JP4926703B2 - セルトリ細胞および筋様細胞を含有する組成物、並びに細胞性移植における該組成物の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的因子の欠損から生じる疾患の治療において、哺乳動物被験者中に免疫特権部位を生成し、それによってこうした生物学的因子を産生する細胞の移植を容易にするための、セルトリ細胞および筋様細胞の使用に関する。セルトリ細胞および筋様細胞を含有する薬剤組成物とともに、これらの細胞の使用に関する療法を本発明が提供する。
精巣、脳、および前眼房は、免疫特権部位と見なされ、そしてこれらが細胞性移植片を保護する能力に関して研究されてきている[1〜3]。精巣内に移植された同種組織および調和性(concordant)異種組織は、長期間生存する[4〜10]。
本発明の発明者らは、非免疫抑制Lewisラットにおいて、非免疫特権部位である腎被膜下に移植した際に、ブタ新生仔セルトリ細胞(NPSC)が長期間生存することを立証した。驚くべきことに、本発明の発明者らは、セルトリ細胞の長期間の生存が、筋様細胞の存在に依存することを見出した。
好ましい態様において、薬剤組成物中の筋様細胞対セルトリ細胞の比率は、少なくとも約0.5:99.5である。好ましくは、比率は0.5:99.5〜65:35の範囲内である。
別の態様において、本発明は、哺乳動物被験者、好ましくはヒト被験者において、免疫特権部位を生成する方法であって、該被験者にセルトリ細胞および筋様細胞を投与することによる、前記方法を提供する。
セルトリ細胞および筋様細胞は、被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与されることも可能である。好ましくは、部位は、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される。
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物被験者、好ましくはヒトにおいて、生物学的因子の欠損から生じる疾患を治療する方法であって、セルトリ細胞、筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する療法的に有効な量の細胞を該被験者に投与することによる、前記方法を提供する。
被験者に投与されるセルトリ細胞および筋様細胞は、好ましくは、哺乳動物、好ましくはブタ、そしてより好ましくは60日齢以下のブタ新生仔、そしてさらにより好ましくは5日齢以下のブタ新生仔の精巣から単離される。あるいは、セルトリ細胞を、TM4などの樹立細胞株、またはヒト組織に由来することも可能な幹細胞株いずれかの、セルトリ細胞株から得ることも可能である。細胞株から調製されたこうしたセルトリ細胞を、筋様細胞、および望ましい生物学的因子を産生する細胞と混合することも可能である。
別の好ましい態様において、疾患は糖尿病であり、そして生物学的因子を産生する細胞は、膵島細胞である。セルトリ細胞対膵島細胞の比率が、800膵島あたり、2x106以下のセルトリ細胞が用いられるようなものであることが好ましい。細胞を被験者に投与する前に、セルトリ細胞、筋様細胞、および膵島細胞が、投与用のセルトリ−筋様−膵島細胞凝集体が形成される条件下で、例えば約24〜48時間、共培養されることもまた、好ましい。
(実施例1)
材料および方法
動物
オスのLandrace−Yorkshireブタ新生仔(1〜3日齢)をセルトリ細胞ドナーとして用いた。8〜10週齢のオスLewisラット(RT1l/l、Charles River Canada、カナダ・ケベック州セントコンスタント)をレシピエントとして用いた。
ラット・セルトリ細胞に関して以前記載されたもの[14]と類似の技術を用いて、NPSCを単離した。簡潔には、1〜3日齢のオスのLandrace−Yorkshireブタ新生仔をハロタンで麻酔し、精巣を外科的に取り除き、そして0.25%(w/v)ウシ血清アルブミン(フラクションV;Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス)を補った冷(4℃)ハンクス平衡塩溶液(HBSS)を含有する50mlコニカル試験管に入れた。精巣をはさみで1mm断片に切り、コラゲナーゼ(2.5mg/ml;Sigma タイプV、米国ミズーリ州セントルイス)で、37℃で10分間消化し、そして次いでHBSSで3回洗浄した。