JP2005521497A - キメラ膵臓 - Google Patents

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Abstract

本発明は哺乳類ドナーからの未熟膵臓組織の採取、および膵臓組織が血管新生を行い成熟しうる条件下における、哺乳類レシピエントの腹腔内への上記組織の移植、またそれによるレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための組織および組成物に関する新規な方法を提供する。本発明はまた、単に膵臓組織の治療、レシピエントの免疫抑制およびレシピエントの共刺激遮断に用いる方法および組成物だけでなく、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応化された哺乳類の未熟膵臓組織を含む。

Description

発明の詳細な説明
(関連出願)
本出願は2002年3月25日に出願された米国仮出願番号60/367,181の利益を請求するものであり、仮にその内容が十分に記載されているとしてもその内容を本明細書の一部とするものである。
(本発明の行政権)
本発明は国立衛生研究所からの政府保証R01 DK53497の支援により作成された。アメリカ合衆国政府は本発明に関して特定の権利を有する。
(技術分野)
本発明は生物工学の分野、特に哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための方法、組織および組成物に関連する。
(背景技術)
特発性または原発性糖尿病は、完全に発現された形で、絶対的または相対的なインスリンの欠乏、空腹時高血糖、糖尿、およびアテローマ性動脈硬化症、微小血管障害、腎症および末梢神経障害の発病への著しい傾向によって特徴付けられる、炭水化物、脂肪および蛋白質の代謝の慢性障害である。グルコースの利用が不十分であることは全ての糖尿病患者に特徴的であるが、ベータ細胞の損失から起きる明らかに限定された重度のインスリン欠損だけの患者もいる。多数の残りの糖尿病患者は、末梢組織におけるインスリンに対する著しい抵抗性に伴うインスリンの分泌反応の障害に罹患している。
「特発性糖尿病」なる語は、一般的に上記の特徴を有する障害の混成群を包含する。該疾患について、少なくとも2種の主要なならびに数種のあまり一般的でない変種が同定されている。第1の主要な変種であるインスリン依存性糖尿病(IDDM)(I型)は、糖尿病患者の約10%を占める。第2の主要な変種である、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)(II型)は、全ての糖尿病患者の残り90%に相当する。外因性に産生されたインスリンを使用した通常のインスリン置換療法および、または糖尿病患者の食事を注意してモニタリングしない限り、患者は広範囲にわたる消耗性の症候を経験し、その中の何人かは昏睡および最終的には死亡に進展しうる。
哺乳類において、膵臓は正常血糖の維持に関与する主要臓器である。一般的に、成熟哺乳類膵臓は背側膵臓および腹側膵臓と呼ばれる2つの膵芽(または原基)より発達する。これらの原基は、膵臓を形成する発達中に融合するが背側原基が最初に出現し、膵臓のほとんどを形成する。腹側原基は胆管の傍に発生し、膵臓の頭部および鉤状突起を形成する。
成熟膵臓は外分泌(消化)および内分泌(ホルモン)の両方の機能を有する。外分泌機能としては消化を促進する酵素の分泌が挙げられる。膵臓のホルモンの機能は、少なくとも、共同で血中のグルコースレベルの調節を補助する2つのホルモンである、インスリンおよびグルカゴンの分泌を含む。膵臓の内分泌機能に関して、インスリンを生成および分泌をするのは、ランゲルハンス島と呼ばれる領域に構成されたベータ細胞である。グルカゴンはランゲルハンス島内のアルファ細胞により分泌される。
外科的手法により糖尿病レシピエントにおける膵臓マスおよび、または機能を置換しようと、数多くの試みがなされてきた。例えば、死後のヒトの膵臓由来の消化および単離されたランゲルハンス島を免疫抑制された糖尿病のヒトに移植することが糖尿病を治療する上で確立されているが、実験的手段にすぎない。現在の技術では、この技術を制限する主たる原因は移植に利用できるヒト膵臓組織の供給が不十分であるということである。加えて、移植された島の断片のみが宿主に生着するため、島組織は、消化および単離の手順の間に、ならびに移植後に消失または減少するかもしれない。島内でのベータ細胞のマス増加はまた、このような移植片はベータ細胞マスの拡大の可能性の制限を示すため、最適ではないと言える。さらに、いずれの死後の移植に関係する免疫抑制および関連する問題はかなり重要でありうる。
全ての未熟、胎児ラット膵臓の、ラットの腎皮膜下空間、前眼窩(anterior eye chamber)、精巣、皮下嚢(subcutaneous pocket)、第三脳室、および頬嚢への同種移植はまた当該分野で公知のものである。このような作業はまた、移植組織の成長および分化に対するインスリン治療の効果を含む。
