(実施例3:化合物6cの調製)
[18]に記載の操作に従って調製される化合物1cから出発し、実施例1と同様の操作に従って、化合物6cを調製する。
化合物6cの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た:理論質量=489.23、実測質量MH+=490.11。
[18]に記載の操作に従って調製される化合物1cから出発し、実施例1と同様の操作に従って、化合物6cを調製する。
化合物6cの質量スペクトルによる分析により、以下の結果を得た:理論質量=489.23、実測質量MH+=490.11。
このシュードペプチドを、固相ペプチド合成の標準的プロトコルを使用して固相上で合成した。Fmoc-Trp(732mg、0.58mmol)で置換したWang樹脂を、N-メチルピロリドンNMP(5mL)中に懸濁させ、5分間撹拌する。濾過によりNMPを除去した後、NMP中20%の濃度で10mLのピペリジンを添加し、混合物を15分間撹拌する。濾過の後、該樹脂を以下の溶媒で洗う:NMP(7×10mL)、CH2Cl2(3×10mL)、及びEt2O(2×10mL)。その後、2mlのNMP、ジイソプロピルエチルアミンDIEA(749mg、5.76mmol)およびNMP(2mL)中に希釈した化合物6a(360mg、0.64mmol)及び2-(1H)ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートHBTU(730mg、1.92mmol、3mLのNMP中に希釈)を、反応容器に加える。混合物を24時間撹拌する。濾過の後、樹脂をNMP(4×7mL)及びCH2Cl2(5×7mL)で洗う。トリフルオロ酢酸TFA/CH2Cl2/H2O/トリイソプロピルシラン(90/7.5/1.25/1.25)溶液を反応容器に加え、混合物を3時間に亘って撹拌する(脱保護相)。濾過の後、シュードペプチドGを含有する濾液を回収し、溶媒を蒸発除去して生成物をH2O中に溶解させる。凍結乾燥させた後、シュードペプチドGを逆相HPLCによって精製する(Vydacカラム、C18、半調製)。
図2は、得られたクロマトグラムを示す。この図中には、シュードペプチドG中に存在する4つのジアステレオ異性体に相当する4つのピークが観察される(これら4つのピークは同一の質量スペクトルを有する。実測質量MH+=618.23、理論質量=617.23)。ピーク1のみがACEに対して阻害力を示す。
シュードペプチドB、C、及びDを、アラニン(B)、プロリン(C)、およびアルギニン(D)で置換したWang樹脂を用い、シュードペプチドGの調製のために記載したプロトコルを使用して固相上で合成した。これらのシュードペプチドのHPLC精製により、ACEを阻害することのできるこれらシュードペプチドのジアステレオ異性体を単離することができた。
質量スペクトルによるシュードペプチドの分析により、これらのシュードペプチドの構造が確認される。
シュードペプチドB:理論質量502.19;実測質量503.21。
シュードペプチドC:理論質量528.53;実測質量529.11。
シュードペプチドD:理論質量587.25;実測質量587.24。
シュードペプチドB:理論質量502.19;実測質量503.21。
シュードペプチドC:理論質量528.53;実測質量529.11。
シュードペプチドD:理論質量587.25;実測質量587.24。
シュードペプチドE及びFは、化合物6b及び6cから出発して、シュードペプチドGの調製について記載されたプロトコルに従う、固相合成を経て得られる。逆相C18HPLCによる精製の後、これらシュードペプチドのそれぞれについて回収された第一フラクションはACEを阻害可能であることが判明した。
質量スペクトルによるシュードペプチドの分析により、以下の結果が得られた。
シュードペプチドE:理論質量541.20;実測質量542.26。
シュードペプチドF:理論質量631.24;実測質量632.26。
シュードペプチドE:理論質量541.20;実測質量542.26。
シュードペプチドF:理論質量631.24;実測質量632.26。
(実施例10:ACEのN末端及びC末端部位に対する、シュードペプチドA乃至Gの阻害定数の測定)
ヒトの組換えACEを、この測定に使用する。シュードペプチドA乃至Gを用いる、ACEの阻害の曲線は、クエンチした蛍光基質Mca-Ala:Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-DpaOH(Mca:7-メトキシ-クマリン-2-酢酸;DpaOH:N-3-(2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピオニル)を使用して得られる。
