DE60301387T2

DE60301387T2 - Phosphinsäure pseudo-peptidderivate

Info

Publication number: DE60301387T2
Application number: DE60301387T
Authority: DE
Inventors: Jo Cotton; Dimitri Georgiadis; Vincent Dive
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2023-01-17
Also published as: JP2005522420A; US7105483B2; EP1468003A2; ATE302783T1; US20050070505A1; AU2003222329A1; EP1468003B1; FR2834989A1; FR2834989B1; WO2003062247A3; CA2473047A1; WO2003062247A2; DE60301387D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Phosphinsäurepseudopeptid-Derivaten für die Herstellung eines Arzneimittels zur selektiven Hemmung bzw. Inhibierung (Blockierung) der C-terminalen aktiven Stelle des Enzyms zur Umwandlung von Humanangiotensin I (ACE), d.h., ohne die N-terminale aktive Stelle von ACE zu beeinflussen.
Ein solches Arzneimittel ist verwendbar für die Prävention und Behandlung verschiedener Gefäßerkrankungen beim Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem neue Phosphinsäurepseudopeptid-Derivate, sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen sowie Verfahren zur Herstellung der genannten Phosphinsäurepseudopeptid-Derivate.
Stand der Technik
Das Enzym zur Umwandlung von Angiotensin I (das Angiotensin I umwandelnde Enzym) (ACE) ist ein zentraler Wirkstoff bei der Regulierung des arteriellen Blutdruckes und der Homöostase verschiedener physiologischer Funktionen des Herzgefäßgewebes. Diese Wirkungen scheinen zum Teil abzuhängen:

– von der Maturation eines starken Vasokonstriktors, des Angiotensins II, durch Abspaltung des C-terminalen Endes von Angiotensin I, einem inaktiven Peptid, durch ACE und
– vom Abbau eines starken Vasodilatators, dem Bradykinin, durch ACE.

Diese Wirkungen werden nachstehend erläutert:
Die arterielle Hypertension, aber auch die Erkrankungen des Herzgewebes resultieren aus einer Deregulierung der verschiedenen vasokonstriktiven Hormone. Die Wiederherstellung des Gleichgewichtes zwischen vasokonstriktiven Agentien (Vasokonstriktoren) und vasodilatatorischen Agentien (Vasodilatatoren) zugunsten der letztgenannten ist eines der therapeutischen Hauptziele der in der Humanmedizin verwendeten Arzneimittel zur Heilung der arteriellen Hypertension und der Erkrankungen des Herzgewebes. Man versteht auf diese Weise, wie die Hemmung (Blockierung) des ACE an diesen Zielen teilnehmen kann, indem man die Bildung von Angiotensin II vermindert und von Bradykinin verstärkt. Die ACE-Hemmer werden in der Humanmedizin verwendet nicht nur zur Reduktion des arteriellen Bluthochdrucks (Hypertension), sondern auch zur Aufrechterhaltung der Funktionen des Herzgewebes, wie in den Literaturstellen [1] und [2] beschrieben.
Die Klonierung von ACE und die anschließende Bestimmung seiner Primärstruktur haben auf überraschende Weise die Anwesenheit von zwei aktiven Stellen in diesem Enzym gezeigt, wie in der Literaturstelle [3] beschrieben. Durch eine gerichtete Mutagenese konnte nachgewiesen werden, dass diese beiden aktiven Stellen vollständig funktionell sind, d.h. in der Lage sind, physiologische Substrate von ACE, wie z.B. Angiotensin I und Bradykinin, zu spalten (vgl. die Literaturstellen [4] und [5]).
Trotz aller seit mehr als 20 Jahren mit ACE durchgeführter Arbeiten weiß man immer noch nicht, ob die Anwesenheit von zwei aktiven Stellen in dem Säugetier-ACE, die aus einer Duplizierung eines Vorläufer-Gens resultieren, eine spezielle funktionelle Rolle spielen. Die neuere Erkenntnis, dass beim Menschen in vivo das Peptid Ac-SDKP (N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro) durch die aktive N-terminale Stelle von ACE, im Wesentlichen gespalten wird, spricht für eine unterschiedliche funktionelle Rolle jeder der aktiven Stellen des ACE (Literaturstelle [6]).
Diese Erwägungen haben die Forscher zu dem Versuch veranlasst, Hemmer bzw. Inhibitoren zu entwickeln, die sehr selektiv zwischen den beiden aktiven Stellen des ACE unterscheiden können, um über ein Werkzeug zu verfügen, das in vivo die funktionelle Rolle jeder der aktiven Stellen des ACE regulieren kann.
Diesbezüglich ist es wichtig darauf hinzuweisen, dass alle derzeit in der Klinik eingesetzten Inhibitoren gemischte Inhibitoren des ACE sind, d.h. dass sie gleichzeitig die beiden aktiven Stellen des ACE blockieren (hemmen).
Vor kurzem wurde der erste Inhibitor entwickelt, der auf selektive Weise die aktive N-terminale Stelle des ACE blockiert, nämlich RXP407, bei dem es sich um ein Phosphinsäurepseudopeptid handelt (vgl. die Literaturstellen [7], [8] und [21]). Dieser von der Ratte und der Maus nicht verstoffwechselte Inhibitor ist darüber hinaus in der Lage, den Abbau des Peptids N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (Ac-SDKP) bei der Maus in vivo zu hemmen (Literaturstelle [9]). Dabei würde die Injektion von RXP407, welches die N-terminale aktive Stelle des ACE blockiert, in vivo den Abbau von Ac-SDKP verhindern.
Dieser Hemmer bzw. Inhibitor war Gegenstand einer vorklinischen Untersuchung bei diesem Tier, bei der gezeigt werden sollte, dass er nützlich ist zum Schützen des hämatopoietischen Gewebes bei chemotherapeutischen Behandlungen.
Bisher ist jedoch kein Hemmer bzw. Inhibitor beschrieben worden, der in der Lage ist, zwischen den beiden aktiven Stellen des ACE zu unterscheiden, indem er im Wesentlichen nur mit der C-terminalen aktiven Stelle des ACE in Wechselwirkung tritt. Dennoch wäre es wünschenswert, über derartige Hemmer bzw. Inhibitoren zu verfügen. Außer ihren Vorteilen bei experimentellen und klinischen Forschungsarbeiten würden sie nämlich den Hauptvorteil gegenüber den gemischten klassischen Hemmern bzw. Inhibitoren des ACE bieten, mit den physiologischen Funktionen nicht in Wechselwirkung zu treten, die an die Aktivität der N-terminalen aktiven Stelle des ACE gebunden sind, wie z.B. der Metabolismus des Peptids Ac-SDKP.
Es wurde bereits gezeigt, dass die Phosphinsäurepeptide eine allgemeine Klasse von Verbindungen darstellen, die in der Lage sind, auf sehr wirksame Weise die Metallpeptidasen mit Zink, eine Peptidasen-Familie, zu der das ACE gehört, zu blockieren (hemmen), wie dies aus den Literaturstellen [9] bis [16] ersichtlich ist. In diesen Verbindungen besteht die Rolle der PO₂ ^–-Gruppe darin, mit dem Zinkatom, das an der aktiven Stelle dieser Enzyme angeordnet ist, in Wechselwirkung zu treten:
Neben der Anwesenheit der PO₂ ^–-Gruppe spielt die chemische Natur der Reste P2, P1, P1' und P2' eine entscheidende Rolle, um die Selektivität der Wechselwirkungen zwischen einem speziellen Phosphinsäurepeptid und einer gegebenen Metallpeptidase mit Zink zu gewährleisten (vgl. die Literaturstellen [8], [12] und [13]). So erlaubt die Anwesenheit von ganz speziellen Resten in den Positionen P2, P1, P1' und P2' die Erzielung von selektiven Inhibitoren, die nur bestimmte Metallopeptidasen mit Zink inhibieren (hemmen). Eine solche Selektivität kann ein wesentlicher Faktor im Rahmen der in vivo-Verwendung dieser Inhibitoren sein. Man nimmt nämlich an, dass die in vivo-Toxizität bestimmter Inhibitoren großenteils zurückzuführen ist auf ihren Mangel an Selektivität für ein gegebenes Ziel.
Nach diesen Prinzipien hat die Suche nach Inhibitoren, die in der Lage sind, die C-terminale aktive Stelle des ACE selektiv zu blockieren, darin bestanden, in der Familie der Phosphinsäure-Verbindungen spezielle Reste zu identifizieren, die in den Positionen P1, P1' und P2' angeordnet sind, die den Inhibitoren die Fähigkeit verleihen, mit der C-terminalen aktiven Stelle des ACE selektiv in Wechselwirkung zu treten.
Im Übrigen wurden bereits Phosphinsäurepseudopeptide als Inhibitoren für das Human-Cycloplilin-hyp-18, für die Protease von VIH und für das Umwandlungsenzym der Endotheline in den Literaturstellen [22] bis [24] vorgeschlagen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Forschungsarbeiten haben dazu geführt, dass gefunden wurde, dass die Anwesenheit eines Pseudoprolin-Restes in Phosphinsäurepseudopeptiden ein wesentliches Element darstellt zur Erzielung von Hemmern bzw. Inhibitoren, die selektiv für die C-terminale Stelle des ACE sind.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung mindestens eines Phosphinsäurepseudopeptid-Derivats, das die Aminosäure-Sequenz der nachstehend angegebenen Formel (I) aufweist:
worin:

– R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sind, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit
außerdem den Pro-Rest (Prolin-Rest) bilden kann, und
– R₅ ein Wasserstoffatom, ein pharmakologisch akzeptables Gegenion oder eine Gruppe darstellt, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann;

In dieser Sequenz kann die PO₂-Gruppe in der PO₂ ^–-Form vorliegen, in der sie mit einem Wasserstoffatom oder mit einem vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptablen Gegenion, wie z.B. K⁺, Na⁺, NH₄ ⁺, oder jedem anderen Metallion oder Nicht-Metallion, das vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptabel ist, kombiniert sein kann. Die Art des Gegenions hat keine Bedeutung, weil die geladenen Gruppen in Wasser dissoziiert sind.
Die PO₂-Gruppe kann auch in Form eines in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureesters vorliegen. In diesem Fall ist das Pseudopeptid ein solches vom Prodrug-Typ und nach der Hydrolyse des Esters in vivo entsteht die aktive Form des Pseudopeptids.
Gruppen dieses Typs, die für R₅ verwendbar sind, sind insbesondere in der Literaturstelle [20] beschrieben.
Als Beispiele für derartige Gruppen können die Gruppen genannt werden, die den folgenden Formeln entsprechen:
In diesen Formeln steht t-Bu für die tert-Butyl-Gruppe.
Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung entspricht das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der folgenden Formel (II):
worin:

– R₁ eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion geschütztes Peptid darstellt,
– R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit
außerdem den Pro-Rest (Prolin-Rest) bilden kann,
– R₄ ein Wasserstoffatom oder ein pharmakologisch akzeptables Gegenion darstellt und
R₅ wie weiter oben angegeben definiert ist.

In den oben angegebenen Formeln repräsentieren R₂ und R₃ die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure, beispielsweise einer Pseudoaminosäure.
Die natürlichen Aminosäuren können ausgewählt werden aus der Gruppe Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Norleucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Nitrophenylalanin, Homoarginin, Thiazolidin und Dehydroprolin.
Eine Pseudoaminosäure kann definiert werden als eine Aminosäure, in der die Amin-Funktion oder Carbonyl-Funktion durch eine andere chemische Gruppe ersetzt worden ist.
In der vorstehend angegebenen Formel (II) kann die Gruppe R₁ eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für eine Amin-Funktion sein. Derartige Schutzgruppen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt und sind beispielsweise angegeben in der Arbeit mit dem Titel "Protective Groups in Organic Synthesis", zweite Auflage, von T. W. Greene und P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, Inc., Seiten 309–315 [17]. Als Beispiele für derartige Gruppen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können die Acetyl- und Benzyloxycarbonyl-Gruppen genannt werden.
R₁ kann auch eine natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure oder ein Peptid darstellen, deren (dessen) terminate Amin-Funktion durch eine übliche Schutzgruppe, beispielsweise eine solche, wie sie vorstehend angegeben worden ist, geschützt ist.
Wie aus den nachstehenden Ausführungen ersichtlich, ist erfindungsgemäß die Anwesenheit des Pseudoprolin-Restes wesentlich für die Erzielung der Selektivität gegenüber der C-terminalen aktiven Stelle von ACE, die Art der Seitenketten, die in R₂ und R₃ vorhanden sind, spielt jedoch ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Selektivität der Wechselwirkungen der Derivate, die erfindungsgemäß verwendet werden, mit den N-terminalen und C-terminalen Stellen von ACE.
Was die Hemmung (Inhibierung) der C-terminalen Stelle von ACE angeht, so wurden gute Ergebnisse erhalten mit Pseudopeptiden, in denen die Gruppe R₂ eine Benzyl-, Methyl- oder Phenylethyl-Gruppe darstellt, d.h., die Seitenkette von Phenylalanin, Alanin und Homophenylalanin darstellt.
Wenn R₃ die Seitenkette von Alanin, Arginin oder Tryptophan darstellt oder wenn die Einheit -NH-CH(R₃)-CO- den Pro-Rest darstellt, wurden für R₃ gute Ergebnisse erhalten.
Im Allgemeinen stehen R₄ und R₅ für ein Wasserstoffatom.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der folgenden Formel:
(Pseudopeptid G)
Es hat sich gezeigt, dass die Phosphinsäurepseudopeptid-Derivate, die erfindungsgemäß verwendet werden können, in der Lage sind, die C-terminale aktive Stelle des Enzyms zur Umwandlung von Angiotensin I selektiv zu hemmen (zu inhi bieren) und damit die physiologischen Gehalte an Angiotensin II in vivo zu steuern – das Angiotensin II spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle des Arteriendruckes sowie bei der Homöostase der Gefäßfunktionen beim Menschen – ohne weder in den Stoffwechsel des Bradykinins noch in denjenigen des Peptids Ac-SDKP einzugreifen.
Ihre Verwendung als Wirkstoffe in einem Arzneimittel ist somit in vielerlei Weise möglich bei der Prävention und Behandlung von Human-Gefäßerkrankungen und insbesondere bei Erkrankungen, bei denen das Bradykinin kaum in Erscheinung tritt, wie bei der Prävention der Arteriosklerose.
Unter den Phosphinsäurepseudopeptid-Derivaten, deren Verwendung erfindungsgemäß vorgesehen ist, sind es gerade diese, die bisher in der Literatur niemals beschrieben worden sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat, das die Aminosäure-Sequenz der oben angegebenen Formel (I) aufweist, worin:

– R₂ steht für die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure,
– die Einheit
den Pro-Rest (Prolin-Rest) bildet:
und
– R₅ steht für ein Wasserstoffatom, ein Gegenion, das vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptabel ist, oder für eine Gruppe, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann.