コラゲナーゼで消化および単離された成熟ラットおよびハムスターの島の、ハムスターの皮膚のひだおよび横紋筋組織への移植により、単離された島が再び血管新生することもまた公知である。シクロスポリンA(CsA)および15−デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)(DOS)の、少なくとも2つの免疫抑制処方がこのような異種移植片に有用であることが公知である。同様に、分散された発達中のラット膵臓(細分、分離およびコラゲナーゼで消化)を、アロキサン糖尿病ラットの腹腔または腎皮膜下部位へ注入することで、少なくとも一時的に糖尿病が寛解することは公知である。
胎児ブタ膵臓の単離された島クラスタはまた、ヒト糖尿病患者への異種移植片として利用されてきた。このように、ブタ胎児より膵島を単離、およびヒト糖尿病患者の静脈内に島を注入することは公知である。このような操作に伴う重要な問題は、免疫抑制の維持にシクロスポリン、プレドニゾロンおよびアザチオプリンが必要であることである。付加的な問題は、このような移植片は、レシピエントが循環グルコースレベルの調節能を獲得することを補助しないことである。
従来の方法の短所は有意である。分散またはクラスタ細胞を用いる方法は、レシピエントあたり多量のドナー組織および通常は複数のドナーを必要とする。強力な免疫抑制もまた、移植細胞の急性拒絶反応の回避を補助するため必要とされる。さらに、分散した形式の細胞およびクラスタ移植片が与えられても、実際の移植を管理することは難しく、かつて発達するキメラ臓器が作成されたことは一度もない。その他の相違点では、従来の成人または未熟な膵臓組織全体の移植は、本発明の組織よりも実質的により発達した組織を利用し、移植片部位として腹膜に焦点をあてるものではない。結果として、従来の技術は、膵臓の外分泌機能の望ましくないおよび不必要な発達の可能性だけでなく、超急性および、または急性血管拒絶反応の危険性の増加を示す。本発明のみが、少なくとも超急性および急性血管移植拒絶反応を本質的に回避または減少する一方で、外分泌機能でなく、内分泌機能を有する新たに血管新生したキメラ膵臓臓器の成長方法を提供する。
本発明のキメラ膵臓は、宿主内で機能的マスを実質的に増加させ、または少なくとも増加させる能力を有し、宿主内で少なくとも標準に近い血糖レベルを確立させる。これは、少なくとも、1)移植段階での未熟膵臓組織移植片におけるインスリンの欠乏、および移植後2週での発達した島におけるこのような分泌インスリンの存在;および2)ストレプトゾトシン(streptozotocin)糖尿病ラットでの未熟膵臓組織の移植と組織が発達および成熟する結果としての、宿主の正常血糖の間のおおよそ30日の遅延、により反映される。
したがって、従来のいずれの方法においても、ヒト糖尿病の効果的な治療に至ることができなかったことに鑑みれば、レシピエントの膵臓マスを増加させるため、未熟膵臓組織を哺乳類レシピエントに移植する新たな方法、組織および組成物を開発する必要がある。
(発明の開示)
本発明の1つの具体例は、少なくとも1つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に当該未熟組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させる方法を目的とする。
本発明のもう1つの具体例は、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応化された哺乳類の未熟膵臓組織である。
本発明のもう1つの具体例は、移植された組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、レシピエントの免疫抑制性組成物およびレシピエントが未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植を免疫抑制する方法に関する。
本発明のもう1つの具体例は、移植された組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、レシピエントの共刺激遮断組成物およびレシピエントが未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植の免疫反応を共刺激遮断する方法に関する。
本発明のもう1つの具体例は、組織の移植後の増殖および成長を増強するため、採取された組織を処理するための組成物および方法を含む。この具体例は、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適用した単離された哺乳類未熟膵臓組織をその哺乳類レシピエントでの移植された組織の移植後の増殖および成長を増強するために移植の前に成長因子と一緒にインキュベートすることを含んでいてもよい。
本明細書の各具体例において、未熟膵臓組織は、採取の段階で本質的にドナーからの血管新生を受けておらず、本質的に抗原提示細胞が存在しない、哺乳類胎児の膵臓組織を含んでよい。
本発明の目的は、未熟な哺乳類膵臓組織を哺乳類レシピエントに移植し、レシピエントの膵臓マスを増加させる方法、組織および組成物を提供することである。
他の態様および特徴は、以下で部分的に明白となり部分的に指摘されるだろう。
(図面の記載)
図1Aは、マウスの大網へ移植後14日の、胎生日数(E)28日のブタ後腎(pm)である;