ヒトの組換えACEを、この測定に使用する。シュードペプチドA乃至Gを用いる、ACEの阻害の曲線は、クエンチした蛍光基質Mca-Ala:Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-DpaOH(Mca:7-メトキシ-クマリン-2-酢酸;DpaOH:N-3-(2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピオニル)を使用して得られる。
シュードペプチドA乃至GそれぞれのHPLCによる精製の際に回収された第一フラクション(シュードペプチドGについて、図2のピーク1)を、これらの試験のために使用する。
各シュードペプチドA乃至Gについて、この基質を用いて得られる阻害プロフィールから、Diveら[8]によって記載の操作に従って定数Ki N及びKi Cを決定することが可能である。
阻害実験を、25℃、pH6.8、50mM HEPES、10mM、CaCl2、200mM NaClにて行った。
比較の目的のために、シュードプロリン残基を含まないシュードペプチドAを用いて同一の試験を行った。得られた結果を表1にも記載する。このシュードペプチドは、Yiotakisら[14]により記載のようにホスフィン酸ブロックZPhe[PO(OAd)-CH2]AlaOHから調製し、次いで残基Fmoc-Alaで置換したWang樹脂にこのブロックをカップリングさせた。
ACEに対するシュードペプチドA乃至Gの阻害効果の研究及び、ACEのN末端部位(Ki N)及びC末端部位(Ki C)に対するこれらの親和性の比較(表1)により、下記の結論を導き出すことができる。
1°)シュードペプチドA及びB
ACEの二つの活性部位に対する親和性に関しては、シュードプロリン残基の存在はシュードアラニン残基の存在よりも格段に好ましくないようである。その一方で、これらのホスフィン酸シュードペプチドのP1'位にシュードプロリン残基が存在することにより、ACEのC末端部位の選択的阻害が容易になる。
この結果は、ACEのC末端部位に対する阻害剤の選択性を制御する、シュードプロリン残基の本質的な役割を示す。
ACEの二つの活性部位に対する親和性に関しては、シュードプロリン残基の存在はシュードアラニン残基の存在よりも格段に好ましくないようである。その一方で、これらのホスフィン酸シュードペプチドのP1'位にシュードプロリン残基が存在することにより、ACEのC末端部位の選択的阻害が容易になる。
この結果は、ACEのC末端部位に対する阻害剤の選択性を制御する、シュードプロリン残基の本質的な役割を示す。
2°)シュードペプチドB、C、D、及びG
アラニン、プロリン、アルギニン、及びトリプロファン残基を用いたP2'位の修飾は、この位置での側鎖の性質もまた選択性にとっての本質的要因であることを示す。プロリン残基が存在すれば(シュードペプチドC)、強力だが選択性が僅かなACEのN及びC部位の阻害剤を発生する。その一方で、トリプトファン残基の存在により、ACEのC末端部位の非常に選択的な阻害剤(シュードペプチドG)を得ることが可能になる。
アラニン、プロリン、アルギニン、及びトリプロファン残基を用いたP2'位の修飾は、この位置での側鎖の性質もまた選択性にとっての本質的要因であることを示す。プロリン残基が存在すれば(シュードペプチドC)、強力だが選択性が僅かなACEのN及びC部位の阻害剤を発生する。その一方で、トリプトファン残基の存在により、ACEのC末端部位の非常に選択的な阻害剤(シュードペプチドG)を得ることが可能になる。
3°)シュードペプチドE及びF
シュードアラニンまたはシュード-ホモ-フェニルアラニン残基による、シュードペプチドのP1でのシュードフェニルアラニン残基の置換によれば、シュードペプチドGよりも力が弱く選択性も低いシュードペプチドが得られる。この最後の結果は、選択性に関する阻害剤のP1位の重要性がより低いことを示す。
シュードアラニンまたはシュード-ホモ-フェニルアラニン残基による、シュードペプチドのP1でのシュードフェニルアラニン残基の置換によれば、シュードペプチドGよりも力が弱く選択性も低いシュードペプチドが得られる。この最後の結果は、選択性に関する阻害剤のP1位の重要性がより低いことを示す。