1mM EGTAを補ったカルシウム不含培地中に組織を再懸濁し、そしてトリプシン(25μg/ml;Boehringer Mannheim、カナダ・ラバル)およびDNアーゼ(4μg/ml、Boehringer)で、37℃で10分間、さらに消化した。消化物を500μmのナイロンメッシュに通過させ、HBSSで洗浄し、そして60〜80x106細胞、並びに10mmol/l D−グルコース、2mmol/l l−グルタミン、50μmol/lイソブチルメチルキサンチン、0.5%ウシ血清アルブミン、10mmol/lニコチンアミド、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および10%熱不活性化ブタ新生仔血清を補ったHamのF10培地35mlを含有する未処理ペトリ皿(15cm直径)中で培養した。細胞を37℃で48時間インキュベーションして、細胞凝集体(100〜300μm直径)の形成を可能にした。
培養した後、そして移植直前に、NPSCの純度、生存度および量を、それぞれ、ビメンチン陽性セルトリ細胞と平滑筋アルファアクチン陽性管周囲筋様細胞の比率、トリパンブルー色素排除およびDNA含量に基づいて決定した。三次元構造中で細胞を正確に計数するのは困難であるため、膵島解離に関して以前記載された技術[34]を用いて、凝集体を単細胞に解離させた後、それぞれのアリコット中のビメンチン陽性セルトリ細胞および平滑筋アルファアクチン陽性管周囲筋様細胞の数を評価した。分散した細胞懸濁物をHistobond接着性顕微鏡スライド(F.G.R. Steinmetz Inc.、カナダ・ブリティッシュコロンビア州サリー)に付着させ、ブアン溶液で30分間固定し、70%エタノールで洗浄し、そしてセルトリ細胞マーカーであるビメンチン[14]または筋様細胞マーカーである平滑筋アルファアクチン[35]を用いて免疫染色した。各調製物において、最小500の単細胞を計数した。
組織学
移植4日後(n=3)、20日後(n=5)、30日後(n=8)、40日後(n=5)、60日後(n=10)および90日後(n=3)に、形態学的解析のため、腎摘出を行った。移植片を所持する腎臓をZ固定液に浸し、そしてパラフィンに包埋した。脱パラフィンおよび再水和後、最大出力の電子レンジにおいて、0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で15分間加熱することによる抗原回復を用いて、組織切片を免疫染色した[14、36、37]。連続切片を10%過酸化水素とインキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼの反応を停止し、非特異的血清でブロッキングし、そしてマウス・モノクローナル抗ビメンチン(PCNA;1:100;Dako、米国カリフォルニア州カーピンテリア)またはマウス・モノクローナル抗増殖細胞核抗原(1:50;Dako)いずれかと30分間インキュベーションした。次いで、切片をビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体(1:200;Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)と20分間インキュベーションし、その後、ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン、基質色素原(アミノエチルカルバゾール)とインキュベーションし、そして次いで、ヘマトキシリン(Zymed Laboratories Inc.、米国カリフォルニア州サンフランシスコ)で染色した。陽性対照には、ブタ新生仔精巣の切片が含まれ、一方、陰性対照には、一次抗体の省略が含まれた。陽性対照はセルトリ細胞内で、ビメンチンおよびPCNA免疫反応を示し、そして陰性対照は染色を示さなかった。