図1Bおよび1Cは、マウスの大網へ移植後14日の、ヘモトキシリン(hemotoxylin)およびエオシン(「H&E」)で染色された、パラフィン包埋ブタ後腎の切片を示す。糸球体が標識されている(g);
図1Dは、マウスの大網へ移植した14日後に、マウス特異的内皮細胞マーカー抗CD31で染色された、発達したブタ後腎のパラフィン包埋切片を示す。ブタ後腎にある染色陽性(CD31陽性)のマウス起源の血管構造(矢印および矢じり)を示す;倍率をA&B(A)について、そしてCおよびDについて示す。
図2Aはマウスの大網へ移植後14日のブタ後腎(m)である;
図2Bないし2Eは、移植された後腎のH&E染色された切片を示す。糸球体が標識されており(g)、倍率をA&B(B)、C、DおよびEについて示す;
図3Aは、E12.5のルイスラット胎児由来の十二指腸(duo)切片の写真である。背側膵臓原基(dp)および腹側膵臓原基(vp)が標識されている;
図3Bは、十二指腸が切除されたdpおよびvpのH&Eで染色された切片である;
図3Cは、図3Bに示される背側膵臓の拡大図であり、図3Cは管状房状細胞の凝集帯を示す(矢印);
図4Aは、E12.5のルイスラット胎児から得られた膵臓原基のH&E切片を示す;
図4Bは、抗インスリン抗体で染色された原基の隣接する切片を示し、組織切片において陽性の染色を示していない;
図4Cから4Fは、移植後2週の膵臓原基を示し、4Cおよび4Eは対照染色切片を、および4Dおよび4Fは抗インスリン抗体での染色を示している。矢印は陽性染色構造としてのランゲルハンス島を示す;
図5Aは、成体ルイスラットの腹膜内への移植後6週の背側膵臓原基が起源である対照抗体染色切片である。陰性染色組織を矢印で示す;
図5Bは、抗インスリン抗体に染色された隣接する切片である。矢印は島組織を示す。組織は成長し、移植後2週でより多くの島が存在する;
図5Cおよび5Dは、各々、もう1つの対照抗体染色切片およびもう1つの抗インスリン染色切片の拡大図である。
図5Eおよび5Fは、抗インスリン抗体で染色された組織切片であり、導管上皮に接続されたままの発達中の導管の島を矢印で示す;
図6は、移植後おおよそ15週の膵臓原基を図示しており、腹膜脂肪に覆われた間質内の島組織のキメラ臓器構造を示し、矢印は島を示す;
図6AはH&E染色切片を示す;
図6Bは対照染色切片を示す;
図6Cおよび6Dは抗インスリン染色切片を示す;
図7Aは、移植後15週に回収された膵臓組織の切片を示し、島を矢印により示す;
図7Bは、比較のために、新生児ラットからの背側膵臓原基の切片を示す。島は矢印で示されるが、腺房細胞は矢じりで示される;
図8Aは、島内の細胞の電子顕微鏡検査画像を示し、細胞は結晶化インスリン(矢印)を表す離心濃染核(eccentric dense core)を含む神経分泌顆粒でパックされている;
図8Bは、顆粒の高倍率像を示す;
図9は、35日の期間に渡る、同種移植されたラット、手術を施していない対照、および糖尿病が誘導されたラットの比較グルコースレベルを示す;
図10は、4ヶ月の期間に渡る、同種移植されたラット、手術を施していない対照、および糖尿病が誘導されたラットの比較グルコースレベルの比較を示す;
図11Aは、異種移植された(ラットからビヒクル処理されたマウス)未熟膵臓組織の、移植後4週の横断面を示すスライドである;
図11Bは、異種移植された(ラットから共刺激遮断処理されたマウス)未熟膵臓組織の、移植後4週の横断面を示すスライドである;および
図12は、異なる染色プロトコルを示す異種移植されたラットの膵臓の横断面を示す:
図12Aは、対照血清を示す;
図12Bは、インスリン産生細胞を明らかにする抗インスリン抗体の使用を示す;および
図12Cは、膵島(各枠において矢印により同定される)を明らかにする結合ゴモリ染色を示す。
(発明の詳細な記載)
以下の詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を補助するために設けられている。当該説明は、本明細書に記載の具体例における修正および変形を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者が行うことができる場合、過度に本発明を制限するものと解釈されるべきでない。
全ての出版物、特許、特許出願、データベース、およびその他の文献、本明細書にて参照された全ての関連出願、およびそこで引用される全ての文献は、その出典を明示することで本明細書の一部とする。
本願において引用される本発明の1つの具体例は、哺乳類ドナーからの未熟膵臓組織の採取、および膵臓組織が宿主が起源である血管より血管新生を受け成熟しうる条件下、哺乳類レシピエントの腹腔内への該組織の移植を含み、それによるレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラの内分泌を行う膵臓を成長させる、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための新規な方法を対象とする。未熟膵臓組織は、採取の段階で、少なくとも実質的にドナーからの血管新生を受けておらず、少なくとも実質的に抗原提示細胞が存在しない、哺乳類の未熟膵臓組織を含んでよい。