シュードペプチドA乃至Gの研究により、本発明のシュードペプチドにおいては、P1、P1'、及びP2'の各位置が相互作用の選択性に関与していると結論することができる。シュードフェニルアラニン、シュードプロリン、及びトリプトファン残基がシュードペプチドG中に存在することにより、とりわけ著しい選択性が得られる。
(実施例11:シュードペプチドGの生体内特性の証明)
アンギオテンシンIのアンギオテンシンIIへの変換を阻害する、シュードペプチドGの性能を検査し、また一方ではブラジキニンの、他方ではペプチドAc-SDKPの開裂に対するその作用を検定するために、生体内研究を行う。
アンギオテンシンIのアンギオテンシンIIへの変換を阻害する、シュードペプチドGの性能を検査し、また一方ではブラジキニンの、他方ではペプチドAc-SDKPの開裂に対するその作用を検定するために、生体内研究を行う。
1)研究プロトコル
この研究を、それぞれ体重が20乃至23gのオスのC57BL6/Jマウス(Iffa Credo)のバッチ(各バッチは6匹のマウスを含む)に行う。
この研究を、それぞれ体重が20乃至23gのオスのC57BL6/Jマウス(Iffa Credo)のバッチ(各バッチは6匹のマウスを含む)に行う。
このために、マウスに、体重1kgあたり80mgの投薬量でのナトリウムペントバルビタール(Sanofi)の腹腔内投与によって麻酔をかける。右の頸動脈を単離し、カテーテル(PE10、0.28×0.61、A-M Systems, Inc.)をこの動脈に挿入して血液サンプルの採取を行い、その一方では別のカテーテル(FEP、0.12×0.67、Carnegie Medecin)を同側の頸静脈に挿入して前記物質の投与できるようにする。実験の間中、マウスの体温は38°に維持する。
第一工程において、同一バッチのマウスに、灌流によって30分間に亘り、以下のいずれかの投与を行う:
・体重1kgあたり0.9、3、10、または30mgの投与量に相当するシュードペプチドGの量を含有し、pH7に調整された、50μLの等張性溶液、または
・50μLの生理食塩水、あるいはまた
・体重1kgあたり10mgの投与量に相当するペリンドプリル(この物質はACEの強力な混合阻害剤である(Servier))の一定量を含有する、50μLの溶液。
・体重1kgあたり0.9、3、10、または30mgの投与量に相当するシュードペプチドGの量を含有し、pH7に調整された、50μLの等張性溶液、または
・50μLの生理食塩水、あるいはまた
・体重1kgあたり10mgの投与量に相当するペリンドプリル(この物質はACEの強力な混合阻害剤である(Servier))の一定量を含有する、50μLの溶液。
次いで、ボーラスとして以下のいずれかを投与する:
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識アンギオテンシンI及び21μCiの3H-アンギオテンシンIを含む混合物、または
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識Ac-SDKP及び17μCiの3H-Ac-SDKPを含む混合物、または
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識ブラジキニン及び11μCiの3H-ブラジキニンを含む混合物。
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識アンギオテンシンI及び21μCiの3H-アンギオテンシンIを含む混合物、または
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識Ac-SDKP及び17μCiの3H-Ac-SDKPを含む混合物、または
・50μLの等張性溶液中に、2μgの非標識ブラジキニン及び11μCiの3H-ブラジキニンを含む混合物。
約50μlの動脈血のサンプルを、マウスにアンギオテンシンI混合物またはブラジキニン混合物を注射した30、60、及び90秒後に、これら混合物を受容したマウスから採取し、また、マウスにAc-SDKP混合物の注射の開始から1、5、10、及び15分後にこの混合物を受容したマウスから採取する。いずれの場合においても、血液は、予め計量し、40μLの水、10μLの80%TFA、及び1μLのヘパリンを入れたポリプロピレン試験管に回収する。採取した血液の正確な量を、前記試験管を再計量することによって決定する。195μLの蒸留水を加えた後、これらの試験管をアイスバス中に10分間置き、その後サンプルを4℃にて遠心分離にかけて血漿抽出物を得る。