交差汚染を防止するため、無菌条件下で、移植4日後、20日後、30日後、40日後、60日後、および90日後に、DNA抽出のためにも腎摘出を行った(各時点でn≧3)。移植片を所持する腎臓および移植片を所持しない腎臓由来の組織を、直ちに凍結し、そして後でDNAを単離するため、−80℃で保存した。氷上で融解した後、350μlの溶解緩衝液[50mM Tris、100mM EDTA、400mM NaCl、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)]中で試料を再懸濁し、そして0.2mg/mlプロテイナーゼK(Sigma)を用いて55℃で一晩処理した。プロテイナーゼKを不活性化し、クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した後、DNAペレットを70%エタノール中で洗浄し、風乾し、そして100μlのDNアーゼ/RNアーゼ不含水(Sigma)に溶解した。増幅前に分光光度解析によって、DNA濃度および品質を決定した。
NPSC凝集体性質決定
新生仔精巣からブタ・セルトリ細胞を単離し、そして2日間培養して、細胞性凝集体の形成を可能にした。移植前、免疫反応性ビメンチン陽性セルトリ細胞および平滑筋アルファアクチン陽性筋様細胞の比率を評価することによって、これらの細胞性凝集体の組成を決定した[14、35]。総数4の独立の調製物から、これらの凝集体が、92.2±5.1%のセルトリ細胞および2.2±0.7%の筋様細胞を含有することが示された。残った細胞集団(すなわち<6%)は、生殖細胞、ライディッヒ細胞および線維芽細胞で構成されるようである。
免疫適合Lewisラットの腎被膜下にNPSCを移植して、NPSCが不調和異種移植片として生存可能であるかどうかを確かめた。移植4日後、20日後、30日後、40日後、60日後、および90日後、巨視的には、セルトリ細胞移植片は、大規模な新血管形成を伴って、容易に同定可能であった(図1)。組織切片を組織学的に調べると、すべての時点で移植片中にNBPSCが同定され、移植片の66〜100%がセルトリ細胞を含有していた(表1)。ビメンチン陽性セルトリ細胞は、主に、細胞クラスターまたは細管様構造いずれかとして配置されていた(図2A〜D)。セルトリ細胞がクラスターに編成される場合、大きな渦巻く円形の塊として凝集し、索形成中の胚性精巣に存在する輸精索(seminiferous cords)のものに似ていた(図2E〜G)[39]。細管様構造に配置される場合、大部分のセルトリ細胞は、細管の基底端に沿って核が整列するのではなく、上皮層全体に局在した(図2N)。しかし、時折、セルトリ細胞核が天然精巣におけるように配置されている細管が観察された(図2M)。
ビメンチン免疫組織化学およびCOII PCRによって測定されるような、Lewisラットに移植されたNPSC異種移植片の生存パーセント
巨視的には、移植20日後、セルトリ細胞移植片の大規模な増殖が観察された。移植片が増殖したように見えるとともに、移植した細胞が制御されずに増殖した可能性もあるため、組織切片をPCNAに関して免疫染色して、分裂中の細胞を同定した。PCNAはDNA複製に関与し、そして増殖中の細胞に局在する[40〜42]。連続切片をビメンチン(図2E〜H)およびPCNA(図2I〜L)に関して免疫染色すると、移植20日後および30日後に採取した移植片では、ある程度のPCNA陽性細胞が検出された(図2I、データ未提示);が、第40日には、大部分のセルトリ細胞はもはや分裂していなかった(図2J)。増殖中のセルトリ細胞数は、移植後の時間が経過するのにつれて減少し、移植60日後および90日後には、増殖中のセルトリ細胞は、非常にわずかしかなかった(図2K、L)。このことから、セルトリ細胞は、移植60日後には分裂を止め、そしてしたがって腫瘍を形成する見込みが減少していることが示唆される。
我々の結果から、NPSCが、非免疫抑制Lewisラットにおいて、異種移植後、長期間生存することが示される。ビメンチン免疫染色によって組織学的に生存を確定し、そしてCOII PCRによってさらに実証した。他の研究は、げっ歯類において、移植された不調和[ブタ対ラット;33]および調和[ラット対マウス;43]セルトリ細胞が生存することを報告しているが、これらの移植片は、免疫特権部位[3]と見なされる脳に移植された[33]か、または免疫保護アルギン酸微小カプセル中に入れられた[43]。我々の知る限り、免疫抑制または免疫を調節する何らかの他の介入を伴わない不調和異種移植片の生存を報告したのは、本研究が初めてである。NPSCが異種レシピエントにおいて生存可能であることは、これらが拒絶を防止する免疫調節因子(単数または複数)を合成し、そして分泌する可能性もあることを示す。これらの因子をさらに研究すると、免疫寛容を調べるモデルが提供されうる。