好ましい具体例は、少なくとも1つの哺乳類胎児のドナー、好ましくはブタのドナー、からの、実質的に抗原提示細胞が存在せず、実質的に血管化されていない背側、腹側、または背側および腹側が結合した膵臓原基を少なくとも1つ含む該組織である、未熟膵臓組織の採取を含む。該組織は、ヒト糖尿病患者の腹腔内で上腸間膜動脈の枝に隣接する部位に移植される。移植後、該組織は血管新生を行って成熟し、それによりレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラの内分泌を行う膵臓が発達する。当該好ましい方法はまた、移植された組織の拒絶反応の予防を補助するために、免疫抑制剤または共刺激遮断剤をレシピエントの免疫系に投与することを含んでよい。
当該好ましい方法はまた、組織の移植後の成長および発達を増強するために、組織を処理する方法および組成物を含んでよい。
適当な哺乳類ドナーは、生理学的な類似性、臓器の大きさ、抗原の側面、ドナーの利用性、および膵臓の内分泌機能の類似性を含む様々の因子だけでなく、公知の移植プロトコルに基づいて宿主との適合性により選択される。
ヒトレシピエントにとって好ましい哺乳類のドナーは、無菌で飼育され、崩壊促進因子およびCD59などのいくつかのヒト蛋白質に可能な限りトランスジェニックであるブタ、またはアルファガルトランスフェラーゼ欠損ブタだろう。他の因子の中で、臓器の大きさが同等であり、およびドナーとして一般的に入手可能であるため、ブタはヒトのレシピエントにとって好ましい異種のドナーである。さらに、グルコースホメオスタシスの過程おおびインスリン分泌の調節が、ブタとヒトで非常に類似している。
加えて、ヒト未熟膵臓組織が、ヒトレシピエントに同種移植するのに好ましいだろう。
好ましい具体例において、未熟膵臓組織は、採取の段階でドナーにおいて本質的に血管新生を受けていない、少なくとも1つの胎児背側または膵臓原基を含んでよい。当該組織はさらに、背側および腹側原基を両方、このような原基を1つまたはそれ以上、全膵臓(背側および腹側の両方、または融合した原基)、または1つまたはそれ以上のドナー由来のこのような組織を含んでよい。全ての原基を使用することが好ましいが、このような組織の非消化、非分離部位を含むものも同様に本発明の未熟膵臓組織の範囲内にある。
未熟膵臓組織は、少なくとも1つのドナーより適当な発達段階で、すなわち背側および腹側原基が融合する直前または融合した後の数日以内で、血管新生および組織内でドナーにより抗原提示細胞が生成および分布されるより先に採取されるだろう。未熟膵臓組織は未熟膵臓が形成され始めた後すぐに採取されることが好ましく、ドナー組織より、膵臓内または膵臓外より発生する血管が存在するより先に分離されうる。血管新生より先に採取することは、膵臓原基が採取される発達中の胎児において成熟抗原提示細胞はまだ形成されていないだろうし、仮に形成されていても無血管の膵臓原基内には移動していないであろうから特に好ましい。この段階で、未熟膵臓組織は抗原提示細胞が存在しない、または実質的に存在しないと考えることができる。
膵臓が成長して採取が遅くなりすぎた組織、例えば可視化できる血管を有する組織は、抗原提示細胞および細胞表面抗原を含む可能性が大きく、したがってレシピエントによる拒絶反応の脅威がより大きくなる。成長および血管新生の好ましい段階で採取された組織は、実質的に抗原提示細胞が存在しないだろうし、これは、非同種移植片移植における少なくとも超急性および急性の血管拒絶反応の可能性が、血管新生を受けた移植片または抗原提示細胞を含む移植片の移植と比較して、大きく減少することを意味する。
膵臓組織を採取するための特定の成長段階は、ドナーの種にしたがって変化するだろう。ラットでは、膵臓は22日の妊娠期間で11ないし12日目に形成され、未熟膵臓組織の採取に好ましい時期は約12日目と約13日目の間である。マウスでは、膵臓の形成は19日の妊娠期間で10ないし11日目頃であり、約11日目から約12日目が採取に好ましい。ブタでは、膵臓は、115日の妊娠期間で16ないし18日目に形成され、好ましい採取は約20日目から約38日目に、より好ましい採取の期間は約25日目から約35日目、および最も好ましい採取の日数は約29日目である。ヒトでは、膵臓は、270日の妊娠期間で31ないし40日目に形成され、約40日目から約50日目、または妊娠1期の初期が採取に好ましい。
本発明の1つの態様において、レシピエントは哺乳類で、いずれの年齢でもありうる。好ましいレシピエントはヒトで、より好ましくはヒトのII型またはI型糖尿病患者である。もう1つの好ましい具体例において、このようなレシピエントは、上記疾患の1つに罹患した結果として、膵臓実質の機能の低下を示す。
好ましい方法は、未熟膵臓組織が血管新生を行い成熟を開始しうる条件下、哺乳類レシピエントの腹腔内に、少なくとも1つの胎児哺乳類ドナーの全膵臓原基を含む未熟膵臓組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む。膵臓組織は、当業者に公知の方法を使用してレシピエントの腹腔内へ移植される。
1つの具体例において、膵臓組織は、上腸間膜動脈の分枝に隣接するレシピエントの大網の近くに移植され、好ましくは網嚢に移植される。本明細書に記載の技術を使用して移植された未熟膵臓組織は、最初、血管新生を行うことができず、したがって成長して少なくとも一部はレシピエントの血管により血管形成され、少なくとも1つのキメラ的膵臓内分泌部を成長させる。キメラ膵臓は、少なくともインスリン、可能であればグルカゴンおよびソマトスタチンを産生および放出しうる、成熟した機能を有するランゲルハンス島の形成により特徴付けられる。