これら抽出物の分析を、放射性元素検出器(Z 500-4 cell, Berthold)に接続したHPLC系(Perkin Elmer 200)を使用する液体クロマトグラフィーによって行う。クロマトグラフィーによる分離は、50μLのサンプルの注射により、また下記の移動相及び勾配溶離を使用して、Kromasil C18カラム(AIT)上で行う。
・アンギオテンシンI分析:
移動相:
溶媒A:CH3CN/H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-30% B
30-35分:30-100% B
移動相:
溶媒A:CH3CN/H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-30% B
30-35分:30-100% B
・ブラジキニン分析:
移動相:
溶媒A:CH3CN/H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-25% B
30-35分:25-100% B
移動相:
溶媒A:CH3CN/H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-25% B
30-35分:25-100% B
・Ac-SDKP分析:
移動相:
溶媒A:H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-30% B
30-35分:30-100% B
移動相:
溶媒A:H2O/TFA(10/90/0.1)
溶媒B:CH3CN/H2O/TFA(90/10/0.1)
勾配溶離:
0-30分:0-30% B
30-35分:30-100% B
溶離されたピークを、その滞留時間を非標識の基質(アンギオテンシンI、ブラジキニン、及びAc-SDKP)によって、また予期される開裂生成物(アンギオテンシンII、BK(1-7)、及びBK(1-5))によって示される滞留時間との比較によって同定する。
アッセイは、クロマトグラムの対応するピークの下の領域の積分によって行う。こうして得られる値を、各マウスから採取した血液の重量の関数として正規化する。
結果の統計的比較を、非パラメータMann-Whitney U試験によって行う(Statview5 ソフトウェア)。
2)結果
図3は、棒グラフの形態で、体重1kgあたりシュードペプチドGを0.9、3、10、及び30mg受容したマウス(それぞれ棒グラフ0.9、3、10、及び30)の場合に得られる、アンギオテンシンII/アンギオテンシンI比の平均±SD値、更にまた、コントロールマウス(棒グラフT)、すなわち、50μlの生理食塩水を受容したマウスにおいてこの同一の比について得られる平均±SD値を示す。この図においては、コントロールマウスとの比較により、*はp<0.05に相当し、**はp<0.01に相当する。
図3は、棒グラフの形態で、体重1kgあたりシュードペプチドGを0.9、3、10、及び30mg受容したマウス(それぞれ棒グラフ0.9、3、10、及び30)の場合に得られる、アンギオテンシンII/アンギオテンシンI比の平均±SD値、更にまた、コントロールマウス(棒グラフT)、すなわち、50μlの生理食塩水を受容したマウスにおいてこの同一の比について得られる平均±SD値を示す。この図においては、コントロールマウスとの比較により、*はp<0.05に相当し、**はp<0.01に相当する。
図3は、シュードペプチドGはアンギオテンシンIIへのアンギオテンシンIの開裂を生体内で阻害することができ、またこの阻害が投薬量依存性であるという事実を示す。然るに、コントロールマウスにおいて測定されるアンギオテンシンII/アンギオテンシンI比は、体重1kgあたり0.9mgのシュードペプチドGで処理したマウスの場合には50%、体重1kgあたり30mgのシュードペプチドGで処理したマウスの場合には90%、低減される。
図4は、棒グラフの形態で、体重1kgあたり0.9mgのシュードペプチドGを10mg受容したマウスの場合(棒グラフG)、及びコントロールマウスの場合(棒グラフT)(すなわち体重1kgあたり10mgのペリンドプリルを受容したマウスの場合である)に得られる、ブラジキニンの保護の平均±SDパーセンテージを示す。この図中では、コントロールマウスとの比較により、**はp<0.01に相当する。
図4に見られるように、任意に100%に固定したペリンドプリルによるブラジキニンの保護の平均的程度については、この保護の程度は体重1kgあたり10mgのシュードペプチドGを受容したマウスの場合には9.2%のみである。然るにこのシュードペプチドは、生体内でのブラジキニンの開裂を非常に穏やかに防止できるのみのようである。