Unter diesen Derivaten sind insbesondere diejenigen bevorzugt, die der oben angegebenen Formel (II) entsprechen, worin:

– R₁ eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion oder eine durch eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid darstellt,
– R₂ die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt,
– die Einheit
den Pro-Rest (Prolin-Rest) bildet:
– R₄ steht für ein Wasserstoffatom oder ein vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptables Gegenion,
– R₅ steht für ein Wasserstoffatom, ein vom pharmakologischen Gesichtspunkt aus betrachtet akzeptables Gegenion oder eine Gruppe, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann.

Bevorzugt ist insbesondere das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der Formel
(Pseudopeptid G)
Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der vorstehend angegebenen Formel (II) umfasst, worin:

– R₂ steht für die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure,
– die Einheit
den Pro-Rest (Prolin-Rest) bildet:
und
– R₅ steht für ein Wasserstoffatom, ein vom pharmakologischen Standpunkt aus betrachtet akzeptables Gegenion oder eine Gruppe, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann.

In dieser Zusammensetzung entspricht das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat vorzugsweise der Formel:
(Pseudopeptid G)
Im Hinblick auf die vorstehenden Angaben ist eine solche pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere geeignet für viele Anwendungszwecke bei der Prävention und Behandlung verschiedener Herzgefäß-Erkrankungen beim Menschen.
Die Phosphinsäurepseudopeptid-Derivate der oben angegebenen Formel (II), in der R₄ und R₅ für ein Wasserstoffatom stehen, können nach einem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Stufen umfasst:

1) Reagierenlassen einer Verbindung der Formel (III):
in der R₁ und R₂ wie oben definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (IV):
in der Ac die Acetyl-Gruppe darstellt und Et die Ethyl-Gruppe darstellt, zur Herstellung der Verbindung der Formel (V):
2) Umwandlung der Verbindung (V) in eine Verbindung (VI) durch Umsetzung der Verbindung (V) mit Natriumborhydrid:
3) Schützen der Hydroxylgruppe der Verbindung (VI) mit der Adamantyl-Gruppe Ad, zur Herstellung der Verbindung der Formel (VII):
4) Verseifen der Verbindung (VII) zur Herstellung der Verbindung der Formel (VIII):
5) Kuppeln der Verbindung der Formel (VIII) mit einer Aminosäure der Formel (IX) oder (X):
worin R₃ wie oben definiert ist, und
6) Eliminieren der Schutzgruppe Ad.

Bei diesen Verfahren synthetisiert man zunächst den Phosphinsäureblock der Formel (VIII), der das Pseudoprolin umfasst, und anschließend führt man eine Peptid-Kupplung dieses Phosphinsäureblocks an die gewünschte Aminosäure durch.
Zweckmäßig wird die Stufe (5) der Peptid-Kupplung durchgeführt durch Peptid-Synthese in fester Phase unter Verwendung eines Harzes als feste Phase, das durch die Aminosäure der Formel (IX) oder (X) substituiert ist, deren N-terminales Ende vorher durch eine Fmoc-Gruppe (Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe) geschützt worden ist.
Erforderlichenfalls kann anschließend die Phosphinsäurefunktion des Pseudopeptids der Formel (II), in der R₅ für ein Wasserstoffatom steht, verestert oder in ein Salz überführt werden, indem man sie mit geeigneten Reagentien reagieren lässt.
Die Veresterung kann erhalten werden durch Kuppeln mit einem Alkohol der Formel R₅OH, in dem R₅ für eine Gruppe steht, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann, indem man beispielsweise das in der Literaturstelle [20] (Verfahren A) beschriebene Verfahren anwendet.
Man kann die Veresterung auch durchführen durch Umsetzung mit einem Halogenid der Formel R₅X, in dem R₅ die Gruppe darstellt, die einen in vivo hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann. Diese Reaktion kann unter alkalischen Bedingungen unter Anwendung des in der Literaturstelle [20] (Verfahren B) beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
Vor Durchführung dieser Veresterung schützt man die Carbonsäure-Funktion(en) des Pseudopeptids durch geeignete Schutzgruppen, die man anschließend eliminiert durch Anwendung von klassischen Verfahren.
Wenn man die Phosphinsäurefunktion des Pseudopeptids der Formel (II), in der R für ein Wasserstoffatom steht, in ein Salz überführen will, um dieses Wasserstoffatom durch ein pharmazeutisch akzeptables Gegenion zu ersetzen, lässt man das Pseudopeptid mit einer geeigneten Base reagieren, die dieses Gegenion enthält, beispielsweise mit NaOH, KOH, NH₄OH.
Das gleiche Verfahren kann angewendet werden, um die endständige Carboxylgruppe des Pseudopeptids in ein Salz zu überführen, um das Wasserstoffatom durch ein pharmazeutisch akzeptables Gegenion zu ersetzen.
Weitere Charakteristika der Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden ergänzenden Beschreibung hervor, die sich auf Ausführungsbeispiele für Pseudopeptid-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung und auf das Aufzeigen ihrer Eigenschaften unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen bezieht.
Selbstverständlich dient die nachfolgende ergänzende Beschreibung nur der Erläuterung der Erfindung und die Erfindung ist keineswegs darauf beschränkt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 erläutert die Synthese von Synthonen, die für die Herstellung von erfindungsgemäßen Phosphinsäurepseudopeptiden geeignet sind;
2 erläutert das Chromatogramm, das bei der Reinigung von Pseudopeptid G durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) erhalten wurde;
3 erläutert die in vivo-Effekte des Pseudopeptis G auf die Spaltung von Angiotensin I zu Angiotensin II;
4 erläutert die in vivo-Effekte des Pseudopeptids G auf die Spaltung von Bradykinin; und
5 erläutert die in vivo-Effekte des Pseudopeptids G und von RPX407 (einem selektiven Inhibitor für die N-terminale Stelle von ACE) auf die Spaltung des Peptids Ac-SDKP.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung
Die Synthese der Phosphinsäurepseudopeptide wurde durchgeführt unter Anwendung des in der 1 dargestellten Syntheseschemas.
Diese 1 zeigt die Stufen des Verfahrens, die zu Synthonen der Formel (VIII) führen:
worin:

– R₁ steht für die Benzyloxycarbonyl-Gruppe (Cbz) und
– R₂ steht für die Phenylgruppe (Verbindungen 1a, 3a, 4a, 5a und 6a), die Phenethylgruppe (Verbindungen 1b, 3b, 4b, 5b und 6b) oder für die Methylgruppe (Verbindungen 1c, 3c, 4c, 5c und 6c).