レシピエントによる血管新生は、移植された異種組織の受容を促進するだろう。より明確には、移植片内での血管新生の欠損、および移植の際の移植された組織とレシピエントの間での血管吻合の欠損は、組織の少なくとも超急性および急性の血管拒絶反応を回避するうえで補助となる。このように、本発明の異種移植は、2つのより重症な型の臓器拒絶反応を避け、血管新生を行うことが可能で、宿主内で機能性キメラ的臓器へと成長する。
未熟膵臓組織の同種移植の場合、いずれの胎児の原基も、このような移植を必要とする同種のレシピエント内に移植することができる。所望により、リンパ球混合培養反応などの当該分野で公知のいずれかの方法を使用してドナーおよびレシピエントの間でMHC(主要組織適合性抗原複合体)単相型適合を行ってもよい。
本発明のキメラ的膵臓内分泌部の血管新生および成熟に適当な条件はまた、移植された組織の成長および機能化を促進し、移植片の拒絶反応を防ぐ術前または術後の方法、および組成物の使用を含んでよい。同系移植および異種移植のあるケースにおいては、移植された膵臓組織の宿主拒絶反応がなく、したがって免疫抑制および、または共刺激方法および組成物は回避されるだろう。さらに、発明の未熟膵臓組織は、成長因子および、宿主内でのインスリン産生ベータ細胞の成長である、宿主内での増殖および成長を亢進し、移植拒絶反応の可能性を減少する組成物で処理することで、本発明における使用に適応化させることができる。
本発明のもう1つの態様は、哺乳類レシピエントの膵臓実質を増加させるため、未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に用いる、レシピエントの刺激遮断組成物および方法(実施例処方1および処方2を参照)である。公知のように、CD4+T細胞は、同種および異種移植片の、血管を形成しない急性のT細胞媒介拒絶反応において重大な役割を果たす。このように、レシピエントのT細胞反応の共刺激を遮断することにより、CD4+T細胞の活性化およびまたは機能を標的とすることで、このような拒絶反応を抑え込むことは、本発明において有効であることが証明された。移植された組織に対する宿主のT細胞反応を標的および下方調節する、適当な免疫調節物質および方法を使用してもよく、そのことは本発明において意図されるものである。
第1のこのような方法は、CTLA4Ig(Genetics Institute, Cambridge MA)および抗CD2(Pharmingen, San Diego CA)の組成物を含み、これらは移植の前、間および後にレシピエントに投与されてよい。
共刺激遮断の第2の方法は、抗CD11a(Pharmingen, San Diego CA)、抗CD45RB(Clone 23G2, Pharmingen, San Diego CA)および抗CD154(Clone MR1, Pharmingen, San Diego CA)を含み、これらはまた移植の前、間および後に投与されてよい。
少なくとも異種移植の場合には、本発明はレシピエントに用いる免疫抑制方法および組成物を含むだろう。これは通常、移植後にレシピエントを免疫抑制することでなされる。シクロスポリンA(CSA)処理は、ドナー組織の拒絶反応を防ぐのに十分な免疫抑制を提供する。移植拒絶反応を防ぐためのCSA処理方法は、医学分野で公知である。局所免疫抑制技術は、Gruber(1992), Transplantation 54: 1-11により記載される。米国特許第5,560,911号では、自然発生ヒト抗動物抗体のイディオタイプに拮抗する抗体は、異種移植片拒絶反応を阻害するのに有用であると開示されている。抗リンパ球グロブリンはまた、移植拒絶反応を防ぐことが公知である(Lacyら. (1981), Diabetes 30: 285-291)。免疫抑制の代わりとして、移植された膵臓を移植の前にその抗原性を減少するために処理し得る。表面修飾による移植片の免疫原性を減少させる典型的な解決法が、Faustman WO 92/04033(1992)により開示されている。
本発明の好ましい態様において、未熟膵臓組織を受けたレシピエントが服用する免疫抑制物組成物は、催糖尿病性が低いと証明された免疫抑制物質の使用に基づくであろう。例えば、コルチコステロイド、シクロスポリンAまたはタクロリムスの使用は、本明細書に記載の移植目的に制限することができる。免疫抑制処理が成功する例は、長期高用量シロリムス(Sirolimus)(非催糖尿病性)、長期低用量のタクロリムス(催糖尿病性)および短期のダクリツマブを必要とする、エドモントン法(Shapiroら, 2000)で使用された方法に基づくものであってもよい。