図5もまた棒グラフの形態で、体重1kgあたりシュードペプチドGを10mg受容したマウスの場合(棒グラフG)、及びコントロールマウスの場合(棒グラフT)、すなわち、50μlの生理食塩水を受容したマウスの場合に得られる標識した外因性Ac-SDKPペプチドの平均±SD血液濃度(血液のpmol/gで表示)を示す。この図中では、コントロールマウスとの比較により、**はp<0.01に相当する。
図5はまた、比較の目的のために、体重1kgあたり10mgのシュードペプチドRX407(参考文献[7]および[8]にACEのN末端部位の選択的阻害剤として記載)で処理し、同一の操作プロトコルに従うマウスの場合(棒グラフR)の、標識した外因性Ac-SDKPペプチドの平均±SD血液濃度を示す。
図5に示されるように、シュードペプチドGは、体重1kgあたり10mgの投薬量では、ペプチドAc-SDKPの開裂に何ら著しい効果を持たないように見えるが、その一方でRX407は、このペプチドの血漿含量を、コントロールマウスの場合に観察されるものの16倍増大させる。
Claims (17)
- 下式(II):
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
・R4は、水素原子または薬理学的に許容されるカウンターイオンを表し、更に
・R5は、水素原子、薬理学的に許容されるカウンターイオン、または生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
に相当するホスフィン酸シュードペプチド誘導体の、アンギオテンシンI変換酵素のC末端部位を選択的に阻害することのできる医薬生成物の製造のための使用。 - R1が、アセチル及びベンジルオキシカルボニル基から選択されるアミン官能基のための保護基を表す、請求項2に記載の使用。
- R2が、ベンジル、メチル、またはフェニルエチル基を表す、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の使用。
- R3が、アラニン、アルギニン、またはトリプトファンの側鎖を表す、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の使用。
- R4及び/またはR5が、水素原子を表す、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項9乃至11のいずれか一項に記載の、少なくとも1つのホスフィン酸シュードペプチド誘導体を含む製薬品組成物。
- 下式(II):
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
・R4及びR5は、水素原子を表す]
のシュードペプチドの調製方法であって、以下の工程:
1)式(III):
の化合物を、下式(IV):
の化合物と反応させて下式(V):
2)化合物(V)を水素化ホウ素ナトリウムと反応させることによって、化合物(V)を化合物(VI):
3)化合物(VI)のヒドロキシル基を保護基R5、例えばアダマンチル基Adで保護して、下式(VII):
4)化合物(VII)を鹸化して、下式(VIII):
5)下式(VIII)の化合物を下式(IX)または(X):
R3は上記の定義通りである]
のアミノ酸とカップリングさせる工程;更に
6)保護基Adを除去する工程;
を含む方法。 - ペプチドカップリング工程5)が、式(IX)または(X)のアミノ酸で置換された樹脂を固相として使用する固相ペプチド合成を経て行われる、請求項14に記載される方法。
- 下式(II):
R1は、アミン官能基のための保護基、またはアミン官能基のための保護基で保護されたアミノ酸もしくはペプチドを表し、
・R2及びR3は、同一または相違し、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を表し、下式の配列:
・R4は、水素原子を表し、更に
・R5は、生体内で加水分解可能なホスフィン酸エステルを形成することができる基を表す]
のシュードペプチドの調製方法であって、
請求項14または15の方法を経て得られるシュードペプチドのホスフィン酸官能基が、式R5OHのアルコールとのカップリングによって、または式R5X(式中、Xはハロゲン原子を表す)のハロゲン化物との反応によってエステル化される、調製方法。
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