Beispiel 1: Herstellung der Verbindung 6a
1) Herstellung der Verbindung 1a
Dieses Aminophosphinsäure-Derivat wird nach dem von Baylis [18] beschriebenen Verfahren hergestellt, dann wird das Enantiomere mit der Konfiguration R durch Umkristallisation erhalten, wobei man dem von Baylis [18] angegebenen Versuchsprotokoll folgt.
2) Herstellung der Verbindung 2a
Diese Verbindung wird erhalten, indem man dem Verfahren folgt, das von Villieras et al. [19] beschrieben worden ist. Das erhaltene Produkt wurde durch NMR charakterisiert:
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): 7,03 (t, 1H), 5,93 (m, 1H), 4,1 (m, 2H), 2,6 (m, 1H), 2,34 (m, 2H), 1,95 (s, 3H), 1,82 (m, 1H), 1,18 (t, 3H).
3) Herstellung der Verbindung 3a
Eine Mischung der Verbindung 1a (3,2 g, 10 mmol) mit Hexamethyldisilazan (10,5 mL, 50 mmol) unter einem Argonstrom wird 3 h lang auf 110°C erwärmt. Bei dieser Temperatur wird die Verbindung 2 (5,5 g, 12 mmol) zugegeben und diese Lösung wird 4 h lang bei 90°C gerührt. Zu dieser auf 70°C abgekühlten Lösung gibt man 10 mL absolutes Ethanol EtOH tropfenweise zu, wobei die Mischung 30 min lang bei 70°C gerührt wird. Nach dem Eindampfen der Lösungsmitteln wird der Rückstand in 5%igem NaHCO₃ (10 mL) und 5 mL Hexan gelöst. Nach drei Extraktionen mit Ethylacetat AcEtO (3 × 5 mL) wird nach dem Eindampfen des Lösungsmittels das Rohprodukt erhalten. Eine Reinigung an einer Siliciumdioxid-Kolonne unter Verwendung einer Chloroform/Methanol/Essigsäure (7/0,3/0,3)-Mischung erlaubt die Gewinnung von 4 g der reinen Verbindung 3a in Form eines weißen Feststoffes (Ausbeute 89%).
Die NMR-Charakterisierung dieses Produkts basiert auf den COSY-, TOCSY- und HMQC-Versuchen:
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): 1,27 (t, ³JHH = 7,1 Hz, 3H, CH₂CH₃), 1,95–3,00 (m, 5H, PCH(CH₂)₂, PhCHH), 3,13–3,45 (m, 2H, PCH, PhCHH), 4,02–4,31 (m, 2H, CH₂CH₃), 4,34–4,63 (m, 1H, PCH), 4,78–5,05 (m, 2H, OCH₂Ph), 5,71 (d, 1H, NH, ³JHH=11,3 Hz, I), 5,78 (d, 1H, NH, ³JHH = 10,8 Hz, II), 6,91–6,99 (d, 1H, C=CH, I/II), 7,02–7,34 (m, 10H, Aryl).
¹³C-NMR (62 MHz, CDCl₃): 14,2/14,2 (CH₂-CH₃), 26,2/26,5 (PCHCH₂), 32,7/32,8 (PCHCH₂CH₂), 34,5 (CH₂Ph), 41,8 (d, ¹J_PC = 87,7 Hz, PCHC, I), 43,1 (d, ¹J_PC = 87,3 Hz, PCHC, II), 50,5 (d, ¹J_PC = 99,7 Hz, PCHN, I), 50,5 (d, ¹J_PC = 100,5 Hz, PCHN, II), 61,1/61,2 (CH₂CH₃), 66,8 (OCH₂Ph), 126,6, 127,7, 127,8, 127,9, 127,9, 128,4, 128,4, 129,4, 132,2, 132,3, 132,9, 136,5, 136,6, 137,1, 137,3, (Aryle), 148,1 (d, ²J_PC = 8,7 Hz, =CCO, I), 148,1 (d, ²J_PC = 9 Hz, =CCO, II), 156,1 (d, ²J_PC = 5,5 Hz, CONH, I), 156,2 ((d, ²J_PC = 5,7 Hz, CONH, II), 165,3 (d, ²J_PC = 2,7 Hz, COOEt),
³¹P-NMR (100 MHz, CDCl₃): 46,89, 48,13.
Die Verbindungen I und II entsprechen verschiedenen Diastereoisomeren.
Elementaranalyse:
theoretische Werte:
C: 61,80%, H: 6,27%, N: 3,00%,
experimentelle Werte:
C: 61,89%, H: 6,23%, N: 2,98
4) Herstellung der Verbindung 4a
Die Verbindung 3a (1,4 g, 3,06 mmol) und NiCl₂·6H₂O (1,09 g, 9,2 mmol) werden in einer THF (12,4 mL)/Methanol (7,7 mL)-Mischung gelöst. Zu dieser Lösung gibt man innerhalb von 30 min bei –30°C NaBH₄ (0,58 g, 15,4 mmol) in Portionen zu. Diese Mischung wird weitere 10 min lang bei –30°C gerührt. Die Lösungsmittel werden verdampft und das Produkt wird in eine Mischung von AcOEt (25 mL) und 1 N HCl (20 mL, pH 1) extrahiert.
Die organische Phase wird entnommen und mit Wasser (10 mL) gewaschen, dann mit Na₂SO₄ getrocknet. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel wird das Produkt an einer Siliciumdioxid-Kolonne mit einer mobilen Phase aus Chloroform/Methanol/Essigsäure (7/0,3/0,3) gereinigt. Man erhält 1,28 g der Verbindung 4a (Ausbeute 91%).
Die Massenspektral-Analyse nach dem negativen Modus (festgestellte Masse MH^– = 458,48, erwartete Masse = 459,47) steht in Übereinstimmung mit der chemischen Struktur der Verbindung 4a.
Elementaranalyse:
theoretische Werte:
C: 61,78%, H: 6,63%, N: 3,00
experimentelle Werte:
C: 61,98%, H: 6,31%, N: 3,08
5) Herstellung der Verbindung 5a
Die Adamantylierung der Verbindung 4a wird nach dem von Yiotakis et al. [14] beschriebenen Versuchsprotokoll durchgeführt.
Zu einer Lösung der Verbindung 4a (1,03 g, 2,24 mmol) in Chloroform werden 1-Adamantyl-Br (538 mg, 2,5 mmol) und Ag₂O (577 mg), verteilt auf 5 gleiche Portionen, innerhalb 1 h zugegeben. Nach 2 h werden 0,5 Äquivalente AdBr und 0,5 Äquivalente Ag₂O erneut zugegeben und die Mischung wird 10 h lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Eindampfen der Lösungsmittel wird das Rohprodukt an einer Siliciumdioxid-Kolonne gereinigt unter Verwendung einer Chloroform/Isopropanol (9,8/0,2)-Mischung als mobile Phase. Die Verbindung 5a wird in reiner Form mit einer Ausbeute von 96% (1,27 g) erhalten.
Massenspektralanalyse, positiver Modus:
festgestellte Masse MH⁺ = 594,21,
erwartete Masse = 593,1.
Elementaranalyse:
theoretische Werte:
C: 67,76%, H: 7,53%, N: 2,32
experimentelle Werte:
C: 67,49%, H: 7,58%, N: 2,24%
6) Herstellung der Verbindung 6a
Nach dem Verdünnen der Verbindung 5a (1,1 g, 1,85 mmol) in Methanol (20 mL) werden 2 mL 4 N NaOH zugegeben. Nach 6-stündigem Rühren wird die Reaktion durch TLC verfolgt und sie bestätigt die vollständige Verseifung des Ausgangsprodukts. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird das Produkt in einer Wassermischung (10 mL) aufgenommen, dann wird AcOEt (15 mL) zugegeben und es wird mit 1 N HCl auf pH 1 angesäuert. Der Rückstand wird in die organische Phase aufgenommen und das Extraktionsverfahren wird zweimal wiederholt. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na₂SO₄ getrocknet, dann werden die Lösungsmittel verdampft. Die reine Verbindung 6a wird in einer Ausbeute von 94 (0,98 g) erhalten.
Spektralanalyse, positiver Modus:
festgestellte Masse MH⁺ = 566,15,
erwartete Masse = 565,26.
Elementaranalyse:
theoretische Werte:
C: 67,95%, H: 7,13%, N: 2,48
experimentelle Werte:
C: 67,64%, H: 7,30%, N: 2,40
Beispiel 2: Herstellung der Verbindung 6b
Man folgt der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 zur Herstellung der Verbindung 6b, wobei man von der Verbindung 1b ausgeht, die nach dem in [18] beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist.
Die Massenspektralanalyse der Verbindung 6b hat die folgenden Ergebnisse ergeben:
erwartete Masse = 579,27,
festgestellte Masse MH⁺ = 580,29.
Beispiel 3: Herstellung der Verbindung 6c
Man folgt der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 zur Herstellung der Verbindung 6c, wobei man von der Verbindung 1c ausgeht, die nach dem in [18] beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist.
Die Massenspektralanalyse der Verbindung 6c hat die folgenden Ergebnisse ergeben:
erwartete Masse = 489,23,
festgestellte Masse MH⁺ = 490,11.
Beispiel 4: Herstellung des Pseudopeptide G der Formel:
(Pseudopeptid G)
Dieses Pseudopeptid wurde auf einer festen Phase synthetisiert unter Anwendung eines Standardprotokolls zur Synthese von Peptiden auf einer festen Phase. Das Harz Wang, substituiert durch ein Fmoc-Trp (732 mg, 0,58 mmol) wird in N-Methylpyrrolidon (NMP) (5 mL) suspendiert und 5 min lang gerührt. Nach der Eliminierung des NMP durch Filtrieren werden 10 mL 20%iges Piperidin in NMP zugegeben und die Mischung wird 15 min lang gerührt. Nach dem Filtrieren wird das Harz mit den folgenden Lösungsmitteln gewaschen: NMP (7 × 10 mL), CH₂Cl₂ (3 × 10 mL) und Et₂O (2 × 10 mL). Dann werden in den Reaktor 2 ml NMP, Diisopropylethylamin (DIEA) (749 mg, 5,76 mmol) und die Verbindung 6a (360 mg, 0,64 mmol), verdünnt in NMP (2 mL) und 2-(1H)-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU) (730 mg, 1,92 mmol, verdünnt in 3 mL NMP) eingeführt. Die Mischung wird unter Rühren 24 h lang stehen gelassen. Nach dem Filtrieren wird das Harz mit NMP (4 × 7 mL), CH₂Cl₂ (5 × 7 mL) gewaschen. Dann wird eine Lösung von Trifluoressigsäure (TFA)/CH₂Ch/H₂O/Triisopropylsilan (90/7,5/1,25/1,25) in den Reaktor gegeben und die Mischung wird 3 h lang gerührt (Schutzgruppenentfernungs-Phase). Nach dem Filtrieren wird das das Pseudopeptid G enthaltende Filtrat gewonnen, das Lösungsmittel wird verdampft und das Produkt wird in H₂O gelöst. Nach dem Lyophilisieren wird das Pseudopeptid G durch Phasenumkehr-HPLC (Vydac-Kolonne C18, semi-präparativ) gereinigt.