未熟膵臓組織は、移植前だが採取後にも冷却(おおよそ4℃)する準備をするか、または冷却下で維持することで、移植に適応させることができる。本発明はさらに、単離された哺乳類の未熟膵臓組織を、成長因子、成長培地、および組織の移植後の成長および発達を増強する他の化合物および組成物に接触させることによって、膵臓組織を移植に適応させることを含む。このような組成物の1つは、採取後および移植前の、HamsF12:Dulbeccoの修飾Eagles培地(好ましくは50から100ulの50:50の混合液)内の、肝細胞成長因子(好ましくは10ないし9M)およびVEGF(好ましくは5μg/ml)を含んでもよい。好ましい具体例において、組織を該組成物と一緒に3/4ないし3時間、4℃でインキュベートする。
採取された組織は、移植片の成長を増強するため、様々の成長因子および成長促進物質、またはそれらの組み合わせにより処理されてもよい。例えば、採取された組織を肝細胞成長因子(HGF)と接触させてベータ細胞の増殖を強化し、インビボで島実質を増加させてもよい。同様に、血管内皮成長因子(VEGF)を用いて、膵島の血管新生を増加させてもよい。成長および成熟化を強化するプロトコルを計画かつ実行するのに利用することのできる他の成長因子は、とりわけ、以下の:臓器培養液内で維持される膵臓原基内での内分泌細胞の直系決定を調節しうる、表皮成長因子(EGF)ファミリーリガンド;ベータ細胞の分化を促進するベータセルリン(BTC);およびソマトスタチン産生デルタ細胞の成長に影響するノイレグリン(Neuregulin)(NRG−4);インビトロで腺房の分化を阻害するレチノイド拮抗薬;変換増殖因子ファミリー(TGFs)、成長因子(IGFs)、ガストリン、アクチビンAのメンバー、および線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーのメンバーを含む。
移植片、特にベータ細胞の成長の強化は、インスリン、特に異種インスリンをレシピエントに外科手術後に投与することで増強することができる。好ましい具体例において、本発明は、移植された組織の発達を増強するため移植後に異種インスリンを患者に投与する工程を含む。
十分な成長期間の後、発明の移植された組織がインスリン分泌能を有することが明らかである。組織を腹腔内へ移植しているため、分泌されたインスリンは、レシピエントの門脈系内に直接放出される。したがって、発明の方法および組成物を使用した未熟膵臓組織の移植は、レシピエントの機能的な内分泌マスが増加する一因となる。
また、十分な成長期間の後、外分泌膵臓組織がキメラ膵臓に存在しないことは明らかである。その代わりに、それは図7に示されるようにランゲルハンス島および間質組織から構成される。したがって、キメラ膵臓からの外分泌膵臓分泌物をドレナージする方法を考案する必要はない。
実施例
以下の実施例を用いて、本発明の具体例を記載する。本明細書の請求項の範囲内における他の具体例は、本明細書で開示される本発明の明細または実践を考慮することで当業者には明白となるであろう。実施例と共に明細書は単なる例示として解され、本発明の範囲および精神は添付した特許請求の範囲で表される。
ブタからマウスへの移植に用いる共刺激遮断処方
処方1:本実施例において、発達中のブタ後腎組織(発達中の腎臓原基)を、ブタドナーよりマウスレシピエント内へと移植した。治療方法は、レシピエントC57B1/6Jマウスに、CTLA4Igの組成物を、移植前2および1日目に、移植の日に、および移植後5日目に、0.5mg/日にて投与し;および、抗CD2の組成物を、移植の日および移植後の3、7および10日目に、0.5mg投与することを含む。図1Aに示されるのは、マウスの大網への移植後14日のブタ後腎(m)である。H&Eで染色された、パラフィン包埋後腎の切片を、図1BおよびCに示す。糸球体を標識する(g)。図1Dはマウス特異的抗CD31で染色されたパラフィン包埋切片を示す(6)。血管(矢印)および糸球体系蹄毛細血管ループ(矢じり)は、ブタ後腎において示す。これらの血管およびループはマウス由来である(染色+マウス特異的抗CD31のため)。糸球体(g)を標識する。このように、移植されたブタ組織はマウスレシピエント内で拒絶されることなく、実際に成長し、その成長の間にレシピエントにより血管新生がなされた。
処方2:この方法および組成物はまた、ブタからマウスへの後腎の移植により具現化される。レシピエントマウスは、移植の日および移植後0、1、7および14日目に、0.2mgの抗CD11aで静脈内的に;移植3および2日目に0.2mgで、移植前の1日目に0.3mgで、および移植の日および移植後1ないし10日目に0.1mgの抗CD45RBで静脈内的に;および、移植の前の日、移植の日および移植後2および4日目に、0.25mgの抗CD154で静脈内的に処理された。図2Aに示されるのは、マウスの大網への移植後14日のブタ後腎(m)である。H&Eで染色された切片を、図2BないしEで示す。尿管(u)が図2Bでは標識されている。腎発生帯(ネフロンに発達)を示す(図2CおよびDの矢印)。糸球体(g)を図2Dおよび2Eにおいて標識する。再び、移植後の図により、後腎が宿主内で拒絶反応を起こさずに血管を形成し、成長したことが確立される。
胎児膵臓原基の移植はランゲルハンス島の形成をもたらす。
背側および腹側の膵臓両方よりなる膵臓原基をE12.5ルイスラット胎児より切開の範囲下で外科的に採取し、無菌状態下で氷冷された生理食塩水内に浮遊させた(図3A参照)。切除から2時間以内に、膵臓原基を成体ルイスラットの大網内に移植した。移植後2週で、成体ルイスラットを殺し、組織学的分析のために膵臓移植片を摘出した。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された組織マスの、固定、パラフィン包埋および薄切りされた切片を組織学的試験に付し、移植された膵臓原基は、ランゲルハンス島を含む組織へと増殖および成長したことが明らかとなった。