例えば、セルトリ細胞は、FasL[13]、TGFβ[27]およびクラステリン[28]を産生することが知られ、これらはすべて、移植片保護において役割を果たすことが示唆されている。セルトリ細胞はまた、IL−2産生[24]およびT細胞増殖[24〜26]を減少させる、未同定の因子もまた分泌する。先のデータから、セルトリ細胞に分泌されるFasLは、同種レシピエントの腎被膜下に移植されたマウス精巣組織断片の生存において、役割を果たしうることが示されている[13]。特に、gldマウス(機能するFasLを欠く)から単離された精巣組織を同種移植片として移植すると、該移植片は7日後にはもはや存在しないが、野生型マウス(機能するFasLを産生する)由来の移植片は28日間生存した[13]。しかし、より最近の論文は、糖尿病の非肥満性糖尿病(NOD)マウスにおいて、NODマウス膵島と同時移植した際、セルトリ細胞が示す免疫保護効果は、FasLとは関連せず[22、23]、FasLはむしろ、有害であり、そして好中球補充およびそれに続く移植片破壊と相関することを示唆している[22]。一方、NODマウス・セルトリ細胞/膵島同時移植モデルを用いた我々の以前の研究から、TGFβが膵島破壊を防止する際に保護する役割を果たすことが示されている[23]。
セルトリ細胞が濃縮された移植片によって与えられる局所免疫保護における、筋様細胞の潜在的な関与
セルトリ細胞は精巣の正常構成要素であり、セルトリ細胞は精巣において、発生中の生殖細胞を養育し、そして免疫学的に保護する。単離セルトリ細胞は、免疫特権部位を異所性に生成することも可能であり、強力な免疫抑制分子および生存増進分子を分泌することによって、同時移植された同種細胞または異種細胞の生存を可能にする。セルトリ細胞の天然機能を利用することによって、細胞移植に関連する主要な制限:適切なドナー組織の不足および一生続く免疫抑制の必要性を克服することも可能である。前臨床動物モデルにおいて、単離セルトリ細胞は(1)同種環境および異種環境に移植された際、生着し、そして自己保護し、(2)同時移植された同種細胞および異種細胞を免疫破壊から保護し、そして(3)膵島同時移植片の長期生存を可能にし、そして膵切除によるかまたは自己免疫疾患による糖尿病の動物(非肥満性糖尿病モデル)において、高血糖を逆転させることが可能である。
(1)免疫抑制を使用せずに、ラットに異種ブタ新生仔セルトリ細胞を移植して生存するかどうかを決定する実験を設計した。セルトリ細胞を単離し、培養し、そして次いで、非免疫抑制Lewisラットの腎被膜下に移植した。免疫細胞化学技術を用いて、培養した細胞調製物は、92+/−5.1%のセルトリ細胞(ビメンチン染色)および2.2+/−0.7%の筋様細胞(平滑筋アルファアクチン染色)を含有することが見出された。生存を評価するため、移植4日後、20日後、30日後、40日後、60日後、および90日後に移植片を取り除き、そしてセルトリ細胞マーカーであるビメンチンに関して免疫染色した。ブタ組織のマーカーであるブタ・ミトコンドリア・チトクロムオキシダーゼIIサブユニット遺伝子(COII)に関するPCRによって、生存を確認した。どちらの方法によっても、少なくとも90日間、移植片中にセルトリ細胞が検出された。組織学的に、セルトリ細胞は、小さい凝集体にクラスターを形成するか、または細管様構造に編成された。隣接切片を染色すると、セルトリ細胞移植片部位内に、生存筋様細胞が存在することもまた明らかになった(図4)。これらのデータから、少ない割合の筋様細胞を含有するブタ・セルトリ細胞調製物が、ラットにおいて、異種移植後、長期間生存することが立証される。
Claims (34)
- 哺乳動物被験者において、免疫特権部位を生成するための薬剤組成物であって、前記組成物がセルトリ細胞、筋様細胞および薬学的に許容しうるキャリアーを含み、前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率は少なくとも5:95であり、そして前記セルトリ細胞および前記筋様細胞は哺乳動物の精巣から得られる、前記薬剤組成物。
- 前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも25:75である、請求項1の薬剤組成物。
- 前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が5:95〜65:35の範囲内である、請求項1の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物がブタである、請求項1の薬剤組成物。