Die 2 erläutert das dabei erhaltene Chromatogramm. In dieser Figur sind 4 Peaks zu erkennen, die den in dem Pseudopeptid G vorhandenen 4 Diastereoisomeren entsprechen (diese 4 Peaks weisen ein identisches Massenspektrum auf, festgestellte Masse MH⁺ = 618,23, erwartete Masse = 617,23). Nur der Peak 1 zeigt ein Hemmungs- bzw. Inhibierungsvermögen gegenüber ACE.
Die NMR-Charakterisierung des Pseudopeptids G, Peak 1 HPLC, basiert auf COSY-, TOCSY- und HMQC-Versuchen:
¹H NMR (250 MHz, DMSO) 4,93 (d, 2H, CH₂-O-Ph), 4,01 (m, 1H, CH-CH₂-Ph), 2,77 (m, 1H, CH-CH₂-Ph), 3,08 (m, 1H, CH-CH₂-Ph), 3,09 (α-Pseudo-Prolin), 1,77 (β-Pseudo-Prolin), 1,56 (γ-Pseudo-Prolin), 1,79 (δ-Pseudo-Prolin), 2,49 (ε-Pseudo-Prolin), 4,50 (α-Trp), 3,13 (β,β-Trp), 7,6 NH, 8,3 NH, Aryle 7,35–6,9.
Beispiele 5 bis 7: Herstellung der Pseudopeptide B, C und D der Formeln:
(Pseudopeptid B)
(Pseudopeptid C)
(Pseudopeptid D)
Die Pseudopeptide B, C und D wurden in fester Phase synthetisiert mit Wang-Harzen, die substituiert waren durch Alanin (B), Prolin (C) und Arginin (D) unter An wendung des für die Herstellung des Pseudopeptids G beschriebenen Standard-Protokolls. Die Reinigung dieser Pseudopeptide durch HPLC erlaubte die Isolierung der Diastereoisomeren dieser Pseudopeptide, die ACE hemmen (inhibieren) können.
Die Analyse der Pseudopeptide durch Massenspektrometrie bestätigt die Struktur dieser Pseudopeptide:
Pseudopeptid B: erwartete Masse 502,19; festgestellte Masse 503,21;
Pseudopeptid C: erwartete Masse 528,53; festgestellte Masse 529,11.
Pseudopeptid D: erwartete Masse 587,25; festgestellte Masse 587,24.
Beispiele 8 und 9: Herstellung der Pseudopeptide E und F der Formeln
(Pseudopeptid E)
(Pseudopeptid F)
Man erhält die Pseudopeptide E und F durch Synthese in fester Phase, wobei man von den Verbindungen 6b und 6c ausgeht und dem Standardprotokoll folgt, wie es für die Herstellung des Pseudopeptids G beschrieben worden ist. Nach dem Reinigen durch Umkehrphasen-HPLC C18 erweist sich die für jedes dieser Pseudopeptide gesammelte erste Fraktion als fähig, ACE zu hemmen (zu inhibieren).
Die Analyse durch Massenspektrometrie ergibt die folgenden Ergebnisse:
Pseudopeptid E: erwartete Masse 541,20; festgestellte Masse 542,26.
Pseudopeptid F: erwartete Masse 631,24; festgestellte Masse 632,26.
Beispiel 10:
Bestimmung der Inhibierungskonstanten der Pseudopeptide A bis G gegenüber den N- und C-terminalen Stellen des ACE
Für diese Bestimmung verwendet man ein rekombinantes Human-ACE. Kurven zur Hemmung (Inhibierung) von ACE durch die Pseudopeptide A bis G werden erhalten unter Verwendung des Fluoreszenz-Auslöschungssubstrats Mca-Ala: Mca-Ala-Ser-Asp-Lys-DpaOH (Mca: 7-Methoxy-cumarin-2-essigsäure; DpaOH: N-3-(2,4-Dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl).
Für diese Versuche verwendet man die bei der Reinigung jedes der Pseudopeptide A bis G durch HPLC gesammelte erste Fraktion (Peak 1 der 2 für das Pseudopeptid G).
Ausgehend von den Hemmungs- bzw. Inhibierungsprofilen, die mit diesem Substrat für jedes Pseudopeptid A bis G erhalten werden, ist es möglich, die Konstanten Ki N und Ki C zu bestimmen durch Anwendung des Verfahrens, wie es von Dive et al. in [8] beschrieben ist.
Die Inhibierungsversuche wurden bei 25°C, pH 6,8, 50 mM HEPES, 10 mM, CaCl₂, 200 mM NaCl durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der weiter unten folgenden Tabelle 1 angegeben.
Zu Vergleichszwecken wurde der gleiche Versuch mit dem Pseudopeptid A, das keinen Pseudoprolin-Rest enthielt, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle 1 angegeben. Dieses Pseudopeptid wurde hergestellt aus dem Phosphinsäureblock ZPhe[PO(OAd)-CH₂]AlaOH, wie von Yiotakis et al. in [14] beschrieben, dann wurde dieser Block an ein Wang-Harz, das durch den Fmoc-Ala-Rest substituiert war, gekuppelt.
Die Untersuchung der Inhibitoreffekte der Pseudopeptide A bis G auf ACE und der Vergleich ihrer Affinität gegenüber der N-terminalen Stelle (Ki N) und der C- terminalen Stelle (Ki C) von ACE (Tabelle 1) erlaubt es, daraus die folgenden Schlussfolgerungen zu ziehen.
1°) Pseudopeptide A und B:
Was die Affinität für die beiden aktiven Stellen von ACE angeht, scheint die Anwesenheit eines Pseudoprolin-Restes weit weniger günstig zu sein als eines Pseudoalanin-Restes. Dagegen eröffnet die Anwesenheit eines Pseudoprolin-Restes in der Position P1' dieser Phosphinsäurepseudopeptide einen Zugang zu selektiven Inhibitoren für die C-terminale Stelle von ACE.
Dieses Ergebnis zeigt die wesentliche Rolle des Pseudoprolin-Restes für die Kontrolle (Steuerung) der Selektivität der Inhibitoren für die C-terminale Stelle von ACE.
2°) Pseudopeptide B, C, D und G:
Die Modifikationen der Position P2' durch die Alanin-, Prolin-, Arginin- und Tryptophan-Reste zeigen, dass die Art der Seitenkette in dieser Position ebenfalls ein wesentlicher Faktor für die Selektivität ist. Die Anwesenheit des Prolin-Restes (Pseudopeptid C) ergibt einen starken Inhibitor, der jedoch wenig selektiv ist für die N- und C-Stellen von ACE. Dagegen erlaubt die Anwesenheit eines Tryptophan-Restes die Erzielung eines extrem selektiven Inhibitors (Pseudopeptid G) für die C-terminale Stelle von ACE.
3°) Pseudopeptide E und F:
Die Substitution eines Pseudophenylalanin-Restes in der Position P1 der Pseudopeptide durch einen Pseudoalanin- oder Pseudohomo-phenylalanin-Rest führt zu Pseudopeptiden, die weniger stark (wirksam) und weniger selektiv sind als das Pseudopeptid G. Das zuletzt genannte Ergebnis zeigt eine geringere Bedeutung der Position P1 der Inhibitoren in Bezug auf die Selektivität an.
Eine Untersuchung der Pseudopeptide A bis G erlaubt die Schlussfolgerung, dass in den erfindungsgemäßen Pseudopeptiden jede Position P1, P1' und P2' zu der Selektivität der Wechselwirkungen beiträgt. Die Anwesenheit der Pseudophenylalanin-, Pseudoprolin- und Tryptophan-Reste in dem Pseudopeptid G verleiht diesem eine besonders ausgeprägte Selektivität.
Beispiel 11: Nachweis der in vivo-Eigenschaften des Pseudopeptids G
Es wird eine in vivo-Untersuchung durchgeführt, um die Fähigkeit des Pseudopeptids G zu bestätigen, die Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II zu inhibieren (hemmen) und um seine Effekte auf die Spaltung von Bradykinin einerseits und des Peptids Ac-SDKP andererseits festzustellen.
1) Untersuchungsprotokoll
Diese Untersuchung wurde mit Gruppen von männlichen Mäusen C57BL6/J (Iffa Credo) mit einem Gewicht von jeweils 20 bis 23 g durchgeführt, wobei jede Gruppe 6 Mäuse umfasste.
Um diese Versuche durchzuführen, wurden die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbitalnatrium (Sanofi) in einer Dosis von 80 mg/kg Körpergewicht anästhesiert. Die rechte Halsschlagader (Karotis) wurde isoliert und es wurde ein Katheter (PE10, 0,28 × 0,61, A-M Systems, Inc.) in diese Arterie eingeführt, um die Entnahme von Blutproben zu ermöglichen, während ein anderer Katheter (FEP, 0,12 × 0,67, Carnegie Medecin) in die ipsilatare Jugular-Vene eingeführt wurde, um die Verabreichung von Substanzen zu ermöglichen. Während der gesamten Versuchsdauer wurde die Körpertemperatur der Mäuse bei 38°C gehalten.
In einer ersten Stufe wurden den Mäusen derselben Gruppe durch 30-minütige Perfusion verabreicht:

– entweder 50 μL einer isotonischen Lösung (eingestellt auf pH 7), die eine Menge an Pseudopeptid G enthielt, die einer Dosis von 0,9; 3; 10 oder 30 mg/kg Körpergewicht entsprach,
– oder 50 μL physiologisches Serum,
– oder auch 50 μL einer Lösung, die eine Menge von Perindopril enthielt, die einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht entsprach, wobei diese Substanz ein starker gemischter Inhibitor für ACE war (Servier).

Dann wurde ihnen als Bolus-Injektion verabreicht:

– entweder eine Mischung, umfassend 2 μg nicht-markiertes Angiotensin I und 21 μCi ³H-Angiotensin I in 50 μL isotonischer Lösung,
– oder eine Mischung, umfassend 2 μg nicht-markiertes Ac-SDKP und 17 μCi ³H-Ac-SDKP in 50 μL isotonischer Lösung,
– oder eine Mischung, umfassend 2 μg nicht-markiertes Bradykinin und 11 μCi ³H-Bradykinin in 50 μL isotonischer Lösung.

30, 60 und 90 s nach der Injektion der Mischung von Angiotensin I oder der Mischung von Bradykinin wurden etwa 50 μL Arterienblut entnommen bei den Mäusen, denen eine dieser Mischungen verabreicht worden war, und 1, 5, 10 und 15 min nach Beginn der Injektion der Mischung von Ac-SDKP wurden etwa 40 μL Arterienblut entnommen bei den Mäusen, welche die zuletzt genannte Mischung erhalten hatten. In allen Fällen wurde das Blut in Propylen-Röhrchen gesammelt, die vorher gewogen worden waren und 40 μL Wasser, 10 μL 80%iges TFA und 1 μL Heparin enthielten. Die genauen Mengen des entnommenen Blutes wurden durch erneutes Wiegen der Röhrchen bestimmt. Nach der Zugabe von 195 μL destilliertem Wasser wurden diese Röhrchen 10 min lang in ein Eisbad gestellt und die Proben wurden bei 4°C zentrifugiert, um Plasmaextrakte zu erhalten.
Die Analyse dieser Extrakte wurde durch Flüssigchromatographie unter Ver wendung eines HPLC-Systems (Perkin Elmer 200), kombiniert mit einem Radioelement-Detektor (Z 500-4 Zelle, Berthold) durchgeführt. Die chromatographischen Trennungen wurden an einer Kromasil C18-Kolonne (AIT) durchgeführt durch Injektion von 50 μL-Proben und unter Verwendung der mobilen Phasen und der Elutionsgradienten, wie nachstehend angegeben sind:
• Analyse von Angiotensin I:

Mobile Phase: Lösungsmittel A: CH₃CN/H₂O/TFA (10/90/0,1) Lösungsmittel B: CH₃CN/H₂O/TFA (90/10/0,1)
Elutionsgradienten: 0–30 min: 0–30% B 30–35 min: 30–100% B

• Analyse von Bradykinin:

Mobile Phase: Lösungsmittel A: CH₃CN/H₂O/TFA (10/90/0,1) Lösungsmittel B: CH₃CN/H₂O/TFA (90/10/0,1)
Elutionsgradienten: 0–30 min: 0–25% B 30–35 min: 25–100% B

• Analyse von Ac-SDKP:

Mobile Phase: Lösungsmittel A: H₂O/TFA (100/0,1) Lösungsmittel B: CH₃CN/H₂O/TFA (90/10/0,1)
Elutionsgradienten: 0–30 min: 0–30% B 30–35 min: 30–100% B

Die eluierten Peaks werden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit denjenigen, welche die nicht-markierten Substrate aufwiesen (Angiotensin I, Bradykinin und Ac-SDKP) und durch die erwarteten Spaltungsprodukte (Angiotensin II, BK (1-7) und BK (1-5)) identifiziert.
Die Analysenwerte wurden erhalten durch Integration der Fläche unter den entsprechenden Peaks des Chromatogramms. Die so erhaltenen Werte wurden normiert als Funktion des bei jeder Maus entnommenen Blutgewichtes.
Die statistischen Vergleiche der Ergebnisse wurden realisiert durch den nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test U (Programm Statview 5).
2) Ergebnisse
Die 3 erläutert in Form eines Balkendiagramms die Mittelwerte ± SD des Verhältnisses Angiotensin II/Angiotensin I, die bei den Mäusen erhalten wurden, denen 0,9; 3; 10 und 30 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht verabreicht wurden (die Balken 0,9; 3; 10 bzw. 30), sowie die Mittelwerte ± SD, die für das gleiche Verhältnis bei den Vergleichsmäusen (Balken T), d.h. den Mäusen, denen 50 μl physiologisches Serum verabreicht worden waren, erhalten wurden. In dieser 3 entspricht * p < 0,05, während ** entspricht p < 0,01 verglichen mit den Vergleichsmäusen.
Die 3 zeigt, dass das Pseudopeptid G geeignet ist, in vivo die Spaltung von Angiotensin I zu Angiotensin II zu inhibieren (zu hemmen) und dass diese Inhibierung (Hemmung) dosenabhängig ist. Das Verhältnis Angiotensin II/Angiotensin I, das bei den Vergleichsmäusen gemessen wurde, ist um 50% vermindert bei den Mäusen, die mit 0,9 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht behandelt worden sind, und es ist um 90% bei den Mäusen vermindert, die mit 30 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht behandelt worden sind.
Die 4 erläutert in Form eines Balkendiagramms die mittleren Prozentsätze ± SD der Schutzwirkung von Bradykinin, die bei den Mäusen erhalten wurden, denen 10 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht (Balken G) verabreicht worden waren, und bei den Vergleichsmäusen (Balken T), d.h. für den Fall erhalten worden waren, dass den Mäusen 10 mg Perindopril pro kg Körpergewicht verabreicht wor den war. In dieser Figur entspricht ** p < 0,01 im Vergleich zu den Vergleichsmäusen.
Wie aus der 4 ersichtlich, beträgt die mittlere Schutzwirkung von Bradykinin durch das Perindopril, die willkürlich auf den Wert 100% festgelegt worden war, nur noch 9,2% bei den Mäusen, denen 10 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht verabreicht worden waren. Dieses Pseudopeptid scheint somit die Spaltung von Bradykinin in vivo nur sehr mäßig zu verhindern.
Die 5 erläutert, ebenfalls in Form eines Balkendiagramms, die mittleren Blutkonzentrationen ± SD (ausgedrückt in pmol/g Blut) des markiertem exogenem Ac-SDKP, die bei den Mäusen erhalten wurden, denen 10 mg Pseudopeptid G pro kg Körpergewicht verabreicht worden war (Balken G) und die bei den Vergleichsmäusen (Balken T), d.h. bei den Mäusen erhalten worden waren, denen 50 μl physiologisches Serum verabreicht worden waren. In dieser Figur entspricht ** p < 0,01, verglichen mit den Vergleichsmäusen.
Im Vergleich dazu zeigt die 5 auch die mittlere Blutkonzentration ± SD von markiertem exogenem Peptid Ac-SDKP, die bei Mäusen festgestellt wurde, die mit 10 mg Pseudopeptid RXP407 (beschrieben als ein selektiver Inhibitor für die N-terminale Stelle von ACE in den Literaturstellen [7] und [8]) pro kg Körpergewicht (Balken R) behandelt worden waren und unter Anwendung eines identischen Arbeitsprotokolls.
Wie die 5 zeigt, scheint das Pseudopeptid G bei einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht keinen signifikanten Effekt auf die Spaltung des Peptids Ac-SDKP zu haben, während das RXP407 den Plasma-Gehalt dieses Peptids auf das 16-fache erhöht, verglichen mit demjenigen, der bei den Vergleichsmäusen beobachtet wurde.
Somit inhibiert das Pseudopeptid G sehr wirksam in vivo die Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II, ohne den Abbau von Bradykinin und noch weniger denjenigen des Peptids Ac-SDKP tatsächlich zu verhindern.
Tabelle 1
Zitierte Literaturstellen