図3Aに示されるのは、E12.5ルイスラット胎児からの十二指腸(duo)の切片の写真である。背側膵臓(dp)および腹側膵臓(vp)を標識する。図3Bに示されるのは、十二指腸が切除された背側および腹側膵臓原基の、H&Eで染色された切片である。図3Cは、3Bに示される背側および腹側膵臓原基の拡大図である。
インスリンに対する免疫反応力がE12.5で膵臓原基に存在するかどうかを決定するために、本発明者らは付加的な染色を実行した。図4Aは、E12.5ルイスラット胎児より得られた膵臓原基のH&Eで染色された切片を示す。図4Bは、抗インスリン抗体で染色された隣接する切片を示す。E12.5においてインスリンに対して陽性となった染色は検出されていない。
ルイスラットの大網内への全ての膵臓原基の移植後2週までに、組織は分化した。図4Cに示されるのは、対照抗体で染色された切片、および4Dに示されるのは、隣接するインスリンで染色された切片である。対応する陰性(4C)および陽性(4D)組織を示す(矢じり)。4Eに示されるのは、移植後2週のもう1つの移植された膵臓の対照染色された切片、および4Fに示されるのは、隣接するインスリンで染色された切片である。ランゲルハンス島を示す(矢印)。倍率はA&B(A)、C&D(C)およびE&F(E)で示される。
2週を過ぎた膵臓原基の増殖および成長、およびインスリン免疫反応力の形式を特徴付けるため、本発明者らは、E12.5膵臓原基の移植後6または15週に、宿主腹膜内に存在する構造物を調査した。図5Aに示されるのは、成体ルイスラットの腹膜内に移植後6週の、膵臓原基より発生した、対照抗体で染色された切片である。図5Bに示されるのは、抗インスリン抗体で染色された隣接する切片である。島組織を示す(矢印)。図5Cおよび5Dに示されるのは、もう1つの対照抗体で染色された切片の拡大図(図5C)、および抗インスリン抗体で染色された隣接する切片(図5D)である。図5EないしFは、抗インスリン抗体で染色された切片で、導管上皮(d)に接続したままの成長中の導管の島を示す(矢印)。倍率はA&B(A)、C&D(C)およびE&F(E)で示される。
図6は移植後15週の膵臓原基を示す。図6Aに示されるのは、H&Eで染色された切片、および図6Bに示されるのは、対照の血清で染色された切片である。対応する抗インスリン抗体で染色された切片は、図6Cに示される。図6Dは、抗インスリン抗体で染色された、腫大したランゲルハンス島を示す。矢印は島を示す。倍率はAからCはAにおいて、およびDにおいて示される。「臓器」は、腹膜脂肪に覆われた間質内の島組織よりなる新しい臓器である。腹膜には炎症性反応は無く、これは活性を有する外分泌の分泌活性を示す。
結合Gomori法は、ベータ細胞を紫に、および腺房細胞を明桃色に染色する。図7Aに示されるのは、移植後15週の発達した膵臓原基由来の切片である。図7Bに示されるのは、新生児ラット由来の背側膵臓の切片である。島(矢印)および腺房細胞(矢じり)を示す。予測通り、結合Gomeri陽性(明桃色)の腺房組織は図7Bに存在する。対照的に、非染色間質に覆われた島組織は図7Aにのみ存在する。倍率を示す(B)。
ベータ細胞がインスリン顆粒を含むかどうかを示すため、電子顕微鏡検査が実行された。図8Aは島内の細胞を示す。その細胞質は、結晶化インスリン(矢印)を表す離心濃染核を含む神経分泌顆粒でパックされている。顆粒の高倍率を図8Bに示す。
膵臓原基の移植によるストレプトゾトシン糖尿病の治療
基線血中グルコースレベルの測定(0日)の後、ストレプトゾトシン糖尿病をルイスラットに誘導した。対照集団(対照、n=8)は、ストレプトゾトシンの代わりにビヒクルを与えられた。ストレプトゾトシンまたはビヒクル投与後5日目に、血中グルコースレベルを測定した。ストレプトゾトシン糖尿病ラットのうち、10の膵臓原基が腹膜内に移植された(n=3移植)。他のラットは偽手術を受けた(N=7糖尿病)。グルコースレベルは、ビヒクルまたはストレプトゾトシンの投与後14、28および35日目のAM8時に再び測定された。図9に示されるように、グルコースレベルは、5、14、28および35日目に対照と比較して、糖尿病ラットにおいて上昇した。対照的に、35日目まで、対照および移植された(以前は高血糖の)ラットの間ではグルコースレベルに違いは無かった。**p<0.01対当日の対照;*P<0.05対当日の対照、ダネット多重比較法。
グルコース負荷試験が、第2の対照ラットの集団(n=6)、糖尿病ラット(n=4)および移植された(以前は高血糖の)ラット(n=6)に対して、移植された集団内に10の膵臓原基を移植後18週に、Brownら, Diabetes 30: 9-13 (1981)において記載される方法論を使用して、実行された。ラットは絶食され、タオルを巻いて抑制され、尾の静脈内に急速注射経由で、0.5g/kg体重の用量でD−グルコースを与えられた。血液サンプルが後で尾の静脈より収集された。グルコース消失の割合を表すK値(%/分)は、10、20および30分の値を使用して決定された。対照ラットおよび糖尿病ラットにおけるグルコース消失を表すK値(%/分)は、各々2.92±0.44および0.48±0.26であり、Brownらにより報告された値(対照>糖尿病、p<0.01)と同等であった。移植されたラットのK値は、2.82±0.46であり、対照と有意には異なるものではなく、糖尿病動物と比較すると有意に上昇した。