- 前記ブタが60日齢以下である、請求項4の薬剤組成物。
- 前記ブタが5日齢以下である、請求項4の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の薬剤組成物。
- 被験者中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項1の薬剤組成物。
- 前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項8の薬剤組成物。
- 前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、105〜108細胞の範囲の総量を含む、請求項1の薬剤組成物。
- 前記総量が107〜108細胞である、請求項1の薬剤組成物。
- 哺乳動物被験者がヒトである、請求項1の薬剤組成物。
- 細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植により投与される、請求項1の薬剤組成物。
- 前記移植が同種移植または異種移植である、請求項13の薬剤組成物。
- 前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、投与前に、セルトリ−筋様細胞凝集体が形成される条件下で共培養される、請求項13の薬剤組成物。
- 哺乳動物被験者において、生物学的因子の欠損から生じる疾患を治療する薬剤組成物であって、セルトリ細胞、筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する療法的に有効な量の細胞を含み、前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率は少なくとも5:95であり、前記セルトリ細胞および前記筋様細胞は哺乳動物の精巣から得られ、そして前記セルトリ細胞および前記筋様細胞が、免疫特権部位を生成するのに有効な量含む、前記薬剤組成物。
- 前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が少なくとも25:75である、請求項16の薬剤組成物。
- 前記筋様細胞対前記セルトリ細胞の比率が5:95〜65:35の範囲内である、請求項16の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物がブタである、請求項16の薬剤組成物。
- 前記ブタが60日齢以下である、請求項19の薬剤組成物。
- 前記ブタが5日齢以下である、請求項19の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項16に記載の薬剤組成物。
- 哺乳動物中の部位に皮下投与されるか、または筋内投与される、請求項16の薬剤組成物。
- 前記部位が、脳、腎被膜下空間、肝被膜下空間、肝門静脈、大網嚢、または皮下筋膜から選択される、請求項23の薬剤組成物。
- 前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記生物学的因子を産生する前記細胞が、105〜108細胞の範囲の総量で含まれる、請求項16の薬剤組成物。
- 前記総量が107〜108細胞である、請求項25の薬剤組成物。
- 前記哺乳動物被験者がヒトである、請求項16の薬剤組成物。
- 細胞を被包する装置の埋め込みによるかまたは移植により投与される、請求項16の薬剤組成物。
- 前記移植が同種移植または異種移植である、請求項28の薬剤組成物。
- 前記生物学的因子がホルモンである、請求項16の薬剤組成物。
- 前記生物学的因子がインスリンであり、そして前記疾患が糖尿病である、請求項16の薬剤組成物。
- 前記生物学的因子を産生する前記細胞が、膵島細胞である、請求項31の薬剤組成物。
- 前記セルトリ細胞、前記筋様細胞、および前記膵島細胞が、投与前に、セルトリ−筋様−膵島細胞凝集体が形成されるように共培養される、請求項32の薬剤組成物。
- 800膵島あたり、2x106以下のセルトリ細胞が用いられる、請求項32の薬剤組成物。
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