[1] V. J. Dzan, "Hypertension" 37, 1047–1052, 2001.
[2] W. Linz, G. Wiemer, P. Gohlke, T. Unger und B. A. Scholkens, "Pharmacol. Rev." 47 (1), 25–49, 1995.
[3] F. Soubrier, F. Alhenc-Gelas, C. Hubert, J. Allegrini, M. John, G. Tregear und P. Corvol, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 85 (24), 9386–90, 1988.
[4] L. Wei, F. Alhenc-Gelas, P. Corvol und E. Clauser, "J. Biol. Chem." 266 (14), 9002–8, 1991.
[5] E. Jaspard, L. Wei und F. Alhenc-Gelas "J. Biol. Chem." 268 (13), 9496–503 (1993).
[6] M. Azizi, A. Rousseau, E. Ezan, T. T. Guyene, S. Michelet, J. M. Grognet, M. Lenfant, P. Corvol und J. Menard, "J. Clin. Invest." 97 (3), 839–44, 1996.
[7] WO-A-00/01706.
[8] V. Dive, J. Cotton, A. Yiotakis, A. Michaud, S. Vassiliou, J. Jiracek, G. Vazeux, M. T. Chauvet, P. Cuniasse und P. Corvol, "Proc. Natl. Acad. Sci." USA 96 (8), 4330–5, 1991.
[9] C. Junot, M. F. Gonzales, E. Ezan, J. Cotton, G. Vazeux, A. Michaud, M. Azizi, S. Vassiliou, A. Yiotakis, P. Yiotakis und V. Dive, "J. Pharmacol. Exp. Ther." 297 (2), 606–11, 2001.
[10] FR-A-2 676 059.
[11] EP-A-0 725 075.
[12] J. Jiracek, A. Yiotakis, B. Vincent, A. Lecoq, A. Nicolaou, F. Checler und V. Dive, "Development of highly potent and selective phosphinic peptide inhibitors of zinc endopeptidase 24–15 using combinatorial chemistry" in "J. Biol. Chem." 270 (37): 21701–6, 1995.
[13] J. Jiracek, A. Yiotakis, B. Vincent, F. Checler und V. Dive, "Development of the first potent and selective inhibitor of the zinc endopeptidase neurolysin using a systematic approach based on combinatorial chemistry of phosphinic peptides" in "J. Biol. Chem." 271 (32): 19606–11" 1996.
[14] A. Yiotakis, S. Vassiliou, J. Jiracek und V. Dive, "Protection of the hydroxy-phosphinyl function of phosphinic dipeptides by adamantyl. Application to the solid-phase synthesis of phosphinic peptides" in "J. Org. Chem." 61: 6601–6605, 1996.
[15] S. Vassiliou, A. Mucha, P. Cuniasse, D. Georgiadis, K. Lucet-Levannier, F. Beau, R. Kannan, G. Murphy, V. Knauper, MC. Rio, P. Basset, A. Yiotakis und V. Dive, "Phosphinic pseudo-tripeptides as potent inhibitors of matrix metallo-proteinases: a structure-activity study" in "J. Med. Chem." 42 (14): 2610–20, 1999.
[16] D. Georgiadis, G. Vazeux, C. Llorens-Cortes, A. Yiotakis und V. Dive, "Potent and selective inhibition of zinc aminopeptidase A (EC 3.4.11.7, APA) by glutamyl aminophosphinic peptides: importance of glutamyl aminophosphinic residue in the P1 position" in "Biochemistry" 39 (5): 1152–5, 2000.
[17] "Protective groups in Organic Synthesis", zweite Auflage von T. W. Green und P. G. M. Wuts, "John Wiley & Sons, Inc.", 309–315.
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[19] J. Villieras, W. H. Rambaud und M. Graft, "Synth. Commun." 16, 149, 1986.
[20] H. Chen, F. Noble, P. Roques und M. C. Fournie-Zaluski, "J. Med. Chem." 44, 3523–3530, 2001.
[21] FR-A-2 781 230.
[22] L. Demange und C. Dugave, "Tetrahedron Letters" 42, 6295–6297, 2001.
[23] EP-A-0 361 341.
[24] US-A-5 476 847

Claims

Verwendung mindestens eines Phosphinsäurepseudopeptid-Derivats, das die folgende Aminosäure-Sequenz der Formel (I) umfasst:
worin: – R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sind, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit
außerdem den Pro-Rest bilden kann, und – R₅ ein Wasserstoffatom, ein pharmakologisch akzeptables Gegenion oder eine Gruppe darstellt, die in vivo einen hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann; zur Herstellung eines Arzneimittels, das die C-terminale Stelle des Enzyms zur Umwandlung von Angiotensin I selektiv blockiert.
Verwendung eines Phosphinsäurepseudopeptid-Derivats der folgenden Formel (II):
worin: – R₁ eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion geschütztes Peptid darstellt, – R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit
außerdem den Pro-Rest bilden kann, – R₄ ein Wasserstoffatom oder ein pharmakologisch akzeptables Gegenion darstellt und – R₅ ein Wasserstoffatom, ein pharmakologisch akzeptables Gegenion oder eine Gruppe darstellt, die in vivo einen hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann; zur Herstellung eines Arzneimittels, das die C-terminale Stelle des Enzyms zur Umwandlung von Angiotensin I selektiv blockiert.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der R₁ eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion, ausgewählt unter den Acetyl- und Benzyloxycarbonylgruppen, darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der R₂ die Benzyl-, Methyl- oder Phenethyl-Gruppe darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der R₃ die Seitenkette von Alanin, Arginin oder Tryptophan darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die Einheit -NH-CH(R₃)-CO- den Pro-Rest bildet
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der R₄ und/oder R₅ ein Wasserstoffatom darstellt (darstellen).
Verwendung nach Anspruch 2, bei der das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der Formel entspricht:
(Pseudopeptid G)
Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat, das die Aminosäure-Sequenz der folgenden Formel (I) umfasst:
worin: – R₂ die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt, – die Einheit
den Pro-Rest bildet:
– R₄ ein Wasserstoffatom oder ein pharmakologisch akzeptables Gegenion darstellt, – R₅ ein Wasserstoffatom, ein pharmakologisch akzeptables Gegenion oder eine Gruppe darstellt, die in vivo einen hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann.
Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der folgenden Formel (II):
worin: – R₁ eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion geschütztes Peptid darstellt, – R₂ die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt, – die Einheit
den Pro-Rest bildet:
– R₅ ein Wasserstoffatom, ein pharmakologisch akzeptables Gegenion oder eine Gruppe darstellt, die in vivo einen hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann.
Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der Formel:
(Pseudopeptid G)
Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat nach einem der Ansprüche 9 bis 11 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, in der das Phosphinsäurepseudopeptid-Derivat der Formel entspricht:
(Pseudopeptid G)
Verfahren zur Herstellung eines Pseudopeptids der Formel:
worin: – R₁ eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion geschütztes Peptid darstellt, – R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit:
außerdem den Pro-Rest bilden kann, und – R₄ und R₅ ein Wasserstoffatom darstellen; wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: 1) Reagierenlassen einer Verbindung der Formel (III):
in der R₁ und R₂ wie oben definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (IV):
in der Ac die Acetyl-Gruppe darstellt und Et die Ethyl-Gruppe darstellt, zur Herstellung der Verbindung der Formel (V):
2) Umwandlung der Verbindung (V) in eine Verbindung (VI) durch Umsetzung der Verbindung (V) mit Natriumborhydrid:
3) Schützen der Hydroxylgruppe der Verbindung (VI) mit einer Schutzgruppe R₅, beispielsweise mit der Adamantyl-Gruppe Ad, zur Herstellung der Verbindung der Formel (VII):
4) Verseifen der Verbindung (VII) zur Herstellung der Verbindung der Formel (VIII):
5) Kuppeln der Verbindung der Formel (VIII) mit einer Aminosäure der Formel (IX) oder (X):
worin R₃ wie oben definiert ist, und 6) Eliminieren der Schutzgruppe Ad.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Stufe (5) der Peptid-Kupplung durchgeführt wird durch Peptid-Synthese in fester Phase unter Verwendung eines Harzes, das durch die Aminosäure der Formel (IX) oder (X) substituiert ist, als feste Phase.
Verfahren zur Herstellung eines Pseudopeptids der Formel:
worin: – R₁ eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Aminfunktion geschütztes Peptid darstellt, – R₂ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellen, wobei die Einheit
außerdem den Pro-Rest bilden kann, – R₄ ein Wasserstoffatom darstellt und – R₅ eine Gruppe darstellt, die in vivo einen hydrolysierbaren Phosphinsäureester bilden kann; wobei man in dem Verfahren die Phosphinsäure-Funktion des nach dem Verfahren nach Anspruch 14 oder 15 erhaltenen Pseudopeptids verestert durch Kuppeln mit einem Alkohol der Formel R₅OH oder durch Umsetzung mit einem Halogenid der Formel R₅X, worin X für ein Halogenatom steht.
Verbindung der Formel (VIII):
worin: – R₁ eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion oder eine Aminosäure oder ein durch eine Schutzgruppe für eine Amin-Funktion geschütztes Peptid steht und – R₂ die Seitenkette einer natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäure darstellt.