グルコースレベルは、図9に示されるデータを作成するために使用されたラットにおいて、毎週測定されてきた。正常血糖が4ヶ月(16週)持続した(図10)。
胎児膵臓原基の異種移植
E12.5ルイスラットの膵臓原基を、C57Bl/6Jマウスの大網内に移植した。数匹の宿主マウスを上記と全く同様に共刺激遮断物質[hCTLA4−Ig:0.2mgを経腹膜的に、移植の日(0日)に;および移植後2および4日目に;抗CD45RB(クローン23G2):0.1mgを静脈内的に、移植前の3日目(−3日)から0日まで、および0.1mgを経腹膜的に、移植後1ないし10日目に;および、抗CD154:0.25mgを経腹膜的に、移植後0、2および4日目に]で処理した。他のマウスはビヒクルの注射で処理された。
図11Aは、ビヒクルで処理されたC57Bl/6Jマウスの大網内へ移植後4週のルイスラット膵臓原基を示す。図11Bは、共刺激遮断物質で処理されたC57Bl/6Jマウスの大網内へ移植後4週のルイスラット膵臓原基を示す。図11Aに示される未分化膵臓組織とは対照的に、島(矢印)は図11Bにおいて識別できる。
図12は、共刺激遮断を受けた成人C57Bl/6Jマウスの大網内へ移植後4週の、第2のE12.5ルイスラット膵臓原基を示す。図12Aは対照血清;図12Bは抗インスリン抗体;図12Cは結合ゴモリ染色である。島を示す(矢印)。
(原文に記載なし)

Claims (20)

  1. 少なくとも1つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に当該未熟組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させる方法。
  2. 哺乳類レシピエントがヒトである、請求項1記載の方法。
  3. 哺乳類ドナーがブタである、請求項2記載の方法。
  4. ドナーの妊娠期間の約20日目から約35日目までの間に当該組織の採取を行う、請求項3記載の方法。
  5. 該組織がレシピエントの上腸間膜動脈の分枝に隣接して移植される、請求項2記載の方法。
  6. 該組織がレシピエントの網嚢内に移植される、請求項5記載の方法。
  7. 該組織が、少なくとも1実質的に抗原提示細胞が無く、少なくとも1つの実質的に血管新生を行わない膵臓原基の少なくとも1つの非消化、非分裂部分を含む、請求項1記載の方法。
  8. 該原基が少なくとも腹側の膵臓原基を含む、請求項7記載の方法。
  9. 該原基が少なくとも背側の膵臓原基を含む、請求項7記載の方法。
  10. 該組織が少なくとも1つの全膵臓を含む、請求項7記載の方法。
  11. 該レシピエントによる該組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、少なくとも1つの免疫抑制組成物をレシピエントに投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  12. 該レシピエントによる該組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、少なくとも1つの共刺激遮断組成物をレシピエントに投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  13. 組織の移植後の増殖および成長を増強するため、該組織を処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  14. 哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応した哺乳類未熟膵臓組織であって、少なくとも実質的に抗原提示細胞が無く、少なくとも1つの実質的に血管新生を行わない膵臓原基の少なくとも1つの非消化、非分裂部分を含む、該組織。
  15. 該組織を調整するか、または移植前および採取後に組織を冷却下で維持することで組織を移植に適応させる、請求項14記載の組織。
  16. 該組織を成長因子に接触させることで、該組織が移植に適応化される、請求項14記載の組織。
  17. 該組織が少なくとも1つの腹側の膵臓原基を含む、請求項14記載の組織。
  18. 該組織が少なくとも1つの背側の膵臓原基を含む、請求項14記載の組織。
  19. 該組織が少なくとも1つの全膵臓を含む、請求項14記載の組織。
  20. 少なくとも1つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に該組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、糖尿病の治療を必要とする哺乳類レシピエントにおける糖尿病の治療法。
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